專利名稱：一種酸性果膠酶endo-PGI及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種來源于青霉菌(Penicillium sp.)的酸性果膠酶endo-PGI及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果膠主要是直鏈α -1，4糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸殘基組成的復(fù)合多糖，是植物細(xì)胞壁和中膠層的重要組成部分(van Buren JP. Academic Press，1991. p. 1-22)。果膠酶(pectinases)是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。根據(jù)分解糖苷鍵的反應(yīng)性質(zhì)或降解底物的性質(zhì)可以分為果膠水解酶(pectin hydrolases)、果膠裂解酶(pectin lyases, PL)、 果膠酉旨醇(pectin esterases, ΡΕ)禾口原果膠醇(Alkorta I, et al. Process Biochem 33 21-28,1998)。果膠酶按其作用最適pH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。目前研究和應(yīng)用較多的是酸性果膠酶，其酶作用最適PH在偏酸性范圍，主要應(yīng)用于食品行業(yè)的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度，并可以與其它水解酶共同應(yīng)用于飼料行業(yè)。果膠酶主要來源于微生物(細(xì)菌，真菌和酵母菌)和植物。很多果膠酶已被純化并進(jìn)行了性質(zhì)測定(Niture SK. Biologia 2008;63:1-19)。其中真菌來源的果膠酶大部分在酸性PH值下具有高活性(通常pH值4. 0-6.0)。大多數(shù)商業(yè)化生產(chǎn)的果膠酶也是來源于真菌，尤其是來源于黑曲霉和青霉(Niture SK. Biologia 2008;63:1-19 ；Alkorta et al. Process Biochem 1998 ;33 :21- )。一些果膠酶素基因已被克隆，測序和并進(jìn)行了表達(dá) (Mertens et al. Fungal Genet Biol 2008;45:1616-1624)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種可以應(yīng)用于食品與飼料行業(yè)的酸性果膠酶 endo-PGIο本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述果膠酶endo-PGI的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述果膠酶endo-PGI的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述果膠酶endo-PGI的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種果膠酶endo-PGI，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。MLLSTHSIVL GLLGSTSLAL ASPAAEPAEG NRLIPRGSAC TYSGVNGAAAAIAGKAGCSS 60ITLNNVAVPA GTTLDLTGLA AGTKVIFEGT TTFGHKQffVG PLISISGTNIAVSGAAGHVI 120DGQGARffffDG KGSNTKTNIK PKFFLAHNLK GASTITGLNI KDTPVQVFSIDSSSGLTISG 180VTIDNRNGDK GSLGHNTDGF DIGDSDHITI TGATVYNQDD CLAINSGTNI
3
IFSGGYCSGG 240HGLSIGSVGG RSNNVVDTVH ISSTQVVNSQ NGVRVKAVAG ATGSIKGVTYQDITLSGITS 300QGVTIRQDYT NSGYTGNPTT QVPITGLTLN NVHGTVTSSG TDITVECGSAASCSGffTffTK360VAVSGGKADLCKNAPANTC379其中，該酶全長379個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，N端21個(gè)氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 “MLLSTHSIVLGLLGSTSLALA”。因此，成熟的酸性果膠酶endo-PGI的理論分子量為36. 2kDa,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 SPAAEPAEGN RLIPRGSACT YSGVNGAAAA IAGKAGCSSI TLNNVAVPAGTTLDLTGLAA60GTKVIFEGTT TFGHKQffVGP LISISGTNIA VSGAAGHVID GQGARffffDGKGSNTKTNIKP120KFFLAHNLKG ASTITGLNIK DTPVQVFSID SSSGLTISGV TIDNRNGDKGSLGHNTDGFD180IGDSDHITIT GATVYNQDDC LAINSGTNII FSGGYCSGGH GLSIGSVGGRSNNVVDTVHI240SSTQVVNSQN GVRVKAVAGA TGSIKGVTYQ DITLSGITSQ GVTIRQDYTNSGYTGNPTTQ300VPITGLTLNN VHGTVTSSGT DITVECGSAA SCSGffTffTKV AVSGGKADLCKNAPANTC358本發(fā)明的果膠酶來自于青霉菌(Penicillium sp.)。本發(fā)明提供了編碼上述酸性果膠酶endo-PGI的基因。該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所示atgttgttat cgacacacag tattgttctg ggcttgctag gctcaacgtc cttggccctc 60gcttctccag ctgccgaacc ggctgaaggg aacagactca tccctcgtgg atctgcttgc 120acctattcag gagtcaatgg tgcagctgca gcgatagccg gaaaggcagg ttgctccagt 180attactctca ataacgttgc agtgcctgcc gggactacgc tggatttgac tggtctggcc 240gcgggtacca aggtaagaac tctccacaaa cccatgactc tcttgctcca ccgacggcga 300atttactgag aatgttgtag gtgatatttg agggaaccac tactttcggc cataagcagt 360gggtgggccc tctgatctcc atctctggga ccaacatcgc agtttctggg gctgccggtc 420
acgtcattga tggccaaggt gcccgctggt gggatggaaa gggttccaac accaagacca 480atatcaaacc taagttcttc ctcgcccaca atctcaaggg agcctccact attacggggt 540tgaacatcaa ggatactccc gttcaggtct tcagcatcga tagctcgtcg ggtctgacga 600tcagtggtgt cacaattgac aacagaaatg gtgataaggg ttctctcggt cacaacaccg 660acgggttcga tatcggcgac agtgatcaca ttaccatcac tggtgctaca gtttataacc 720aagacgactg cctggccatc aattctggga cggtaagtgc tcgaagattg tcgccctgcc 780tagctgcagg aaataattac cacggttctt gctgaccatt aatacccaga acattatttt 840ctccggcggt tactgctctg gtggccacgg attgtctatc ggctcagtcg gtggccgttc 900caataatgtg gtagacaccg tccatatcag cagcacccag gtcgtcaact ctcagaatgg 960taagcccgag ccggataatg actataagtt ttttttcgtt tcttgaactg atatttttgt 1020caggtgtccg tgtcaaagct gtcgctggcg ccaccggtag tatcaaaggc gtgacttacc 1080aggatattac cctctccggc attacgagcc agggagtcac catccgccaa gactacacca 1140attctggcta cactggaaac cccacgaccc aggttccaat cactggactc accttgaata 1200atgtgcacgg cacggtcaca tccagtggca ccgatatcac cgtcgagtgt ggaagtgctg 1260ccagttgttc aggctggact tggactaaag ttgcagtcag tggcggcaag gcggatttgt 1320gcaagaatgc acctgccaac acttgctaa 1349本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一酸性果膠酶基因endo-pgl，DNA全序列分析結(jié)果表明，酸性果膠酶endo-PGI的結(jié)構(gòu)基因pgl全長1，349bp，含有3個(gè)內(nèi)含子， 255-322bp，753-829bp，和 962_1025bp 為其內(nèi)含子序列，cDNA 長 1，140bp，其 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 4 所示。atgttgttat cgacacacag tattgttctg ggcttgctag gctcaacgtc cttggccctc 60gcttctccag ctgccgaacc ggctgaaggg aacagactca tccctcgtgg atctgcttgc120acctattcag gagtcaatgg tgcagctgca gcgatagccg gaaaggcagg ttgctccagt 180attactctca ataacgttgc agtgcctgcc gggactacgc tggatttgac tggtctggcc 240gcgggtacca aggtgatatt tgagggaacc actactttcg gccataagca gtgggtgggc 300cctctgatct ccatctctgg gaccaacatc gcagtttctg gggctgccgg tcacgtcatt 360gatggccaag gtgcccgctg gtgggatgga aagggttcca BCBCCBBgBC C BB B C 3-3-3-420cctaagttct tcctcgccca caatctcaag ggagcctcca ctattacggg gttgaacatc 480aaggatactc ccgttcaggt cttcagcatc gatagctcgt cgggtctgac gatcagtggt 540gtcacaattg acaacagaaa tggtgataag ggttctctcg gtcacaacac cgacgggttc 600gatatcggcg acagtgatca cattaccatc actggtgcta cagtttataa ccaagacgac 660tgcctggcca tcaattctgg gacgaacatt attttctccg gcggttactg ctctggtggc 720cacggattgt ctatcggctc agtcggtggc cgttccaata atgtggtaga caccgtccat 780atcagcagca cccaggtcgt caactctcag aatggtgtcc gtgtcaaagc tgtcgctggc 840gccaccggta gtatcaaagg cgtgacttac caggatatta ccctctccgg cattacgagc 900cagggagtca ccatccgcca agactacacc aattctggct acactggaaa ccccacgacc 960caggttccaa tcactggact caccttgaat aatgtgcacg gcacggtcac atccagtggc 1020accgatatca ccgtcgagtg tggaagtgct gccagttgtt caggctggac ttggactaaa 1080gttgcagtca gtggcggcaa ggcggatttg tgcaagaatg cacctgccaa cacttgctaa 1140其中，信號肽的堿基序列為ATGTTGTTATCGACACACAGTATTGTTCTGGGCTTGCTAG GCTCAACGTCCTTGGCCCTCGCT本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因pgl的重組載體。優(yōu)選為pPIC9-pgI。將本發(fā)明的果膠酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將果膠酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl 啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-pgI。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株GS115/pgI。本發(fā)明還提供了一種制備酸性果膠酶的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/
PgI。目前報(bào)道的青霉來源的果膠酶的最適pH在pH5. 5左右(Silva D，et al. Process Biochem 2005 ；40 :2885-2889 ；Yao C，et al. Phytopathology 1996 ;86 :1160-1166)。本發(fā)明提供的果膠酶的最適PH為3. 5，與鮮榨果汁的pH(3. 5-4. 0)相當(dāng)。真菌來源的果膠酶的最適溫度為45-65°C，當(dāng)溫度低于30°C時(shí)，酶活很低或失活(Marcus L,et al. Physiol Plant Pathol 1986 ；29 :325-336 ；Channe P, et al. Folia Microbiol 1995;40:111-117)。本發(fā)明提供的果膠酶的最適為40°C，并且在0°C時(shí)仍有7. 3%的酶活。本發(fā)明還提供了上述酸性果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)新的果膠酶基因，其編碼的果膠酶具有嗜酸性，作用PH范圍廣，較好的耐熱性，可作應(yīng)用于飼料、食品等工業(yè)， 或用于工業(yè)制備果膠酶。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)酸性果膠酶。


圖1重組果膠酶的SDS-PAGE分析，M 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 純化的果膠酶 endo-PGI。圖2果膠酶的最適pH。圖3果膠酶的pH穩(wěn)定性。圖4果膠酶作用的最適溫度。圖5果膠酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)條件1、菌株及載體畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9及菌株GSl 15購自于hvitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自hvitrogen公司。 果膠、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I)Penicillium sp 產(chǎn)果膠酶誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基0. 2% MgSO4 · 7H20，0. 1% KH2PO4, 0. 1% CuSO4 · 5Η20，0· 1% CaCl2,0. 5%果膠，0. 5%蛋白胨，ρΗ6· 0。
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(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同。說明本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來進(jìn)行，包括 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。實(shí)施例1 Penicillium sp.果膠酶編碼基因pgl的克隆提取Penicillium sp.基因組 DNA:將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據(jù)第28家族果膠酶基因的保守(GPNTDG (A) I (F) H⑶和GHGL (V) SIGS)序列設(shè)計(jì)合成了簡并引物P1，P2Pl 5' -GGCCGAAACACGGAYGSNITNVA-3‘；P2 5' -CGATCCGATNGANAINCCRTGNCC-3‘其中=Y= C/T, W = A/T, R = A/G, S = C/G, N = A/T/G/C以Penicillium sp總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C 5min ； 94°C 30sec, 52-47°C 30sec (其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0. 5°C )，72°C lmin, 10個(gè)循環(huán)， 然后進(jìn)入第二個(gè)循環(huán)程序94°C 30sec,48°C 30sec,72°C lmin，25 個(gè)循環(huán)后；72°C IOminJlC 脂糖電泳檢測。得到的片段回收后與PEASY-T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引物)見表1。表1.果膠酶endo-PGI TAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種具有強(qiáng)果膠降解能力的酸性果膠酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.—種酸性果膠酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種酸性果膠酶基因pgl，其特征在于，編碼權(quán)利要求1或2所述的果膠酶。
4.如權(quán)利要求3所述的果膠酶基因pgl，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 3所示。
5.如權(quán)利要求3所述的果膠酶基因pgl，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 4所示。
6.一種果膠酶的表達(dá)載體，其特征在于包含有權(quán)利要求3、4或5所述的果膠酶基因序列。
7.包含權(quán)利要求3、4或5所述果膠酶基因的重組菌株，其特征在于，由權(quán)利要求6所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主獲得。
8.一種制備酸性果膠酶endo-PGI的方法，其特征在于，包括以下步驟.1)用權(quán)利要求6表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；.2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶的表達(dá)；以及.3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶endo-PGI。
9.權(quán)利要求1或2所述果膠酶endo-PGI的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3所述果膠酶基因的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種來源于青霉菌(Penicillium sp.)的酸性果膠酶endo-PGI及其基因和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的具有強(qiáng)果膠降解能力的酸性果膠酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本發(fā)明還提供了上述酸性果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)新的果膠酶基因，其編碼的果膠酶具有嗜酸性，作用pH范圍廣，較好的耐熱性，可作應(yīng)用于飼料、食品等工業(yè)，或用于工業(yè)制備果膠酶。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)酸性果膠酶。
文檔編號C12N1/21GK102533696SQ20101061855
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者張菁, 苑鵬, 詹志春 申請人:武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司