專利名稱：Gap啟動子文庫在調節(jié)s-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域；更具體地，本發(fā)明涉及GAP啟動子在調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應用。
背景技術：
在過去的幾十年里，為了提高微生物發(fā)酵產量，越來越多的基因工程手段被應用到代謝工程中。但是大多數(shù)情況下，這些嘗試都無法達到預期的效果，有的甚至與預期的結果截然相反。在改造代謝途徑的研究中，為了增加特定目的代謝產物或構建具有過量生產能力且能應用于工業(yè)生產的工程菌，常采用過表達限速反應步驟中相關酶和阻斷目的產物分支代謝途徑這兩個傳統(tǒng)的策略。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)作為所有生物體內的重要甲基供體，無論是在抑郁癥，肝臟疾病還是關節(jié)炎治療領域都具有良好的臨床應用價值。正因為SAM具備如此廣泛的應用價值，越來越多的研究人員利用代謝工程改變細胞的代謝途徑以獲得高產SAM的菌株。過表達和基因敲除這兩個基因操作手段成功地應用到了 SAM高產菌的代謝工程改造中強化S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(saml和san^)的表達量，提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)的活性，從而增加SAM的產量；敲除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，增加胞內SAM的積累。野生菌中，MAT酶活是SAM產量提高的限速步驟，提高細胞內部的SAM合成酶的酶活有利于胞內SAM的累積。有兩條途徑可以提高重組菌胞內的SAM合成酶的酶活，即提高胞內SAM合成酶的量或者提高所表達的外源SAM合成酶的比酶活。對于前者，將外源SAM合成酶基因在適合的宿主菌中進行強化表達，通過體外添加L-Met來實現(xiàn)SAM的高產。已有研究者將克隆得到的S. cerevisiae來源的sam2基因置于醇氧化酶_1 (AOXl)啟動子調控下，整合至畢赤酵母Pichia pastoris，獲得了 SAM累積量比野生株高30多倍的重組菌。而對于后者，可利用DNA Shuffling來增強SAM合成酶的酶活。Hu (H. Hu. J. C. Qian. J. Chu.Y. Wang. Y. P. Zhuang. S. L. Zhang. DNA shuffling of methionine adenosyltransferasegene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production in Pichia pastoris.Journal of Biotechnology. 2009,141 :97-103)等為了提高外源SAM合成酶在重組畢赤酵母胞內的活力，以來源不同的三種SAM合成酶基因為出發(fā)材料，利用DNA Shuffling技術對SAM合成酶進行體外進化。經過篩選獲得了一株整合了編碼高酶活SAM合成酶基因的重組畢赤酵母菌株GS115/DS56，在搖瓶中，GS115/DS56的胞內SAM累積量為1. 64g/L，SAM合成酶的酶活達到463U/gDCW，比含來源于母本的SAM合成酶的重組菌分別提高了 102%和201%，有效改善了胞內SAM合成酶的酶活對SAM合成的限制。然而，Hu等還發(fā)現(xiàn)，GS115/DS56胞內的SAM合成酶的酶與出發(fā)菌株相比提高了 2. 8倍，但是SAM的單位菌體產量只提高了 13%，胞內SAM合成酶的酶活達到一定水平后，對合成SAM的促進作用十分有限。實驗表明單獨增加限速酶量有時并不有效。在過表達該酶的過程中還可能造成一些細胞生長必需物質的減少，菌體代謝負擔加大，或者是代謝過程所需輔因子的平衡被打破，最終相對于整個代謝網絡而言該途徑的通量是減少的，這也是該方法的缺陷所在。很多研究表明，基因的適度表達比過量表達能達到更好的效果。將SAM分解代謝途徑進行阻斷是增加細胞內SAM積累的另一有效策略。敲除β -胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，可以實現(xiàn)胞內SAM積累的增加。L-Met和ATP經SAM合成酶催化反應生成SAM，SAM通過轉甲基反應很容易生成SAH，后者可以通過水解生成同型高半胱氨酸和腺苷，同型高半胱氨酸有三個流向一是再次甲基化形成L-Met，二為在胱硫醚合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)的作用下和絲氨酸化合生成胱硫醚，三為通過SAH水解酶作用逆反應生成SAH。其中第一、三流向均為L-Met和SAM閉循環(huán)，而第二個流向由于通過CBS將巰基從同型高半胱氨酸源源不斷移出來，影響了 SAM的積累濃度。細胞內若存在過量的L-Met，SAM的產量將會提高 80 倍(F. Schlenk. C. R. Zydek. D. J. Ehninger. J. L. Dainko. The production ofS-adenosyl-L-methionine and S-adenosyl-L-ethionine by yeast. Enzymologia. 1965,29 :283-298)。胱硫醚β -合成酶(CBQ是細胞轉硫途徑的第1個酶，催化絲氨酸和高半朧氨酸合成胱硫醚和生成水。理論上，敲除胱硫醚β-合成酶基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，可增加L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而提高SAM 的胞內累積量。鑒于此，He 等(J. He. J.Deng· Y. Zheng. J. Gu. A synergistic effecton the production of S-adenosyl-L-methionine in Pichia pastoris by knockingin of S-adenosyl-L-methionine synthase and knocking out of cystathionine-betasynthase. J Biotechnol. 2006，126 :519-527)通過基因敲除的方法將過量表達SAM合成酶的畢赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，結果SAM積累量提高了兩倍多，效果相當明顯；但是，將SAM分解代謝途徑β-胱硫醚(CBS)完全阻斷，重組菌成為營養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中需外源添加谷胱甘肽(GSH)。因此也導致發(fā)酵成本大大提高。雖然相對要提高的目的代謝物而言，一些支路代謝途徑對于細胞生長并不是必需的，即便完全阻斷該途徑也不會影響細胞的存活，但是這些代謝途徑中的一些代謝物可能用于維持細胞內的輔因子平衡，或可能調控其他代謝途徑中的代謝物。因此，去除這些旁路可能造成細胞整個代謝能力的減弱，最終也影響到目的產物的產量提高，這也是完全阻斷代謝途徑的缺陷所在?？偠灾?，在代謝途徑中限速步驟往往是由多個基因控制的，因此成功的代謝工程操作需要對多個基因的表達進行平衡操作才能實現(xiàn)目的?；诩毎麅却x網絡的復雜性，過表達限速步驟關鍵酶或敲除代謝支路支點的酶這兩種傳統(tǒng)方式已遠遠不能滿足代謝工程的要求，科研工作者越來越傾向于對細胞內的代謝網絡進行精確地控制和調節(jié)。取而代之，在一寬廣的范圍內實現(xiàn)對相關基因的連續(xù)微調并找到最佳表達水平(最大化該代謝途徑通量或目的產物的對應基因表達水平)已成為代謝優(yōu)化必不可少的手段。隨后，以同樣的方式優(yōu)化第二、三……個代謝物的表達水平。因此，只有對代謝途徑中多個酶同時進行調控(強化或弱化相關酶的表達)，才能實現(xiàn)某個代謝途徑的通量的增加。這就要求在代謝工程操作中對基因表達進行連續(xù)精細的調控。為了實現(xiàn)基因表達的連續(xù)微調，也有研究人員利用誘導表達系統(tǒng)來調控目的基因。無論是通過改變誘導劑的濃度來實現(xiàn)基因的連續(xù)微調，還是利用溫度、溶氧或PH誘導系統(tǒng)通過改變發(fā)酵控制參數(shù)來實現(xiàn)基因的微調，這些誘導系統(tǒng)存在許多缺陷。利用誘導型啟動子可以通過不同濃度的誘導劑在一定程度上實現(xiàn)對基因不同表達強度的控制，但是誘導劑通常比較昂貴，對細胞具有一定的毒性，而且細胞對誘導劑感應存在非均一性。發(fā)酵參數(shù)的控制(如溫度、溶氧或PH的控制)難以實現(xiàn)在小范圍內的改變，也難以在大規(guī)模的發(fā)酵體系中快速達到設定值。而且，誘導表達系統(tǒng)均無法達到基因的穩(wěn)定表達。因此現(xiàn)有的一些誘導系統(tǒng)，無論是基于化學試劑還是基于發(fā)酵控制參數(shù)，都不能實現(xiàn)在大規(guī)模工業(yè)生產中基因的精確調控，也無法實現(xiàn)同時對多個基因連續(xù)調控。因此，本領域目前還需要對SAM生產菌株的基因表達調控進行深入研究，找到改變細胞的代謝途徑以獲得高產的新途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供GAP啟動子文庫在調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中的應用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種突變型GAP啟動子文庫的用途，用于調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑，從而調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量；其中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQID NO :3所示核苷酸序列的啟動子。在一個優(yōu)選例中，所述的調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑為調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ的表達。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動子，用于提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。在另一優(yōu)選例中，所述的GAP啟動子通過下調(非阻斷)β-胱硫醚合成酶的表達提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。在本發(fā)明的另一方面，提供一種構建物，所述的構建物包括以下操作性相連的元件(5’ 一 3’) β -胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側翼序列；抗性選擇標記；選自SEQ IDNO=USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子；β -胱硫醚合成酶的編碼基因。在另一優(yōu)選例中，所述的構建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生產菌的基因組中，從而調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑。在另一優(yōu)選例中，所述的β-胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側翼序列具有SEQ IDNO :5所述的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的β-胱硫醚合成酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO 6所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量的方法，包括以選自突變型GAP啟動子文庫的啟動子來調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸生產菌的S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達，從而調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量；其中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQID NO :3所示核苷酸序列的啟動子。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(1)提供一種表達載體，其中包含所述的構建物；(2)將(1)所述的表達載體轉化S-腺苷甲硫氨酸生產菌，使得所述的構建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產量相對于基因組中未整合所述構建物的S-腺苷甲硫氨酸生產菌發(fā)生改變。在另一優(yōu)選例中，(1)中，還包括以下元件ori，fl origin,以及多克隆位點(酶切位點)，終止子；這些元件在表達載體上操作性相連。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性選擇標記選自(但不限于)=Zeocin或Kan。在另一優(yōu)選例中，選自所述的突變型GAP啟動子文庫的啟動子包括選自SEQ IDNO 2或SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的啟動子，其下調(非阻斷)β -胱硫醚合成酶的表達，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的S-腺苷甲硫氨酸生產菌，其基因組中整合有所述的構建物。在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產菌是酵母。在另一優(yōu)選例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產菌是重組畢赤酵母。在本發(fā)明的另一方面，提供一種突變型GAP啟動子，所述的啟動子的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的突變型GAP啟動子(如SEQ ID NO 3所示)的用途，用于下調S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ的表達，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、畢赤酵母SAM代謝途徑。圖2、啟動子G0，G6和G12相對強度。圖3、CBS啟動子替換載體pGAP-CBS的構建示意圖。圖4、重組質粒驗證圖。其中，(A)質粒pGAP-Z-TT的酶切驗證。Lanel 質粒經Mil線性化驗證；Lane2 質粒經NotI 和 SalI 雙酶切驗證；Lane3 :DNA Marker。(B)質粒pET-Z-TT的酶切驗證。Lanel 質粒經BamHI線性化驗證；Lane2 質粒經NotI 和 BamHI 雙酶切驗證；Lane3、4 :DNA Marker。(C)質粒pET-Z-TT-GAP的酶切驗證。Lane2 質粒經NotI和1雙酶切驗證；Lane3 質粒經 XbaI 線性化驗證；Lanel、4 =DNA Marker。(D)質粒pGAP-CBS的酶切驗證。Lanel 質粒經XhoI和NotI雙酶切驗證；Lane2 質粒經EcoRI和XbaI雙酶切驗證；Lane3 質粒經EcoRI線性化驗證；Lane4、5 =DNA Marker。(E)質粒 pGO-CBS，pG6_CBS 和 pG12_CBS 的酶切驗證；Lanel_3 質粒經 XbaI 線性化驗證；Lane4-6 質粒經 XbaI 和 BamHI 雙酶切驗證；Lane7、8 =DNAMarker0圖5、重組菌GO-CBS，G6-CBS和G12-CBS陽性克隆菌落PCR驗證(A)重組菌 GO-CBS 和 G6-CBS 用引物 GAP F5/CBS R2 進行 PCR 驗證。Lanel-6 重組菌 GO-CBS 的 PCR 驗證；Lane7-12 重組菌 G6-CBS 的 PCR 驗證；Lanel3 :DNA Marker。
(B)重組菌G12-CBS用引物GAP F5/CBS R2進行PCR驗證。Lane 1-6 重組菌G12-CBS 的 PCR 驗證；Lane7 :DNA Marker。(C)重組菌 GO-CBS 和 G6-CBS 用引物 PCBS F/TZ R 進行 PCR 驗證。Lane 1-6 重組菌 GO-CBS 的 PCR 驗證；Lane8-13 重組菌 G6-CBS 的 PCR 驗證；Lane7 =DNAMarker0(D)重組菌G12-CBS用引物PCBS F/TZ R進行PCR驗證。Lane 1-6 重組菌G12-CBS的 PCR 驗證；Lane7 :DNA Marker。圖6、重組菌GO-CBS、G6-CBS、G12-CBS和對照菌DS16生長比較。圖7、比較重組菌GO-CBS、G6-CBS和G12-CBS與對照菌DS16的SAM產量。A 重組菌GO-CBS、G6-CBS和G12-CBS與對照菌DS16的SAM單位菌體產量比較；B 與對照菌DS16相比重組菌G0-CBS、G6-CBS和G12-CBS的SAM產量增加百分比。圖 8、重組菌 G0-CBS、G6-CBS、G12-CBS 和對照菌 DS16 的 cys4 mRNA 轉錄水平、CBS酶活和SAM產量比較。A 各重組菌CBS轉錄水平和CBS酶比酶活比較；B 各重組菌SAM單位菌體產量和CBS酶比酶活比較。圖9、誘導前重組菌G0-CBS、DS16、G6-CBS和G12-CBS胞內L-Met水平比較。圖10、15L發(fā)酵罐中G12-CBS和DS16的SAM產量比較。
具體實施例方式本發(fā)明人經過廣泛的研究，采用組成型啟動子文庫(突變型GAP啟動子文庫)實現(xiàn)了 S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達的精確調控，找到了提高S-腺苷甲硫氨酸產量的切實可行的方法。在此基礎上完成了本發(fā)明。術語如本文所用，所述的“啟動子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。如本文所用，所述的“GAP啟動子文庫”(也稱為“突變型GAP啟動子文庫”)是指含有本發(fā)明的一系列突變型GAP啟動子的核酸集合體。較佳地，所述的“GAP啟動子文庫”包括選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子。 如本文所用，所述的“GAP啟動子”簡稱為pGAP、Pgap或Pe。如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性相連”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子的引導，從而，啟動子被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“弱化型GAP啟動子”是指相對于野生型GAP啟動子(其序列如SEQ ID N0:4所示)其調控目的基因表達的強度顯著弱化，例如弱化10%以上，較佳的弱化20%以上，更佳的弱化30%以上，如弱化50%以上、弱化80%以上或弱化100%以上。較佳地，除非另外說明，所述的“弱化型GAP啟動子”是指SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子。如本文所用，所述的“增強型GAP啟動子”是指相對于野生型GAP啟動子其調控目的基因表達的強度顯著增強，例如增強10 %以上，較佳的增強20 %以上，更佳的增強30%以上，如增強50%以上、增強80%以上或增強100%以上。其調控目的基因表達的強度可通過檢測目的的基因表達量而得知，表達量的檢測是本領域技術人員熟知的技術。較佳地，除非另外說明，所述的“增強型GAP啟動子”是指SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的啟動子。如本文所用，“目的基因”是指可由本發(fā)明的啟動子指導表達的基因。較佳地，除非另外說明，所述的“目的基因”是指胱硫醚合成酶(CBS)。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。GAP啟動子文庫為了實現(xiàn)對S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達的連續(xù)微調，本發(fā)明人選擇了一組突變型GAP啟動子，包括SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3所示核苷酸序列的啟動子，構成啟動子文庫，各啟動子調控目的基因表達的強度呈現(xiàn)梯度分布，用于在不同強度下指導目的基因表達。啟動子文庫的獲得可保證對所調控的目的基因表達進行梯度調節(jié)，實施可控基因擾動和系統(tǒng)分析。本發(fā)明還包括具有與上述的任一種啟動子序列具有80%以上，更優(yōu)地選90%以上，最優(yōu)選地95%以上(如98%、99%)相同性的啟動子，它們保留有與上述啟動子相同的功能以及啟動目的基因表達的強度?！跋嗤浴笔侵赴凑瘴恢孟嗤陌俜直?，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因前，該目的基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因是S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶(CBQ。通過調節(jié)β-胱硫醚合成酶的表達強度，可以調節(jié)SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，調節(jié)L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而改變SAM的胞內累積量。例如通過弱化β-胱硫醚合成酶的表達強度，可以弱化SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，增加L-Met合成SAM的代謝途徑通量，從而提高SAM的胞內累積量。表達載體和宿主細胞來自于本發(fā)明的啟動子文庫的任何一種啟動子和/或目的基因序列可被包含在構建物或重組表達載體中。為了改變S-腺苷甲硫氨酸生產菌的代謝途徑，使其在本發(fā)明的啟動子調控下表達CBS，本發(fā)明人設計了構建物。所述的構建物包括胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側翼序列；抗性選擇標記；選自SEQ ID NO =USEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的啟動子；β-胱硫醚合成酶的編碼基因。所述的構建物用于整合到S-腺苷甲硫氨酸生產菌的基因組中，從而調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑。當用于轉化S-腺苷甲硫氨酸生產菌時，所述的構建物被包含在表達載體中。用于制備重組載體的方法是本領域技術人員所熟知的。術語“表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都是可以被采用的。優(yōu)選的，所述的表達載體是酵母細胞適用的表達載體。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子和編碼基因，還可含有一種或多種其它啟動子或編碼基因。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導型的。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的重組表達載體包括(從5’到3’方向)β_胱硫醚合成酶的編碼基因的5’側翼序列，pTEF，抗性選擇標記(如koCin、Kan)，A0Xl TT，選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子，β -胱硫醚合成酶的編碼基因，ori，抗性選擇標記(如k0Cin、Kan)，fl origin，以及多克隆位點(酶切位點)，終止子；這些元件在表達載體上操作性相連。所述的重組表達載體用于轉化S-腺苷甲硫氨酸生產菌，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產菌是酵母；更佳地，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產菌是重組畢赤酵母。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸產量的方法本發(fā)明還提供了一種調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量的方法，包括以選自所述突變型GAP啟動子文庫的啟動子來調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達，從而調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量；其中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述方法包括(1)提供一種表達載體，其中包含所述的構建物；(2)將(1)所述的表達載體轉化S-腺苷甲硫氨酸生產菌，使得所述的構建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產量相對于基因組中未整合所述構建物的S-腺苷甲硫氨酸生產菌發(fā)生改變。組成型啟動子文庫應用于基因的連續(xù)微調組成型啟動子文庫作為基因精確調控的新工具克服了誘導啟動子的缺點，對組成型啟動子進行人工進化可以得到不同活性范圍的啟動子，實現(xiàn)單個或多個基因同時的精細、穩(wěn)定調控。代謝控制理論告訴人們只有對代謝途徑中多個酶同時進行調控，才能實現(xiàn)某個代謝途徑的通量的增加。因此，對于SAM代謝的調控，不僅要調控MAT酶活水平，還要嘗試在適度表達MAT的同時減少SAM分解代謝途徑的通量，以實現(xiàn)SAM合成的最大化。弱化SAM分解代謝途徑是增加細胞內SAM積累的另一有效策略。通過基因敲除的方法將過量表達SAM合成酶的畢赤酵母菌株的CBS合成基因缺失掉，結果SAM積累量提高了兩倍多，效果相當顯著；但是，將SAM分解代謝途徑β-胱硫醚(CBQ完全阻斷，重組菌成為營養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中需外源添加GSH。因此本發(fā)明人在此采用更合理的方案，將CBS酶活降低，以實現(xiàn)CBS合成途徑通量的減少，以維持細胞自身生長所必需的物質，而不是完全將CBS酶失活以阻斷轉硫途徑。綜上所述，用傳統(tǒng)的基因缺失的方式阻斷CBS代謝途徑，并不明智，而將其進行弱化，減少SAM的代謝通量更值得研究。因此本發(fā)明主要研究了不同強度啟動子調控CBS表達，實現(xiàn)CBS合成途徑流量不同程度弱化，以考查其對細胞內SAM積累的影響。本實驗以整合了編碼高酶活SAM合成酶基因dsl6(MAT酶活為1. 14U/mg蛋白)的重組畢赤酵母菌株GS115/DS16[1]為出發(fā)菌株，用GAP啟動子文庫中弱啟動子對GS115/DS16的CBS基因進行調控，以弱化CBS途徑，GAP突變啟動子包括PTO，PG6, Pei2，啟動子強度依次降低，構建的對應重組菌分別為 GO-CBS、G6-CBS 和 G12-CBS。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、重組質粒pGO-CBS，pG6_CBS和pG12_CBS的構建CBS啟動子替換載體pGAP-CBS的構建過程如圖3。首先以質粒pPICZ A(購自Invitrogen)為模板，用引物TZ F/TZ R(表1)擴增帶kocin抗性片段TEF-kocin，經限制性內切酶Not I和MlI雙酶切并與同樣方法酶切質粒pGAPZA連接獲得重組質粒PGAP-Z-TT0重組質粒酶切驗證如圖4A，pGAP-Z-TT經Mil單酶切后得到3. 7kb的線性化片段；經NotI和MlI雙酶切，得到961bp插入的目的條帶與2. 7kb的載體片段。重組質粒pGAP-Z-TT經Not I和BamHI雙酶切后約1. 2kb片段與經同樣方式酶切的質粒PET 28a連接獲得重組質粒pET-Z-TT。重組質粒酶切驗證如圖4B。pET-Z-TT經BamHI線性化后為6. 56kb ；經NotI和BamHI雙酶切驗證，切下目的條帶為1. 2kp，余下載體片段為5. 3kb0以質粒pGAPZA(Invitrogen)作為模板，利用引物GAP F B/GAP R X(表1)，擴增得到的GAP啟動子片段經BamH I和)(baI酶切，連接經同樣方法酶切的載體pET-Z-TT，獲得重組質粒pET-Z-TT-GAP。重組質粒酶切驗證如圖4C。pET-Z-TT-GAP經XbaI線性化后為6. 9kb ；經BamH I和XbaI雙酶切驗證，切下目的條帶為480bp，余下載體片段為6. 4kb。以畢赤酵母基因組DNA為模板，利用引物PCBS F/PCBS R和引物CBSORF F/CBSORF R分別擴增CBS編碼序列的上游的304bp片段CBS 5，和CBS編碼序列的469bp片段CBS 0RF。先將CBS ORF的469bp片段經BglII和^CbaI雙酶切后與同樣方式酶切的質粒pET-Z-TT-GAP連接，再將經XhoI和NotI雙酶切后片段CBS 5’插入，最終構建成CBS啟動子替換載體pGAP-CBS。重組質粒酶切驗證如圖4D。pGAP-CBS經EcoRI線性化后為7. 6kb ；經XhoI和NotI雙酶切驗證，切下目的條帶為300bp，余下載體片段為7. 3kb ；經EcoRI和XbaI雙酶切切驗證，切下目的條帶為470bp，余下載體片段為7. 21Λ。
將篩選獲得的突變啟動子PmPa^nPei2作為模板，利用引物GAP F B/GAPR X，擴增得到的Pe。，Pg6和Pei2突變啟動子序列經BamH I和)(baI酶切，連接經同樣方法酶切的載體pGAP-CBS,分別獲得重組質粒pGO-CBS，pG6_CBS和pG12_CBS。重組質粒酶切驗證如圖4E。pGO-CBS, pG6-CBS 和 pG12_CBS 經 XbaI 線性化后為 7. 6kb ；經 BamH I 和 XbaI 雙酶切驗證，切下目的條帶為480bp，余下載體片段為7. 11Λ。表1、基因克隆及PCR驗證實驗所用引物
SEQ ID
引物名稱引物序列NO:
TZ FCCGCGGCGGCCGCCCCACACACCATAGCTTC7
TZRACAGTCGACTCAGTCCTGCTCCTCGGCC8
GAP F BCGCGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGT9
GAPRXTGCTCTAGAATAGTTGTTCAATTGATTGAAA10
PCBS FCCGCTCGAGGGGGGTGGAACACTACAGGTATAG11PCBS R AATGCGGCCGCAGTATGTATTTCTGAAAAGAAAAGAAAAGAA 12
CBS ORF FTGCTCTAGAATGTCAGACAACAACCAACCTTTG13
CBS ORF RCGCGGATCCGGAATTCGGTCTAAGATTACAGCAT14
PCBSFAATTGATCTTCGATACGAATCCC15
GAP F5CCCTATTTCAATCAATTGAACAAC16
CBS R2GGGCATCTGGATTGTTAACATTAC17表2
.各啟動子及基因序列
權利要求
1.一種突變型GAP啟動子文庫的用途，用于調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑，從而調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量；其中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動子。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑為調控S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β-胱硫醚合成酶的表達。
3.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子，用于提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。
4.一種構建物，所述的構建物包括以下操作性相連的元件(5’ 一 3’ ) 胱硫醚合成酶的編碼基因的5，側翼序列；抗性選擇標記；選自SEQ ID NO =USEQID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動子；β -胱硫醚合成酶的編碼基因。
5.一種調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量的方法，包括以選自突變型GAP啟動子文庫的啟動子來調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸生產菌的S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達，從而調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的產量；其中，所述的突變型GAP啟動子文庫包括選自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的啟動子。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一種表達載體，其中包含權利要求4所述的構建物；(2)將(1)所述的表達載體轉化S-腺苷甲硫氨酸生產菌，使得所述的構建物整合到S-腺苷甲硫氨酸生產菌的基因組中，獲得重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌；(3)培養(yǎng)( 所述的重組S-腺苷甲硫氨酸生產菌，從而該菌的S-腺苷甲硫氨酸的產量相對于基因組中未整合所述構建物的S-腺苷甲硫氨酸生產菌發(fā)生改變。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的選自權利要求1所述的突變型GAP啟動子文庫的啟動子包括選自SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的啟動子，其下調β -胱硫醚合成酶的表達，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。
8.—種重組的S-腺苷甲硫氨酸生產菌，其基因組中整合有權利要求4所述的構建物。
9.一種突變型GAP啟動子，所述的啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
10.權利要求9所述的突變型GAP啟動子的用途，用于下調S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中β -胱硫醚合成酶的表達，從而提高S-腺苷甲硫氨酸的產量。
全文摘要
本發(fā)明涉及GAP啟動子文庫在調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應用。本發(fā)明還提供了用于調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑的表達載體，以及含有所述表達載體的宿主細胞。本發(fā)明采用組成型啟動子文庫實現(xiàn)了S-腺苷甲硫氨酸分解代謝途徑中基因表達的精確調控，找到了提高S-腺苷甲硫氨酸產量的切實可行的方法。
文檔編號C12N15/63GK102559726SQ201010621230
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者于曉光, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良, 武曉樂, 秦秀林, 錢江潮 申請人:華東理工大學