專利名稱：用于提高核酸擴(kuò)增反應(yīng)效率的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明包括具有提高的持續(xù)合成能力的雜合聚合酶以及用于減少反應(yīng)諸如PCR過程中非特異性擴(kuò)增的方法和組合物。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增反應(yīng)，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，一般是模板依賴性反應(yīng)，其中所需的核酸序列通過使用過量的兩種寡核苷酸引物處理靶核酸的分離的互補(bǔ)鏈來擴(kuò)增。所述引物延伸形成互補(bǔ)引物延伸產(chǎn)物，所述產(chǎn)物起模板作用，以用于合成所需的核酸序列。在這樣的過程中，選擇性擴(kuò)增各DNA鏈上的弓I物之間的核酸序列。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供用于提高核酸合成和擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性的方法和組合物。在一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增靶核酸的方法。該方法包括使用反應(yīng)混合物溫育靶核酸，所述反應(yīng)混合物包括至少一種引物、雜合聚合酶、和滲壓劑。在另一方面，所述溫育步驟在這樣的條件下進(jìn)行，所述條件允許靶核酸通過雜合聚合酶來擴(kuò)增。在再一方面，所述雜合聚合酶包括聚合酶結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一方面，本發(fā)明提供用于定量PCR的試劑盒。在示范性方面，所述試劑盒包括具有降低的外切核酸酶活性的雜合聚合酶、dNTPs、包含肌氨酸的緩沖液、和在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用雜合聚合酶的說明書。在一些實施方案中，本發(fā)明提供擴(kuò)增樣品中靶核酸的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在反應(yīng)化合物中溫育所述靶核酸，所述反應(yīng)混合物包括至少一種引物，雜合聚合酶，其包含聚合酶結(jié)構(gòu)域和異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和添加劑，其選自由肌氨酸和肝素組成的組，所述添加劑處于這樣的量，所述量足以將擴(kuò)增反應(yīng)的效率與缺少所述添加劑的反應(yīng)混合物相比提高至少10%，其中所述溫育處于允許所述靶核酸通過所述雜合聚合酶擴(kuò)增的條件下。在一些實施方案中，所述添加劑是肌氨酸，其處于小于600mM的濃度。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶在外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中包括突變，以使得該聚合酶基本缺乏3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括家族 B樣聚合酶，其基本缺乏(例如，具有突變，其導(dǎo)致基本缺乏)3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括與SEQ ID NO :2基本相同，S卩，跨越所述聚合酶結(jié)構(gòu)域(S卩，除SEQ ID NO :3以外的全部)或SEQ ID NO :2完整序列的至少65%，70%，75%， 80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 或更高的氨基酸序列同一性的多肽序列。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括SEQ ID NO :2。在一些實施方案中，所述樣品包括擴(kuò)增抑制劑且其中將所述樣品的等分試樣以這樣的量加入至反應(yīng)混合物中，所述量使得抑制劑處于能夠抑制野生型Taq聚合酶的濃度且其中雜合聚合酶擴(kuò)增靶核酸。在一些實施方案中，所述樣品選自血液或完整細(xì)胞或食物樣品。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶在溫育步驟過程中在加熱步驟前與一種或多種抗體復(fù)合。在一些實施方案中，所述抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)，其中(a)所輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO 22, SEQ ID N0:23，和 SEQID N0:24，且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，和 SEQ ID NO 27 ；或(b)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :29，和 SEQ ID NO :30， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，和 SEQ ID NO 33 ；或(c)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :35，禾口 SEQ ID NO :36， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :38，禾口 SEQ ID NO :39。在一些實施方案中，實時檢測來自擴(kuò)增的信號。在一些實施方案中，所述異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :3基本相同(S卩，至少 65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%或
更高)ο在一些實施方案中，以小于1，2，3，或4秒的延伸時間進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實施方案中，所述聚合酶和外切核酸酶結(jié)構(gòu)域來自家族B DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述反應(yīng)混合物還包括雙鏈DNA結(jié)合染料。本發(fā)明還提供反應(yīng)混合物。在一些實施方案中，所述反應(yīng)混合物包括雜合聚合酶，其中所述聚合物包括聚合酶結(jié)構(gòu)域和異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和添加劑，其選自由肌氨酸和肝素組成的組，所述添加劑處于這樣的量，所述量足以將擴(kuò)增反應(yīng)的效率與缺少所述添加劑的反應(yīng)混合物相比提高至少10%。在一些實施方案中，所述反應(yīng)混合物還包括至少一種寡核苷酸引物。在一些實施方案中，所述添加劑是肌氨酸，其處于小于600mM的濃度。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶在外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中包括突變，以使得該聚合酶基本缺乏3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括家族B 樣聚合酶，其基本缺乏(例如，具有突變，其導(dǎo)致基本缺乏)3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括與SEQ ID NO :2基本相同，S卩，跨越所述聚合酶結(jié)構(gòu)域 WPJI^SEQ IDNO :3 以外的全部)或 SEQ ID NO :2 完整序列的至少 65%，70%，75%，80%， 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%或更高的氨基酸序列同一性的多肽序列。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括SEQ ID NO :2。在一些實施方案中，所述混合物包括樣品等分試樣，其中所述樣品包括擴(kuò)增抑制劑，其中所述抑制劑處于能夠抑制野生型Taq聚合酶的濃度。在一些實施方案中，所述樣品選自血液或完整細(xì)胞或食物樣品。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶與抗體復(fù)合。在一些實施方案中，所述抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中(a)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，和 SEQ ID NO :24， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，和 SEQ ID NO 27 ；或(b)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :29，和 SEQ ID NO :30， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，和 SEQ ID NO 33 ；或(c)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :35，和 SEQ ID NO :36， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :38，禾口 SEQ ID NO :39。在一些實施方案中，所述異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :3基本相同(S卩，至少 65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%或更高)ο在一些實施方案中，所述聚合酶和外切核酸酶結(jié)構(gòu)域來自家族B DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述反應(yīng)混合物包括一種或多種不同的三磷酸脫氧核糖核苷酸。在一些實施方案中，所述反應(yīng)混合物還包括雙鏈DNA結(jié)合染料。本發(fā)明還提供試劑盒。在一些實施方案中，所述試劑盒包括雜合聚合酶，其包含聚合酶結(jié)構(gòu)域和異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和添加劑，其選自由肌氨酸和肝素組成的組，所述添加劑處于這樣的量，所述量足以將擴(kuò)增反應(yīng)的效率與缺少所述添加劑的反應(yīng)混合物相比提高至少10%。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶在外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中包括突變，以使得該聚合酶基本缺乏3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括家族 B樣聚合酶，其基本缺乏(例如，具有突變，其導(dǎo)致基本缺乏)3' -5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括與SEQ ID NO :2基本相同，S卩，跨越所述聚合酶結(jié)構(gòu)域(S卩，除SEQ ID NO :3以外的全部)或SEQ ID NO :2完整序列的至少65%，70%，75%， 80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 或更高的氨基酸序列同一性的多肽序列。在一些實施方案中，所述雜合聚合酶包括SEQ ID NO :2。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括特異于所述雜合聚合酶的抗體。在一些實施方案中，所述抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中(a)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，和 SEQ ID NO :24， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，和 SEQ ID NO 27 ；或(b)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :29，和 SEQ ID NO :30， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，和 SEQ ID NO 33 ；或(c)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :35，和 SEQ ID NO :36， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :38，禾口 SEQ ID NO :39。在一些實施方案中，所述異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :3基本相同(S卩，至少 65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%或更高)ο在一些實施方案中，所述聚合酶和外切核酸酶結(jié)構(gòu)域來自家族B DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括以下一種或多種一種或多種不同的三磷酸脫氧核糖核苷酸；雙鏈DNA結(jié)合染料；和寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供具有對于由SEQ ID NO :2組成的蛋白的結(jié)合特異性的分離抗體， 其中所述抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其中(a)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，和 SEQ ID NO. 24， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，和 SEQ ID NO 27 ；或(b)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :29，禾口 SEQ ID NO :30， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :32，和 SEQ ID NO 33 ；或(c)所述輕鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :35，和 SEQ ID NO :36， 且所述重鏈可變區(qū) CDRs 包括 SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :38，禾口 SEQ ID NO :39。在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包括(a)分別地，SEQ ID NO 14 和 SEQ ID NO 18 ；(b)分別地，SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 19 ；(c)分別地，SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 20 ；或(d)分別地，SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 21 ；本發(fā)明還提供編碼包括如上所述的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還提供與聚合酶復(fù)合的抗體，其中所述抗體包括如上所述的重鏈可變區(qū)和 /或輕鏈可變區(qū)。附圖簡述

圖1顯示肌氨酸對qPCR反應(yīng)的效率的影響。圖2顯示關(guān)于包含不同濃度的肝素的反應(yīng)與不添加肝素的反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖3顯示關(guān)于不同雜合聚合酶隨復(fù)性/延伸溫度變化的擴(kuò)增曲線。顯示關(guān)于25pg， 250pg，和2500pg輸入DNA的擴(kuò)增曲線。圖4㈧顯示包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的示范性雜合聚合酶的氨基酸序列。圖4 (B)顯示示范性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。優(yōu)選實施方案詳述除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常理解的相同含義。本文中提及的所有公開物通常參考結(jié)合在本文中，以用于描述和公開所述公開物中描述的裝置、制劑和方法，并且其可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。注意，當(dāng)在本文中和在所述權(quán)利要求書中使用時，單數(shù)形式“一種”(〃 a, “ “ an,“)和“所述”(〃 the")包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另外明確指示。 因此，例如提到“一種聚合酶”意指一種試劑或這樣的試劑的混合物，且提到“所述方法”包括提及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價步驟和方法，等等。當(dāng)提供一定范圍的數(shù)值時，理解該范圍上限和下限之間的每一個介于其間的數(shù)值和該指定范圍內(nèi)的任何其他指定數(shù)值或介于其間的數(shù)值屬于本發(fā)明。這些較小的范圍的上限和下限可以獨立地包括在所述較小的范圍內(nèi)，且也屬于本發(fā)明，在指定的范圍內(nèi)進(jìn)行任何明確的排除限值。當(dāng)指定的范圍包括一個或兩個所述限值，則排除那些包括的限值中的任意2個的范圍也包括在本發(fā)明中。
在以下說明書中，闡述許多特定詳細(xì)信息，以提供本發(fā)明的更全面的理解。然而， 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，本發(fā)明可以在不存在這些特定詳細(xì)信息中的一種或多種的條件下進(jìn)行。在其他情況下，不需要描述公知的特征和本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的程序，以避免混淆本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，這些附件特征也屬于本發(fā)明。定義除非另外定義，本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常理解的相同含義。一般地，本文中使用的術(shù)語和下述的細(xì)胞培養(yǎng)實驗室程序、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)、和核酸活性和雜交是本領(lǐng)域中公知并普遍使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行核酸和肽分析。所述技術(shù)和程序通常按照本領(lǐng)域中常規(guī)方法和多種一般參考文件 (一般參見，Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL (分子克隆實驗室手冊)，第二版(1989) Cold Spring Harbor LaboratoryPress (冷泉港實驗室出版社)，Cold Spring HarboH冷泉港)，N. Y.，將其通過參考結(jié)合與此)來進(jìn)行，其貫穿該文件提供。本文中使用的術(shù)語和下述分析化學(xué)、和有機(jī)合成的實驗室程序是本領(lǐng)域中公知和普通使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其改進(jìn)方案進(jìn)行化學(xué)合成和化學(xué)分析。術(shù)語“雜合聚合酶”在本文中用于描述包括來自多親本序列的氨基酸殘基的聚合酶。雜合聚合酶可以包括兩種聚合酶結(jié)構(gòu)域以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“雜合位置”意指親本序列，或子序列之間不同的位置?！耙吧途酆厦浮币庵柑烊淮嬖诘木酆厦?。“野生型聚合酶氨基酸序列”意指天然存在的氨基酸序列。 “天然”聚合酶序列意指親本聚合酶序列，典型地，“野生型”序列?！坝H本聚合酶序列”表示在操作本發(fā)明前的起始或參考氨基酸或核酸序列。該術(shù)語與“起始序列”交替使用。親本序列可以是野生型蛋白、含有突變的蛋白、或其他工程蛋白。 親本序列也可以是全長蛋白、蛋白亞單元、蛋白結(jié)構(gòu)域、氨基酸基序、蛋白活性位點、或任何聚合酶序列或聚合酶序列子集，無論是連續(xù)的還是被其他多肽序列中斷的。術(shù)語“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”意指以序列非特異性方式結(jié)合DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以顯著親和性結(jié)合DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域，關(guān)于其不存在這樣的已知核酸，所述核酸以與具有相同組成但不同核苷酸序列的另一種核酸相比超過100 倍更高的親和性結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域。術(shù)語〃 Sso7d〃或〃 Sso7d DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域〃或〃樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域" 或"Sso7d結(jié)合蛋白"意指這樣的核酸和多肽多形變體、等位基因、突變體、種間同源物 (1)具有這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID而3的&07(1序列具有高于約60%氨基酸序列同一性，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99%或更高氨基酸序列同一性，優(yōu)選在至少約15，25，35，50，或63個氨基酸的區(qū)域內(nèi)；(2) 結(jié)合針對包括氨基酸序列SEQ ID NO :3及其保守修飾變體的免疫原產(chǎn)生的抗體，例如，多克隆抗體；(3)在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO 3的Sso7d核酸序列及其保守修飾變體特異性雜交；(4)具有這樣的核酸序列，其與SEQ ID NO :4具有高于約90%，91%，92%，93%， 94%,95%,96%,97%,98%,99%,或更高核苷酸序列同一性，優(yōu)選在至少約50，100，150， 或更多核苷酸的區(qū)域內(nèi)。該術(shù)語包括全長^07(1多肽和所述多肽具有序列非特異性雙鏈結(jié)合活性的片段。&o7d-樣蛋白包括Sac7d和&iC7e。
“結(jié)構(gòu)域”意指蛋白或蛋白復(fù)合物的單元，其包括多肽序列、完整多肽序列、或許多多肽序列，其中所述單元具有確定的功能。理解所述功能是廣泛定義的，且可以是配體結(jié)合、催化活性或可以對蛋白的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定化作用?！靶省痹诒景l(fā)明反應(yīng)的上下文中意指反應(yīng)組分在特定反應(yīng)條件下執(zhí)行其功能的能力。例如，效率可以意指聚合酶在特定反應(yīng)條件下執(zhí)行其催化功能的能力。用于計算擴(kuò)增反應(yīng)效率的方法是本領(lǐng)域中已知的，并在本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述?！霸鰪?qiáng)”在酶的上下文中意指提高酶的活性，即增加產(chǎn)物量/單位酶/單位時間?！爱愒吹摹?，在關(guān)于蛋白的部分使用時，表示所述蛋白包括兩個或多個在自然界彼此間不以相同關(guān)系存在的結(jié)構(gòu)域。這樣的蛋白，例如，融合蛋白，含有兩個或多個來自被安排形成新的功能性蛋白的無關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域?！斑B接”意指本領(lǐng)域中關(guān)于功能性連接蛋白結(jié)構(gòu)域的任何已知方法，包括但不僅限于具有或不具有干擾結(jié)構(gòu)域的重組融合、內(nèi)含肽-介導(dǎo)的融合、非共價連接、和共價鍵結(jié)合、包括二硫鍵結(jié)合；氫鍵結(jié)合；靜電結(jié)合；和構(gòu)象結(jié)合，例如，抗體-抗原，和生物素-抗生物素蛋白連接?！熬酆厦浮币庵高M(jìn)行多核苷酸的模板-指導(dǎo)的合成的酶。該術(shù)語包括全長多肽和具有聚合酶活性的結(jié)構(gòu)域二者?！俺掷m(xù)合成能力"意指聚合酶保持與模板或底物結(jié)合和進(jìn)行多核苷酸合成的能力。持續(xù)合成能力通過每次結(jié)合事件中發(fā)生的催化事件(例如，結(jié)合的核苷酸)數(shù)量來測量?！盁岱€(wěn)定的聚合酶”用于本文中時，意指利用DNA或RNA作為模板，通過將核苷酸單元加入至核苷酸鏈來催化多核苷酸合成的任何酶，并在高于45°C的溫度下具有最佳活性?！皸珶峋鷮?Thermus)聚合酶”指由任何棲熱菌屬物種分離的家族ADNA聚合酶， 包括但不僅限于水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、Thermus brockianus、和嗜熱棲熱菌 (Thermus thermophilus)；源自棲熱菌屬物種的任何重組聚合酶，及其任意功能性衍生物， 無論是通過遺傳修飾或化學(xué)修飾或本領(lǐng)域中已知的其他方法來衍生。術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)”意指用于增加核酸靶序列拷貝的任意體外方法。這樣的方法包括但不僅限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) ,DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見美國專利號4，683，195和 4, 683, 202 ；PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR、流程方法禾口應(yīng)用指導(dǎo))(Innis等編，1990))，(LCR)、QBeta RNA復(fù)制酶、和基于RNA轉(zhuǎn)錄的(諸如TAS和 3SR)的擴(kuò)展反應(yīng)以及本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其他。“擴(kuò)增”意指使溶液經(jīng)歷足以容許擴(kuò)增多核苷酸的條件的步驟，條件是反應(yīng)的全部組分是完整的。擴(kuò)增反應(yīng)的組分包括，例如，引物，多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù)語 “擴(kuò)增”典型地意指靶核酸的“指數(shù)”增加。然而，“擴(kuò)增”用于本文中時還可以意指核酸的選擇靶序列數(shù)量的線性增加，諸如使用循環(huán)測序獲得的。術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”意指包含用于擴(kuò)增靶核酸的多種試劑的水溶液。這些包括酶、水性緩沖液、鹽、擴(kuò)增引物、靶核酸、和三磷酸核苷。如本文中進(jìn)一步討論地，擴(kuò)增反應(yīng)混合物還可以進(jìn)一步包括穩(wěn)定劑和其他用于最優(yōu)化效率和特異性的添加劑。根據(jù)上下文， 所述混合物可以是完全的或不完全的擴(kuò)增反應(yīng)混合物?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”意指這樣的方法，通過該方法以幾何級數(shù)擴(kuò)增靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子序列。PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)；參見，例如，美國專利號 4,683，195 禾口 4，683，202 ；禾口 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 流程方法和應(yīng)用指導(dǎo))，Innis等編，1990。示范性PCR反應(yīng)條件典型地包括兩步驟或三步驟循環(huán)。兩步驟循環(huán)具有變性步驟，隨后是雜交/延伸步驟。三步驟循環(huán)包括變性步驟，隨后是雜交步驟，隨后是單獨的延伸步驟?！伴LPCR”意指長度為51Λ或以上的DNA片段的擴(kuò)增。長PCR典型地使用特別適合的聚合酶或聚合酶混合物來進(jìn)行(參見，例如，美國專利號5，436，149和5，512，46 ，所述聚合酶或聚合酶混合物與常規(guī)用于擴(kuò)增較短產(chǎn)物的聚合酶不同?！耙铩币庵概c靶核酸上的序列雜交的多核苷酸序列并擔(dān)當(dāng)核酸合成的起始點。引物可以具有不同的長度，且通常長度小于50個核苷酸，例如，長度為12-30個核苷酸。用于PCR中的引物的長度和序列可以基于本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的原則來設(shè)計，參加，例如， Innis等，見上文。“溫度模式”意指PCR或循環(huán)測序反應(yīng)的變性、復(fù)性和/或延伸步驟的溫度和時間長度。PCR或循環(huán)測序反應(yīng)的溫度模式典型地由相似或相同較短溫度模式的10-60次循環(huán)；這些較短的模式中的每一個可以典型定義兩步驟或三步驟循環(huán)。溫度模式的選擇基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種考慮因素，參見，例如，Innis等，見上文。在如本文中所述的長 PCR反應(yīng)中，獲得長度為51Λ或以上的擴(kuò)增產(chǎn)物所需的延伸時間與常規(guī)聚合酶混合物相比縮短。PCR “靈敏性”意指擴(kuò)增以低拷貝數(shù)存在的靶核酸的能力。“低拷貝數(shù)”意指待擴(kuò)增核酸樣品中靶序列的拷貝數(shù)為105，經(jīng)常1(^1(^1(^101或更少。術(shù)語“聚合酶引物/模板結(jié)合特異性”用于本文中時，意指聚合酶辨別正確匹配的引物/模板和錯配引物模板的能力?！熬酆厦敢?模板結(jié)合特異性的增加”在該上下文中意指本發(fā)明聚合酶辨別匹配的引物/模板和錯配的引物復(fù)合物的能力與野生型聚合酶相比的增加?！澳０濉币庵高@樣的多核苷酸序列，其包括待擴(kuò)增的側(cè)鄰引物雜交位點的多核苷酸。因此，“靶模板”包括側(cè)鄰關(guān)于5’引物和3’引物的雜交位點的靶多核苷酸序列。用于本文中時，“核酸”意指DNA，RNA,單鏈，雙鏈，或更加高度聚集的雜交基序，及其任意化學(xué)修飾。修飾包括，但不僅限于，向核酸配體堿基或向作為整體的核酸配體提供結(jié)合另外的電荷、極化性、氫鍵結(jié)合、靜電相互作用、連接點和功能性的化學(xué)基團(tuán)的那些。這樣的修飾包括，但不僅限于，肽核酸(PNAs)，磷酸二酯基修飾，(例如，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2 ‘-位糖修飾，5-位嘧啶修飾，8-位嘌呤修飾，環(huán)外胺的修飾，4-硫尿苷的取代， 5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代；主鏈修飾，甲基化，不尋常堿基配對組合諸如異堿基(isobase)，異胞苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine)等。核酸還可以包括非天然堿基，諸如，例如，硝基吲哚。修飾還可以包括3'和5'修飾諸如用熒光團(tuán)(例如，量子點) 或另一種結(jié)構(gòu)部分加帽。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中交替使用，意指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“氨基酸”意指天然存在和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及稍后修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸，.Y.-羧基谷氨酸，和ο-磷酸絲氨酸。 氨基酸類似物意指與天然存在的氨基酸具有相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)，即，與氫原子、羧基、氨基、 和R基結(jié)合的碳原子的化合物，例如，高絲氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亞砜，甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾肽主鏈，但是保持與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物意指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過其普遍已知的三字母符號或通過由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的一字母符號來提及。同樣地，核苷酸可以通過其普遍接受的單字母密碼來提及?！氨Ｊ匦揎椬凅w”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列二者。關(guān)于特殊的核酸序列，保守修飾變體意指編碼相同或基本相同氨基酸序列，或其中核酸不編碼氨基酸序列的那些核酸，基本相同序列。由于遺傳密碼的簡并，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白。例如，密碼子 GCA, GCC, GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在通過密碼子指定丙氨酸的各個位置處， 該密碼子可以改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中任一個，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變化是 “沉默變化”，其是保守修飾變化的一種。本文中編碼多肽的各核酸序列也描述各種可能的核酸的沉默變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，核酸中的各密碼子(除AUG (其通常僅編碼甲硫氨酸)和TGG(其通常僅編碼色氨酸外)可以修飾為產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變化是各所述序列中固有的。作為氨基酸序列，本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，在編碼的序列中改變、添加或缺失單氨基酸或小比例氨基酸的各取代、缺失或添加核酸、肽、多肽、或蛋白序列是“保守修飾的變體”，其中變化導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)類似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域中公知的。這樣的保守修飾變體是本發(fā)明多形變體、種間同源物、和等位基因以外的，但不排除這些。術(shù)語“編碼”意指編碼一個或多個氨基酸的多核苷酸序列。該術(shù)語不需要起始密碼子或終止密碼子。氨基酸序列可以以由多核苷酸序列提供的6種不同閱讀框中任一種來編碼。術(shù)語“啟動子”意指位于轉(zhuǎn)錄起始上游和/或下游并參與識別和結(jié)合RNA聚合酶和其他蛋白以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域或序列?！拜d體”意指這樣的多核苷酸，其在獨立于宿主染色體時，能夠在宿主生物體中復(fù)制。優(yōu)選的載體包括質(zhì)粒，且典型地具有復(fù)制起點。載體可以包括，例如，轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列，和有效用于調(diào)節(jié)特殊核酸表達(dá)的啟動子?！爸亟M”意指人操作的多核苷酸或人操作的多核苷酸的拷貝或補(bǔ)體。例如，包括與第二多核苷酸可操作連接的啟動子的重組表達(dá)盒可以包括與所述第二多核苷酸異源的啟云力子，這是人操作(例如，通過Sambrook等,Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，Cold Spring Harbor (7令泉港)，N. Y.，(1989)或 Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)前分子生物學(xué)方案)第1-3卷，John Wiley & Sons，Inc. (1994-1998)所述的方法)包含表達(dá)盒的分離的核酸的結(jié)果。在另一個實例中，重組表達(dá)盒可以包括以這樣的方式組合的多核苷酸，所述方式使得所述多核苷酸與自然界中存在的非常不像。例如，人操作的限制性位點或質(zhì)粒載體序列可以使啟動子側(cè)鄰所述第二多核苷酸或使啟動子與所述第二多核苷酸分開。 本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，多核苷酸可以以許多方式來操作并不限于以上實例。本發(fā)明的“聚合酶多肽”是包含聚合酶結(jié)構(gòu)域的蛋白。聚合酶多肽還可以包括另外的結(jié)構(gòu)域包括異源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，ko7D。DNA聚合酶是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，包括但不僅限于，由嗜熱古細(xì)菌(Pyrococcus furiosus),Thermococcus litoralis，禾口海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)，或其修飾形式分離或來源的DNA聚合酶。它們包括 DNA-依賴性聚合物和RNA-依賴性聚合酶二者，諸如逆轉(zhuǎn)錄酶。已知至少5個DNA-依賴性 DNA聚合酶家族，盡管大部分屬于家族A、B和C。不同家族之間存在很少或不存在序列相似性。大多數(shù)家族A聚合酶是單鏈蛋白，其可以含有多酶功能包括聚合酶、3'至5'外切核酸酶活性和5'至3'外切核酸酶活性。家族B聚合酶典型地具有聚合酶的單催化結(jié)構(gòu)域和3'至5'外切核酸酶活性，以及輔助因子。家族C聚合酶典型地是多亞單元蛋白，其具有聚合和3'至5'外切核酸酶活性活性。在大腸桿菌(E. coli)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種類型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I (家族A)，II (家族B)，和III (家族C)。在真核細(xì)胞中，三種不同的家族B聚合酶，即DNA聚合酶α，δ，和ε，參與核復(fù)制，且家族A聚合酶，即聚合酶Y，用于線粒體DNA復(fù)制。其他類型的DNA聚合酶包括噬菌體聚合酶。類似地，RNA聚合酶典型地包括真核RNA聚合酶I，II，和III，和細(xì)菌RNA聚合酶以及噬菌體和病毒聚合酶。 RNA聚合酶可以是DNA-依賴性和RNA-依賴性的。本發(fā)明的多肽聚合酶具有聚合酶活性。使用本文中所述的測定法，可以測量本發(fā)明的多肽的活性。本發(fā)明的一些聚合酶多肽在本文中所述的測定法中，表現(xiàn)出與野生型聚合酶相比提高的聚合酶活性。兩個核酸序列或多肽被稱為“相同”，如果這兩個序列中的核苷酸或氨基酸殘基序列在如下所述比對以獲得最大對應(yīng)性時，分別相同。術(shù)語“相同”或百分比“同一性”在兩個或多個核酸或多肽序列的背景下，意指當(dāng)比較和比對以在比較窗中獲得最大對應(yīng)性時， 相同或具有特定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸的兩個或多個序列或子序列，其如使用一種以下序列比較運算法則或通過手工比對和視覺觀察來測量。當(dāng)序列同一性的百分比關(guān)于蛋白或多肽使用時，認(rèn)為不相同的殘基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被取代為具有類似化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基并因此不改變該分子的功能特性。當(dāng)序列在保守取代中不同時，百分比序列同一性可以上調(diào)，以校正取代的保守天性。用于進(jìn)行該調(diào)整的手段是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。典型地，這涉及將保守取代作為部分而非完全錯配來評分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，當(dāng)相同的氨基酸給分為1且非保守取代給分為O時，保守取代給分在O和1之間。保守取代的評分根據(jù)例如，Meyers & Miller的運算法則，Computer Applic. Biol. Sci.(計算機(jī)應(yīng)用生物科學(xué))4 :11-17(1988)來計算，例如，如以程序PC/GENEantelligenetics，Mountain View, 加利福尼亞，USA)進(jìn)行。術(shù)語多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含具有至少50%序列同一性的序列。示范性實施方案包括與參考序列相比至少=55%,60,65%, 70%, 75%,80%,85%, 90 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，或99 %，其使用本文中所述的程序；優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST，如下所述。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，這些數(shù)值可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，以通過考慮密碼子簡并，氨基酸相似性，閱讀框定位等來確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白的相應(yīng)同一性。氨基酸序列的基本同一性為了這些目的通常意指至少65%的序列同一性。示范性實施方案包括至少 65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%94%，95%，96%，97%，98%或 99%?！盎绢愃频摹倍嚯墓蚕砣缟纤龅男蛄校庵幵谟诓幌嗤臍埢恢每梢酝ㄟ^保守氨基酸改變而不同。保守氨基酸取代意指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交替性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺的側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳基側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸，精氨酸，和組氨酸；且一組具有含硫的側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。示范性保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)兩個多肽也可以“基本相同”，條件是這兩個多肽免疫學(xué)類似。因此，總蛋白結(jié)構(gòu)可以類似，而兩個多肽的氨基酸序列顯示顯著不同。因此，用于測量兩個多肽是否基本相同的方法包括測量單克隆或多克隆抗體與每個多肽的結(jié)合。兩個多肽基本相同，條件是特異于第一多肽的抗體以與第一多肽的親和性的至少1/3的親和性結(jié)合第二多肽。兩個多肽也可以被認(rèn)為是“基本相同的”，條件是它們在使用本領(lǐng)域中已知方法進(jìn)行的western印跡分析中顯示處交叉反應(yīng)性。為了序列比較，典型地，一個序列擔(dān)當(dāng)參考序列，測試序列與所述參考序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較運算法則時，將測試序列和參考序列輸入計算機(jī)，如果需要，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列運算法則程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或可以指定備選的參數(shù)。序列比較運算法則然后基于程序參數(shù)，計算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性?！氨容^窗”用于本文中時，包括選自由20-600，通常約50-約200，更通常約100-約 150組成的組的任一連續(xù)位置數(shù)量的區(qū)段，其中當(dāng)兩序列最佳比對后，序列可以與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列進(jìn)行比較。比對序列以進(jìn)行比較的方法是本領(lǐng)域中公知的。用于比較的最佳序列比對可以，例如，通過Smith & Waterman，Adv. Appl Math.(現(xiàn)代應(yīng)用數(shù)學(xué))2 =482(1981)的局部同源比對運算法則，通過Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)48 =443(1970)的同源比對運算法則，通過Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)85 :2444(1988)的相似方法的搜索，通過計算機(jī)化執(zhí)行這些運算法則(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和 TFASTA，在 Wisconsin Genetics Software Package (威斯康辛州遺傳學(xué)軟件包)，Accelrys中)，或提供人工比對和視覺觀察來進(jìn)行。適合用于確定百分比序列同一性和序列相似性的運算法則的實例是BLAST運算法則，其記述在Altschul等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)215 :403-410 (1990)中。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可公共地獲自國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.go-v/)。該運算法貝抱括首先通過識別查詢序列中長度W的短詞來識別高評分序列對(HSI^s)，其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比對時，匹配或滿足一些正值閾值評分。T指鄰近詞評分閾值(Altschul等，見上文)。這些起始鄰近詞擊中擔(dān)當(dāng)開始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)包含它們的較長的HSI^s。詞擊中以兩個方向沿各序列延伸，以直至可以增加累積比對評分。詞擊中在各方向的延伸中以下時
14刻停止累積比對評分通過量X由其最大獲得值下降；累積評分變?yōu)?或以下，這歸因于一個或多個負(fù)評分殘基比對的累積；或達(dá)到各序列的末端。BLAST運算法則參數(shù)W，T，和X確定運算法則的靈敏性和速度。BLAST程序在默認(rèn)詞長(W)Il時，使用BL0SUM62評分基質(zhì)(參見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)89 :10915(1989)) 比對(B)為50，期望值(E)為10，M = 5，N = _4，和兩條鏈比較。BLAST運算法則也進(jìn)行兩序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin & Altschul，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)90 :5873-5787 (1993))。由 BLAST運算法則提供的相似性的一個測量值是最小綜合可能性(P (N))，其提供兩核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的可能性指示。例如，核酸被認(rèn)為與參考序列相似，條件是測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和可能性小于約0. 2，更優(yōu)選小于約0. 01，且最優(yōu)選小于約0. 001。術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”指這樣的條件下，在該條件下，探針與其靶子序列，典型地在核酸的復(fù)雜混合物中進(jìn)行雜交，而不與其他序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中應(yīng)該不同。較長的序列特別在較高溫度下雜交。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes (生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)——使用核探針的雜交)，“Overview of principles of hybridization and the strategy of t亥assays (1 原 禾口t亥定策略綜述)"(1993)。一般地，高嚴(yán)格條件被選為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度pH下熱熔點(Tm)低約5-10°C。低嚴(yán)格條件通常被選為比Tm低約15-30°C。Tm是這樣的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、PH、和核濃度下)，在該溫度下，50%的與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針平衡地雜交靶序列 (當(dāng)靶序列過量存在時，在Tm，50 %的探針平衡地被占據(jù))。雜交條件典型地是那樣的，其中鹽濃度在PH7. 0-8. 3下，低于約1. OM鈉離子，典型地約0. 01-1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)并且溫度對于短探針(例如，10-50核苷酸)是至少約30°C且對于長探針(例如，大于 50核苷酸)是至少約60°C。嚴(yán)格條件還可以使用添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號是至少兩倍背景，優(yōu)選10倍背景雜交。在嚴(yán)格條件下不相互雜交的核酸仍然是基本相同的，條件是它們編碼的多肽基本相同。這，例如，在使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并創(chuàng)建核酸拷貝時發(fā)生。在這樣的情形中，核酸典型地在中度嚴(yán)格雜交條件下雜交。示范性“中度嚴(yán)格雜交條件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS緩沖液中，在37°C下雜交和在IX SSC，在45°C下洗滌。示范性“嚴(yán)格雜交條件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS緩沖液中，在37°C下雜交和在0. 2X SSC, 在溫度至少約50°C，通常約55°C -約60°C下至少一次20分鐘的洗滌，或等價條件。陽性雜交是至少兩倍背景。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該欣然承認(rèn)，可以使用備選的雜交和洗滌條件來提供類似嚴(yán)格性的條件?！翱贵w”指基本由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽配體，其特異性結(jié)合和識別表位(例如，抗原)。被識別的免疫球蛋白基因包括κ和λ輕鏈恒定區(qū)，α， Υ，δ，ε和μ重鏈恒定區(qū)基因，和無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因?？贵w，例如，作為完整免疫球蛋白或作為許多充分表征的使用不同肽酶消化產(chǎn)生的片段而存在。這包括，例如，F(xiàn)ab' 和F(ab)' 2片段。術(shù)語“抗體”用于本文中時，還包括通過修飾完整抗體生成或利用重組 DNA方法從頭合成的抗體片段。其還包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或單鏈抗體?？贵w的"Fe"部分指免疫球蛋白重鏈的包含一個或多個重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域、 CHI、CH2和CH3，但不包含重鏈可變區(qū)的部分。術(shù)語“滲壓劑”用于本文中時，指影響滲透性和/或負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞中滲透壓的任何物質(zhì)或化合物。綜述本發(fā)明提供用于提高核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性的方法和組合物。在一方面，本發(fā)明提供包含聚合酶結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合聚合酶。在一個實施方案中，本發(fā)明的雜合聚合酶包括導(dǎo)致聚合酶外切核酸酶缺陷的突變?！巴馇泻怂崦溉毕荨庇糜诒疚闹袝r意指聚合酶具有充分減小(即，小于來自嗜熱古細(xì)菌的Pfu DNA聚合酶的3' -5'外切核酸酶活性的10%，5%或)的或無外切核酸酶活性。例如，聚合酶結(jié)構(gòu)域中取代位置D141和E143處的丙氨酸的雙點突變可以去除或消除3’ -5’外切核酸酶活性。Derbyshire 等 Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)，卷洸2 (1995)，第 363-385 頁。 包含這樣的雙點突變的雜合聚合酶應(yīng)該通常在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中顯示增加的特異性，從而導(dǎo)致較少的擴(kuò)增副產(chǎn)物(諸如引物二聚體的擴(kuò)增)和擴(kuò)增所需靶核酸的增加的效率。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的雜合聚合酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括Sso7d蛋白。 聚合酶結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如ko7d的綴合增加聚合酶的持續(xù)合成能力，由此導(dǎo)致增加量的擴(kuò)增產(chǎn)物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用于執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法、組合物、反應(yīng)混合物、和試劑盒，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)使用與熱開始抗體復(fù)合的雜合聚合酶。所述熱開始抗體以在較低(環(huán)境)溫度下抑制聚合酶活性的方式結(jié)合雜合聚合酶。例如，在一些實施方案中， 抗體在50°C，6(TC，和甚至72°C下基本抑制聚合酶活性，由此在室溫反應(yīng)設(shè)置過程中以及在由室溫開始加熱熱循環(huán)塊至例如，95°C的過程中基本不發(fā)生DNA合成。這些抗體在較高溫度下與聚合酶解離，由此釋放聚合酶活性的抑制。這樣的抗體增加核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效率， 因為聚合酶在擴(kuò)增反應(yīng)的開始設(shè)置過程中和在開始變性步驟之前保持失活。由于其在低溫下失活，所以與抗體復(fù)合的聚合酶不能延伸可以在較低溫度下形成的非特異性引物-模板雜交。在再一方面，本發(fā)明提供用于在存在添加劑的條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法、 組合物、反應(yīng)混合物和試劑盒，所述添加劑起提高所述反應(yīng)的效率和特異性的作用。在一個實施方案中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)在存在滲壓劑，諸如肌氨酸的條件下進(jìn)行。已知肌氨酸穩(wěn)定水溶液中的蛋白。使用肌氨酸的常規(guī)方法使用摩爾范圍內(nèi)的濃度，但是在本發(fā)明中，毫摩爾范圍，一般50毫摩爾或更低的濃度導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)效率的提高。在另一個實施方案中，模擬雙鏈DNA靜電特性的分子包括在反應(yīng)混合物中，以減少聚合酶與雙鏈模板核酸的非特異性結(jié)合。在再一個實施方案中，為了減少非特異性結(jié)合而包括的分子是肝素分子。有效用于本發(fā)明的雜合聚合酶本發(fā)明提供包含聚合酶結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合聚合酶。已知所述雜合聚合酶顯示增加的持續(xù)合成能力。參見例如，美國專利申請
發(fā)明者付榮典, 埃文·H·伯西, 王巖, 程曼, 約翰·蘇利文, 龔曉松 申請人:伯樂實驗室公司