專利名稱：一種檢測遲緩愛德華氏菌、鲇魚愛德華氏菌或致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列及其檢 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及一種檢測遲緩愛德華氏菌、鲇魚愛德華氏 菌或致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列及其檢測方法和應用。
背景技術：
遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是水生動物常見的病原菌，其感染的宿主 范圍十分廣泛，有兩棲類(蟾蜍、蛙)、爬行類(蜥蜴、蛇、海龜、鱷魚)、魚類(鰻、鲇、鲆等)、 鳥類(企鵝、禿鷹、鴕鳥)和包括人在內的哺乳動物(海獅、海牛、豬、狗、牛、猴子)。遲緩愛 德華氏菌能在海水和淡水環(huán)境生存，感染多種野生和養(yǎng)殖魚類，引起以出血性敗血癥為主 要癥狀的愛德華菌病(Edwardsiellosis)。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，遲緩愛德華菌 病不僅影響多種淡水經(jīng)濟動物(鰻鱺、甲魚、牛蛙、鯽魚、草魚等)的養(yǎng)殖，還嚴重影響多種 海水經(jīng)濟魚類(大菱鲆、牙鲆、舌鰨、石斑、大黃魚等)的養(yǎng)殖，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損 失。遲緩愛德華氏菌是愛德華氏菌屬中唯一可以感染人、使人患病的病原，可通過消化道和 皮膚傷口等途徑感染人，引起腦膜炎、膽囊炎、心內膜炎、骨髓炎、軟組織感染、積膿癥、菌血 癥及敗血癥、痢疾、腸胃炎等，危害人類健康。我國動物疫病病種目錄將遲緩愛德華氏菌列 為有害生物，是我國和其他國家在水產(chǎn)品進出口貿(mào)易中必須檢疫的微生物。因此，建立遲緩 愛德華氏菌的鑒定和檢測方法、建立疫病的監(jiān)測和預警體系，是綜合控制愛德華菌病、保證 水產(chǎn)養(yǎng)殖健康持續(xù)發(fā)展和水產(chǎn)品質量和公共衛(wèi)生安全的需要。病原的鑒定和檢測方法有常規(guī)生理生化方法、免疫學方法和基于多聚酶鏈式反 應(PCR)的分子生物學方法。常規(guī)生理生化方法繁瑣費時，免疫學方法檢測靈敏度低、特 異性不高，難以滿足復雜多變的疾病疫情處理需要。PCR方法檢測時間短、特異性強、靈敏 度高，是目前快速而準確檢測病原的有效方法；同時，在普通PCR基礎上發(fā)展起來的多重 PCR(multiplex PCR)可以檢測和分析更多的靶基因，大大提高了檢測效率、降低了檢測成 本，成為醫(yī)學和獸醫(yī)學臨床診斷的主要手段。愛德華氏菌是水環(huán)境微生態(tài)系中的正常菌群，存在于水環(huán)境的沉積物、動植物表 面以及一些動物消化道中，有致病性和非致病性兩種生理型。當養(yǎng)殖環(huán)境不適或易感動物 免疫力降低時，致病性細菌容易感染動物導致疾病發(fā)生。正確鑒別致病性和非致病性遲緩 愛德華氏菌是準確診斷疾病、制定疫病有效防治措施的重要前提。愛德華氏菌屬的另一個 種細菌-鲇魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)也是魚類的重要病原菌，該病原在淡 水環(huán)境生存，可感染多種淡水魚類。根據(jù)全基因組序列比較分析結果，愛德華氏菌屬細菌 的基因組序列相似程度很高，目前報道的基于PCR的方法用于檢測愛德華氏菌存在以下問 題(1)不能在種的水平上從其它微生物中準確鑒別愛德華氏菌屬細菌；(2)不能在愛德華 氏菌屬的細菌準確區(qū)分遲緩愛德華氏菌和鲇魚愛德華氏菌；C3)不能準確區(qū)分致病性和非 致病性的愛德華氏菌屬細菌。目前越來越多的微生物全基因組序列得到詮釋，通過比較基 因組學和功能基因組學的研究可以全面深入地闡明微生物遺傳信息的差別和微生物的生物學功能，也為微生物的分子鑒定和鑒別提供了準確的信息。迄今為止，已有兩株遲緩愛德 華和一株鲇魚愛德華氏菌的全基因組序列得到測定，愛德華氏菌的致病機制正在得到逐步 的闡明。通過比較基因組學分析和致病功能基因的分析，遲緩愛德華和鲇魚愛德華氏菌既 存在種間的遺傳信息差別，也存在功能相同的基因信息，為建立準確的鑒別遲緩愛德華和 鲇魚愛德華氏菌的檢測方法奠定了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種檢測遲緩愛德華氏菌、鲇魚愛德華氏菌或致病性遲緩愛 德華氏菌的引物序列及其檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列 引物序列對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQID No. 4，所述引物分別為， SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ IDN0. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQID NO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。檢測鲇魚愛德華氏菌的引物序列引物序列對SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；所述引物分別為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC。檢測致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列引物序列對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6;所述引物分別 為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ IDN0. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。檢測致病性鲇魚愛德華氏菌的引物序列引物序列對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6;所述引物分別 為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ IDN0. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列的檢測方法以SEQ ID No. 1和SEQID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4為引物序列對，進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性 分析，若擴增產(chǎn)物片斷段出現(xiàn)500bp的條帶，即為遲緩愛德華氏菌陽性。檢測鲇魚愛德華氏菌的檢測方法以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4為引物序列對，進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若 擴增產(chǎn)物片斷段同時出現(xiàn)500bp和32!3bp的條帶，即為鲇魚愛德華氏菌陽性。檢測致病性遲緩愛德華氏菌的檢測方法以SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6為引物序列對，進行多重PCR擴增，擴 增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷同時出現(xiàn)955bp和500bp的條帶，即為致 病性遲緩愛德華氏菌陽性。檢測致病性鲇魚愛德華氏菌的檢測方法以SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6為引物序列對，進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷同時出現(xiàn)95^p、500bp、32;3bp的條帶， 即為致病性鲇魚愛德華氏菌陽性。檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列的應用所述引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境 的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別遲緩愛德華氏 菌的檢測試劑盒中。檢測鲇魚愛德華氏菌的引物序列的應用所述引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境 的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別鲇魚愛德華氏 菌的檢測試劑盒中。檢測致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列的應用所述引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng) 殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別致病性 遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒中。檢測致病性鲇魚愛德華氏菌的引物序列的應用，其特征在于所述引物序列可應 用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出口動物、水產(chǎn)品 的鑒別致病性鲇魚愛德華氏菌的檢測試劑盒中。通過本發(fā)明的引物序列SEQ ID No. 1-4擴 增出的500bp的DNA條帶為遲緩愛德華氏菌和鲇魚愛德華氏菌保守的rpoS基因片段，而 323bp的DNA條帶為鲇魚愛德華氏菌特有的條帶，在遲緩愛德華氏菌中沒有，本發(fā)明利用建 立的多重PCR方法，根據(jù)上述兩種DNA特異條帶的出現(xiàn)，可以檢測和區(qū)分遲緩愛德華氏菌和 鲇魚愛德華氏菌。通過本發(fā)明的引物序列SEQ IDNo. 5和6擴增出的95^p的DNA條帶為 致病性遲緩愛德華氏菌和致病性鲇魚愛德華氏菌保守的esaV基因片段，本發(fā)明利用建立 的多重PCR方法，根據(jù)上述三種DNA條帶的出現(xiàn)，可以檢測和區(qū)分致病性遲緩愛德華氏菌和 致病性鲇魚愛德華氏菌。本發(fā)明所具有的優(yōu)點普通PCR擴增在同一反應體系有一對引物，只能擴增一個目的基因；本發(fā)明采用 多重PCR擴增在同一反應體系有兩對以上引物，可擴增2個以上目的基因，因而多重PCR 比單重PCR更節(jié)省試劑、時間和工作量，從而降低成本、提高效率。本發(fā)明提供的引物序列 和多重PCR擴增特異性強、靈敏度高，可從多種細菌微生物中快速檢測遲緩愛德華氏菌，并 進一步區(qū)分致病性和非致病性菌株，在3小時內同時完成遲緩愛德華氏菌在種、致病型和 非致病型的鑒別檢測，每個擴增反應的檢測靈敏度為10 100個細菌。本發(fā)明提供的檢 測方法可應用于多種含遲緩愛德華氏菌樣品的分析和檢測，如水生環(huán)境的水、沉積物、動物 (魚、蝦、貝、甲魚、牛蛙、浮游動物等)及其排泄物、植物(浮游植物、藻類等)，進出口水生 動植物、水產(chǎn)品，醫(yī)院疑似病人的嘔吐物、腸積液、排泄物等。本發(fā)明提供的檢測試劑盒特 異、靈敏、快速和簡便，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、商檢、醫(yī)院對愛德華氏菌病的診斷，在臨床診斷和 疾病控制方面具有很大的應用價值。


圖1為本發(fā)明實施例提供的多重PCR鑒別和檢測遲緩愛德華氏菌的電泳顯色圖， 其中M:Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；C:空白對照(不 添加任何DNA模板)；泳道1-36為遲緩愛德華氏菌(E. tarda)，如表1所示的1_36 ；泳道 37-66為其它種類細菌，如表1所示的37-66 ；泳道67為鲇魚愛德華氏菌(E. ictaluri)，如
6表1所示的67。圖2為本發(fā)明實施例提供的單重PCR鑒別致病性遲緩愛德華氏菌的電泳顯色圖， 其中M :Trans 2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；C 空白對照(不 添加任何DNA模板)；泳道1-9分別為致病性遲緩愛德華氏菌，如表1所示的1-9 ；泳道 10-21分別為非致病性遲緩愛德華氏菌，如表1所示的19-30。圖3為本發(fā)明實施例提供的多重PCR鑒別致病性遲緩愛德華氏菌的電泳顯色圖， 其中M JrandK Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；C:空白對照(不添 加任何DNA模板)；泳道1-9分別為致病性遲緩愛德華氏菌，如表1所示的1-9 ；泳道10-12 為非致病性遲緩愛德華氏菌，如表1所示的19-21 ；泳道13為致病性遲緩愛德華氏菌，如表 1所示的10 ；泳道14-28為非遲緩愛德華氏菌，如表1所示的22-36 ；泳道四_36為致病性 遲緩愛德華氏菌，如表1所示的11-18 ；泳道37-44為其它種類細菌，如表1所示的37-44 ； 泳道45為鲇魚愛德華氏菌(E. ictaluri)，如表1所示的67。圖4為本發(fā)明實施例提供的分析牙鲆養(yǎng)殖池塘水樣是否有遲緩愛德華氏菌的電 泳顯色圖，其中M:Trans 2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；1 12 水樣1 12 ； 13 空白對照(不添加任何DNA模板)。圖5為本發(fā)明實施例提供的分析工廠化大菱鲆養(yǎng)殖水體蓄水池水樣的電泳顯色 圖，其中M:Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；1 7:養(yǎng)殖場 A G ;8 空白對照(不添加任何DNA模板)圖6為本發(fā)明實施例提供的分析工廠化大菱鲆養(yǎng)殖水體蓄水池底泥的電泳顯色 圖，其中M =Trans 2K Plus II DNA ma rke r(北京全式金生物技術有限公司)；1 7 養(yǎng) 殖場A G ;8 空白對照(不添加任何DNA模板)。圖7為本發(fā)明實施例提供分析工廠化養(yǎng)殖大菱鲆的電泳顯色圖，其中M :Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技術有限公司)；1 8 腎組織9 空白對照(不添 加任何模板)。
具體實施例方式實施例1快速鑒別檢測遲緩愛德華氏菌本實施例利用多重PCR方法，用以在一個PCR反應管中通過一次PCR反應，從含 有遲緩愛德華氏菌的診斷樣品中快速鑒別檢測遲緩愛德華氏菌，即從表1中提供的各菌株 中快速鑒別檢測遲緩愛德華氏菌，其中所述各菌株均可參見相關文獻中的報道從市面流通 渠道中獲得，為此提供優(yōu)選引物對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，提供的優(yōu)選的 PCR 反應體系為IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0.4 μ M/L SEQ ID No. 1,0. 4 μ M/L SEQ ID No. 2,0. 2 μ M/L SEQ ID No. 3,0. 2 μ M/ L SEQ ID No. 4，1. 0 μ 1模板，添加蒸餾水至25 μ 1。提供優(yōu)選的PCR反應條件為94°C預變 性3 5min ；94°C變性45秒，60. 6 60. 8°C退火45秒，68°C 72°C延伸1. 5 2. 5分鐘； 進行30 35個循環(huán)；72°C延伸5 lOmin。提供優(yōu)選的定性觀測方法為對擴增產(chǎn)物進行 1 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色顯示擴增產(chǎn)物大小，觀察到擴增產(chǎn)物片斷大 小只有500bp的樣品判定為遲緩愛德華氏菌陽性，如圖1的泳道1-36 ；觀察到擴增片段同時有500bp和32!3bp的判定為鲇魚愛德華氏菌陽性，如圖1的泳道67 ；未擴增到上述任何 片段的判斷為遲緩愛德華氏菌陰性，如圖1的37-66泳道(參見表1)。引物對分別為SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAGSEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCCSEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGTSEQ ID NO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。實施例2從遲緩愛德華氏菌菌株中鑒別致病性菌株，即從實施例1中篩選出的遲緩愛德華 氏菌陽性為模板。本實施例利用單重PCR方法，用以從遲緩愛德華氏菌菌株中鑒別致病性菌株， 為此提供的優(yōu)選序列引物對SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6，提供的優(yōu)選PCR反應體系 % =IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0.4yM/L SEQ ID No. 5， 0.4 μ M/L SEQ ID No. 6，1. 0 μ 1模板，添加蒸餾水至25 μ 1。提供優(yōu)選的PCR反應條件為 94°C預變性3 5min ；94°C變性45秒；50 62°C退火45秒；72°C延伸50秒 1分30秒； 進行30 35個循環(huán)；72°C延伸5 lOmin。提供優(yōu)選的定性觀測方法為對擴增產(chǎn)物進行 1 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色顯示擴增產(chǎn)物大小，觀察到擴增產(chǎn)物片斷大 小只有955bp的樣品判定為遲緩愛德華氏菌陽性，如圖2的1-9泳道；未擴增到任何片段的 判定為遲緩愛德華氏菌陰性，如圖2的10-21泳道。引物對分別為SEQ ID N0. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAASEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。 同時也可以利用多重PCR方法，用以在一個PCR反應管中通過一次PCR反應，從其 它微生物中快速鑒別和檢測致病性遲緩愛德華氏菌，為此提供的優(yōu)選引物為SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。提供的優(yōu)選 多重 PCR 反應體系為=IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0. 4μΜ/ L SEQ ID No. 1,0.4 μ M/L SEQ ID No. 2，0.2 μ M/L SEQ ID No. 3，0.2 μ M/L SEQ ID No. 4， 0.4 μ M/L SEQ ID No. 5,0. 4 μ M/L SEQ ID No. 6，1. 0 μ 1 模板，添加蒸餾水至 25 μ 1。提供 優(yōu)選的PCR反應條件為94°C預變性3 5min ；94°C變性45秒，60. 6 60. 8°C退火45秒， 68°C 72°C延伸1. 5 2. 5分鐘；進行30 ；35個循環(huán)；72°C延伸5 IOmi η。提供優(yōu)選 的定性觀測方法為對擴增產(chǎn)物進行1 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色顯示擴 增產(chǎn)物大小，同時觀察到擴增產(chǎn)物片斷大小為955bp和500bp的樣品判定為致病性遲緩愛 德華氏菌陽性，如圖3的泳道1-9、13、29-36 ；只觀察到擴增產(chǎn)物片斷大小為500bp的樣品 判定為非致病性遲緩愛德華氏菌陽性，如圖3的泳道10-12、14-28 ；同時觀察到擴增產(chǎn)物片 斷大小為95^p、500bp、32;3bp的樣品判定為遲緩愛德華氏菌陰性、致病性鲇魚愛德華氏菌 陽性，如圖3的泳道45 ；未擴增到上述任何片段的判斷為遲緩愛德華氏菌陰性，如圖3的泳 道37-44(參見表1)。引物對分別為SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG
SEQIDNO.2:TCGTTCTGGGTGCAATCC
SEQIDNO.3CCTGGCGTTCCACCACTATGT
SEQIDNO.4GCCTTGATGACTATGCCGTTC
SEQIDNO.5GGTCAATAGCTGGCTACACAA
SEQIDNO.6GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT表1實施例使用的菌株來源及其PCR檢測結果
權利要求
1.一種檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列，其特征在于引物序列對SEQ ID No. 1 禾口 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 禾口 SEQ ID No. 4，所述引物分另Ij 為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQIDN0. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。
2.一種檢測鲇魚愛德華氏菌的引物序列，其特征在于引物序列對SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；所述引物分別為，SEQ ID NO. 1 :GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQ IDNO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。
3.—種檢測致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列，其特征在于引物序列對SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和 SEQ ID No. 6 ；所述引物分別 為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ； SEQ IDNO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。
4.一種檢測致病性鲇魚愛德華氏菌的引物序列，其特征在于引物序列對SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和 SEQ ID No. 6 ；所述引物分別 為，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ； SEQ IDNO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ； SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ； SEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。
5.一種權利要求1所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列的檢測方法，其特征在于 以 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 為引物序列對，進行多重 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷段出現(xiàn)500bp的條帶，即為遲緩 愛德華氏菌陽性。
6.一種權利要求2所述的檢測鲇魚愛德華氏菌的檢測方法，其特征在于以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4為引物序列對，進行多重PCR擴增，擴增 產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷段同時出現(xiàn)500bp和323bp的條帶，即為鲇 魚愛德華氏菌陽性。
7.—種權利要求3所述的檢測致病性遲緩愛德華氏菌的檢測方法，其特征在于以SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 為引 物序列對，進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷同時出 現(xiàn)955bp和500bp的條帶，即為致病性遲緩愛德華氏菌陽性。
8.—種權利要求4所述的檢測致病性鲇魚愛德華菌的檢測方法，其特征在于以SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 為引 物序列對，進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳進行定性分析，若擴增產(chǎn)物片斷同時出 現(xiàn)95^p、500bp、32;3bp的條帶，即為致病性鲇魚愛德華氏菌陽性。
9.一種權利要求1所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物序列的應用，其特征在于所述 引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出 口動物、水產(chǎn)品的鑒別遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒中。
10.一種權利要求2所述的檢測鲇魚愛德華氏菌的引物序列的應用，其特征在于所述 引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別鲇魚愛德華氏菌的檢測試劑盒中。
11.一種權利要求3所述的檢測致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列的應用，其特征在 于所述引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物 或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別致病性遲緩愛德華氏菌的檢測試劑盒中。
12.—種權利要求4所述的檢測致病性鲇魚愛德華氏菌的引物序列的應用，其特征在 于所述引物序列可應用于對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水樣、泥樣、動物及其排泄物、動物餌料、植物 或進出口動物、水產(chǎn)品的鑒別致病性鲇魚愛德華氏菌的檢測試劑盒中。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及一種檢測遲緩愛德華氏菌、鲇魚愛德華氏菌或致病性遲緩愛德華氏菌的引物序列及其檢測方法和應用。所述引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增檢測的方法，進一步涉及致病性和非致病性遲緩愛德華氏菌檢測用引物及應用所述引物進行單重和多重擴增檢測的方法；本發(fā)明進一步涉及包含上述引物的遲緩愛德華氏菌、致病性和非致病性遲緩愛德華氏菌的檢測用試劑盒。本發(fā)明采用多重PCR擴增在同一反應體系有兩對以上引物，可擴增2個以上目的基因，因而多重PCR比單重PCR更節(jié)省試劑、時間和工作量，從而降低成本、提高效率。
文檔編號C12Q1/68GK102140513SQ201010620648
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2010年12月24日
發(fā)明者李 杰, 李貴陽, 肖鵬, 莫照蘭 申請人:中國科學院海洋研究所