專利名稱：一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及通過 檢測NADH生成量檢測唾液酸含量的方法，及根據(jù)該方法制備的單試劑或雙試劑液體試劑盒。
背景技術(shù)：
唾液酸(Sialic acid, SA)是多種天然神經(jīng)氨酸衍生物之一，其母體結(jié)構(gòu)是九個碳 原子組成的內(nèi)環(huán)氨基酸，是一族化合物的總稱，化學(xué)名稱為N-乙酰神經(jīng)氨酸。它由于最初 從頌下腺粘蛋白中分離而出而得名。唾液酸分布于哺乳動物體內(nèi)，血管內(nèi)皮細胞內(nèi)含量尤其豐富。血清總唾液酸 (total sialic acid，TSA)含量約為1. 5 2. 5mmol/L，包括游離唾液酸和結(jié)合唾液酸。游 離唾液酸的含量較低，約為1 3umol/L ；與脂蛋白和糖蛋白結(jié)合的唾液酸為結(jié)合唾液酸， 主要以唾液酸鹽的形式存在。唾液酸位于糖蛋白、糖脂的寡糖鏈的末端，與細胞識別、分化 以及黏附有關(guān)，參與受體組成，并誘導(dǎo)細胞增殖、死亡。正常代謝時，血清的唾液酸含量穩(wěn)定，當組織細胞惡變時，細胞表面糖蛋白在結(jié)構(gòu) 和功能上均發(fā)生明顯改變，結(jié)合在糖蛋白上的唾液酸隨異常表達的糖蛋白脫落入血，是血 液中唾液酸升高的可能原因。許多研究發(fā)現(xiàn)帶瘤動物及腫瘤患者的瘤體及血液中SA含量增加并隨病情的加重 而升高，隨著病情的緩解而降低，因此SA被作為惡性腫瘤存在和發(fā)展監(jiān)控的一個指標，并 且廣泛的應(yīng)用于很多腫瘤的診斷和監(jiān)控中。除此之外，唾液酸含量檢測也可應(yīng)用在食品安 全和健康領(lǐng)域，如燕窩、奶粉中的唾液酸含量檢測。檢測總唾液酸含量的方法有很多，例如HPLC、酶法、化學(xué)比色法(常見的有硫代巴 比妥酸法、間苯二酚法)。HPLC方法具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點，但是儀器昂貴且不適 合臨床批量檢測?；瘜W(xué)比色法雖然價格較低，但是特異性低，操作復(fù)雜繁瑣，需要高溫萃取， 不適合自動化分析，其試劑成分具有一定的腐蝕性和人體危害性。酶分析法具有特異性高， 操作簡單快捷、準確安全、可自動化分析的優(yōu)點。酶法中常用的是神經(jīng)氨酸醛縮酶斷裂結(jié) 合唾液酸的糖苷鍵，產(chǎn)生游離的N-乙酰神經(jīng)氨酸，N-乙酰神經(jīng)氨酸在神經(jīng)氨酸苷酶的作用 下生成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸與NADH在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸和NAD，NADH在 340nm有特異性吸收，通過檢測NADH的減少量來檢測樣本中的總唾液酸。該方法穩(wěn)定周期 短，大多為干粉試劑，由于以往自動生化分析儀未普及，試劑用量大、干粉復(fù)溶后穩(wěn)定時間 短、適用機型少，導(dǎo)致用戶適用成本高、無法滿足臨床檢測需求。因此，臨床上依然存在對方 便適用、成本低廉、穩(wěn)定可靠的SA含量檢測的試劑盒及檢測方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種方便適用、成本低廉、穩(wěn)定可靠的SA含量 檢測的試劑盒及檢測方法。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法，其包括以下步 驟a)向樣品中加入神經(jīng)氨酸醛縮酶，使樣品中的結(jié)合唾液酸在神經(jīng)氨酸醛縮酶的催 化下生成N-乙酰神經(jīng)氨酸；b)向步驟a)的混合物中加入神經(jīng)氨酸苷酶，使N-乙酰神經(jīng)氨酸在神經(jīng)氨酸苷酶 催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰甘露糖胺和丙酮酸；C)向步驟b)的混合物中加入甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD，使N-乙酰甘露 糖胺和氧化型輔酶NAD在甘露糖胺脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰甘露糖內(nèi)酯、NADH和氫 離子，d)檢測NADH的生成量對唾液酸進行定量，優(yōu)選地，所述樣品為血清樣品，優(yōu)選地，所述甘露糖胺脫氫酶為N-?；事短前?1-脫氫酶，優(yōu)選地，檢測NADH生成量的方法為分光光度法。優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸醛縮酶、 神經(jīng)氨酸苷酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD同時加入到樣品中，或者將神經(jīng)氨酸醛縮 酶和甘露糖胺脫氫酶以及神經(jīng)氨酸苷酶和氧化型輔酶NAD先后加入到樣品中。優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸苷酶的用量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/ L ；優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸醛縮酶的用量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L ；優(yōu) 選地，所述氧化型輔酶NAD的用量為0. 02-5mmol/L，更優(yōu)選0. 05-2mmol/L，最優(yōu)選0. Immol/ L ；優(yōu)選地，所述甘露糖胺脫氫酶的用量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L。本發(fā)明的第二方面涉及一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其包括
神經(jīng)氨酸苷酶0.1-100KU/L,
神經(jīng)氨酸醛縮酶0.1-100KU/L,
氧化型輔酶NAD0.01-10mmol/L,
甘露糖胺脫氫酶0.1-100KU/L,
緩沖液l-500mmol/L,
保護劑0. 01-10%,
防腐劑0. 01-10%,
其中所述百分比為]重量體積比。
優(yōu)選地，所述試劑羞 為單試劑液體試劑盒或為由試劑ι和試劑2組成的液體雙試
劑試劑盒，其中試劑1由緩沖液，神經(jīng)氨酸苷酶，氧化型輔酶NAD組成，試劑2由緩沖液，神 經(jīng)氨酸醛縮酶，N-酰基甘露糖胺1-脫氫酶組成，防腐劑和保護劑存在于試劑1或試劑2中， 或同時存在于試劑1和試劑2中。優(yōu)選地，試劑1和試劑2的體積比在2-6范圍內(nèi)。優(yōu)選 地，所述緩沖液選自PH3-11范圍內(nèi)的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、檸檬 酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、MES緩沖液、Good’ s緩沖液或硼酸緩沖 液中的一種或多種。優(yōu)選地，所述防腐劑選自山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、PC300 中的一種或多種。優(yōu)選地，所述保護劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇 中的一種或多種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括表面活性劑，優(yōu)選地，所述表面活性劑為非離 子表面活性劑，更優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑選自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列。
優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸苷酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/ L ；優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸醛縮酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L ；優(yōu)選地，所述氧化型輔酶NAD的含量為0. 02-5mmol/L，更優(yōu)選0. 05-2mmol/L，最優(yōu)選0. Immol/ L ；優(yōu)選地，所述甘露糖胺脫氫酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L ； 優(yōu)選地，所述緩沖液的濃度為25-300mmol/L，更優(yōu)選50-200mmol/L，最優(yōu)選100mmol/L ； 優(yōu)選地，所述保護劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優(yōu)選0. 03-1 %重量體積比，最優(yōu)選 0. 05%重量體積比；優(yōu)選地，所述防腐劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優(yōu)選0. 03-1% 重量體積比，最優(yōu)選0. 05 %重量體積比。最優(yōu)選地，所述試劑盒為單試劑液體試劑盒，其由下述成分組成神經(jīng)氨酸苷酶50KU/L，神經(jīng)氨酸醛縮酶50KU/L，氧化型輔酶NAD0. lmmol/L,甘露糖胺脫氫酶50KU/L，MES 緩沖液100mmol/L，聚乙二醇0.05%，疊氮鈉0.05%，試劑pH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比；或所述試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，其成分如下試劑1成分及濃度如下神經(jīng)氨酸苷酶80KU/L，氧化型輔酶NAD4mmol/L,HEPES 緩沖液1 OOmmol/L，聚乙二醇0.1%，苯甲酸鈉0.1%，試劑1的pH為6. 5，，其中所述百分比為重量體積比，試劑2成分及濃度如下神經(jīng)氨酸醛縮酶10KU/L，甘露糖胺脫氫酶60KU/L，HEPES 緩沖液400mmol/L，丙三醇5%，疊氮鈉0.1%，試劑2的pH為7. 2，其中所述百分比為重量體積比。換言之，發(fā)明人通過對現(xiàn)有酶法檢測唾液酸含量的方法和試劑盒的試劑主要成 分神經(jīng)氨酸苷酶、神經(jīng)氨酸醛縮酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD的特性進行仔細研 究發(fā)現(xiàn)，進口干粉試劑成本過高的主要原因是當時試劑的系統(tǒng)設(shè)計無法滿足反應(yīng)得最佳條 件，主要表現(xiàn)在①反應(yīng)關(guān)鍵工具酶神經(jīng)氨酸苷酶與神經(jīng)氨酸醛縮酶在該反應(yīng)條件下活性 只有最佳狀態(tài)的50%左右，而且這兩個工具酶的價格十分昂貴，致使試劑成本過高；②試 劑中使用的還原性輔酶NADH在該反應(yīng)條件下不穩(wěn)定，必須制成干粉試劑才能達到長期保 存穩(wěn)定，復(fù)溶后必須盡快使用，否則在保存過程中由于NADH降解速度較快對試劑性能會造 成很大影響；③由于進口干粉試劑都是大包裝，中小用戶復(fù)溶后如不及時用完，造成試劑浪 費，在很大程度上增加了檢測成本。
因此，為了改進現(xiàn)有酶法檢測唾液酸方法和試劑盒的缺點，探尋一種穩(wěn)定的酶法 測定唾液酸方法和液體試劑盒，發(fā)明人更改了試劑反應(yīng)原理，把不穩(wěn)定的NADH換為穩(wěn)定的 NAD來進行檢測；該液體試劑可為單試劑，也可為雙試劑。所述單試劑包括 優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸苷酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/ L ；優(yōu)選地，所述神經(jīng)氨酸醛縮酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L ；優(yōu) 選地，所述氧化型輔酶NAD的含量為0. 02-5mmol/L，更優(yōu)選0. 05-2mmol/L，最優(yōu)選0. Immol/ L ；優(yōu)選地，所述甘露糖胺脫氫酶的含量為10-80KU/L，更優(yōu)選30-60KU/L，最優(yōu)選50KU/L ； 優(yōu)選地，所述緩沖液的濃度為25-300mmol/L，更優(yōu)選50-200mmol/L，最優(yōu)選100mmol/L ； 優(yōu)選地，所述保護劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優(yōu)選0. 03-1 %重量體積比，最優(yōu)選 0. 05%重量體積比；優(yōu)選地，所述防腐劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優(yōu)選0. 03-1% 重量體積比，最優(yōu)選0. 05 %重量體積比。
神經(jīng)氨酸醛縮酶 甘露糖胺脫氫酶 緩沖液 保護劑 防腐劑
本發(fā)明的試劑盒與現(xiàn)有的通過檢測NADH減少量而檢測唾液酸含量的試劑盒相 比，其數(shù)據(jù)擬合度很高，而本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性則優(yōu)于現(xiàn)有的通過檢測NADH減少量而檢 測唾液酸含量的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可以用于腫瘤篩查、腫瘤治療、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測或唾液 酸檢測。


圖1 顯示了本發(fā)明試劑盒與使用乳酸脫氫酶方法的試劑盒的相關(guān)性研究結(jié)果。圖2 顯示了本發(fā)明試劑盒與使用乳酸脫氫酶的試劑盒的37°C加速穩(wěn)定性研究結(jié)
果 ο圖3 顯示了實施例3和實施例4的試劑盒之間的相關(guān)性研究結(jié)果。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。實施例實施例1采用單試劑的SA檢測試劑盒該試劑盒的試劑采用單試劑，試劑成分及濃度如下神經(jīng)氨酸苷酶50KU/L神經(jīng)氨酸醛縮酶50KU/L氧化型輔酶NAD0. lmmol/L甘露糖胺脫氫酶50KU/LMES 緩沖液IOOmmol/L聚乙二醇0.05%疊氮鈉0.05%試劑pH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比。單試劑使用方法如下表1 單試劑的使用方法
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法，其包括以下步驟a)向樣品中加入神經(jīng)氨酸醛縮酶，使樣品中的結(jié)合唾液酸在神經(jīng)氨酸醛縮酶的催化下 生成N-乙酰神經(jīng)氨酸；b)向步驟a)的混合物中加入神經(jīng)氨酸苷酶，使N-乙酰神經(jīng)氨酸在神經(jīng)氨酸苷酶催化 下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰甘露糖胺和丙酮酸；c)向步驟b)的混合物中加入甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD，使N-乙酰甘露糖胺 和氧化型輔酶NAD在甘露糖胺脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰甘露糖內(nèi)酯、NADH和氫離子，d)檢測NADH的生成量對唾液酸進行定量，優(yōu)選地，所述樣品為血清樣品，優(yōu)選地，所述甘露糖胺脫氫酶為N-?；事短前?-脫 氫酶，優(yōu)選地，檢測NADH生成量的方法為分光光度法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法，其特征在于所述神經(jīng)氨酸醛 縮酶、神經(jīng)氨酸苷酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD同時加入到樣品中，或者將神經(jīng)氨 酸醛縮酶和甘露糖胺脫氫酶以及神經(jīng)氨酸苷酶和氧化型輔酶NAD先后加入到樣品中。
3.一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其包括神經(jīng)氨酸苷酶 神經(jīng)氨酸醛縮酶 氧化型輔酶NAD 甘露糖胺脫氫酶 緩沖液 保護劑 防腐劑0.1-100KU/L, 0.1-100KU/L, 0.01-10mmol/L, 0.1-100KU/L, l-500mmol/L, 0. 01-10%, 0. 01-10%,其中所述百分比為重量體積比。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于其為由試劑1 和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，試劑1由緩沖液，神經(jīng)氨酸苷酶，氧化型輔酶NAD組成， 試劑2由緩沖液，神經(jīng)氨酸醛縮酶，N-?；事短前?-脫氫酶組成，防腐劑和保護劑存在 于試劑1或試劑2中，或同時存在于試劑1和試劑2中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于試劑1和試劑 2的體積比在2-6范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于 所述緩沖液選自PH3-11范圍內(nèi)的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、檸檬 酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、MES緩沖液、Good’ s緩沖液或硼酸緩沖 液中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于所 述防腐劑選自山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、PC300中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7任一項所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于所 述保護劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8任一項所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于所 述試劑盒還包括表面活性劑，優(yōu)選地，所述表面活性劑為非離子表面活性劑，更優(yōu)選地，所 述非離子表面活性劑選自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至9任一項所述的穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特征在于所 述試劑盒為單試劑液體試劑盒，其由下述成分組成神經(jīng)氨酸苷酶 神經(jīng)氨酸醛縮酶 氧化型輔酶NAD 甘露糖胺脫氫酶 MES緩沖液 聚乙二醇 疊氮鈉、50KU/L, 50KU/L,、0.lmmol/L, 50KU/L, 1OOmmo1/L, 0. 05%, 0. 05%,試劑PH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比；或所述試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，其成分如下 試劑1成分及濃度如下神經(jīng)氨酸苷酶 氧化型輔酶NAD HEPES緩沖液聚乙二醇 苯甲酸鈉、80KU/L, 4mmol/L, IOOmmo1/L, 0. 1%, 0. 1%,試劑1的PH為6. 5，，其中所述百分比為重量體積比， 試劑2成分及濃度如下神經(jīng)氨酸醛縮酶 甘露糖胺脫氫酶 HEPES緩沖液丙三醇 疊氮鈉試劑2的pH為7,、10KU/L, 60KU/L, 400mmol/L, 5%, 0. 1%,、2，其中所述百分比為重量體積比,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒。具體而言，本發(fā)明的方法為結(jié)合唾液酸在神經(jīng)氨酸醛縮酶催化下生成N-乙酰神經(jīng)氨酸，后者在神經(jīng)氨酸苷酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰甘露糖胺，該產(chǎn)物與甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD反應(yīng)生成NADH，通過檢測NADH生成量測得唾液酸含量。本發(fā)明也涉及根據(jù)該方法制備的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒使用方便快捷，無需溶解液復(fù)溶，長期穩(wěn)定，瓶間變異小，適用于各類生化分析儀，避免二次污染，簡化生產(chǎn)工藝方法。
文檔編號C12Q1/25GK102072953SQ20101061521
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉希, 劉瑤, 杜愛銘 申請人:北京九強生物技術(shù)有限公司