專利名稱：一種人中期因子抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ー種具有抗血管新生作用的人中期因子的抑制肽以及該抑制肽在治療和預(yù)防腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中期因子(midkine，MK)是1988年由日本學(xué)者在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的肝素親和生長因子，分子量約為13kD，是ー個低分子量的蛋白質(zhì)。中期因子大量表達(dá)于妊娠中期并在妊娠發(fā)展中起著重要的作用。在成人，中期因子被限制在一定的組織中表達(dá)。然而，在腫瘤發(fā)生，炎癥和組織細(xì)胞修復(fù)的過程中，中期因子的表達(dá)明顯增強(qiáng)。中期因子能促進(jìn)細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移，并與腫瘤的侵襲、炎癥疾病的發(fā)生及受損細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)密切相關(guān)，中期因子也被期待成為ー種阻止細(xì)胞凋亡的治療手段。與此同吋，中期因子已成為惡性腫瘤和炎性疾病治療中頗具前景的分子靶點(diǎn)并已成為ー種新的腫瘤標(biāo)記物。中期因子能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活和分化，在許多不同類型的腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，包括食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌、肺癌、甲狀腺、乳腺、膀胱、子宮、卵巣、前列腺和肝癌、神經(jīng)細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤，陽性表達(dá)率介于45%-90%之間，中期因子在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。中期因子在腫瘤早期、潛伏期和癌前病變階段也呈高水平表達(dá)。這表明，中期因子在許多類型的腫瘤發(fā)生和生物學(xué)行為中起重要作用，已經(jīng)有研究證實(shí)中期因子在腫瘤發(fā)生中的作用，在體內(nèi)中期因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，這種生長與腫瘤血管密度的増加有關(guān)，同時證實(shí)了中期因子有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。另外有研究證實(shí)人口腔癌中中期因子的表達(dá)與腫瘤血管生成也相關(guān)。血管生成(angiogenesis)是指在原有血管的基礎(chǔ)上，內(nèi)皮細(xì)胞以發(fā)芽的模式形成新血管的過程。血管生成時在促血管生成因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)變成具有遷移能力的頂細(xì)胞，同時激活間質(zhì)金屬蛋白酶降解血管外基質(zhì)，幫助頂細(xì)胞向周圍擴(kuò)增和遷移形成柱狀絲狀偽足，并逐步形成血管腔。最后，周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等支持細(xì)胞環(huán)繞在內(nèi)皮細(xì)胞周圍形成完整的新生血管。血管新生是ー個復(fù)雜的過程，主要包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、成管等幾個關(guān)鍵步驟。1971年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Judah Folkman首次提出“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成”的假說，并于1973年提出腫瘤血管生成因子(TAF)概念，此后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種血管生成因子。研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤血管生成相關(guān)的因子有30余種。腫瘤生長具有明確的血管依賴性，腫瘤通過新生血管從宿主獲取營養(yǎng)成分，又經(jīng)過血管向宿主輸送腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤灶的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。Hanahan等提出的“血管生成的開關(guān)假設(shè)”認(rèn)為，腫瘤血管形成過程受到開關(guān)的調(diào)節(jié)，當(dāng)血管形成因子的濃度上升或抑制因子濃度下降，血管生成開關(guān)處于開放狀態(tài)，新生血管大量形成，腫瘤則持續(xù)生長。腫瘤在沒有養(yǎng)分的供應(yīng)下，只能長到2-3立方毫米。如果沒有新生血管長入，腫瘤就將保持休眠狀態(tài)甚至退化。足夠的血管形成以提供充足的營養(yǎng)及氧供是腫瘤生長的必要條件，因此，腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴于血管新生。既然惡性腫瘤的生長轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤的血管生成，以腫瘤血管為靶點(diǎn)、抑制其生成或破壞其存在，從而阻斷了腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移的營養(yǎng)通道的抗血管生成治療正逐漸成為探索腫瘤治療的又ー亮點(diǎn)。而中期因子在腫瘤組織中的過度表達(dá)促進(jìn)了腫瘤血管的形成，促進(jìn)了腫瘤的生長和浸潤。因此，中期因子有望成為ー種新的腫瘤標(biāo)志物及腫瘤生物治療的新靶點(diǎn)，而且可能成為判斷患者預(yù)后的新指標(biāo)，對復(fù)發(fā)性腫瘤中中期因子的表達(dá)目前尚未見報道，可能將是今后研究的方向之一。顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)是近年來發(fā)現(xiàn)的ー個獨(dú)立的生長因子，具有廣泛的生理功能。大部分上皮組織來源的腫瘤細(xì)胞(如卵巣癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞等)都高表達(dá)顆粒蛋白前體蛋白。在對卵巢癌的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過激光捕獲顯微切割技木，在侵襲性卵巣癌組織中，腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)顆粒蛋白前體，而在非侵襲性的卵巣癌組織中，只有基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)顆粒蛋白前體。一部分其他來源的腫瘤細(xì)胞也高表達(dá)顆粒蛋白前體蛋白，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，多發(fā)性骨髄瘤和子宮平滑肌肉瘤等。最近又研究表明，子宮平滑肌肉瘤細(xì)胞高表達(dá)顆粒蛋白前體蛋白，表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。因此，顆粒蛋白前體在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力和促進(jìn)腫瘤組織血管新生等方面均發(fā)揮重要作用，提示顆粒蛋白前體可能是腫瘤治療的良好靶標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，中期因子和顆粒蛋白能夠相互作用，并對內(nèi)皮細(xì)胞的増殖，遷移和管腔形成具有顯著促進(jìn)的作用，在體外血管形成的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，中期因子和顆粒蛋白相互作用可以促進(jìn)血管新生。因此，中期因子和顆粒蛋白的相互作用位點(diǎn)，可能成為抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長的良好靶點(diǎn)，可能成為ー個新的抗腫瘤血管新生的良好藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明申請的目的在于提供有效種抑制腫瘤的抑制肽及其活性片段，特別是生長中期因子與顆粒蛋白相互作用引起的腫瘤血管新生。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案
ー種人中期因子抑制肽，該抑制肽以中期因子基因與顆粒蛋白相互作位點(diǎn)為靶標(biāo)，其特征在于所述抑制肽的氨基酸序列為gpcqvdahcsaghsciftvsgtssccpfpeavacgdghhccprg fhcsadgrscfq.該抑制肽是人顆粒蛋白前體基因(Pgrn)來源的含有56個氨基酸的肽片段， 分子量約為10kD，命名為GrnG (Granulin G)。該抑制肽片段是采用常規(guī)的人工合成純化的方法制備得到的。本發(fā)明的第二個方面，提供編碼這些抑制肽的多核苷酸片段，序列為3’ -g gcccctgccaggttgatgcccactgctctgccggccactcctgcatctttaccgtctcagggacttccagt tgctgccccttcccagaggccgtggcatgcggggatggccatcactgctgcccacggggcttccactgca-gtgcagacgggcgatcctgcttccaa-5，。本發(fā)明的第四個方面，本發(fā)明的抑制肽可以治療和/或預(yù)防腫瘤血管新生。如本發(fā)明所用，“新的抗血管新生抑制肽”是指抗血管新生抑制肽中基本上不含天然與其相關(guān)的其他蛋白、脂類、糖類或其他物質(zhì)。本發(fā)明提供了一種新的抑制肽——抗血管新生抑制肽。本發(fā)明的抑制肽是使用重組技術(shù)從原核宿主中產(chǎn)生。


圖1為GrnG合成純化SDS-PAGE電泳結(jié)果。第1泳道為蛋白Marker，第2泳道為純化后的GrnG蛋白。圖2為GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)増殖。圖3為GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移。A為0小時倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)；B-H為12小時細(xì)胞劃痕狀態(tài)，其中B為空白對照，C為VEGF 10ng/ml, D為 MK+PGRN各 100ng/ml，E 為 MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG 100ng/ml，F(xiàn) 為 GrnG 100ng/ml，G 為 MK+PGRN各100ng/ml+GrnG 200ng/ml，H為GrnG 200ng/ml。統(tǒng)計分析柱狀圖為各組定量分折后，與空白對照組相比得出的細(xì)胞遷移率，其中將對照設(shè)為100%的遷移率來計算。圖4為GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)Transwe 11小室中的遷移。A-G為M 小時后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移的狀態(tài)，其中A為MK+PGRN各lOOng/ml+GrnG 100ng/ml, B 為 GrnG 100ng/ml, C 為 MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG 200ng/ml, D 為 GrnG 200ng/ml, E 為 VEGF 10ng/ml，F(xiàn)為MK+PGRN各100ng/ml，G為空白對照。統(tǒng)計分析柱狀圖為各組定量分析后，與空白對照組相比得出的細(xì)胞遷移率，其中將對照設(shè)為100%的遷移率來計算。圖5為GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)管腔形成。A-G為M小時后在倒置顯微鏡下觀察的細(xì)胞管腔形成狀態(tài)，其中A為MK+PGRN各lOOng/ml+GrnG 100ng/ml, B為 GrnG 100ng/ml, C 為 MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG 200ng/ml,D 為 GrnG 200ng/ml,E 為 VEGF 10ng/ml, F 為 MK+PGRN 各 100ng/ml, G 為空白對照。圖6為GrnG抑制雞胚絨毛膜血管新生。A-G為M小時后在倒置顯微鏡下觀察的雞胚絨毛膜新生血管狀態(tài)，其中A為MK+PGRN各100ng/ml+GrnG 100ng/ml,B為GrnG IOOng/ ml，(為 MK+PGRN 各 lOOng/ml+GrnG 200ng/ml, D 為 GrnG 200ng/ml, E 為 VEGF lOng/ml, F 為MK+PGRN各100ng/ml，G為空白對照。圖中，均以ρ<0· 05表示有顯著差異，*，ρ<0· 05，**，ρ<0· 01。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1 :GrnG人工合成及純化
目的和原理大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生成的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚，培養(yǎng)操作簡單，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，生長繁殖快，成本低廉，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)。PET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng)，它是最初由Studier等利用與啟動子配套能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)，可以從各種基因 (包括原核、真核細(xì)胞)生長大量的目的蛋白。方法將人顆粒蛋白前體基因的第174-339個核苷酸序列克隆入pET28a+表達(dá)體系，構(gòu)建好GrnG- pEU8a+載體，將該載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，挑選出陽性克隆，將 ー個陽性克隆接種到1000ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振搖培養(yǎng)至0D0. 6，加入0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，370C，200rpm振搖繼續(xù)培養(yǎng)8小吋。IOOOrpm離心5分鐘收集菌體。 用IOml細(xì)菌裂解液裂解菌體，超聲條件為功率400W，工作時間3S，間隙時間6S，工作次數(shù)200次。電泳鑒定SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白主要表達(dá)于包涵體。用Washing Buffer 洗滌包涵體，將Binding Buffer平衡鎳柱至基線平穩(wěn)；再用Binding Buffer稀釋的樣品上柱，繼續(xù)平衡至基線平穩(wěn)；然后加入Eluting Buffer洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測濃度和純度。最后，將上柱純化后的包涵體用復(fù)性緩沖液復(fù)性，將復(fù)性后的蛋白用PBS透析并濃縮，BCA定量。結(jié)果評價通過大腸桿菌表達(dá)體系，表達(dá)、純化得到了純度>95%的Grn G蛋白。實(shí)施例2 =GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)増殖
目的和原理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞増殖實(shí)驗(yàn)采用MTT Assay. MTT全稱為 3- (4, d; -dimethyltniahiazo (-z-yl) -3, 5-di- phenytetrazo丄iumromiae,是一禾1PjtC彥頁色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在490nm處進(jìn)行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會有反應(yīng)。方法用0.025%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用含洲胎牛血清及各種生長因子的M200培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔5xl03個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為lOOul。將培養(yǎng)板放入C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37度、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)M小吋。24小時后，對細(xì)胞進(jìn)行分別進(jìn)行處理，包括 MK+PGRN 各 100ng/ml， MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG100ng/ml， GrnG100ng/ml, MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG200ng/ml, GrnG200ng/ml, VEGFlOng/ml 以及無血清培養(yǎng)液的空白處理對照組。每個處理組做三個復(fù)孔，在C02培養(yǎng)箱中孵育48小時后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 10ul，在37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小吋，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150ul DMS0，振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸收值，記錄結(jié)果。結(jié)果與評價與MK+PGRN實(shí)驗(yàn)處理組和實(shí)驗(yàn)空白對照組相比，GrnG處理以后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞増殖能力受到抑制，說明GrnG不僅可以抑制MK+PGRN對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的増殖作用，而且對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞本身的増殖作用也具有抑制作用。實(shí)施例3 =GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移
目的和原理在細(xì)胞生長因子MK和PGRN的作用下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可以向沒有細(xì)胞的劃痕區(qū)域遷移，通過觀察遷入劃痕區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞量，來評價GrnG是否有具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力。方法用0.025%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用含洲胎牛血清及各種生長因子的M200培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔IxlO4個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為lOOul。將培養(yǎng)板放入C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37度、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)M小吋。M小時后，用Tip頭劃ー個一字形劃痕，用PBS洗凈劃下的細(xì)胞，對細(xì)胞分別進(jìn)行處理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG100ng/ml, GrnGl00ng/ml,MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ ml,VEGF10ng/ml以及無血清培養(yǎng)液的空白處理對照組。每個處理組做六個復(fù)孔，在C02培養(yǎng)箱中孵育6小時后，每隔3個小時在Leica倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照后用軟件對細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果評價通過統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示與MK+PGRN實(shí)驗(yàn)處理組和實(shí)驗(yàn)空白對照組相比，GrnG處理以后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力受到抑制，說明GrnG不僅可以抑制MK+PGRN 對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用，而且對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞本身的遷移作用也具有抑制作用。實(shí)施例4 =GrnG抑制肽抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Transwel 1小室遷移
目的和原理QCM 24-Well Colorimetric Cell Migration Assay Kit (CHEMICON)是 ー個快速高效的檢測細(xì)胞遷移的試劑盒，該試劑盒利用8um孔徑的膜，可以使幾乎所有的細(xì)胞通過，細(xì)胞穿過膜以后，將這部分遷移到膜底面的細(xì)胞染色觀察，并通過裂解后檢測吸光值來分析和比較遷移能力。方法人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于用含洲胎牛血清及各種生長因子的M200培養(yǎng)液中，按照 QCM 24-Well Colorimetric Cell Migration Assay Kit (CHEMICON)試劑盒的說明書要求進(jìn)行操作。首先將細(xì)胞用0. 025%胰蛋白酶消化單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，按5xl04個細(xì)胞/ml接種于小室中，對細(xì)胞分別進(jìn)行處理，包括 MK+PGRN 各 100ng/ml， MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG100ng/ml， GrnG100ng/ml, MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG200ng/ml, GrnG200ng/ml, VEGFlOng/ml 以及無血清培養(yǎng)液的空白處理對照組。M小時后，對細(xì)胞進(jìn)行染色，在普通Leica倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。并通過裂解穿過小室的細(xì)胞，在560nm下測定吸光值，對其進(jìn)行定量。結(jié)果與評價通過統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示與MK+PGRN實(shí)驗(yàn)處理組和實(shí)驗(yàn)空白對照組相比，GrnG處理以后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力受到抑制，說明GrnG不僅可以抑制 MK+PGRN對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用，而且對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞本身的遷移作用也具有抑制作用。實(shí)施例5 =GrnG抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管
目的和原理Fibrin Gel In Vitro Angiogenesis Assay Kit (CHEMICON)是ー個在 96孔板中檢測內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的操作方便的試劑盒。該試劑盒將細(xì)胞培養(yǎng)于Fibrin膠上，內(nèi)皮細(xì)胞可以在膠內(nèi)迅速的排列形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Fibrin膠是通過酶解Fibrinogen而形成的，酶解后的Fibrin可以形成半透明的，規(guī)則的，高分子矩陣，該試劑盒提供了一個合適的條件來利于內(nèi)皮細(xì)胞的成管。方法人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于用含洲胎牛血清及各種生長因子的M200培養(yǎng)液中，按照 Fibrin Gel In Vitro Angiogenesis Assay Kit (CHEMICON)試劑盒的說明書要求進(jìn)行操作。首先，將Thrombin液和Fibrinogen液溶解，將30ul Fibrinogen液加到96 孔板中，輕輕地晃動使溶液完全覆蓋底面。然后，將20ul Thrombin液加到96孔板中，馬上輕輕晃動，是兩者充分混勻，在37度孵育60分鐘。培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用0. 025% 的胰酶消化，用無血清培養(yǎng)液配成終濃度為5xl04個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞加到經(jīng) Fibrinogen處理后的96孔板中，并對細(xì)胞進(jìn)行處理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各 100ng/ml+GrnG100ng/ml, GrnGl00ng/ml,MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ ml,VEGF10ng/ml以及無血清培養(yǎng)液的空白處理對照組。M小時后，在普通Leica倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成管情況。
結(jié)果與評價內(nèi)皮細(xì)胞在Fibrin gel中生長12-1 后，單個細(xì)胞在Fibrin gel中延伸，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示與MK+PGRN實(shí)驗(yàn)處理組和實(shí)驗(yàn)空白對照組相比，GrnG處理以后，內(nèi)皮成管過程受到影響，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說明GrnG不僅可以抑制MK+PGRN 對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞微管形成，而且對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞本身的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞微管形成也具有抑制作用。實(shí)施例6 =GrnG抑制雞胚絨毛膜新生血管形成
目的和原理雞胚絨毛膜模型是ー個理想的血管發(fā)生模型，在雞胚培養(yǎng)的第5天，由于小血管尚未完全發(fā)育，便于定性或半定量的檢測樣品對新生血管生長的影響。方法將受精的雞胚置于孵化箱中孵化5天，在超凈工作臺中，用酒精擦拭表面， 在雞胚卵殼鈍端用鑷子開ー個小ロ，通過開出的小孔觀察胚胎所在的位置，在血管稀疏的地方撕開氣室膜，用滅菌透明膠帶封ロ，放入孵育箱中繼續(xù)孵育。孵育M小時后，將各處理組加到無菌明膠海綿上，包括 MK+PGRN 各 100ng/ml，MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG100ng/ml， GrnG 100ng/ml,MK+PGRN 各 100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGFlOng/ml 以及無血清培養(yǎng)液的空白處理對照組。將明膠海綿加在絨毛膜上無血管區(qū)，用滅菌透明膠帶封ロ，放入孵育箱中繼續(xù)孵育。兩天后，揭去透明膠帶，在OLYMPUS體式顯微鏡下拍照，觀察各處理組的血管新生情況。結(jié)果與評價通過觀察分析，結(jié)果顯示與MK+PGRN實(shí)驗(yàn)處理組和實(shí)驗(yàn)空白對照組相比，GrnG處理以后，雞胚絨毛膜的新生血管受到抑制，說明GrnG不僅可以抑制MK+PGRN 對雞胚絨毛膜的新生血管具有抑制作用，而且對雞胚絨毛膜本身的新生血管也具有抑制作用。
權(quán)利要求
1.ー種人中期因子抑制肽，該抑制肽以中期因子基因與顆粒蛋白相互作位點(diǎn)為靶標(biāo)， 其特征在于所述抑制肽的氨基酸序列為GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCP RGi7HCSADGRSCFQ。
2.ー種人中期因子抑制肽，其特征在于編碼這些抑制肽的多核苷酸片段序列為 3， -GGCCCCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACTTCC AGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCACGGGGCTTCCACTGC AGTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAA-5’。
3.ー種人中期因子抑制肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述抑制肽具有如下氨基酸序列GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGraCSADGRSCFQ。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述人中期因子抑制肽應(yīng)用于制備抑制腫瘤血管新生的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有抗血管新生作用的，其氨基酸序列為GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQ。本發(fā)明申請?zhí)峁┝颂禺愋砸种萍?xì)胞內(nèi)中期因子和顆粒蛋白前體相互作用的抑制肽，以及該肽在治療和預(yù)防腫瘤血管新生中的作用，為制備特異性抑制由中期因子引起的腫瘤血管新生藥物提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/12GK102558330SQ20101062036
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者姚行, 戴利成, 黃惠蓮 申請人:湖州市中心醫(yī)院