專利名稱：超高密度大規(guī)模產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法及設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及超高密度大規(guī)模產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法及設(shè)備。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndome, PRRS)又稱藍(lán)耳病，是由冠狀病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcinereproductive and respiratory syndome virus,PRRSV)弓I起的豬繁殖障石導(dǎo)禾口呼吸系統(tǒng)的傳染病。2006年夏季藍(lán)耳病自我國南方數(shù)省開始，逐步蔓延到我國大部分省份， 許多豬場發(fā)生了以豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為特征的豬“高熱病”，至今疫情仍有發(fā)生， 給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬“高熱病”為多病原混合感染及繼發(fā)感染引起，其中 PRRSV為主要病原之一。然而對PRRS尚無特效藥物，目前主要采取綜合防治措施和對癥療法，其中免疫預(yù)防是控制該病的重要措施之一。因此許多研究者致力于該病疫苗的研究并取得了較大的進(jìn)展，目前已有多種滅活疫苗和弱毒疫苗被批準(zhǔn)使用，由于用弱毒疫苗預(yù)防導(dǎo)致PRRS的流行的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，因此研究者多主張采用滅活疫苗。滅活疫苗具有安全性好、不存在散布病原和造成PRRS新疫源的危險(xiǎn)、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。因此如何提高滅活疫苗的質(zhì)量，消除外源病毒，減少血清和內(nèi)毒素含量，優(yōu)化制造工藝等，成為現(xiàn)在研究者的主要目標(biāo)。此外，隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，隨著產(chǎn)品過程優(yōu)化和放大技術(shù)研究的進(jìn)展， 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式已難以滿足市場的需求，生物反應(yīng)器開始普遍流行于生物制品行業(yè)中，而且不斷有更先進(jìn)的生物反應(yīng)器推向市場，它克服了傳統(tǒng)方式的缺陷，可由小規(guī)模到大規(guī)模自動(dòng)化放大培養(yǎng)細(xì)胞及病毒，滿足市場對疫苗的需求。目前，藍(lán)耳病疫苗的生產(chǎn)主要是通過轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞病繁殖豬繁殖與呼吸綜合征病毒的工藝進(jìn)行生產(chǎn)。該方法自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致細(xì)胞和藍(lán)耳病疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)品批次差異大。此外，中國專利CN101612395A中，揭示了一種在生物反應(yīng)器中用球形微載體培養(yǎng)敏感細(xì)胞，在細(xì)胞上接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒以繁殖病毒，培養(yǎng)方法為懸浮培養(yǎng)。由于球形微載體提供了更大的表面積，細(xì)胞可以生長到更高的細(xì)胞密度，使得細(xì)胞和病毒繁殖處于較優(yōu)的環(huán)境，提高了病毒滴度。然而該方法是在較低的細(xì)胞密度(3X IO6-IOX IO6個(gè)細(xì)胞/mL)時(shí)接種病毒，培養(yǎng)一段時(shí)間后，收獲含有細(xì)胞的病毒液，因此在制備疫苗時(shí)候，需要至少凍融一次并進(jìn)行過濾(去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片)后才能滅活、乳化，制成疫苗。操作工藝、條件復(fù)雜，易于污染。并且該專利中所揭示的獲得的病毒液中病毒的滴度相比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝只提高了 0. 3-1個(gè)TCID5tl，也即提高的病毒產(chǎn)量并不多。綜上，本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步研究生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，優(yōu)化生產(chǎn)條件和生產(chǎn)設(shè)備，簡化生產(chǎn)流程，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒及疫苗的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒的設(shè)備。在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的方法， 所述的方法包括(1)提供一生物反應(yīng)器(細(xì)胞培養(yǎng)罐)，其中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體； (2)在生物反應(yīng)器中加入營養(yǎng)液和病毒生產(chǎn)細(xì)胞，從而細(xì)胞貼于片狀載體，且在片狀載體上的細(xì)胞密度為5. 8X 103-7. 2X IO3個(gè)/cm2 ；培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細(xì)胞至片狀載體上的細(xì)胞密度為 1 X 105-5 X IO5 個(gè) /cm2 ；(3)在生物反應(yīng)器中加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(4)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。在另一優(yōu)選例中，加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞前，對生物反應(yīng)器進(jìn)行清洗和/或滅菌。在另一優(yōu)選例中，加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞前，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器運(yùn)行條件至80士40rpm、 37士2°C、PH7. 25士0. 3、溶氧率(DO)60士 10% (ν/ν)。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒生產(chǎn)細(xì)胞是Marc-145細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的營養(yǎng)液是DMEM高糖培養(yǎng)基，其中以8-10% (ν/ν)的比例加入牛血清。在另一優(yōu)選例中，所述的片狀載體是Fibracel DiSkS，Ig = 1200-1500cm2。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)期間通過灌注法補(bǔ)充營養(yǎng)液或維持液。在另一優(yōu)選例中，定期取樣測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，來判定病毒生產(chǎn)細(xì)胞的生長情況或確定培養(yǎng)基的補(bǔ)充時(shí)間。在另一優(yōu)選例中，所述的維持液是DMEM高糖培養(yǎng)基，其中以0. 5-1% (ν/ν)的比例加入牛血清。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，接種時(shí)，病毒感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι值)為0.005-0. 5;較佳地為 0. 01-0. 02。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗的方法，所述的方法包括(1)提供一生物反應(yīng)器(細(xì)胞培養(yǎng)罐)，其中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；(2)在生物反應(yīng)器中加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞和培養(yǎng)基，從而細(xì)胞貼于片狀載體，且在片狀載體上的細(xì)胞密度為5. 8Χ 103-7. 2Χ IO3個(gè)/cm2 ；培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細(xì)胞至在片狀載體上的細(xì)胞密度為1 X 105-5 X IO5個(gè)/cm2 ；(3)在生物反應(yīng)器中接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(4)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液；(5)將收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液進(jìn)行滅活和乳化，從而獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生物反應(yīng)器，其包括一生物反應(yīng)器本體，所述生物反應(yīng)器本體中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；一或多個(gè)位于生物反應(yīng)器本體或與生物反應(yīng)器本體相連接的加料口 ；一或多個(gè)位于生物反應(yīng)器本體或與生物反應(yīng)器本體相連接的出料口 ；以及一控制裝置，其用于調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器運(yùn)行條件至80士40rpm、37士2 °C、 PH7. 25士0. 3、溶氧率(DO)60士 10% (ν/ν)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、細(xì)胞培養(yǎng)期間葡萄糖消耗量(g/d)。圖2、病毒繁殖期間葡萄糖消耗量(g/d)。其中，41h_48h以4. 2L/d的速度灌流； 48h-65. 5h 以 8. 4L/d 的速度灌流；65. 5h_89h 以 12. 6L/d 的速度灌流；89h_113h 以 8. 4L/d 的速度灌流；113h-185h以4. 2L/d的速度灌流；185h更換維持液后不再進(jìn)行灌流，直至培
養(yǎng)結(jié)束。圖3、病毒繁殖期間TCID5tl的變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究試驗(yàn)，在設(shè)備、載體、工藝條件等方面優(yōu)化了生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。為此，我們實(shí)驗(yàn)室致力于探索藍(lán)耳病疫苗的生產(chǎn)工藝優(yōu)化，研究應(yīng)用生物反應(yīng)器采用片狀載體培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞繁殖PRRSV，并摸索較為合理的培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的方法，所述的方法包括(1)提供一生物反應(yīng)器(細(xì)胞培養(yǎng)罐)，其中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；(2)在生物反應(yīng)器中加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞和培養(yǎng)基，從而細(xì)胞貼于片狀載體，且在片狀載體上的細(xì)胞密度為5. 8X 103-7. 2X IO3個(gè)/cm2 ；培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細(xì)胞至在片狀載體上的細(xì)胞密度為1 X 105-5 X IO5個(gè)/cm2 ；(3)在生物反應(yīng)器中加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(4)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。生物反應(yīng)器如本文所用，所述的“生物反應(yīng)器”可以與“細(xì)胞培養(yǎng)罐”互換使用。本發(fā)明所述的生物反應(yīng)器中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)。固定床籃式攪拌系統(tǒng)是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長，且細(xì)胞始終在固定的位置生長，加強(qiáng)了 PRRSV的感染機(jī)會(huì)。而且采用提升式攪拌系統(tǒng)，使得細(xì)胞承受的剪切力很小，有利于細(xì)胞的生長。本發(fā)明所述的生物反應(yīng)器中還包括片狀載體。片狀載體主要成分是聚酯類纖維及聚丙烯支架，細(xì)胞主要生長于纖維片上，片狀載體直徑較佳地約為6mm。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的片狀載體是？讓！^⑶丨1^^!^，^=^。。-^。。^!!2。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該種片狀載體提供了一種良好的載體環(huán)境，有利于本發(fā)明的病毒生產(chǎn)細(xì)胞的吸附和排列，有利于在培養(yǎng)后產(chǎn)生超高密度的細(xì)胞，且有利于病毒對于細(xì)胞的感染以及病毒在細(xì)胞上的增殖。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的生物反應(yīng)器包括一些控制設(shè)備，其可以控制生物反應(yīng)器的運(yùn)行條件至 80 士 40rpm、37 士 2°C、PH7. 25 士 0. 3、溶氧率(D0)60 士 10% (ν/ν)。 在該運(yùn)行條件下病毒生產(chǎn)細(xì)胞可良好地生長增殖以及生產(chǎn)病毒。所述生物反應(yīng)器的體積沒有特別的限制，本領(lǐng)域人員在本申請的提示下易于做出選擇。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的生物反應(yīng)器的罐體積是10-20L，工作體積8-15L。生物反應(yīng)器的一些其他設(shè)施、配件是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。生物反應(yīng)器的清洗、消毒可以采用本領(lǐng)域熟知的方法和試劑，如可以在121°C的溫度下進(jìn)行消毒。細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基可采用任何適宜于被豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染和繁殖的細(xì)胞作為病毒生產(chǎn)細(xì)胞。例如所述的細(xì)胞可以是Marcl45細(xì)胞或MA104細(xì)胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的病毒生產(chǎn)細(xì)胞是Marcl45細(xì)胞。用于培養(yǎng)本發(fā)明的病毒生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些，只要其能夠?yàn)椴《旧a(chǎn)細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)成分和能量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的培養(yǎng)基是DMEM高糖培養(yǎng)基，其中以8-10% (ν/ν) 的比例加入牛血清。所述的高糖培養(yǎng)基中，葡萄糖含量是較高的，較佳地在3. 0-4. 5g/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，培養(yǎng)期間通過灌注法補(bǔ)充培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度來沒確定灌注的時(shí)機(jī)。一般當(dāng)測得培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于1. 5g/L時(shí)，開始灌注培養(yǎng)基。灌注加入培養(yǎng)基的同時(shí)，還需要在截留細(xì)胞的同時(shí)排出培養(yǎng)上清(其中包括了一些代謝副產(chǎn)物)。通過定期取樣測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，來判定病毒生產(chǎn)細(xì)胞的生長情況。當(dāng)測得的病毒生產(chǎn)細(xì)胞至在片狀載體上的細(xì)胞密度為1 X 105-5 X IO5個(gè)/cm2 (如2 X IO5個(gè)/ cm2)時(shí)，在生物反應(yīng)器中接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒。病毒接種及生產(chǎn)在獲得適宜于接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境后，進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒的接種。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，接種時(shí)的病毒感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι值)為0.005-0. 5;較佳地為 0.01-0.02。所述的“病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection) ”是指每一個(gè)細(xì)胞上所感染病毒的數(shù)量。MOI =有感染力的病毒量/細(xì)胞總量。病毒接種后，可以感染病毒生產(chǎn)細(xì)胞并利用細(xì)胞進(jìn)行繁殖。接種后的一段時(shí)間 (如24小時(shí))后，可以收獲病毒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，收獲病毒的時(shí)間是在接種24小時(shí)之后，該時(shí)段收獲的病毒的滴度可達(dá)到107_4TCID5tZmL ；更佳地是在接種后70-185小時(shí)， 該時(shí)段收獲的病毒的滴度可達(dá)到1012_°TCID5(l/mL。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的一般生產(chǎn)技術(shù)下獲得的病毒的滴度。病毒滴度(TCID5tl)的測定可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。比如可以按照韓先杰、 王宏偉、王金寶，《豬繁殖與呼吸綜合征病毒TCID5tl的測定》，萊陽農(nóng)科院學(xué)報(bào)22(2) 132 134，2005中所報(bào)導(dǎo)的方法。
采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)可獲得較純的病毒液，其中基本上不含有細(xì)胞或細(xì)胞碎片， 且含有很低的血清。該較純的病毒液可直接用于疫苗的制備。利用所述的病毒液制備疫苗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，通常包括病毒的滅活、乳化。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明人使用片狀載體來培養(yǎng)細(xì)胞且生產(chǎn)病毒，不同于以往的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或以球形微載體培養(yǎng)。所述片狀載體可以為細(xì)胞生產(chǎn)病毒提供一個(gè)良好的生長和生產(chǎn)環(huán)境，可獲得高濃度的細(xì)胞，進(jìn)而獲得高滴度的病毒。(2)本發(fā)明所采用的是固定床籃式攪拌系統(tǒng)，而非其他培養(yǎng)方式如懸浮微載體培養(yǎng)方式。該籃式攪拌系統(tǒng)能夠?yàn)椴《旧a(chǎn)細(xì)胞提供良好當(dāng)生長環(huán)境，有利于細(xì)胞的生長以
及高產(chǎn)病毒。(3)以往的技術(shù)中，在較低的細(xì)胞密度(3X IO6-IOX IO6個(gè)細(xì)胞/mL)時(shí)接種病毒， 獲得的是含有細(xì)胞的病毒液，因此在制備疫苗時(shí)候，需要至少凍融一次并進(jìn)行過濾后才能滅活、乳化，制成疫苗。而本發(fā)明是將細(xì)胞培養(yǎng)至高密度如1 X 105-5X 105個(gè)/cm2后接種病毒，收獲的病毒液病毒含量非常高，且基本上不含有細(xì)胞碎片，血清和內(nèi)毒素含量也是非常少，進(jìn)一步提高了產(chǎn)品質(zhì)量，不需要進(jìn)行凍融、也不需要進(jìn)行過濾，可以直接制備成疫苗。(4)本發(fā)明的方法獲得的病毒滴度顯著提高，通過本發(fā)明的培養(yǎng)方式能夠提高5 個(gè) TCID50/mL。(5)本發(fā)明的方法，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不需要使用抗生素，降低了生產(chǎn)成本且提高了安全性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料試劑(1) Hyclone DMEM 高糖培養(yǎng)基，配方干粉培養(yǎng)基溶于5L水，含4mM L-谷氨酰胺，4500mg/L葡糖糖，含110mg/L丙酮酸鈉，碳酸氫鈉添加量為2g/L。干粉加入5L的注射用水溶解后，0. 22微米濾器過濾除菌。(2)濟(jì)南勁牛血清，購自濟(jì)南勁牛生物材料有限公司。(3)培養(yǎng)基(營養(yǎng)液)=Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基中以8-10% (ν/ν)的比例加入濟(jì)南勁牛血清(不含抗生素)。(4)維持液=Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基中以0. 5-1% (ν/ν)的比例加入濟(jì)南勁牛血清(不含抗生素)。(5)0. 4%% (w/v)的 NaOH。
儀器設(shè)備 (I)NBS的C310細(xì)胞培養(yǎng)罐(包括加料口、出料口及控制裝置)使用籃式攪拌槳， 罐體積14L，工作體積10L。(2)蠕動(dòng)泵1個(gè)，蠕動(dòng)泵設(shè)Irpm時(shí)流量約為4. 2L/天。(3)低溫冰柜1個(gè)，設(shè)置溫度為2_8°C。(4)生物安全柜1個(gè)。(5)轉(zhuǎn)瓶機(jī)1個(gè)。(6)顯微鏡1個(gè)。(7)371溫室1間。(8)恒溫水浴鍋1個(gè)。實(shí)驗(yàn)材料(1)細(xì)胞Marc-145，購自中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。(2)種毒NADC-JXA1株P(guān)RRSV第10代病毒，購自中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。(3)載體NBS 提供的 Fibracel Disks，Ig = 1200_1500cm2，也就相當(dāng)于傳統(tǒng)方法中1個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶。(4)其它2000mL玻璃瓶、1. 5mL離心管、酒精燈、消毒酒精棉球、消毒酒精、消毒液、皮筋、鋁箔紙。實(shí)施例1、培養(yǎng)罐清洗、安裝與滅菌采用NBS的C310細(xì)胞培養(yǎng)罐使用籃式攪拌槳(固定床籃式攪拌系統(tǒng))，罐體積 14L，工作體積10L。將培養(yǎng)罐清洗干凈后，加入約450g Fibracel Disks片狀載體(相當(dāng)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方式中的450個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶)，再加入IOL PBS,安裝好罐子上的所有接口，并與主機(jī)箱連接，通過啟動(dòng)循環(huán)冷卻水裝置向罐子的夾套中充水至夾套體積的1/3-1/2。再與主機(jī)箱斷開，稍稍擰松罐子底座上的螺絲，放入高壓鍋中，121°C滅菌Ih后，待其冷卻后擰緊罐子底座上的螺絲。將滅菌好的培養(yǎng)罐與主機(jī)箱連接，再將0. 4%的NaOH瓶與培養(yǎng)罐的補(bǔ)料口管道連接上，漸漸改變參數(shù)，至所有參數(shù)都穩(wěn)定，即80rpm、37°C、PH7.25、D0 60% (體積)。如此運(yùn)行1-3天，以鑒定培養(yǎng)罐安裝是否出錯(cuò)或者滅菌是否徹底。鑒定完后，再抽出罐內(nèi)所有液體，加入IOL的營養(yǎng)液，再次調(diào)整參數(shù)至穩(wěn)定。實(shí)施例2、細(xì)胞接種與培養(yǎng)取在轉(zhuǎn)瓶上培養(yǎng)了 48h的Marc-145細(xì)胞，消化后用營養(yǎng)液稀釋至接種瓶中，細(xì)胞數(shù)量約為3.9X109個(gè)。細(xì)胞接種至培養(yǎng)罐后，約15min細(xì)胞完全貼上載體，且在載體上的細(xì)胞密度約為6. 7X IO3個(gè)/cm2。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，控制培養(yǎng)罐的攪拌速度為80rpm，溫度為 37°C，PH值為7.25，D0為60%。根據(jù)定期取樣測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量(取出的樣品直接使用常規(guī)的葡萄糖濃度測定試劑盒測定其葡萄糖含量)，按每天的葡萄糖消耗量來判定細(xì)胞的生長情況，并更改營養(yǎng)液的灌注。Marc-145細(xì)胞接種到培養(yǎng)罐中后，培養(yǎng)96h，細(xì)胞數(shù)量增加到約2 X IO5個(gè)/cm2載體。細(xì)胞培養(yǎng)階段，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞每天的耗糖量也隨之增加。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到最大后，葡萄糖消耗量會(huì)處于一個(gè)穩(wěn)定期，如果繼續(xù)培養(yǎng)，葡萄糖消耗量會(huì)開始降低。為了保證細(xì)胞有足夠的營養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖含量低于1. 5g/L時(shí)，及時(shí)進(jìn)行營養(yǎng)液的灌注，從45h開始以4. 2L/d的速度進(jìn)行營養(yǎng)液的灌流。具體葡萄糖消耗的數(shù)值見圖1。實(shí)施例3、病毒接種與繁殖

當(dāng)葡萄糖消耗量達(dá)到最高的穩(wěn)定期時(shí)，即細(xì)胞密度已達(dá)到最大。細(xì)胞培養(yǎng)4天后，載體上細(xì)胞密度達(dá)到2X IO5個(gè)/cm2，接種NADC-JXA1株P(guān)RRSV第10代種毒200ml， MOI 0. 014。接毒后24h開始以循環(huán)灌流的方式收獲病毒液，定期取樣檢測病毒的TCID5Q。 通過定期取樣測定葡萄糖含量，來判定灌注維持液的速度。病毒TCID5tl的測定靜置培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，制備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，根據(jù)國家規(guī)程要求(參見中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程)的檢測方法來測定病毒樣品的TCID5tlt5從接毒后算起，收獲的病毒液分三部分(l)l_70h，約10L，病毒效價(jià)為 IO6.0TCID50AiL ； (2)70-185h，約 35L，病毒效價(jià)為 IO12.0TCID50AiL ； (3) 185_353h，約 10L，病毒效價(jià)小于104 8TCID5Q/mL。其中70_185h收獲的病毒液經(jīng)過無血清培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)試驗(yàn)(結(jié)果見表1)，結(jié)果表明，稀釋50倍后病毒效價(jià)仍高于國家標(biāo)準(zhǔn)(106_°TCID5(l/mL)，所以最后可以得到病毒液1770L。具體數(shù)值見圖2和圖3。收獲的病毒液中含有極低量的細(xì)胞碎片(肉眼沒有看見培養(yǎng)基變渾濁，取出的樣品在顯微鏡下觀察沒有看到細(xì)胞碎片或者其它雜質(zhì)，只有在培養(yǎng)至280小時(shí)時(shí)，才能看見培養(yǎng)基稍變渾濁，在顯微鏡下觀察也可以看見少許雜質(zhì)，50個(gè)/mL)，血清含量也是非常少 (只有0.01-0. 02%)，內(nèi)毒素也是彡10EU/ml，且不含有抗生素。可見本發(fā)明的方法進(jìn)一步提高了產(chǎn)品質(zhì)量。表1、病毒液稀釋試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)提供一生物反應(yīng)器，其中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；(2)在生物反應(yīng)器中加入營養(yǎng)液和病毒生產(chǎn)細(xì)胞，從而細(xì)胞貼于片狀載體，且在片狀載體上的細(xì)胞密度為5. 8X 103-7. 2X IO3個(gè)/cm2 ；培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細(xì)胞至片狀載體上的細(xì)胞密度為 1 X 105-5X 105 個(gè)/cm2 ；(3)在生物反應(yīng)器中加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(4)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞前，對生物反應(yīng)器進(jìn)行清洗和/或滅菌。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞前，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器運(yùn)行條件至 80 士 40rpm、37 士 2°C、PH7. 25 士 0. 3、溶氧率 60 士 10% (ν/ν)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病毒生產(chǎn)細(xì)胞是Marc-145細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的營養(yǎng)液是DMEM高糖培養(yǎng)基，其中以 8-10% (ν/ν)的比例加入牛血清。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的片狀載體是FibracelTMDiSkS，Ig= 1200-1500cm2。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)期間通過灌注法補(bǔ)充營養(yǎng)液或維持液。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，接種時(shí)，病毒感染復(fù)數(shù)為 0. 005-0. 5。
9.一種制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)提供一生物反應(yīng)器，其中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；(2)在生物反應(yīng)器中加入病毒生產(chǎn)細(xì)胞和培養(yǎng)基，從而細(xì)胞貼于片狀載體，且在片狀載體上的細(xì)胞密度為5. 8X 103-7. 2X IO3個(gè)/cm2 ；培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細(xì)胞至在片狀載體上的細(xì)胞密度為 1 X 105-5X 105 個(gè)/cm2 ；(3)在生物反應(yīng)器中接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(4)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液；(5)將收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液進(jìn)行滅活和乳化，從而獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗。
10.一種生物反應(yīng)器，其包括一生物反應(yīng)器本體，所述生物反應(yīng)器本體中包括固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體；一或多個(gè)位于生物反應(yīng)器本體或與生物反應(yīng)器本體相連接的加料口；一或多個(gè)位于生物反應(yīng)器本體或與生物反應(yīng)器本體相連接的出料口 ；以及一控制裝置，其用于調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器運(yùn)行條件至80士40rpm、37士2°C、PH7. 25士0. 3、溶氧率 60 士 10% (ν/ν) ο
全文摘要
本發(fā)明涉及超高密度大規(guī)模產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法及設(shè)備。本發(fā)明還涉及制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗的方法。本發(fā)明的方法采用固定床籃式攪拌系統(tǒng)以及片狀載體，優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，可獲得高密度的病毒生產(chǎn)細(xì)胞，從而獲得高滴度的病毒。
文檔編號C12M1/36GK102154220SQ20101061398
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者吳桃芬, 徐素珍, 李金華, 藍(lán)勝芝, 趙艷敏, 黃芳 申請人:浙江易邦生物技術(shù)有限公司