專利名稱：三萜組合物和它們的使用方法
三萜組合物和它們的使用方法本申請(qǐng)是1999. 05. 19提交的CN 99807877. 8，題為“三萜組合物和它們的使用方法”的分案申請(qǐng)。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的涉及藥物領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及獲得治療性用于哺乳動(dòng)物的新植物化合物的方法。2.相關(guān)領(lǐng)域的描述植物是鑒定新的生物活性分子的寶貴來源。已在植物 中得到鑒定的一類分子是皂苷類。皂苷是高分子化合物，含有連接于三萜或類固醇苷元的糖部分的糖苷。由于三萜皂苷的生物特性，它們是非常令人感興趣的對(duì)象。已研究了不同植物的三萜皂苷的藥理和生物學(xué)特性，包括殺真菌的、抗病毒的、抗誘變的、殺精子的或避孕的、心血管的和抗炎癥的活性(Hostettmarm等人，1995)。已知通過結(jié)合于血漿的脂肪，皂苷和膽固醇形成復(fù)合體，從而改變了膽固醇的代謝(Oakenfull 等人，1983)。已顯示出服用三萜皂苷減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液和組織中的膽固醇量(Cheeke， 1971)。已發(fā)現(xiàn)皂苷是許多民間土藥和一些最近開發(fā)的植物藥物中的成分。已知三萜甘草亭酸和它的衍生物有抗?jié)?、抗炎癥、抗過敏、抗肝炎和抗病毒的作用。例如，某些甘草亭酸衍生物可以預(yù)防和治愈胃潰瘍(Doll等人，1962)。本領(lǐng)域已知的這些化合物是氫琥珀酸甘草次酸(美國專利No. 3，070，623)、在3’位置有取代基的甘草亭酸酯衍生物(美國專利No. 3070624)，甘草亭酸的氨基酸鹽(日本專利公告 JP-A-44-32798)、甘草亭酸的酰胺衍生物(比利時(shí)專利No. 753773)、和11-脫氧甘草亭酸 (deoxoglycyrrhetinic acid)(英國專利NO. 1346871)。甘草亭酸已顯示出能抑制參與白細(xì)胞三烯生物合成中的酶(包括5-脂肪氧合酶)的活力，并且被認(rèn)為這導(dǎo)致了所報(bào)道的抗炎癥活性(Inoue等人，1986)。據(jù)報(bào)告，樺木酸(一種五環(huán)的三萜)是在裸鼠異種移植模型中人黑素瘤生長(zhǎng)的選擇性抑制劑，且顯示出能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而造成細(xì)胞毒性(Pisha等人，1995)。已證明一種葫蘆科中國藥用植物的三萜皂苷有抗腫瘤活性(Kong等人，1993)。三萜的單糖苷已顯示出對(duì)M0LT-4人白血病細(xì)胞有強(qiáng)效和選擇性細(xì)胞毒性(Kasiwada等人，1993)，而且一些鳶尾科的三萜糖苷，能抑制植入歐利希腹水癌(Ehrlichascites carcinoma)的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)其生存時(shí)間(Nagamoto等人，1988)。從豆科的Dolichos falcatus植物中制備的皂苷， 已報(bào)道在體外和體內(nèi)可有效的抗肉瘤-37細(xì)胞(Huang等人，1982)。豆科的大豆皂苷也已顯示可有效抗許多月中瘤(Tomas-Barbaren 等人，1988)。從 Swartzia madagascariensis (豆科)的磨碎的豆莢中分離出顯示有溶血活性和殺螺活性(molluscicidal)的石竹素和絲石竹配基糖苷(Borel 和 Hostettmann，1987)。染料木素(一種從大豆中分離出的自然異黃酮素化合物(isoflavonoid))是酪氨酸激酶的抑制劑，已顯現(xiàn)出可抑制雌激素陽性和雌激素陰性的乳房癌細(xì)胞系的增殖 (Akiyama等人，1987)。在植物王國中非常豐富的煙酸肌醇酯(植酸)是谷物和莢果中一種天然飲食成分，已顯現(xiàn)出能造成結(jié)腸癌細(xì)胞系的終末分化。植酸也表現(xiàn)出在體內(nèi)對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸和乳房癌的抗腫瘤活性(Yang等人，1995)。還證明了一些三萜糖苷具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制特性，即Crossopteryx febrifuga(茜草科)植物的莖皮(stem bark)已顯現(xiàn)出在 ng/ml范圍時(shí)對(duì)Co-115人結(jié)腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞抑制作用(Tomas-Barbaren等人，1988)。 雖然以前的報(bào)道鑒定了具有多種用途之一種的三萜化合物，但在本領(lǐng)域中依然存在著對(duì)鑒定新的有生物活性的三萜化合物的巨大需求。這些化合物許多對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒性。另外，先前鑒定的三萜的生物活性是多種多樣的，而且許多在治療給定的人或哺乳動(dòng)物病癥中受到限制或有效性程度不同。已鑒定的不同三萜間的巨大差異甚至在密切相關(guān)的三萜化合物之間觀察到生物活性上的大范圍差異和不可預(yù)測(cè)性，強(qiáng)調(diào)了獲得潛在性治療劑的三萜中曾遭遇到的困難。若能解決鑒定到具有有益生物活性的新三萜這個(gè)難題，就有可能提供治療多種(現(xiàn)有治療手段效果有限)人類疾病的全新途徑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及從勝利金合歡(Acacia victoriae) (Benth.)(豆科)豆莢和根中分離新的有用的生物化合物的新用途。勝利金合歡的種子世代被澳洲土著人作為食物來源 (Lister等人，1996)。然而，豆莢和根則作為廢料被丟棄。本發(fā)明的發(fā)明者證明這種植物的這些部分中存在新的抗癌化合物和有生物用途的其它化合物這在以前沒有被利用過。例如，本文公開的新的生物活性皂苷化合物通常對(duì)惡性(腫瘤)細(xì)胞有特異性細(xì)胞毒性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了從勝利金合歡分離得到的新的皂苷化合物和它們的混合物，以及使用它們的方法。在這方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種含有三萜或其它芳香萜類化合物的皂苷化合物。本文公開的皂苷也可含有糖苷基團(tuán)。在皂苷含有三萜成分的優(yōu)選實(shí)施例中，該三萜成分通常是含合歡酸或石竹素或其它結(jié)構(gòu)相似的三萜系化合物成分。這種三萜或三萜糖苷組合物通常也含有一個(gè)單萜分子或多個(gè)單萜分子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本文所述的皂苷化合物還可用其它化學(xué)官能團(tuán)替代。所以，本文公開的皂苷化合物含有的三萜分子與至少一個(gè)、較佳的是兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)單萜分子相連。當(dāng)存在一個(gè)以上單萜分子時(shí)，這些分子可各自(i)直接與三萜分子連接(ii)與連接于三萜分子的糖或其它連接基團(tuán)連接，或(iii)與一個(gè)單萜分子連接，該單萜分子直接或通過一個(gè)糖或其它連接基團(tuán)連接于三萜分子。連接基團(tuán)包括糖、酰、酰胺、烷氧基、羰游基、烷基、亞烷基和其它對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道的類似化學(xué)分子。本文公開的三萜糖苷的分子量范圍為1800-2600amu，或至少從1800、1900、2000、2100amu到2200、 2300、2400 或 2600amu。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是提供了分離含有一種或多種分離的皂苷或三萜糖苷混合物的方法，該皂苷或三萜糖苷具有如下特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；b)含有至少一種分子量為1800到2600amu的三萜糖苷；c)具有在jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的能力；和d)具有在jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。在本發(fā)明的實(shí)施例中，三萜化合物也可具有如下特性在jurkat細(xì)胞中能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性IC50約為0. 12到約0. 40 μ g/ml。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，當(dāng)以約100到400mg/ ml的濃度用于jurkat細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，當(dāng)以約200到約250、300、350或400ng/ml或以約300到約350或400ng/ml的濃度用于jurkat細(xì)胞時(shí)， 誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，通過膜連蛋白結(jié)合重新組織jurkat細(xì)胞質(zhì)膜來測(cè)定細(xì)胞凋亡。這可通過流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)定，誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為16-18%本發(fā)明的另一實(shí)施例包括一種或多種分離的三萜糖苷組成的混合物，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；b)含有至少一種分子量為1800到2600amu 的三萜糖苷；和c)具有誘導(dǎo)jurkat細(xì)胞線粒體釋放細(xì)胞色素C的能力。本發(fā)明的另一實(shí)施例包括一種或多種分離的三萜糖苷組成的混合物，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；b)含有至少一種分子量為1800到 2600amu的三萜糖苷；和c)具有激活jurkat細(xì)胞caspase-3的能力。其中的caspase活力范圍為從約0. 3到約1. 6熒光單位/分鐘/mg。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，該混合物包括一種或多種分離的三萜糖苷，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；b)含有至少一種分子量為1800到 2600amu的三萜糖苷；和c)具有斷裂jurkat細(xì)胞中的PARP的能力。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，該混合物包括一種或多種分離的三萜糖苷，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；b)含有至少一種分子量為1800到 2600amu的三萜糖苷；和c)具有抑制jurkat細(xì)胞中PI-3-激酶活性的能力。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例中，該混合物包括一種或多種分離的三萜糖苷，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；和b)對(duì)啟動(dòng)和促進(jìn)哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞發(fā)展成惡變前或惡性腫瘤階段具有抑制能力。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，該混合物包括一種或多種分離的三萜糖苷，其具有如下性能特性a)可從勝利金合歡的組織分離得到；和b)具有誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物惡凋亡的能力。本發(fā)明的另一重要方面是提供一種含有三萜糖苷的天然營養(yǎng)物化合物，及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)，如緩沖液、溶劑、稀釋劑、惰性載體、油、奶油、或可食材料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，天然營養(yǎng)物化合物可包括在藥學(xué)上可接受介質(zhì)中的干燥和磨碎的勝利金合歡根、豆莢或它們的組合物。本文公開的天然營養(yǎng)物化合物通?？梢允撬幤⒛z囊或軟膏的形式。在另一方面，本發(fā)明提供制備含有一種或多種分離的三萜糖苷混合物的組合物的方法，包括a)從勝利金合歡植物中得到組織；b)用溶劑提取該組織，獲得提取物；和C)從該提取物中得到一種或多種三萜糖苷。用于該過程中的組織通常包括豆莢、根、種子或它們的混合物。用于提取的溶劑可以是任何一種有提取能力的有機(jī)溶劑，通?？科淙芙飧信d趣的皂苷化合物。有用的提取溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、水、甘油和它們的混合物。該過程可包括附加步驟。例如，該過程還可包括在提取后，通過過濾從植物濾渣中分離化合物。在另一實(shí)施例中，該過程還包括在提取前，用有機(jī)溶劑將植物組織脫脂。有機(jī)溶劑可以是任何適用于脫脂的有機(jī)溶劑，如己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或它們的混合物。在另一實(shí)施例中，分離過程還包括在提取后蒸發(fā)溶劑。該過程也可包括通過層析分離至少一種三萜糖苷化合物而獲得三萜化合物的混合物。層析技術(shù)的例子包括液相層析、MPLC或HPLC。雖然對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，用于層析分離的溶劑是顯然知道的，但較佳的溶劑包括甲醇、乙腈、水和它們的混合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備含有一種或多種分離的三萜糖苷混合物的組合物的方法，包括a)制備含有勝利金合歡植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)物；和b)用溶劑從細(xì)胞中提取三萜化合物，從而從組織中至少提取了第一種三萜化合物。在另一方面，組織培養(yǎng)物包括毛根培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一方面，通過用發(fā)根土壤桿菌R-1000感染勝利金合歡制備組織培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，組織培養(yǎng)包括含有約3%到約4% (重量)蔗糖的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一方面，用于提取化合物的溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、 乙酸乙酯、水或它們的混合物。在本發(fā)明的另一方面，該方法還包括附加的步驟，如從三萜混合組合物中過濾植物濾渣，在提取步驟后通過層析和/或蒸發(fā)溶劑，分離三萜混合組合物。有一方面描述了連續(xù)增殖勝利金合歡植物組織的方法，從該植物中可提取到本發(fā)明的活性化合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，描述了含有勝利金合歡植物細(xì)胞(在細(xì)胞培養(yǎng)基中，已受到發(fā)根土壤桿菌R-1000感染)的發(fā)根組織培養(yǎng)物。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中， 組織培養(yǎng)基含有約3%到與4%的蔗糖。本發(fā)明的另一方面描述了連續(xù)收獲勝利金合歡植物組織的方法，包括a)在水培生長(zhǎng)系統(tǒng)中栽培勝利金合歡植物；和b)每年約1到4次收獲該植物組織，其中在收獲時(shí)并不殺死植物。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，該生長(zhǎng)系統(tǒng)是通氣(aeroponic)系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施例中，用于培養(yǎng)的組織是勝利金合歡根組織。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是提供了一種對(duì)引發(fā)和促進(jìn)哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞發(fā)展成惡變前或惡性腫瘤階段的抑制方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞施用治療有效劑量的上述天然營養(yǎng)物組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，上皮細(xì)胞是皮膚細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、子宮細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、膀胱細(xì)胞或乳房細(xì)胞。在一相關(guān)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是人。 在另一相關(guān)實(shí)施例中，給予該天然營養(yǎng)物的方式是口服。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施例中，給予該天然營養(yǎng)物的方式是局部給藥。本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物惡性腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括上述對(duì)細(xì)胞施用治療有效劑量的天然營養(yǎng)物組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞是皮膚細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、子宮細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、膀胱細(xì)胞或乳房細(xì)胞。在一相關(guān)的實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是人。在一相關(guān)實(shí)施例中，給予天然營養(yǎng)物的方式是口服。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施例中，給予天然營養(yǎng)物的方式是局部給藥。本發(fā)明還包括防止哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞在體外或在哺乳動(dòng)物體內(nèi)異常增殖的方法， 包括給予哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞或哺乳動(dòng)物治療有效劑量的上述天然營養(yǎng)物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該上皮細(xì)胞是隱窩細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，該上皮細(xì)胞是結(jié)腸細(xì)胞。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施例中，該哺乳動(dòng)物是人。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施例中，體內(nèi)施用該天然營養(yǎng)物的方式是口服。本發(fā)明也包括一種治療哺乳動(dòng)物炎癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用治療有效劑量的上述天然營養(yǎng)物組合物。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施例中，該哺乳動(dòng)物是人。本發(fā)明還包括一種純化的三萜化合物，其含有的三萜分子連接于具有如下分子式
的單萜分子，
權(quán)利要求
1.一種制備分離的三萜糖苷組合物的方法，其特征在于，包括如下步驟a)制備含有勝利金合歡植物的細(xì)胞的組織培養(yǎng)物；和b)用溶劑從所述的培養(yǎng)物中提取所述的三萜糖苷，從而提取至少一種三萜糖苷化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組織培養(yǎng)物包括毛根培養(yǎng)物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的組織培養(yǎng)物是通過用發(fā)根土壤桿菌感染所述的勝利金合歡細(xì)胞而制備的。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的組織培養(yǎng)物包括約3% -4%重量的蔗糖。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、水或它們的混合物。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在提取后通過過濾將所述的三萜糖苷組合物與植物濾渣分離。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在提取后通過液相層析分離所述的三萜糖苷組合物。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在提取后蒸發(fā)掉溶劑。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)根土壤桿菌是通過基因改造的。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織培養(yǎng)物含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選自IAA、NAA、IBA、2，4-D 禾P BAP0
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織培養(yǎng)物含有乙酰丁香酮。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從勝利金合歡分離的新的皂苷混合物和化合物，和它們的使用方法。這些化合物可包括三萜分子，如連接了寡糖和單萜的金合歡酸或石竹酸。這種混合物和化合物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性的有關(guān)特性，且表現(xiàn)出對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102274272SQ20101061339
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月19日
發(fā)明者C·J·阿恩岑, D·T·貝利, G·S·賈亞蒂拉克, J·J·霍夫曼, J·U·格特曼, M·布萊克 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)