專利名稱：即配即用型的胰蛋白酶制劑的制作方法
即配即用型的胰蛋白酶制劑技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及即配即用型的胰蛋白酶制劑。
技術(shù)背景
胰蛋白酶溶液易自身降解，一般使用之前配制，無(wú)菌過(guò)濾后，馬上使用。但由于胰蛋白酶溶液是細(xì)胞消化使用的一個(gè)常用的試劑，所以，現(xiàn)在市場(chǎng)上有配制好的胰蛋白酶細(xì)胞消化液。
細(xì)胞消化液的主要成分為胰蛋白酶，目前市場(chǎng)上的細(xì)胞消化液均為溶液，運(yùn)輸及儲(chǔ)存均需在低于4°C的條件下進(jìn)行，如運(yùn)輸及儲(chǔ)存不當(dāng)，極易失活，失活后即喪失消化能力， 導(dǎo)致使用時(shí)細(xì)胞消化的效果不穩(wěn)定。
并且，目前市場(chǎng)上的胰蛋白酶細(xì)胞消化液均以其中含有的胰蛋白酶的重量來(lái)計(jì)算，而不以其單位活性來(lái)計(jì)算，因此其用于細(xì)胞消化時(shí)由于單位活性不清楚而導(dǎo)致無(wú)法精確地確定正確的用量。
因此，本領(lǐng)域目前迫切地需要改善胰蛋白酶制劑的配制和使用現(xiàn)狀，找到一種更為合適的、準(zhǔn)確的胰蛋白酶制劑的配制和使用方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種即配即用型的胰蛋白酶制劑。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種胰蛋白酶制劑組合，包括
(1) 一胰蛋白酶凍干粉，所述對(duì)胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液直接凍干或加入甘露醇或海藻糖后凍干制成；和
(2) 一溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及終濃度為0. 001-0. 01% (w/v) 的 EDTA。
在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞平衡液中不包括Ca2+，Mg2+離子。
在另一優(yōu)選例中，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以0. 1-10% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
在另一優(yōu)選例中，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以0. 5-6% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
在另一優(yōu)選例中，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以1-5% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶劑中包括終濃度為0. 003-0. 008% (w/v)的EDTA。
在本發(fā)明的另一方面，提供所述的胰蛋白酶制劑組合的用途，用于制備酶解或消化細(xì)胞的試劑盒。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種胰蛋白酶凍干粉，所述的胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液加入甘露醇或海藻糖后凍干制成。
在另一優(yōu)選例中，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以0. 5-6% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
在另一優(yōu)選例中，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以1-5% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及終濃度為 0. 001-0. 01% (w/v)的 EDTA。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶劑中包括終濃度為0. 003-0. 008% (w/v)的EDTA。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于酶解或消化細(xì)胞的溶液，由所述的胰蛋白酶凍干粉和所述的溶劑混合而成。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶液中胰蛋白酶的酶活性為500-15000單位(U)；或
在另一優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-12000單位(U)。
在另一優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-10000單位(U)。
在另一優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-6000單位(U)。
在另一優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1500-3000單位(U)。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶液中EDTA的終濃度為0. 001-0. 01% (w/v)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種酶解或消化細(xì)胞的方法，所述方法包括采用所述的用于酶解或消化細(xì)胞的溶液處理需要酶解或消化的細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，其包括所述的試劑組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括使用說(shuō)明書(shū)。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1顯示了采用本發(fā)明的酶蛋白制劑消化細(xì)胞的結(jié)果。其中，
I.消化1 2min，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變形，加入培養(yǎng)基，終止消化。
II.細(xì)胞經(jīng)懸浮后，基本呈單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，無(wú)成團(tuán)現(xiàn)象。
III.細(xì)胞經(jīng)貼壁生長(zhǎng)2d后，基本單個(gè)生長(zhǎng)，無(wú)成團(tuán)現(xiàn)象。
具體實(shí)施方式
針對(duì)胰蛋白酶現(xiàn)有的制備以及使用技術(shù)落后的問(wèn)題，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究， 開(kāi)發(fā)了一種適合于制備胰蛋白酶凍干粉制劑的方法，以及優(yōu)化的用于溶解凍干粉制劑且同時(shí)作為細(xì)胞平衡液的溶劑。所述的凍干粉以及溶劑分開(kāi)儲(chǔ)存，在使用前可方便地混合及使用。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、 “基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由…… 構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
凍干粉
由于胰蛋白酶具有自身消化的能力，穩(wěn)定性差，以往在儲(chǔ)存和使用時(shí)存在諸多問(wèn)題。一般使用之前配制，配制后馬上使用，這就給試驗(yàn)人員增加了試驗(yàn)操作的復(fù)雜性。本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于開(kāi)發(fā)出胰蛋白酶長(zhǎng)期儲(chǔ)存以及方便使用的方法，發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的方法制備胰蛋白酶凍干粉，在凍干過(guò)程中可能會(huì)造成活性損失，需加入特定保護(hù)劑，且并非所有凍干保護(hù)劑都是適用的。因此，本發(fā)明人對(duì)凍干保護(hù)劑及其濃度進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)找到了使用的凍干保護(hù)劑及其適用的濃度。
因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供一種胰蛋白酶凍干粉，所述的胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液加入甘露醇或海藻糖后凍干制成。較佳地，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以 0. 5-6% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖；更佳地以1-5% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。當(dāng)酶液中添加所述濃度的甘露醇或海藻糖后，不僅使得胰蛋白酶凍干粉具有良好的賦形性和溶解性，而且酶活完全沒(méi)有損失，說(shuō)明甘露醇或海藻糖能夠有效提高胰蛋白酶凍干過(guò)程的穩(wěn)定性，可以作為胰蛋白酶優(yōu)良的凍干保護(hù)劑。
凍干胰蛋白酶的其它方法可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的凍干技術(shù)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用冷凍真空干燥的方法。
本發(fā)明適用的胰蛋白酶可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明的胰蛋白酶可以為來(lái)自于豬、牛胰腺中提取的胰蛋白酶，也可以是重組的胰蛋白酶。本發(fā)明的胰蛋白酶優(yōu)選的是重組蛋白，其可保證無(wú)動(dòng)物源性病毒污染。
本發(fā)明適用的甘露醇或海藻糖都是本領(lǐng)域現(xiàn)有的已知產(chǎn)品，可以通過(guò)商購(gòu)的方式方便地獲得，例如可以購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。
溶劑
胰蛋白酶細(xì)胞消化液(用于酶解或消化細(xì)胞的溶液)在用于消化細(xì)胞時(shí)，不僅要保證自身具有良好的、穩(wěn)定的酶活性，而且還要給細(xì)胞提供良好的環(huán)境以使得消化后的細(xì)胞具有較好的狀態(tài)。因此，用于配制胰蛋白酶細(xì)胞消化液的溶劑的優(yōu)化也是很重要的。本發(fā)明人致力于找到合適配方的溶劑，經(jīng)過(guò)廣泛研究后，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞平衡液中加入低濃度的 EDTA可以有效地協(xié)助胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的消化作用，使得胰蛋白酶在低的活性單位下達(dá)到與高活性單位同樣的效果。但高濃度的EDTA與胰蛋白酶合用對(duì)細(xì)胞有殺傷作用，所以，消化應(yīng)用盡量低的EDTA濃度，配合胰蛋白酶作用。
因此，本發(fā)明提供了一種溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液以及終濃度為 0. 001-0. 01% (w/v)的EDTA ；較佳地，所述的溶劑中包括終濃度為0. 003-0. 008% (w/v) 的 EDTA。
本發(fā)明對(duì)于細(xì)胞平衡液沒(méi)有特別的限制，可以是任何基本的平衡液，只要其能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供所需的平衡PH以及滲透壓環(huán)境。例如，所述的細(xì)胞平衡液選自linger、 PBS、earle、hanks、dulbecco或d_hanks。這些細(xì)胞平衡液的配方以及配制方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的細(xì)胞平衡液是PBS。
所述的溶劑通常被制備成無(wú)菌的形式，例如通過(guò)無(wú)菌灌裝的方法，從而避免了對(duì)細(xì)胞的污染。
胰蛋白酶細(xì)胞消化液
以上所述的胰蛋白酶凍干粉與細(xì)胞所述的溶劑可以配制成胰蛋白酶細(xì)胞消化液， 用于酶解或消化細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了一種用于酶解或消化細(xì)胞的溶液，其由所述的胰蛋白酶凍干粉和所述的溶劑混合而成。
所述的胰蛋白酶細(xì)胞消化液被配制成具有相當(dāng)?shù)拿富钚缘娜芤海@樣有利于本領(lǐng)域人員確定所需的用量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的溶液中胰蛋白酶的酶活性為 500-15000單位(U)；更佳地，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-12000單位(U)；更佳地， 所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-10000單位(U)；更佳地，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1000-6000單位(U)；更佳地，所述的胰蛋白酶液的酶活性為1500-3000單位(U)。
由于EDTA能夠協(xié)同胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，因此，所述的胰蛋白酶細(xì)胞消化液還被配制成具有適當(dāng)濃度的EDTA的溶液。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的溶液中EDTA的終濃度為0. 001-0. 01% ；更佳地濃度為0. 003-0. 008% ο
所述的胰蛋白酶細(xì)胞消化液可適用于任何細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的消化或酶解，這是由其消化細(xì)胞的特性所決定的。所述的細(xì)胞例如但不限于神經(jīng)間質(zhì)瘤細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞、癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、各種原代細(xì)胞等需要消化分散或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞。
試劑組合及試劑盒
基于本發(fā)明的以上改進(jìn)，本發(fā)明還提供了一種試劑組合，所述的試劑組合包括一胰蛋白酶凍干粉，所述對(duì)胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液加入甘露醇或海藻糖后凍干制成； 和一溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及終濃度為0. 001-0. 01%的EDTA。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其中包含有以上所述的試劑組合。
當(dāng)然，所述的試劑盒中還可包括一些其他的試劑或說(shuō)明，例如包括配制或使用說(shuō)明書(shū)；或例如包括細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解液等。
所述的試劑組合或試劑盒可便于本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行胰蛋白酶細(xì)胞消化液的配制和使用，穩(wěn)定性高，且便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存或運(yùn)輸。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1)提供了一種配即用型的胰蛋白酶細(xì)胞消化液，將胰蛋白酶經(jīng)無(wú)菌灌裝后凍干為固體粉末，固體形式穩(wěn)定，易于運(yùn)輸和儲(chǔ)存。胰蛋白酶固體包裝，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。
(2)本發(fā)明的胰蛋白酶制劑高活性，可以在室溫(25°C )消化，不需37°C條件。且高純度，避免了雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
(3)本發(fā)明中的胰蛋白酶細(xì)胞消化液不含有Ca2+，Mg2+離子，避免了 Ca2+，Mg2+離子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)等產(chǎn)生的影響?？朔吮绢I(lǐng)域人員常規(guī)認(rèn)為的在胰蛋白酶細(xì)胞消化液中必須加入Ca2+，Mg2+離子以保護(hù)酶活的技術(shù)偏見(jiàn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1、平衡液配制
按照以下表1所示的配方配制基本平衡液，平衡液為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需的平衡 PH及滲透壓環(huán)境。依次加入所述試劑至SOOmL無(wú)菌水中，磁力攪拌下溶解，雙蒸水定容至IOOOmL0 高壓滅菌，121°C，15min。
表1、不同的細(xì)胞平衡液配制方法
權(quán)利要求
1.一種胰蛋白酶制劑組合，其特征在于，包括(1)一胰蛋白酶凍干粉，所述對(duì)胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液直接凍干或加入甘露醇或海藻糖后凍干制成；和(2)—溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及終濃度為0.001-0. 01% (w/v)的 EDTA0
2.如權(quán)利要求1所述的胰蛋白酶制劑組合，其特征在于，制備所述的胰蛋白酶凍干粉時(shí)，以0. 1-10% (w/v)的終濃度加入所述的甘露醇或海藻糖。
3.權(quán)利要求1-2任一所述的胰蛋白酶制劑組合的用途，其特征在于，用于制備酶解或消化細(xì)胞的試劑盒。
4.一種胰蛋白酶凍干粉，其特征在于，所述的胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液加入甘露醇或海藻糖后凍干制成。
5.一種溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及終濃度為0.001-0. 01% (w/v)的 EDTA0
6.一種用于酶解或消化細(xì)胞的溶液，其特征在于，由權(quán)利要求5所述的胰蛋白酶凍干粉和權(quán)利要求6所述的溶劑混合而成。
7.如權(quán)利要求6所述的溶液，其特征在于，所述的溶液中胰蛋白酶的酶活性為 500-15000 單位(U)。
8.如權(quán)利要求6所述的溶液，其特征在于，所述的溶液中EDTA的終濃度為 0. 001-0. 01% (w/v) ο
9.一種酶解或消化細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求6-8任一所述的用于酶解或消化細(xì)胞的溶液處理需要酶解或消化的細(xì)胞。
10.一種試劑盒，其特征在于，其包括權(quán)利要求1所述的試劑組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及即配即用型的胰蛋白酶制劑，包括一組合一胰蛋白酶凍干粉，所述對(duì)胰蛋白酶凍干粉由胰蛋白酶液直接凍干或者加入甘露醇或海藻糖后無(wú)菌過(guò)濾后凍干制成；和一無(wú)菌溶劑，所述的溶劑中包括細(xì)胞平衡液，以及低濃度的EDTA。本發(fā)明將胰蛋白酶凍干為無(wú)菌固體粉末，固體形式穩(wěn)定，易于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，且降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/76GK102533704SQ20101061368
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者馮矗, 李素霞, 趙致 申請(qǐng)人:上海雅心生物技術(shù)有限公司