專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘高效表達(dá)重組酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株高效表 達(dá)重組多功能纖維素酶的方法。利用甘蔗渣和豆粕高效表達(dá)重組多功能纖維素酶的方法。
背景技術(shù)：
纖維素、半纖維素是自然界最豐富的可再生資源之一，是植物細(xì)胞壁的主要組 成物質(zhì)。地球每年由光合作用產(chǎn)生數(shù)億噸的植物干物質(zhì)(多糖類物質(zhì))，其主要成分就是 纖維素和半纖維素。纖維素和半纖維素的酶學(xué)降解又是目前公認(rèn)的最有效、最清潔的 轉(zhuǎn)化方法。其生物降解需要纖維素酶的作用。而纖維素酶是一種復(fù)合酶系，主要包括內(nèi) 切-β-1，4- -葡聚糖酶(E.C. 3.2. 1. 4)、外切-β-1，4-D-葡聚糖酶(E. C. 3.2.9. 11)和 β-葡萄糖苷酶(Ε. C. 3.2.1.21)。纖維素的降解需要這些酶的協(xié)同作用才能完成，單一酶 組分對纖維素的降解能力很差。多功能纖維素酶(MFC)同時具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、 外切- β -1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切- β -1，4-木聚糖酶3種酶活性，能高效分解天然纖維素。目前生產(chǎn)纖維素酶的主要生產(chǎn)菌株有木霉、青霉和曲酶，生產(chǎn)方法是通過對這些 絲狀真菌的固體發(fā)酵或液體發(fā)酵獲得纖維素酶，由于這些絲狀真菌所產(chǎn)生的纖維素酶成 分單一，在實際應(yīng)用中酶的活力較低，不能有效地降解纖維素(如上所述纖維素的降解需 要多種酶的協(xié)同作用才能完成)，而且目前纖維素酶的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高。本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株表達(dá)的多功能纖維素酶同時具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外 切-β -1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β -1，4-木聚糖酶3種酶活性，能高效地降解纖維素。同時， 本發(fā)明使用的培養(yǎng)基為農(nóng)業(yè)廢棄物甘蔗渣和豆粕，生產(chǎn)成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株高效 表達(dá)重組多功能纖維素的方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘高效表達(dá)重組酶的方法，多功能纖維素酶基因轉(zhuǎn)化灰 蓋鬼傘獲得轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株，作為生產(chǎn)菌株，以甘蔗渣粉和豆粕為主要原料作為培養(yǎng) 基，搖瓶發(fā)酵表達(dá)重組多功能纖維素酶。所述培養(yǎng)基的配方為甘蔗渣粉(20目)27. 9-30g/L，豆粕粉(40目)4. 3_6g/L，磷 酸氫二鉀 0. 5-1. 5g/L，磷酸二氫鉀 0. 23-0. 69g/L，硫酸鎂 0. 5-1. 5g/L，pH 值 6. 25-7. 82 ；搖 瓶發(fā)酵的條件是發(fā)酵溫度36-37°C、發(fā)酵時間5-7d。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C、培養(yǎng) 時間7d、搖床轉(zhuǎn)速180-210 r/min。所述的轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株菌種齡84_96h，菌株在培養(yǎng)基中的接種量為1-1. 5%， 即每IOOmL的培養(yǎng)基中接種1-1. 5mL的灰蓋鬼傘菌液，菌干重0. 1-0. 15g。該轉(zhuǎn)基因灰蓋 鬼傘菌株是多功能纖維素酶基因轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘獲得的，其制備方法可參見楊培周博士論文(多功能纖維素酶基因的克隆及其在灰蓋鬼傘中的表達(dá)研究，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論 文，2008年6月)?？梢圆捎靡韵聝?yōu)選方案進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)
(1)將所述轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株接種于灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基上，37°c培養(yǎng)7d，接種 1-5%菌種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，37°C，210r/min振蕩培養(yǎng)84_96h ；
(2)配制甘蔗渣培養(yǎng)基，甘蔗渣粉(20目)27.9-30g/L,豆粕粉4. 3_6g/L，磷酸氫二鉀 lg/L，磷酸二氫鉀0. 46g/L，硫酸鎂lg/L，pH值6. 25-7. 82，分裝于250mL三角瓶中，每瓶裝 液量lOOmL，高壓滅菌；
(3)在超凈工作中每瓶如步驟(2)的培養(yǎng)基接種ImL步驟(1)中培養(yǎng)的菌種，接種后置 于36-37°C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速210r/min。(4)培養(yǎng)7d終止培養(yǎng)，離心收集發(fā)酵液。其中的灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成葡萄糖10份，天冬 酰胺2份，腺嘌呤硫酸鹽0. 1份，Stock A緩沖液25份，Stock B緩沖液1份，Stock C 緩沖液10份，瓊脂14份，水補充至總重量1000份。Stock A緩沖液配方為以下重量份數(shù) 的物質(zhì)構(gòu)成酒石酸銨20份，KH2P0440份，無水NaSO4 11. 6份，無水Na2HPO4 90份，水補充至 總重量1000份。Stock B緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成硫胺素0.04份，水補充 至總重量1000份。Stock C緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成=MgCl2 ·Η20 25份，水 補充至總重量1000份。種子培養(yǎng)基配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成微晶纖維素20份， 酵母膏4份，磷酸氫二鉀1份，磷酸二氫鉀0. 46份，硫酸鎂1份，瓊脂20份，水補充至總重 量1000份。本發(fā)明是通過單因素篩選、PB設(shè)計的方法獲得了轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株高效表達(dá)重 組多功能纖維素的最佳培養(yǎng)基配方及最佳培養(yǎng)條件。不僅為重組多功能纖維素酶的高效生 產(chǎn)提供了一種有效的方法，而且也為農(nóng)業(yè)廢棄物的合理利用提供科學(xué)理論依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1.本發(fā)明的方法能有效地使轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株利用廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物甘蔗渣和豆 粕產(chǎn)重組多功能纖維素酶。2.本發(fā)明方法所產(chǎn)生的重組多功能纖維素酶，其酶的分子量大小與天然從福壽螺 胃液中分離的多功能纖維素酶的大小相一致，為45. 8KDa，酶的活性也與天然的相一致。比 原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組多功能纖維素酶在酶學(xué)性質(zhì)上均有顯著的優(yōu)勢， 原核表達(dá)系統(tǒng)的重組多功能纖維素酶活性低，且是胞內(nèi)酶不易純化，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 重組多功能纖維素酶酶由于被過度糖基化，因此酶的活性也不及天然的多功能纖維素酶。


圖1是轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株在不同碳源下培養(yǎng)產(chǎn)生的重組多功能纖維素酶的酶 活性。圖2是轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株在不同氮源下培養(yǎng)產(chǎn)生的重組多功能纖維素酶的酶 活性。圖3甘蔗渣添加量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影響。圖4豆粕粉添加量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影響。
圖5發(fā)酵初始pH值對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影響。圖6接種量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影響。 圖7硫酸鎂添加量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影響。圖8磷酸二氫鉀添加量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影 響。圖9磷酸氫二鉀添加量對重組多功能纖維素酶的Xylanase和CMCase活力的影 響。圖10 N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計與MFC的木聚糖酶(Xylanase)活力結(jié)果。圖11 N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計與MFC的內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活力結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。實施例1
配制培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基微晶纖維素20g、酵母膏4g、磷酸氫二鉀lg、磷酸二氫鉀0. 46g,硫酸鎂 Ig,蒸餾水定容至IOOOmL,高壓滅菌后備用。灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基葡萄糖10 g，天冬酰胺2 g，腺嘌呤硫酸鹽0.1 g，Stock A 緩沖液25 mL, Stock B緩沖液1 mL, Stock C緩沖液10 mL,瓊脂14 g，蒸餾水定容至 lOOOmL，高壓滅菌后備用。Stock A 緩沖液酒石酸銨 20 g, KH2P0440 g，無水 NaSO4 11. 6 g，無水 Na2HPO4 90 g，蒸餾水定容至IOOOmL,加入幾滴氯仿室溫下保存。Stock B緩沖液硫胺素0. 04 g，蒸餾水定容至IOOOmL,過濾滅菌后4°C保存。Stock C緩沖液MgCl2 · H2O 25 g，蒸餾水定容至IOOOmL,高壓滅菌，室溫
下保存?；A(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳源20g、氮源4g、磷酸氫二鉀lg、磷酸二氫鉀0. 46g、硫酸鎂 Ig,調(diào)節(jié)初始PH為6. 25，蒸餾水定容至IOOOmL高溫滅菌。重組多功能纖維素酶多種生產(chǎn)方法的對比
(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株，其構(gòu)建方法參見以下論文多功能纖維素酶基因 的克隆及其在灰蓋鬼傘中的表達(dá)研究，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2008年6月。構(gòu)建獲得轉(zhuǎn) 基因灰蓋鬼傘菌株TClesll，接種于灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基平板37°C培養(yǎng)7d，接種1_5%于 IOOmL種子培養(yǎng)基中，370C，210r/min振蕩培養(yǎng)4d。(2)在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以酵母膏為唯一氮源，香蕉皮粉(60目)、蕎麥粉 (60目)、玉米粉(60目)、甘蔗渣(20目)、微晶纖維素、燕麥、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木屑分別 為碳源接種ImL上述種子培養(yǎng)基中的菌液37°C 210rpm振蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)7d的發(fā)酵液測定 其酶活性，篩選出最佳碳源。(3)在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以篩選出的碳源為唯一碳源，蛋白胨、牛肉膏、酵 母膏、尿素、硫酸銨、磷酸二氫銨、豆粕粉(40目)、黃豆粉(40目)、麩皮(40目)、玉米粉(60目)分別為氮源接種ImL上述種子培養(yǎng)基中的菌液37°C 210rpm振蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)7d的發(fā) 酵液，采用DNS法測定其酶活性，確定最適氮源。(4)以上述篩選出的甘蔗渣為唯一碳源，豆粕粉為唯一氮源，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中 加入10-30g/L的甘蔗渣粉(20目)，加入2-6g/L的豆粕粉(40目)，加入0. 5-1. 5g/L的磷酸 氫二鉀，加入0. 23-0. 69g/L的磷酸二氫鉀，加入0. 5-1. 5g/L的硫酸鎂，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初 始ρΗ4· 5-8. 0，接種0. 5-2. 5mL菌種，37°C 2IOrpm振蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)7d的發(fā)酵液，采用DNS 法測定其酶活性。(5)運用Design-Expert 7. 1. 3軟件，選用11因素、實驗次數(shù)為12的 Plackett-Burman設(shè)計，考察碳源、氮源、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH對產(chǎn)酶影響的顯著性， 余留6個空項作誤差分析。每個因素取2個水平，“低水平”和“高水平”均依據(jù)實驗情況而 定。以Xylanase活力和CMCase活力為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7. 1. 3軟件建立方差 分析模型，選擇P < 0. 05的因素為主效應(yīng)因素。上述結(jié)果如圖1-9、圖10-11所示。圖1所示不同的碳源對TClesll菌株產(chǎn)重組多功能纖維素酶的影響不同，其中以 甘蔗渣的作用最為顯著。因此確定甘蔗渣為TClesll菌株發(fā)酵產(chǎn)重組多功能纖維素酶的最 佳碳源。由圖2可知，無機氮源硫酸銨、尿素和磷酸二氫銨對TClesll菌株產(chǎn)重組多功能纖 維素酶的影響不明顯，而有機氮源豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米粉、麩皮、黃豆粉的 影響明顯，其中豆粕粉的作用最為顯著，因此確定豆粕粉作為TClesll菌株發(fā)酵產(chǎn)重組多 功能纖維素酶的最佳氮源。由圖3-9所示磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和硫酸鎂對TClesll菌株 產(chǎn)重組多功能纖維素酶的影響不明顯，而甘蔗渣、豆粕、初始PH值、接種量的影響明顯。綜 合圖10、圖11的結(jié)果顯示，甘蔗渣、初始pH值、接種量為影響TClesll菌株產(chǎn)重組多功能纖 維素酶的主效應(yīng)因素。實施例2
(1)將實施例1制備的TClesll菌株接種于灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)7d， 接種1-5%于IOOmL種子培養(yǎng)基中，37°C，210r/min振蕩培養(yǎng)96h ；
(2)配制甘蔗渣與豆粕粉互配培養(yǎng)基，甘蔗渣粉30g/L，豆粕粉6g/L，磷酸氫二鉀Ig/ L,磷酸二氫鉀0. 46g/L，硫酸鎂lg/L，調(diào)節(jié)pH值6. 25 ；分裝于250mL三角瓶中，每瓶裝液量 IOOmL,高壓滅菌；
(3)在超凈工作中每瓶接種ImL步驟(1)中培養(yǎng)的菌種，接種后置于37°C下?lián)u床培養(yǎng)， 搖床轉(zhuǎn)速為210r/min。(4)培養(yǎng)7d終止培養(yǎng)，離心收集發(fā)酵液。其中的灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成葡萄糖10份，天冬 酰胺2份，腺嘌呤硫酸鹽0. 1份，Stock A緩沖液25份，Stock B緩沖液1份，Stock C 緩沖液10份，瓊脂14份，水補充至總重量1000份。Stock A緩沖液配方為以下重量份數(shù) 的物質(zhì)構(gòu)成酒石酸銨20份，KH2P0440份，無水NaSO4 11. 6份，無水Na2HPO4 90份，水補充至 總重量1000份。Stock B緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成硫胺素0.04份，水補充 至總重量1000份。Stock C緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成=MgCl2 ·Η20 25份，水 補充至總重量1000份。種子培養(yǎng)基配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成微晶纖維素20份， 酵母膏4份，磷酸氫二鉀1份，磷酸二氫鉀0. 46份，硫酸鎂1份，瓊脂20份，水補充至總重
6量1000份。 收集發(fā)酵液后，采用DNS法測定其酶活性，檢測結(jié)果顯示木聚糖酶(Xylanase)酶 活 1. 66 XlO5 U/L，內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)酶活為 1. 7 X IO4 U/L。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘高效表達(dá)重組酶的方法，其特征是多功能纖維素酶基因轉(zhuǎn)化 灰蓋鬼傘獲得轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘TClesll，作為生產(chǎn)菌株，以甘蔗渣粉和豆粕粉為主要原料作 為培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有甘蔗渣粉27. 9-30g/L和豆粕粉4. 3-6 g/L，搖瓶發(fā)酵表達(dá)重組 多功能纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述培養(yǎng)基的配方為甘蔗渣粉27.9-30g/L，豆 粕粉 4. 3-6 g/L，磷酸氫二鉀 0. 5-1. 5g/L，磷酸二氫鉀 0. 23-0. 69g/L,硫酸鎂 0. 5-1. 5g/L， pH6. 25-7. 82。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是最所述搖瓶發(fā)酵的條件是發(fā)酵溫度36-37°C，發(fā) 酵時間 5-7d、轉(zhuǎn)速 180-210r/min。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的菌株菌種齡為84-%h，接種量1-1.5%。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株接種于灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)成為接種菌種；(2 )配制甘蔗渣培養(yǎng)基甘蔗渣粉27. 9-30g/L,豆粕粉4. 3_6g/L，磷酸氫二鉀 0. 5-1. 5g/L，磷酸二氫鉀 0. 23-0. 69g/L，硫酸鎂 0. 5-1. 5g/L，ρΗ6· 25-7. 82，調(diào)節(jié) ρΗ 值 6. 25-7. 82 ；(3)在無菌環(huán)境下進(jìn)行接種，將步驟(1)獲得的菌種接種到甘蔗渣培養(yǎng)基上，接種量 1-1. 5%，接種后置于36-37°C下培養(yǎng)；(4)培養(yǎng)5-7d終止培養(yǎng)，離心收集發(fā)酵液。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株是在37°C培養(yǎng)7d, 接種1-5%接種菌種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，370C，210r/min振蕩培養(yǎng)84_%h，成為接種菌 種。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(4)所述培養(yǎng)是在轉(zhuǎn)速210r/min的條件 下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的灰蓋鬼傘固體培養(yǎng)基配方為 以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成葡萄糖10份，天冬酰胺2份，腺嘌呤硫酸鹽0.1份，Mock A緩 沖液25份，Mock B緩沖液1份，Mock C緩沖液10份，瓊脂14份，水補充至總重量 1000 份。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的種子培養(yǎng)基配方為以下重量 份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成微晶纖維素20份，酵母膏4份，磷酸氫二鉀1份，磷酸二氫鉀0. 46份， 硫酸鎂1份，瓊脂20份，水補充至總重量1000份。
10.如權(quán)利8所述的方法，其特征是所述MockA緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì) 構(gòu)成酒石酸銨20份，KH2P0440份，無水NaSO4 11. 6份，無水Na2HPO4 90份，水補充至總重量 1000份；Stock B緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成份，水補充至總重量1000份； Stock C緩沖液配方為以下重量份數(shù)的物質(zhì)構(gòu)成=MgCl2 · H2O 25份，水補充至總重量1000 份。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及重組多功能纖維素酶的制備方法，其特征是將多功能纖維素酶基因遺傳轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘獲得轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株，作為生產(chǎn)菌株，采用甘蔗渣粉與豆粕粉互配為最佳培養(yǎng)基，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵制備重組多功能纖維素酶。甘蔗渣粉與豆粕粉互配培養(yǎng)基配方為甘蔗渣粉27.9-30.0g/L，豆粕粉4.3-6g/L，磷酸氫二鉀0.5-1g/L，磷酸二氫鉀0.23-0.69g/L，硫酸鎂0.5-1g/L，pH值6.25-7.82。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36-37℃、培養(yǎng)時間7d、搖床轉(zhuǎn)速210r/min。最佳產(chǎn)酶量為Xylanase酶活1.66×105U/L，CMCase酶活1.7×104U/L。本發(fā)明的方法能有效地使轉(zhuǎn)基因灰蓋鬼傘菌株利用廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物甘蔗渣和豆粕粉生產(chǎn)重組多功能纖維素酶。
文檔編號C12N15/09GK102127532SQ20101061350
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者婁囡囡, 楊培周, 林俊芳, 郭麗瓊 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)