專利名稱：一種彎曲單孢菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海藻糖(Trehalose)是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1_糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，1832年由Wiggers首次將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來(lái)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)海藻糖廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲(chóng)、植物等。外源性的海藻糖同樣對(duì)生物體及生物大分子、生物膜具有良好的非特異性保護(hù)作用，它可以保護(hù)細(xì)胞免受由于環(huán)境變化，如脫水、高滲變化后造成的損害，具體表現(xiàn)為對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)和DNA等的有效保護(hù)，因此被譽(yù)為“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，過(guò)去主要是從干酵母中提取，由于含量低，提取過(guò)程較復(fù)雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)生物制品的活性保持的應(yīng)用，隨著人類社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，希望能將海藻糖應(yīng)用于日常生活所常用各類食品的鮮味保持與質(zhì)地改善，更好提高人們的生活和健康水平，因此必須要盡快地找到廉價(jià)而高效的海藻糖制造方法。海藻酮糖(Trehalulose)和異麥芽酮糖(lsomaltulose)都是蔗糖(sucrose)的異構(gòu)體，蔗糖是以α，α-1，2_糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖，海藻酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，1_糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖，異麥芽酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，6_糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖。海藻酮糖和異麥芽酮糖都是蔗糖的同分異構(gòu)體，但是它們的化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)有很大區(qū)別，異麥芽酮糖甜度為蔗糖的 42%，幾乎不吸水，一般認(rèn)為沒(méi)有吸水性，即使添加1. 5 15%的檸檬酸，其吸濕性也不會(huì)增加，因此這種不吸水和不發(fā)粘的特性非常適合用以生產(chǎn)需要干燥保存的食品和藥劑。與異麥芽酮糖不同的是海藻酮糖則具有很高的溶解度和吸水性，甜度是蔗糖的70%，在室溫的條件下其溶解度達(dá)到90%以上，其溶液幾乎不能被結(jié)晶，在容易析出結(jié)晶的溶液中只要添加少量的海藻酮糖就可以有效的減少溶液中的結(jié)晶析出。自然界中的海藻酮糖在蜂蜜中的含量最高，所以純的蜂蜜濃度高也不容易結(jié)晶。這種高吸水性和不易結(jié)晶的特性非常適合用以生產(chǎn)高級(jí)液體飲料、液體狀藥物制劑以及化妝品等。但是自然界中的海藻酮糖和海藻糖同樣都是含量很低的糖，即使在含量最高的蜂蜜含量也在以下，而且由于海藻酮糖的高吸水性和不易結(jié)晶的特性，使得其分離純化十分困難，所以需要找到可以生產(chǎn)更高純度海藻酮糖糖漿的制備方法。目前已經(jīng)在多種微生物中分離到多種不同類型的海藻糖合成酶及其相關(guān)的基因，目前發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成相關(guān)酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途徑可以分為三種途徑，第一種途徑是海藻糖磷酸化酶合成途徑，主要由徑6-磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase)禾口 6_ 憐酸海藻糖酉旨 (Trehalose-6-phosphate phosphatase)組成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成 6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脫磷酸后得到海藻糖；第二種途徑是麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成途徑，主要是由麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen， MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)組成，先由麥芽寡糖基海藻糖合成酶以麥芽糊精(Maltodextrin)為底物，通過(guò)分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用把麥芽糊精末端的兩個(gè)葡萄糖分子間的α，α_1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)變成α， α-1，1糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麥芽寡糖基海藻糖在麥芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下從麥芽寡糖基海藻糖分子上水解下一個(gè)海藻糖分子，而原來(lái)的麥芽糊精則轉(zhuǎn)變?yōu)闇p少了兩個(gè)葡萄糖基的新寡糖，并可作為新的底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)就可以將麥芽糊精轉(zhuǎn)化成海藻糖；第三種途徑是海藻糖合成酶途徑，與其它海藻糖合成途徑不同是這種途徑只有一種酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, Tre S)組成，它作用的底物是麥芽糖(Maltose)，通過(guò)催化麥芽糖分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基，將α， α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖轉(zhuǎn)化為α，α_1，1糖苷鍵，麥芽糖轉(zhuǎn)變成海藻糖。第一種途徑需要用到價(jià)格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖為底物來(lái)生產(chǎn)海藻糖， 在生產(chǎn)成本很難產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，第二種和第三種途徑是以淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糊精或者麥芽糖為底物生產(chǎn)海藻糖，具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，第三種途徑和第二種途徑相比，第三種途徑只需要一種酶，在利用基因工程菌生產(chǎn)重組酶，由于不用生產(chǎn)兩種酶，不需要考慮兩種的反應(yīng)條件是否一致，因此在生產(chǎn)過(guò)程中設(shè)備的占用率會(huì)更低，生產(chǎn)工藝會(huì)更簡(jiǎn)單，因而具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。蔗糖的純度可以達(dá)到99%以上，是最適合制備海藻酮糖的底物，產(chǎn)物可以直接應(yīng)用于食品和醫(yī)藥。目前文獻(xiàn)公開(kāi)報(bào)道能轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻酮糖的酶主要有三種類型，一種是蔗糖異構(gòu)酶也稱α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到90%，但它轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物是海藻酮糖和異麥芽酮糖等比例的混合糖漿；第二種是海藻糖酮糖合成酶，它能轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻酮糖，蔗糖轉(zhuǎn)化率可以達(dá)70%以上，但一般反應(yīng)速度較慢，但這類酶不能以麥芽糖為底物生成海藻糖；第三種能轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻酮糖就是海藻糖合成酶，有研究發(fā)現(xiàn)某些海藻糖合成酶能以蔗糖為底物生成海藻酮糖，但是目前報(bào)道能轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻酮的海藻糖合成酶以蔗糖為底物時(shí)糖蔗糖的轉(zhuǎn)化率都較低，一般都低于5%。目前已有不少文獻(xiàn)和專利報(bào)道了海藻糖合成相關(guān)基因的克隆和分離，以及這些海藻糖合成酶基因的相關(guān)酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成相關(guān)酶的合成途徑不同，或者菌種來(lái)源不同，導(dǎo)致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚遠(yuǎn)，酶學(xué)特性與酶活力不同，而且大部分還沒(méi)有得到工業(yè)規(guī)?；膽?yīng)用。關(guān)于海藻酮糖合成酶基因在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，關(guān)于海藻酮糖合成酶的應(yīng)用和海藻酮糖生產(chǎn)的專利也還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明人利用生物信息手段對(duì)GenBank中龐大的DNA序列和氨基酸序列資源進(jìn)行同源性檢索分析，對(duì)已經(jīng)完成序列分析的上千種微生物的DNA序列進(jìn)行大量核酸序列進(jìn)行分析和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測(cè)是某功能蛋白質(zhì)”的極為有用基因，推測(cè)該序列的功能，找到候選基因序列，然后進(jìn)行功能鑒定實(shí)驗(yàn)，最終確定基因的功能和性質(zhì)，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶基因(treS)，并用這種合成酶基因經(jīng)過(guò)克隆和進(jìn)行重組表達(dá)，再利用重組表達(dá)的海藻糖合成酶用于轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖。本發(fā)明人在研究海藻糖合成酶基因的過(guò)程中，對(duì)一種中文名稱為彎曲高溫單孢菌，拉丁名為Thermomonospora curvata的基因組序列進(jìn)行同源檢索分析，發(fā)現(xiàn)這一段尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其功能的DNA序列，這段DNA序列在Genbank中被注釋為“假定的海藻糖合成酶基因，，(putative trehalose synthase)。彎曲高溫單抱菌(Thermomonospora curvata) 是一種嗜熱菌，通?？梢栽诟邷囟逊手心芊蛛x到，具有分解纖維素的能力，生長(zhǎng)溫度范圍廣泛，可以在的溫度下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為50°C，這種生長(zhǎng)溫度范圍廣泛特性可能與海藻糖合成酶基因的有關(guān)。經(jīng)過(guò)分析這段DNA與已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有較高的同源性，同源性達(dá)到70%以上，而其編碼的假定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有較高同源性，氨基酸同源性達(dá)到80%以上，所以很難通過(guò)氨基酸序列確定其為何種酶，必須要經(jīng)過(guò)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定這段基因的功能，確認(rèn)其是什么酶，目前也還沒(méi)有該基因功能的實(shí)驗(yàn)鑒定相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因克隆自彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)，該菌種可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買，也可以通過(guò)野外采集和其他途徑獲得。彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量約為69. 35kD2、等電點(diǎn)約為PI = 4. 73、酶的最適反應(yīng)溫度為；35 45°C4、酶的反應(yīng)的pH在6. 0 7. 5，優(yōu)選pH為6. 5 7. 05、當(dāng)Ni2+，F(xiàn)e3+, Mn2+，Mg2+，Ca2+等金屬離子的濃度在5m mol/L時(shí)，該酶的活力不受影響，但狗2+，&12+，012+金屬離子在5m mol/L的濃度時(shí)會(huì)對(duì)該酶的活力產(chǎn)生一定的抑制，只剩有85%左右的活力。6、酶達(dá)到一定濃度后，反應(yīng)產(chǎn)物中海藻糖含量達(dá)到最高，繼續(xù)添加過(guò)量的酶會(huì)降低海藻糖的含量，而副產(chǎn)物葡萄糖的含量會(huì)升高。7、該海藻糖合成酶能以蔗糖為底物生成海藻糖酮糖，反應(yīng)速度較以麥芽糖為底物慢，但反應(yīng)時(shí)間超過(guò)M個(gè)小時(shí)后，反應(yīng)產(chǎn)物中海藻酮糖的含量達(dá)到83%以上。本發(fā)明人所采用的實(shí)驗(yàn)方法，包括眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)；DNA的提取、酶切、連接等DNA分子操作技術(shù)，把這一段標(biāo)記為假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列連接到表達(dá)載體上，如PSE380等表達(dá)質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎，例如利用溶菌酶、超聲波或機(jī)械碾磨法等破碎細(xì)胞后，獲得該基因表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行研究，確定其功能和酶學(xué)特性，證實(shí)了這一 DNA片段編碼的是一種特性特征與前人發(fā)現(xiàn)的完全不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最適反應(yīng)溫度和最適PH不同，反應(yīng)條件不同，酶對(duì)底物得特異性以及對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖比例的差異等特性，因此判定是一種新的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因克隆自彎曲高溫單孢菌(Thermomonosporacurvata)，該酶在天然的彎曲高溫單孢菌中是一種胞內(nèi)酶，需要用細(xì)胞破碎的方法才能檢查到；而且在天然菌中該酶的含量也非常低，需要將培養(yǎng)液濃縮1000倍濃縮以上才能檢驗(yàn)到海藻糖合成酶的活力，無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。應(yīng)用基因工程菌來(lái)表達(dá)本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高數(shù)千倍，可以用于海藻糖和海藻酮糖的生產(chǎn)。編碼本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段未確定功能的DNA片段，長(zhǎng)度為1803個(gè)堿基對(duì)，編碼601個(gè)氨基酸，GC含量為68%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的優(yōu)勢(shì)1、同樣具有轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的功能，但屬于分子量較小的一類海藻糖合成酶，分子量與日本林原研究所專利報(bào)道的來(lái)自Pimerlobacter sp. R48的海藻糖合成酶，與中國(guó)專利專利號(hào)為ZL200410013007. 3的報(bào)道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶相差不大，但是比日本林原研究所報(bào)道的來(lái)自水棲嗜熱菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶少 363個(gè)氨基酸，比中國(guó)專利號(hào)為ZL200410073883. 5報(bào)道的騰沖嗜熱厭氧菌的海藻糖合成酶少了 179個(gè)氨基酸。小分子量的蛋白酶更加容易通過(guò)基因重組與表達(dá)技術(shù)來(lái)進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)，因而更有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。2、酶的最適反應(yīng)溫度為35 45°C，是適中的最適反應(yīng)溫度，與中國(guó)專利專利號(hào)為 ZL00710100350.5的報(bào)道的一種海藻糖合成酶及其應(yīng)用的最適反應(yīng)溫度是20°C，與中國(guó)專利專利號(hào)為ZL200410013007. 3的報(bào)道的Hiermobifida fusca海藻糖合成酶的最適反應(yīng)溫度是25-30°C，與中國(guó)專利號(hào)為ZL200410073883. 5報(bào)道的一種熱穩(wěn)定海藻糖合成酶及其編碼基因與應(yīng)用的最適合反應(yīng)溫度60-70°C相比。在底物轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速度基本相同的條件下，在35 45°C較溫和的反應(yīng)條件下，在生產(chǎn)上不需要過(guò)度升溫或者降溫來(lái)保持生產(chǎn)設(shè)備的溫度，在節(jié)約能源上有優(yōu)勢(shì)。3、具有對(duì)兩種底物高效的轉(zhuǎn)化能力，不僅能轉(zhuǎn)化麥芽糖生成70%以上的海藻糖， 還能以蔗糖為底物生成80%以上海藻酮糖，這樣就可以同時(shí)以麥芽糖和蔗糖為反應(yīng)底物， 反應(yīng)產(chǎn)物中就會(huì)得到以海藻糖和海藻糖酮糖為主要成分的并同時(shí)還含有麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的混合糖漿，這種糖漿可以再進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)糖苷酶進(jìn)行反應(yīng)，就可生產(chǎn)得到含有麥芽糖三糖、異麥芽三糖、潘糖、海藻糖葡萄糖三糖、海藻糖果糖三糖、海藻酮糖葡萄糖三糖和海藻酮糖果糖三糖等多種三糖混合物糖漿?；旌瞎烟潜葐我坏墓烟蔷哂懈鼜?qiáng)的保健作用，這種多種三糖的混合糖漿也稱為人造蜂蜜，如果用兩種酶來(lái)制備混合糖漿就要考慮兩種酶不同的反應(yīng)條件。


圖1為海藻糖合成酶以麥芽糖為底物的反應(yīng)產(chǎn)物分析。圖2為海藻糖合成酶以蔗糖為底物的反應(yīng)產(chǎn)物分析。圖3為海藻糖合成酶的最適反應(yīng)pH值得分析。圖4為海藻糖合成酶的最適反應(yīng)溫度值的測(cè)定。圖5為金屬離子對(duì)海藻糖合成酶酶活影響的測(cè)定。圖6為海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)產(chǎn)物中各種糖含量變化分析。
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圖7為添加不同酶量對(duì)海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖的反應(yīng)產(chǎn)物中各糖含量變化分析。圖8為海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化蔗糖反應(yīng)不同時(shí)間的產(chǎn)物中各糖含量變化分析。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例所述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容，但并不僅僅限于這些內(nèi)容，有些對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的擴(kuò)展內(nèi)容雖然并未在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中出現(xiàn)，但也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利請(qǐng)求范圍。1、彎曲高溫單孢菌的培養(yǎng)彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata，菌株編號(hào)為41067)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買，接種于以下培養(yǎng)基(克/升)葡萄糖4. O克，酵母提取物10克， 麥芽提取物10克L，用KOH調(diào)pH至7. 2，然后在50 55°C恒溫?fù)u床上振蕩48小時(shí)，用于總 DNA的提取。2、彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因的克隆、表達(dá)及粗酶的制備根據(jù)Genbank中公布的Hiermomonospora curvata基因序列中注釋為可能為海藻糖合成酶基因的序列，命名為Tct，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增該基因并連接到表達(dá)載體上然后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，設(shè)計(jì)引物如下上游引物(Senseprimer) 5' -CTGCC ATGGAGATGACCGGGGACCCC‘下游引物(AntisensePrimer) 5' -TCA AAGCTT TCACTTCGCCGTCTGCCG-3‘上下游引物的5 ‘端分別設(shè)計(jì)了的Nco 1和Hind III酶切位點(diǎn)，用于將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體PSE380上，用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增可能為海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Tct，擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒純化回收目的擴(kuò)增片段，然后利用Nco 1和Hind III進(jìn)行雙酶切，與同樣利用Nco 1和Hind III進(jìn)行雙酶切的表達(dá)載體PSE380進(jìn)行連接，然后經(jīng)過(guò)篩選驗(yàn)證得到Tct基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pSE380-Tct，然后用于表達(dá)制備海藻糖合成酶。把重組的表達(dá)質(zhì)粒pSE380_Tct轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)，當(dāng)0D600達(dá)到0. 8左右時(shí)，加入IPTG 使其終濃度達(dá)到lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)20h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進(jìn)行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為粗酶液，可用于轉(zhuǎn)化麥芽糖的試驗(yàn)。3、彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖產(chǎn)物的分析利用高效液相色譜儀(HPLC)來(lái)進(jìn)行海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖和蔗糖后產(chǎn)物的分析，分析條件，色譜柱Alltima Amino IOOA 5u 柱(4. 6mmX250mm)；檢測(cè)器A1 Itech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；流動(dòng)相70%乙腈/30% H2O ；流速lmL/min，柱溫;35°C。(1)麥芽糖為底物的反應(yīng)產(chǎn)物分析取pH6. 5的10%麥芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液，37°C進(jìn)行反應(yīng)，然后用HPLC進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分析，結(jié)果見(jiàn)圖1，與海藻糖標(biāo)樣相比，麥芽糖反應(yīng)樣圖ID出現(xiàn)目的產(chǎn)物峰，表明以麥芽糖為底物反應(yīng)能生成海藻糖，反應(yīng)產(chǎn)物有葡萄糖生成和未轉(zhuǎn)化的麥芽糖。(2)蔗糖為底物的反應(yīng)產(chǎn)物分析
取pH6. 5的10%蔗糖底物96 μ L+4 μ L酶液，37°C進(jìn)行反應(yīng)，然后用HPLC進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，與海藻酮糖的標(biāo)樣相比，蔗糖反應(yīng)樣圖2D出現(xiàn)目的產(chǎn)物峰，表明以蔗糖為底物反應(yīng)產(chǎn)物中能生成海藻酮糖，反應(yīng)產(chǎn)物中還有葡萄糖和果糖的生成，以及未轉(zhuǎn)化的蔗糖。(3)最適反應(yīng)pH值的分析 分別取96 μ L用不同pH的磷酸鹽緩沖液配制10%的麥芽糖底物+4 μ L的酶液(蛋白含量達(dá)4yg)，在37°C反應(yīng)lh，然后用HPLC分析反應(yīng)的產(chǎn)物組分，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖含量來(lái)代表酶活力。不同PH對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖3所示，表明酶的最適反應(yīng)pH在 6. 0 7. 5。(4)最適反應(yīng)溫度測(cè)定取pH6. 5的10%麥芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)4 μ g)，在不同的反應(yīng)溫下保溫反應(yīng)lh，然后用HPLC分析反應(yīng)的產(chǎn)物組分，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖百分含量來(lái)代表酶活力。不同溫度對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖4所示，表明酶的最適反應(yīng)溫度為35 45°C。(5)金屬離子對(duì)酶活的影響取pH6. 5的10 %麥芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)4 μ g)+10 μ L金屬離子(使金屬離子終濃度為5mmol/L)，在37°C下反應(yīng)lh，按底物的消耗量來(lái)反映酶活力的變化，以加磷酸鹽緩沖液的酶活力為100%，不同金屬離子對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖5所示， 表明在5m mol/L的濃度的條件下，Ni2+, Fe3+, Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價(jià)金屬離子對(duì)該酶的活力沒(méi)有抑制作用，F(xiàn)e2+, Zn2+, Cu2+對(duì)該酶的活力有部分抑制作用，損失15%左右的酶活力。(6)不同反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)物中各種糖含量變化取96 μ L的10 %麥芽糖底物(ρΗ6. 5) +4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)4 μ g)，在37 °C下反應(yīng)不同的時(shí)間，然后分析反應(yīng)產(chǎn)物中各種糖的含量，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖含量高低來(lái)表示酶的最適合反應(yīng)時(shí)間。不同時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中各種糖含量的影響結(jié)果如圖6所示，表明以 10%麥芽糖為底物反應(yīng)100分鐘左右海藻糖含量就可以達(dá)到最高，含量可以達(dá)到70%以上。(7)不同酶量，反應(yīng)1小時(shí)后產(chǎn)物中各糖含量用IOOmM的磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)配制1 %的麥芽糖底物，反應(yīng)體積為 IOOul (80ul底物+不同的酶量+緩沖液)在37°C下反應(yīng)Ih,煮沸5min,離心，用HPLC測(cè)定反應(yīng)后各糖的含量變化，結(jié)果如圖7。表明添加酶達(dá)到一定濃度后，反應(yīng)產(chǎn)物中海藻糖含量達(dá)到最高，繼續(xù)添加過(guò)量的酶會(huì)降低海藻糖的含量，葡萄糖副產(chǎn)物會(huì)增加。(8)以蔗糖為底物反應(yīng)不同時(shí)間產(chǎn)物中各糖含量以蔗糖為底物pH6.5，35°C反應(yīng)不同的時(shí)間，分析產(chǎn)物中各糖含量結(jié)果見(jiàn)圖8，結(jié)果表明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中海藻酮糖的含量會(huì)提高，可以達(dá)到80%以上。4、從麥芽糖漿制備海藻糖取市售以淀粉制備麥芽糖含量約為70 %的麥芽糖漿，用5mM，pH為6. 5磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液配制成含30%麥芽糖的反應(yīng)底物(pH為6. 5左右)，取100升配制好的反應(yīng)底物放置于不銹鋼反應(yīng)罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液 10升，加入到100升含30%麥芽糖的反應(yīng)底物中，然后在37°C條件下反應(yīng)M小時(shí)，然后用 HPLC對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如表1
表1 :30%麥芽糖底物反應(yīng)M小時(shí)后反應(yīng)液中各組分含量(％ )
權(quán)利要求
1.一種彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其分子量為 69. 35kD，等電點(diǎn)為PI = 4. 7，酶的適合反應(yīng)溫度為35 45°C，酶的適合反應(yīng)pH在6. 0 7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶，其具有將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖或?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化生成海藻酮糖的能力。
5.權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶在轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖或者海藻酮糖中的應(yīng)用， 其特征在于，包括以下步驟1)將海藻糖合成酶基因構(gòu)建基因工程菌進(jìn)行藻糖合成酶的高效表達(dá)；2)收集制備重組的海藻糖合成酶；3)以麥芽糖或者淀粉制備的麥芽糖漿為原料用海藻糖合成酶制造海藻糖，或者以蔗糖為原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。
全文摘要
一種彎曲高溫單孢菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用，該基因克隆自彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)，它表達(dá)的海藻糖合成酶具有兩種不同的轉(zhuǎn)化功能，該酶在正常的生化反應(yīng)條件下可以將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖，也能將蔗糖轉(zhuǎn)化生成海藻酮糖。該基因可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖，也可以用于轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)海藻酮糖。這種海藻糖和海藻酮糖都可應(yīng)用于食品工業(yè)、飲料和功能性食品、美容化妝品、醫(yī)藥生物制品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102154327SQ20101061483
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者杜麗琴, 梁甲元, 韋宇拓, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)