專利名稱：重組慢病毒滴度的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，特別涉及慢病毒載體的滴度檢測方法。
背景技術(shù)：
慢病毒載體是目前應(yīng)用最廣泛的基因運載工具之一，在基因治療研究和轉(zhuǎn)基因動 物的制備中已顯示出其廣闊的應(yīng)用前景。慢病毒載體是一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，與傳統(tǒng)的病 毒載體相比，慢病毒載體均勻分布于基因組內(nèi)，從而降低了其激活宿主內(nèi)源性基因的幾率?，F(xiàn)有測定重組慢病毒滴度的方法有流式細胞分選法(FACS)、酶聯(lián)免疫(ELISA)法 和絕對定量PCR法。FACS法是最準(zhǔn)確的測定慢病毒滴度的方法。該法先用病毒懸液感染靶細胞，之后 通過流式細胞儀測定靶細胞中成功被感染的細胞的比例。該方法可準(zhǔn)確測定重組慢病毒的 實際感染能力，所測滴度數(shù)據(jù)能準(zhǔn)確反應(yīng)病毒滴度的實際值，但該方法需要重組慢病毒表 達標(biāo)記基因(如綠色熒光蛋白eGFP)，不能測定無標(biāo)記基因重組慢病毒。ELISA法是通過檢測慢病毒顆粒中PM蛋白的含量，以測定慢病毒顆粒數(shù)從而推 算病毒滴度。由于該方法僅僅測定慢病毒的顆粒數(shù)，并沒有測定慢病毒對靶細胞的實際感 染能力，因此ELISA法測定的是慢病毒的物理滴度而非實際(生物)滴度。此外，由于病毒懸 液中含有一定的游離的P24蛋白，因此ELISA法通常過高地估計病毒滴度。絕對定量PCR法可測定病毒感染的靶細胞中平均每個細胞基因組中病毒基因組 的拷貝數(shù)，可在一定程度上較準(zhǔn)確地反應(yīng)慢病毒、尤其是無標(biāo)記基因的慢病毒的實際滴度。 但該方法需要進行絕對定量PCR檢測，樣本需求量大，影響因素多，數(shù)據(jù)重復(fù)性差，對于不 能在體外大量增殖培養(yǎng)的靶細胞并不適宜。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組慢病毒滴度的檢測方法，該方法將 FACS檢測法與定量PCR法相結(jié)合的重組慢病毒滴度的檢測方法，本方法既能準(zhǔn)確測定無標(biāo) 記基因的慢病毒滴度，又提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，同時減少了樣本用量，可準(zhǔn)確測定 重組慢病毒針對數(shù)量少、不能在體外大量培養(yǎng)增殖的靶細胞的滴度。有鑒于此，本發(fā)明的技術(shù)方案為
重組慢病毒滴度的檢測方法，具體包括以下步驟
A、對照病毒滴度檢測
運用流式細胞分選法檢測對照病毒滴度，得對照病毒滴度，所述對照病毒為能表達標(biāo) 記蛋白且與待測病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的慢病毒；
B、待測病毒與對照病毒相對含量比值R的確定
將待測病毒與對照病毒在相同條件下同時感染相同數(shù)量的靶細胞，分別提取待測病毒 與對照病毒感染后的靶細胞的總DNA，通過相對定量PCR檢測待測病毒與對照病毒的基因 組在細胞基因組中的相對含量，并獲得待測病毒與對照病毒相對含量比值R;C、重組慢病毒滴度的確定
將步驟A所得對照病毒滴度乘以待測病毒與對照病毒相對含量比值R，得待測病毒滴 度，即重組慢病毒滴度。進一步，步驟A中，所述標(biāo)記蛋白為綠色熒光蛋白；
進一步，步驟A中，將對照病毒的懸液先作IO4 IO6倍稀釋，在含相同細胞數(shù)量的不同 培養(yǎng)孔中分別加入不同體積(2uL、5uL、10uL、20uL、50uL)的病毒稀釋液；用對照病毒稀釋 液分別感染靶細胞后，運用流式細胞分選法分別檢測每孔感染的靶細胞的熒光細胞比例， 計算對照病毒滴度。對照病毒滴度計算公式如下TU/mL = (P X N / 100 X V) X 1000/ DF,其中TU/mL為病毒滴度，P =熒光陽性細胞比例，N =感染時的細胞數(shù)量；V =每孔加 入的病毒稀釋液的體積；DF =稀釋梯度；
進一步，步驟A中，將對照病毒的懸液先作IO4 IO6倍稀釋，利用2 μ L、5 μ L、10y L、 20μ L、50y L的病毒稀釋液分別感染數(shù)量相同的靶細胞。
進一步，步驟B中，將對照病毒的懸液和待測病毒的懸液按照KT1 10_6分別進行10 倍梯度稀釋，得對照病毒梯度稀釋液和待測病毒梯度稀釋液；
進一步，步驟B中，用對照病毒梯度稀釋液和待測病毒梯度稀釋液分別感染靶細胞后， 分別提取待測病毒與對照病毒感染后的靶細胞的基因組DNA，并進一步通過相對定量PCR 測定靶細胞基因組DNA中病毒基因組DNA的相對含量；
相對定量PCR測定中針對病毒基因組的上游引物如SEQ ID No. 1所示，下游引物如SEQ ID No. 2所示；針對內(nèi)參基因的上游引物如SEQ ID No. 3所示、下游引物如SEQ ID No. 4所 示；
相對定量 PCR 檢測的體系為=SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 yL、引物 各0. 2 μ L;靶細胞基因組DNA或標(biāo)準(zhǔn)品1 μ L、加入去離子水至20 μ L ；
相對定量PCR檢測的反應(yīng)程序為95°C條件下3分鐘，進入循環(huán)94°C條件下30秒， 500C條件下30秒，56°C條件下30秒，終點讀板，共40個循環(huán)；之后72°C條件下3分鐘， 95°C條件下1分鐘，55 °C條件下1分鐘。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明適用于無標(biāo)記基因的重組慢病毒滴度測試，尤其 是用于基因治療或轉(zhuǎn)基因動物研制等需要準(zhǔn)確測定滴度的重組慢病毒；本發(fā)明既能準(zhǔn)確測 定無標(biāo)記基因的慢病毒滴度，又提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，同時減少了樣本用量，可準(zhǔn) 確測定重組慢病毒針對數(shù)量少、不能在體外大量培養(yǎng)增殖的靶細胞的滴度。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中
圖1為熒光細胞比例與對照病毒稀釋液添加體積之間的相關(guān)曲線； 圖2為熒光定量PCR產(chǎn)物溶解曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線；A、C分別為病毒基因組定量PCR產(chǎn)物 和內(nèi)參基因定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線；縱坐標(biāo)為PCR反應(yīng)體系中熒光強度，橫坐標(biāo)為溶解溫 度；不同顏色的曲線表示不同樣本(每個培養(yǎng)孔的細胞基因組DNA)的PCR產(chǎn)物的溶解曲線；曲線2為曲線1的對數(shù)值，曲線2為單一波峰表明PCR體系中無非特異性擴增。B、D分別 為病毒基因組和內(nèi)參基因的定量PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；縱坐標(biāo)為熒光定量PCR體系中模板 量的對數(shù)值(log值)，與10倍稀釋梯度呈線性相關(guān)；橫坐標(biāo)為PCR反應(yīng)的Ct值，即PCR體 系中熒光強度達到設(shè)定閾值時的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)；
圖3為定量PCR的Ct值與病毒稀釋梯度的相關(guān)曲線；縱坐標(biāo)為針對病毒基因組的定量 PCR的Ct值，橫坐標(biāo)為所加病毒液的10倍稀釋梯度(ΙΟ—1 10_6)。圖A 待測病毒曲線；圖 B:對照病毒曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進 行詳細的描述。實施例重組慢病毒滴度的檢測方法 一、所用材料
1、試劑
DMEM細胞培養(yǎng)基(高糖) 胎牛血清
細胞
細胞基因組DNA提取試劑盒 Real-time PCR Master Mix rTaq 酶 HBSS緩沖液 PBS緩沖液
兩種表達標(biāo)記基因(eGFP)的重組慢病
2、所用耗材
24孔細胞培養(yǎng)板Corning ；
各種規(guī)格移液器槍頭Axygen ；
離心管Axygen ；
3、所用主要設(shè)備 流式細胞器檢測儀
Gibcol 公司；
Gibcol 公司； Invitrogen 公司； Tiangen 公司； Τ0Υ0Β0 ； Takara ； Sigma公司； Gibcol 公司； S懸液 自備。
美國貝克曼庫爾特公司
Bio-rad ； Thermo ；
Real-time PCR 儀 C02培養(yǎng)箱
二、實驗方法
1、FACS測定對照病毒滴度
用HBSS緩沖液將兩種表達eGFP標(biāo)記基因的重組慢病3
24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 X IO6個細胞，共12孔，每種病
充分懸浮并作IO6倍稀釋。在 用6個孔。之后放置于 C02孵箱中培養(yǎng)1天以后，每孔分別加入病毒稀釋液2uL、5uL、10uL、20uL、50uL，充分混合均 勻。剩下一個孔不加病毒液以作為空白對照。細胞感染后，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，吸出細胞培
5養(yǎng)液，并用PBS洗細胞3次，充分去除殘留在上清的病毒。之后每孔加入500 μ L含質(zhì)量分 數(shù)為0.02% EDTA的PBS，用移液器充分吹吸細胞，以使細胞充分懸浮。通過流式細胞分選 (FACS)檢測每孔熒光細胞比例。選取所加病毒稀釋液的體積與熒光細胞比例呈正比關(guān)系的 樣本的數(shù)據(jù)計算病毒滴度，求出平均值，即為兩種病毒的實際(生物)滴度。病毒滴度計算公 式如下TU/mL = (P X N / 100 X V) X 1000/DF, TU/mL為病毒滴度；P =熒光陽性細胞 比例(％)，N =感染時的細胞數(shù)量；V =每孔加入的病毒稀釋液的體積(μ L) ;DF =稀釋系 數(shù)(10-6)。由圖1可知，病毒稀釋液添加了 5uL與添加IOuL的孔其熒光細胞比例與所添加 的病毒稀釋液體積呈正比例關(guān)系，表明這兩個孔的數(shù)據(jù)均可用于計算病毒滴度，而所測病 毒滴度值則可取兩個孔的平均值。
2、通過相對定量PCR測定待測病毒滴度
在對孔培養(yǎng)板中，按照第1部分所述方法接種細胞共M孔，其中12孔用于對 照病毒的感染、12孔用于待測病毒的感染。用HBSS緩沖液將兩種表達eGFP標(biāo)記基因的重 組慢病毒懸液按照KT1 10_6進行10倍梯度稀釋。任選其中一個作為對照病毒，另外一 個作為待測病毒。每個梯度稀釋液分別加入兩孔細胞，每孔10 μ L，充分混勻。培養(yǎng)48小 時后，按照FACS法所描述的方法懸浮靶細胞。利用細胞基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)， 提取每孔細胞的總DNA，此時細胞基因組DNA中已包含了病毒基因組。以每孔細胞的總 DNA樣本為模板，分別針對病毒基因組和靶細胞內(nèi)參基因進行定量PCR分析。針對慢病毒 基因組保守序列的定量PCR引物序列為上游引物5’ -tgccacggcggaactca-3’；下游引物 5’ -cagccaaggaaaggacgatg -3’ ；針對內(nèi)參基因foiaseP的引物序列分別為上游引物5’ -tgagtcagtgagaaggcaagg -3'弓L 5， -gctgggagggtacacgaga-3' 定量PCR 體系為Green Real-time PCR Master Mix 10yL、引物 0. 2 μ L each;模板(細胞基因組DNA或標(biāo)準(zhǔn)品)1 μ L、加入去離子水至20u μ L ；定量PCR反應(yīng)程序 為95°C 3min，進入循環(huán)94°C 30 s，50°C 30 s，56°C 30 s, reald plate，共 40 個循環(huán)； 之后 72°C 3min，95°C lmin，55°C lmin。以病毒樣本的10倍稀釋梯度為橫坐標(biāo)、以每個稀釋梯度所對應(yīng)的病毒基因組的 Ct值為縱坐標(biāo)做一相關(guān)曲線，選取Ct值與稀釋梯度呈線性相關(guān)、且稀釋梯度相同的對照病 毒與待測病毒樣本的數(shù)據(jù)計算待測病毒滴度。圖2中，如果Ct值與模板量的對數(shù)值呈線性 相關(guān)，表明定量PCR數(shù)據(jù)成立；由圖2可知，針對病毒基因組和內(nèi)參基因的定量PCR反應(yīng)的 Ct值與模板量對數(shù)值均呈高度線性相關(guān)(圖例中相關(guān)系數(shù)r2均為0. 998，大于相關(guān)系數(shù)最 低要求值0.98)；根據(jù)定量PCR產(chǎn)物擴增效率計算公式E (擴增效率)=10_ -1，利用 相同的樣本進行5次重復(fù)實驗并求取平均值，分別獲得病毒基因組的定量PCR擴增效率為 1.045、內(nèi)參基因的定量PCR擴增效率為1.041。由圖3可知，兩個病毒的后三個稀釋梯度 的Ct值均與稀釋梯度呈線性相關(guān)，表明這三個梯度的樣本數(shù)據(jù)均可用于計算R值；為了更 準(zhǔn)確的測算待測病毒與對照病毒相對含量的比值，在計算待測病毒滴度時，可取三個稀釋 梯度R值的平均值。3、待測病毒滴度的計算
跟據(jù)Pfaffl方程計算待測病毒基因組與對照病毒基因組在感染細胞中的相對含量之 比，計算公式為R=El (ctl-ct2)/E2 (ct3- ct4)0其中R為待測病毒基因組與對照病毒基因組的相對含量之比；El為病毒基因組定量PCR引物的擴增效率(1.045) ；E2為內(nèi)參基因定量PCR 引物的擴增效率(1. 041) ;Ctl為對照病毒基因組的Ct值、Ct2為待測病毒基因組的Ct值、 Ct3為對照病毒樣本中內(nèi)參基因的Ct值、Ct4為待測病毒樣本中內(nèi)參基因Ct值。待測病毒 滴度=RX (對照病毒滴度)。
三、實驗結(jié)果
利用5個滴度已知(被FACS法準(zhǔn)確測定)的重組慢病毒，選取其中1個為對照病毒、其 余4個為待測病毒。細胞為感染靶細胞，通過上述方案檢測4個待測病毒滴度。結(jié) 果如下
權(quán)利要求
1.重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于，具體包括以下步驟A、對照病毒滴度檢測運用流式細胞分選法檢測靶細胞中對照病毒滴度，得對照病毒滴度，所述對照病毒為 能表達標(biāo)記蛋白且與待測病毒具有相同的包膜蛋白和感染嗜性的慢病毒；B、待測病毒與對照病毒相對含量比值R的確定將待測病毒與對照病毒在相同條件下同時感染相同數(shù)量的靶細胞，分別提取待測病毒 與對照病毒感染后的靶細胞的總DNA，通過相對定量PCR檢測待測病毒與對照病毒的基因 組在靶細胞基因組中的相對含量，并獲得待測病毒與對照病毒相對含量比值R;C、重組慢病毒滴度的確定將步驟A所得對照病毒滴度乘以步驟B所得的待測病毒與對照病毒相對含量比值R所 得的值為待測病毒滴度，即重組慢病毒滴度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于步驟A中，所述標(biāo) 記蛋白為綠色熒光蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于步驟A中，將對照 病毒的懸液先作IO4 IO6倍稀釋，利用不同體積的病毒稀釋液分別感染數(shù)量相同的靶細 胞；用對照病毒稀釋液分別感染靶細胞后，運用流式細胞分選法分別檢測每孔感染的靶細 胞的熒光細胞比例，計算對照病毒滴度；對照病毒滴度計算公式如下TU/mL = (P X N / 100 X V) X 1000/DF,其中TU/mL為病毒滴度，P代表熒光陽 性細胞比例，N代表感染時的細胞數(shù)量，V代表每孔加入的病毒稀釋液的體積，DF代表稀釋 梯度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于步驟A中，將對照 病毒的懸液先作IO4 IO6倍稀釋，利用2 μ L、5 μ L、10 μ L、20 μ L、50 μ L的病毒稀釋液分別 感染數(shù)量相同的靶細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于步驟B中，將對照 病毒的懸液和待測病毒的懸液按照KT1 10_6分別進行10倍梯度稀釋，得對照病毒梯度稀 釋液和待測病毒梯度稀釋液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組慢病毒滴度的檢測方法，其特征在于步驟B中，用對照 病毒梯度稀釋液和待測病毒梯度稀釋液分別感染靶細胞后，分別提取待測病毒與對照病毒 感染后的靶細胞的基因組DNA，并進一步通過相對定量PCR測定靶細胞基因組DNA中病毒基 因組DNA的相對含量；相對定量PCR測定中針對病毒基因組的上游引物如SEQ ID No. 1所示，下游引物如SEQ ID No. 2所示；針對內(nèi)參基因的上游引物如SEQ ID No. 3所示，下游引物如SEQ ID No. 4所 示；相對定量 PCR 檢測的體系為=SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 yL、引物 各0. 2 μ L;靶細胞基因組DNA或標(biāo)準(zhǔn)品1 μ L、加入去離子水至20 μ L ；相對定量PCR檢測的反應(yīng)程序為95°C條件下3分鐘，進入循環(huán)94°C條件下30秒， 500C條件下30秒，56°C條件下30秒，終點讀板，共40個循環(huán)；之后72°C條件下3分鐘， 95°C條件下1分鐘，55 °C條件下1分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了慢病毒載體的滴度檢測方法，具體為運用流式細胞分選法檢測對照病毒滴度，將待測病毒與對照病毒在相同條件下同時感染相同數(shù)量的靶細胞，分別提取待測病毒與對照病毒感染后的靶細胞的總DNA，通過相對定量PCR檢測獲得待測病毒與對照病毒的基因組在靶細胞基因組中的相對含量的比值R；將所得對照病毒滴度乘以待測病毒與對照病毒相對含量比值R所得的值為待測病毒滴度，即重組慢病毒滴度；本發(fā)明適用于無標(biāo)記基因的重組慢病毒滴度測試，可準(zhǔn)確測定重組慢病毒針對數(shù)量少、不能在體外大量培養(yǎng)增殖的靶細胞的滴度。
文檔編號C12Q1/70GK102134613SQ201010618159
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉勤, 劉宇, 劉昌峨, 周曉楊, 江雯, 王勇, 王露露, 郭科男, 魏泓 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)