專利名稱：與水稻粒重相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，世界上接近50%的人口以水稻為食，不斷提高水稻產(chǎn)量是人類不斷追求的目標(biāo)。研究表明影響水稻產(chǎn)量的構(gòu)成要素主要有三個(gè)分蘗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重。粒重作為影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一漸漸受到人們的廣泛重視。水稻在自然演化及人工馴化的過程中，不斷滿足了人類糧食需求的同時(shí)，等位基因的數(shù)目也在不斷減少，近年來，隨著水稻分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)的完善，迫切需要根據(jù)目前的水稻資源的情況，有效地從中選育出有增加粒重潛力的品種加以遺傳改良，或?qū)ζ淇刂屏Ｖ氐幕蜻M(jìn)行分離和克隆， 具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。我國水稻遺傳資源豐富，從這些豐富的資源中發(fā)掘、定位提高水稻粒重的新基因， 不僅為培育高產(chǎn)水稻新品種提供理論支持，而且對加強(qiáng)我國水稻基因資源的保護(hù)，將資源優(yōu)勢變成經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢具有重要意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的提高水稻粒重的蛋白，名稱為GS6_t，來源于稻屬普通栽培稻 (0. sativa.)秈稻93-11的突變體，是下述1)或2)所述的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID Na 1的氨基酸殘基序列；幻將序列表中的SEQ ID N2 :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID No 1氨基酸殘基序列是由115個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的提高水稻粒重的蛋白的編碼基因(gs6_t)，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中序列SEQ ID N2 :2的DNA序列由348個(gè)核苷酸組成，為該基因的讀碼框或翻譯從ATG起始至TGA終止密碼子結(jié)束，氨基酸產(chǎn)物即序列表中序列SEQID N2 :1。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增
3gs6_t中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述gs6_t基因在培育顆粒重提高的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。本發(fā)明還提供一種提高水稻粒重的方法，該方法，是以水稻(Oryza sativa) gs6CGMCC No . 4458作為供體親本，以待提高粒重水稻品種為受體親本，通過雜交或回交純合，篩選隱性純合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品種的水稻植株。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)分別為CGMCC Na . 4458。使用gs6_t構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛生素基因WDiquitin啟動(dòng)子(ρ^ )等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明編碼提高水稻籽粒寬度的基因gs6_t的植物表達(dá)載體可通過使用 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞或組織培育成植株。本發(fā)明的發(fā)明人在利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秈稻93-11選擇突變體育種材料時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)原始水稻基因(L0C_0s06g03710)編碼區(qū)+348位點(diǎn)處堿基G突變?yōu)閴A基A 后(G348A)，造成原始基因翻譯的提前終止和功能的喪失，并引起粒重的顯著增加，從而產(chǎn)生了本發(fā)明的可以提高水稻粒重的基因gs6-t。實(shí)驗(yàn)證明，將含有該突變基因gs6-t的編碼框的水稻突變體gs6通過回交方式轉(zhuǎn)入水稻后，可以顯著提高水稻粒寬和粒重。該基因?qū)τ谒咀蚜挾确肿訖C(jī)制的研究，水稻高產(chǎn)新品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義，并為改良作物的千粒重提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為秈稻93-11與突變體gs6籽粒在抽穗期(a)、成熟后(b)和成熟后去殼籽粒 (c)的比較；圖2為秈稻93-11與突變體gs6籽粒成熟后粒寬、粒長、粒厚和千粒重的比較；圖3將突變體gs6與秈稻93-11、秈稻特青通過回交自交的方法獲得隱性純合植株的粒重的比較。
圖4為突變體gs6與秈稻93-11的雜交。圖5為突變體gs6與秈稻特青的回交。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、提高水稻粒重的基因gs6_t的獲得及其功能驗(yàn)證一、提高水稻粒重的基因gs6_t的獲得1、水稻(Oryza sativa)突變體gs6的獲得及其表型鑒定我們首先利用化學(xué)誘變劑EMS對秈稻93-11 (購自國家種質(zhì)資源庫)的種子進(jìn)行誘變處理，對種子(M0)進(jìn)行無毒化處理后，然后按常規(guī)田間管理方式播種、施肥和防治病蟲害，成熟后分單株收獲，突變體gs6 (M1)的表型得到初步鑒定粒重較野生型對照(即秈稻 93-11)顯著增加約19%。經(jīng)過仏和禮代重復(fù)鑒定，突變體gs6粒型表現(xiàn)為穩(wěn)定遺傳，如圖 1展示了秈稻93-11和突變體gs6開花前和成熟后籽粒表型特征。同時(shí)選取20株成熟后的秈稻93-11和突變體gs6的籽粒進(jìn)行表型鑒定(粒寬、粒長、粒厚和千粒重)，如圖2所示。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)分別為CGMCC No . 4458。2、提高水稻粒重的新基因gs6_t的獲得構(gòu)建水稻(Oryza sativa)突變體gs6與秈稻特青(購自國家種質(zhì)資源庫)的F2 分離群體，利用圖位克隆的方法進(jìn)行基因定位，經(jīng)過對15. 7kb候選區(qū)域的測序得知突變體 gs6這種表型的獲得是由于秈稻93-11中一個(gè)原始水稻基因(LOC 0s06g03710)編碼區(qū)+348 位點(diǎn)處堿基G突變?yōu)閴A基A后(G348A)(自序列表中序列2的5'端第348位核苷酸)，造成原始基因翻譯的提前終止和功能的喪失(GRAS基因家族保守結(jié)構(gòu)域的完全喪失)，并引起粒重的顯著增加。因此，通過上述實(shí)驗(yàn)表明，上述通過突變形成的一個(gè)新的編碼框編碼一個(gè)提高水稻粒重的新蛋白。利用引物序列為GS6TF 和 GS6TR(GS6TF:5' ATGTTGGCGGGTTGCTCGTT 3 ‘ , GS6TR 5' CCATACCTCATCGCCGTCG 3')可以擴(kuò)增上述突變后獲得的新基因gs6_t編碼序列，具體方法如下所述以突變體gs6基因組DNA為模板，以GS6TF和GS6TR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到348bp的基因片段，測序表明，該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。該片段編碼序列表中序列1所示的蛋白，即本發(fā)明提高水稻粒重的蛋白，名稱為GS6-t。二、提高水稻粒重的基因gs6_t的功能驗(yàn)證1、突變體gs6與誘變親本秈稻93-11的回交驗(yàn)證我們以水稻(Oryza sativa)突變體gs6為父本(供體)，以誘變親本秈稻93-11 為母本(受體)進(jìn)行雜交(F1),在110株&分離群體中得到觀個(gè)純合隱性單株(F2，粒型等其它農(nóng)藝性狀均與突變體gs6相同)，野生型與突變型的分離比為3 Kx2 = 0.0121), 說明造成水稻突變體gs6粒寬粒重較誘變親本秈稻93-11增加的表型變異是由單個(gè)隱性基因控制的，即突變基因gs6-t。抽穗期將觀個(gè)純合隱性單株套袋自交后分單株收獲后(F3) 進(jìn)行F3代種植，每個(gè)F3家系粒型無分離，具體過程如圖4所示。植株成熟后對每個(gè)隱性純合F3家系混合收獲，選取100粒種子，利用電子天平稱其重量，并重復(fù)3次，取3次平均值后換算成千粒重。結(jié)果如圖所示3，各家系與突變體gs6 在粒重?zé)o顯著差異，但與93-11相比較粒重平均增加19%。2、突變體gs6與秈稻特青的回交驗(yàn)證我們以水稻(Oryza sativa)突變體gs6為父本(供體)，以秈稻特青(受體)為母本進(jìn)行雜交(F1)，在600株分離群體中選取粒型與突變體gs6完全相同的10株純合隱性單株(BC1F1),再與秈稻特青進(jìn)行回交(BC2F1),在各個(gè)F2分離群體中(每個(gè)F2群體規(guī)模在 100株-120之間)，再選取所有粒型與突變體gs6相同的共約150個(gè)純合隱性單株(BC2F2)， 揚(yáng)花期套袋自交后分單株收獲后進(jìn)行BC2F3代種植，田間觀察發(fā)現(xiàn)每個(gè)BC2F3家系粒型均無分離，具體過程如圖5所示。植株成熟后對每個(gè)隱性純合BC2F3家系混合收獲，選取100粒種子，利用電子天平稱其重量，并重復(fù)3次，取3次平均值后換算成千粒重。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明隱性純合植株的千粒重不僅顯著高于回交親本秈稻特青，而且顯著高于誘變親本秈稻93-11，增加可達(dá)11. 6%。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是下述1)和幻所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的SEQID No 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQID N2 :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有SEQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述編碼基因，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID Na 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)或2)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、重組工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求2或3所述基因在培育粒重提高的植物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻。
7.一種提高水稻粒重的方法，是以水稻(Oryza sativa)gs6 CGMCC Ns. 4458作為供體親本，以待提高粒重水稻品種為受體親本，通過雜交或回交純合，篩選隱性純合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品種的水稻植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高水稻粒重的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是下述1)或2)所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQ ID №.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因可用于培育粒重增加的水稻新品種，具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102532289SQ20101061632
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者付永彩, 劉鳳霞, 孫傳清, 孫連軍, 朱作峰, 李曉嬌, 謝道昕, 譚祿賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)