專利名稱：Tlr9的合成激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的合成的化學(xué)組合物。 具體地，本發(fā)明涉及產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞因子和趨化因子譜的Toll樣受體9(TLR9)的激動(dòng)劑。相關(guān)領(lǐng)域的概述Toll樣受體(TLR)存在于免疫系統(tǒng)的許多細(xì)胞上，而且已經(jīng)顯示為牽涉先天性免疫應(yīng)答(Hornung，V.等，(2002) J. Immunol. 168 :4531-4537)。在脊椎動(dòng)物中，此家族由稱作 TLRl至TLRll的11種蛋白質(zhì)組成，已知它們識別來自細(xì)菌、真菌、寄生物和病毒的病原體相關(guān)分子樣式(Poltorak, a.等(1998) Science 282 :2085-2088 ；Underhill, D. M.等(1999) Nature 401 :811-815 ；Hayashi, F.等(2001)Nature 410 :1099-1103 ；Zhang, D.等(2004) Science 303:1522-1526 ；Meier, Α.等(2003)Cell. Microbiol. 5:561-570 ；Campos, Μ. Α.等(2001) J. Immunol. 167 :416-423 ；Hoebe, K.等(2003) Nature 424:743-748; Lund, J. (2003)J. Exp. Med. 198 :513-520 ；Heil, F.等(2004)Science 303 :1526-1529 ； Diebold, S. S.等(2004)Science 303 :1529-1531 ；Hornung, V.等(2004)J. Immunol. 173 5935-5943)。TLR是脊椎動(dòng)物識別和起始(mount)對外來分子的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵手段，而且還提供了將先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答聯(lián)系起來的手段(Akira，S.等QOODNature Immunol. 2 :675-680 ；Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1 :135-145)。一些 TLR 位于細(xì)胞表面上以檢測胞外病原體并啟動(dòng)針對它們的應(yīng)答；而其它TLR位于細(xì)胞內(nèi)部以檢測胞內(nèi)病原體并啟動(dòng)針對它們的應(yīng)答。已知TLR9識別細(xì)菌DNA和合成的寡核苷酸中的未甲基化的CpG基序。(Hemmi， H.等Q000) Nature 408:740-745)。對含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修飾也可以影響它們經(jīng)由TLR9充當(dāng)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的能力(參見例如^iao等，Biochem. Pharmacol. (1996)51 :173-182 ；Zhao 等(1996)Biochem Pharmacol. 52 :1537-1544 ；Zhao 等(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 :495-502 ；Zhao 等(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 3453-3458 ;Zhao 等(2000)Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 :1051-1054 ；Yu, D.等(2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 :2585-2588 ；Yu, D.等(2001)Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 2263-2267 ；及 Kandimalla, Ε.等(2001) Bioorg. Med. Chem. 9 :807-813)。已經(jīng)顯示了 TLR9的天然存在的激動(dòng)劑產(chǎn)生抗腫瘤活性(例如腫瘤生長和血管發(fā)生)，導(dǎo)致有效的抗癌癥應(yīng)答(例如抗白血病)(Smith, J. B.和 ffickstrom, Ε. (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90 1146-1154)。另外，已經(jīng)顯示了 TLR9激動(dòng)劑與其它已知的抗腫瘤化合物(例如西妥昔單抗、 伊立替康)協(xié)同起作用(Vincenzo, D.等(2006) Cl in. Cancer Res. 12(2) :577-583)。
某些TLR9激動(dòng)劑由含有核心CpR 二核苷酸的3’ _3’連接的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中R 是經(jīng)修飾的鳥苷(美國專利No. 7，276，489)。另外，特定的化學(xué)修飾已經(jīng)容許制備特定的寡核苷酸類似物，其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的獨(dú)特調(diào)節(jié)。具體地，結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究已經(jīng)容許鑒定產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特定調(diào)節(jié)的合成的基序和新的基于DNA的化合物，而且這些調(diào)節(jié)與那些由未甲基化的 CpG二核苷酸產(chǎn)生的調(diào)節(jié)不同。(Kandimalla，E.等 Q005)Proc. Natl. Acad. ki. U S A102 :6925-6930 ；Kandimalla, Ε.等(2003)Proc. Nat. Acad. Sci. U S AlOO :14303-14308 ； Cong, Y.等(2003)Biochem Biophys Res. Commun. 310 :1133-1139 ；Kandimalla, Ε.等 (2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 306 :948-953 ；Kandimalla, Ε.等(2003)Nucleic Acids Res. 31 :2393-2400 ；Yu, D.等(2003)Bioorg. Med. Chem. 11 :459-464 ;Bhagat， L. φ (2003)Biochem.Biophys. Res. Commun. 300 :853-861 ；Yu, D.等(2002)Nucleic Acids Res. 30 :4460-4469 ；Yu, D.等 O002) J. Med. Chem. 45 :4540-4548. Yu，D.等 O002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 297 :83-90 ；Kandimal la. E.等(2002) Biocon jug. Chem. 13 966-974 ；Yu，D.等(2002)Nucleic Acids Res. 30 :1613-1619 ；Yu，D.等(2001)Bioorg. Med. Chem. 9 :2803-2808 ；Yu, D.等(2001)Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 :2263-2267 ；Kandimalla, E.等 O001) Bioorg. Med. Chem. 9 :807-813 ；Yu, D.等 OOOO) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 2585-2588 ；及 Putta，M.等(2006)Nucleic Acids Res. 34 :3231-3238)。可以通過不同細(xì)胞因子和/或趨化因子譜來最佳地治療不同疾病狀態(tài)或狀況。因而，本領(lǐng)域中需要新的寡核苷酸類似物化合物以提供此類“定制調(diào)節(jié)的(custom-timed) ”應(yīng)答。具體地，本領(lǐng)域中需要具有特定且獨(dú)特的化學(xué)修飾的TLR9激動(dòng)劑，其提供獨(dú)特的免疫應(yīng)答活化譜。發(fā)明概述令人驚訝地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特地修飾核心CpR 二核苷酸側(cè)翼的核酸序列、 核苷酸間的聯(lián)結(jié)(linkage)或連接寡核苷酸的接頭產(chǎn)生TLR9的新型激動(dòng)劑，其產(chǎn)生獨(dú)特的體外和體內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子譜。這種“定制調(diào)節(jié)”對含有CpR的寡核苷酸的細(xì)胞因子和趨化因子應(yīng)答的能力以疾病特異性且甚至患者特異性方式提供預(yù)防和/或治療多種疾病狀況的能力。如此，本發(fā)明提供了新的基于寡核苷酸的化合物等，所述化合物經(jīng)由其作為激動(dòng)劑與TLR9的相互作用來個(gè)別地提供獨(dú)特的免疫應(yīng)答譜。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑的特征在于特定且獨(dú)特的化學(xué)修飾，該化學(xué)修飾提供其獨(dú)特的免疫應(yīng)答活化譜。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑在多種細(xì)胞類型和多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中每種激動(dòng)劑提供獨(dú)特的免疫應(yīng)答譜。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑單獨(dú)地、與其它藥物組合或共施用、或者作為用作疫苗的抗原的佐劑可用于預(yù)防和/或治療多種疾病。 它們作為研究免疫系統(tǒng)，及比較各種動(dòng)物物種諸如人和小鼠的免疫系統(tǒng)的工具也是有用的。如此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 TLR9的基于寡核苷酸的激動(dòng)劑(“化合物”)。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物配制劑，其包含依照本發(fā)明的基于寡核苷酸的 TLR9激動(dòng)劑和藥學(xué)可接受載體。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了疫苗。依照此方面的疫苗包含依照本發(fā)明的藥物配制劑，而且進(jìn)一步包含抗原。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在受試者，特別是人中產(chǎn)生TLR9介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述受試者施用依照本發(fā)明的化合物、藥物配制劑或疫苗。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療性處理患有疾病或病癥的患者的方法，所述方法包括對所述患者施用依照本發(fā)明的化合物、藥物配制劑或疫苗。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防疾病或病癥的方法，所述方法包括對有風(fēng)險(xiǎn)形成疾病或病癥的患者施用依照本發(fā)明的化合物、藥物配制劑或疫苗。在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于使癌細(xì)胞對電離輻射敏感的方法。依照本發(fā)明的此方面的方法包括對患者施用依照本發(fā)明的化合物、藥物配制劑或疫苗，并用電離輻射治療患者。附圖簡述

圖1是一種用于竊供合成本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性化合物的合成方案。DMTr = 4， 4’ -二甲氧基三苯甲基；CE =氰乙基。依照實(shí)施例1來合成本發(fā)明的所有免疫調(diào)節(jié)性化合物。圖2A和2B描繪了表達(dá)TLR9的HEK293細(xì)胞中的NF_kB活性，所述表達(dá)TLR9的 HEK293細(xì)胞依照下文實(shí)施例2來培養(yǎng)、處理并分析。簡言之，用0(PBS/培養(yǎng)基)、0. 1,0.3, 1. 0,3. 0或10. 0 μ g/ml依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸刺激HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，并使用SEAP (人胚胎堿性磷酸酶的分泌形式)測定法來測定NF- κ B水平。圖2A和2B更一般地表明施用依照本發(fā)明的含有新的堿基、接頭、和/或獨(dú)特修飾的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的TLR9活化譜。圖3A和;3B描繪了來自人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度，所述人PBMC依照下文實(shí)施例3來分離、培養(yǎng)、處理并分析。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC， 并將其與0 (PBS)、0. 1、0. 3、1. 0、3. 0或10. 0 μ g/ml依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸一起培養(yǎng)M小時(shí)。收集上清液，并通過Luminex多重測定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。 圖3A和;3B更概括地表明施用依照本發(fā)明的含有新的堿基、接頭、和/或獨(dú)特修飾的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞因子和趨化因子譜。圖4A和4B描繪了來自人的類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(pDC)的IFN-γ濃度，所述人的類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(PDC)依照下文實(shí)施例3來分離、培養(yǎng)、處理并分析。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并將其與1 μ g/ml依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸一起培養(yǎng)M小時(shí)。收集上清液，并通過Luminex多重測定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。圖4A和4B更一般地表明施用依照本發(fā)明的含有新的堿基、接頭、和/或獨(dú)特修飾的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞因子和趨化因子譜。圖5A和5B描繪了由依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸誘導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖。依照下文實(shí)施例4來分離、培養(yǎng)、處理并分析人B細(xì)胞。簡言之，將自新鮮獲得的健康人志愿者的PBMC分離的人B細(xì)胞與0、0. 1、0. 3、1. 0、3. 0、或10. 0 μ g/ml依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸一起培養(yǎng)68小時(shí)，并用3H-胸苷脈沖6-8小時(shí)。使用液體閃爍計(jì)數(shù)器來測定3H-胸苷攝取。圖5A和5B更概括地表明施用依照本發(fā)明的含有新的堿基、接頭、和/或獨(dú)特修飾的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞增殖譜，其隨堿基組成、獨(dú)特的修飾、和所施用的寡核苷酸量而變化。圖6A和6B描繪了依照下文實(shí)施例5處理的C57BL/6小鼠中的血清IL-12誘導(dǎo)。簡言之，給小鼠皮下注射lmg/kg劑量的依照本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸后2小時(shí)，收集血清，并通過Luminex多重測定法分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。圖6A和6B更概括地表明體內(nèi)施用依照本發(fā)明的含有新的堿基、接頭、和/或獨(dú)特修飾的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸產(chǎn)生獨(dú)特的TLR9活化譜，其會(huì)在多種疾病中得到應(yīng)用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的基于寡核苷酸的化合物，該化合物經(jīng)由其作為激動(dòng)劑與TLR9 的相互作用來個(gè)別地提供獨(dú)特的免疫應(yīng)答譜。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑的特征在于獨(dú)特的化學(xué)修飾，該化學(xué)修飾提供其獨(dú)特的免疫應(yīng)答活化譜。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑在多種細(xì)胞類型和多種體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中每種激動(dòng)劑提供獨(dú)特的免疫應(yīng)答譜。因此，它們作為研究免疫系統(tǒng)，及比較各種動(dòng)物物種諸如人和小鼠的免疫系統(tǒng)的工具是有用的。依照本發(fā)明的TLR9激動(dòng)劑單獨(dú)地、 與其它藥物組合或共施用、或者作為用作疫苗的抗原的佐劑也可用于預(yù)防和/或治療多種疾病。在連同附圖閱讀時(shí)，可以通過以下描述更完整地理解本發(fā)明的目的、其各種特征、 及發(fā)明本身，其中下列術(shù)語具有所賦予的意義。術(shù)語“2’ -取代的核苷”或“2’ -取代的阿拉伯糖苷” 一般地包括如下的核苷或阿糖核苷(arabinonucleoside)其中戊糖或阿拉伯糖部分的2’位置處的羥基基團(tuán)被取代而產(chǎn)生2’ -取代的或2’ -0-取代的核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，此類取代是用含有1-6個(gè)飽和或不飽和碳原子的低級烴基基團(tuán)的取代，用鹵素原子的取代，或用具有6-10個(gè)碳原子的芳基的取代；其中此類烴基或芳基可以是未取代的或可以是取代的，例如用鹵素、羥基、 三氟甲基、氰基、硝基、?；?、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代。2’ -0-取代的核糖核苷或2’ -0-取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于2’ -氨基、2’ -氟、2’ -烯丙基、 2’ -0-烷基和2’ -炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷，2’ -0-甲基核糖核苷或2’ -0-甲基阿拉伯糖苷和2’ -0-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’ -0-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。在方向上使用時(shí)，術(shù)語“3’”一般指多核苷酸或寡核苷酸中的某個(gè)區(qū)域或位置在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的3’(朝向寡核苷酸的3’位置)。在方向上使用時(shí)，術(shù)語“5’”一般指多核苷酸或寡核苷酸中的某個(gè)區(qū)域或位置在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的5’(朝向寡核苷酸的5’位置)。術(shù)語“約”一般意味著精確的數(shù)字不是至關(guān)重要的。如此，寡核苷酸中的核苷殘基的數(shù)目不是至關(guān)重要的，而且少1或2個(gè)核苷殘基或具有1個(gè)到幾個(gè)額外核苷殘基的寡核苷酸預(yù)期為上文所描述的每個(gè)實(shí)施方案的等同方案。術(shù)語“氣道炎癥”一般包括但不限于由變應(yīng)原引起的呼吸道炎癥，包括哮喘。術(shù)語“變應(yīng)原”一般指暴露于受試者后引發(fā)變應(yīng)性應(yīng)答的抗原或分子(通常為蛋白質(zhì))的抗原性部分。通常，受試者對變應(yīng)原是變應(yīng)性的，如按照例如風(fēng)團(tuán)和潮紅測試 (wheal and flare test)或本領(lǐng)域已知的任何方法所表明的。即使僅有一小部分的受試者在暴露于分子后表現(xiàn)出變應(yīng)性(例如IgE)免疫應(yīng)答，也稱該分子為變應(yīng)原。術(shù)語“變態(tài)反應(yīng)”一般包括但不限于食物變態(tài)反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)變態(tài)反應(yīng)和皮膚變態(tài)反應(yīng)。術(shù)語“抗原”一般指被抗體或T細(xì)胞或B細(xì)胞抗原受體識別和選擇性結(jié)合，而且引發(fā)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗原可以包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸及其組合?？乖梢允翘烊坏幕蚝铣傻?，而且一般誘導(dǎo)對所述抗原特異性的免疫應(yīng)答。術(shù)語“癌癥”一般指，但不限于由異常的或不受控制的細(xì)胞增殖和/或分裂引起的任何惡性生長或腫瘤。癌癥可以在人和/或動(dòng)物中發(fā)生，而且可以發(fā)生在任何和所有組織中。用本發(fā)明治療患有癌癥的患者可以包括施用依照本發(fā)明的化合物、藥物配制劑或疫苗以影響異常的或不受控制的細(xì)胞增殖和/或分裂。術(shù)語“載體” 一般涵蓋任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、油、脂質(zhì)、含有脂質(zhì)的囊泡、微球體、脂質(zhì)體包囊、或本領(lǐng)域公知用于藥物配制劑的其它材料。應(yīng)當(dāng)理解的是，載體、賦形劑、或稀釋劑的特征會(huì)取決于用于特定應(yīng)用的施用路徑。含有這些材料的藥學(xué)可接受配制劑的制備記載于例如Remington，s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，A. Gennaro 編，Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990。術(shù)語“藥學(xué)可接受的”或“生理學(xué)可接受的”一般指不干擾依照本發(fā)明的化合物的效率，且與生物學(xué)系統(tǒng)如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、或生物體相容的材料。優(yōu)選地，生物學(xué)系統(tǒng)是活的生物體，諸如脊椎動(dòng)物。術(shù)語“共施用”或“共施用的”一般指在時(shí)間上足夠接近地施用至少兩種不同物質(zhì)以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，共施用指同時(shí)施用至少兩種不同物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)有效量”一般指足以影響期望的生物學(xué)效應(yīng)，諸如有益的結(jié)果的量。如此，“藥學(xué)有效量”會(huì)取決于其被施用的背景。藥學(xué)有效量可以在一次或多次預(yù)防性或治療性施用中施用。術(shù)語“與...組合”一般指施用依照本發(fā)明的化合物和可用于治療疾病或狀況的另一種藥劑。所述施用可以以任何次序完成，包括同時(shí)施用，以及相隔幾秒至數(shù)天或相隔幾小時(shí)至幾天、或相隔幾小時(shí)的時(shí)間上有間隔的次序。此類組合處理還可以包括施用依照本發(fā)明的化合物和/或獨(dú)立地所述其它藥劑超過一次。依照本發(fā)明的化合物和其它藥劑的施用可以通過相同或不同路徑進(jìn)行。術(shù)語“受試者”或“患者，，一般指哺乳動(dòng)物，諸如人。哺乳動(dòng)物一般包括但不限于人、非人靈長類、大鼠、小鼠、貓、犬、馬、牛、奶牛(cows)、豬、綿羊和兔。術(shù)語“激酶抑制劑” 一般指在細(xì)胞中拮抗或抑制磷酸化依賴性細(xì)胞信號傳導(dǎo)和/ 或生長途徑的分子。激酶抑制劑可以是天然存在的或合成的，而且包括具有要作為口服治療劑施用的潛力的小分子。激酶抑制劑具有快速且特異性抑制靶標(biāo)激酶分子的激活的能力。蛋白質(zhì)激酶是有吸引力的藥物靶物，這部分是因?yàn)樗鼈冋{(diào)節(jié)極其多種信號傳導(dǎo)和生長途徑，而且包括許多不同蛋白質(zhì)。因此，它們在治療牽涉激酶信號傳導(dǎo)的疾病，包括癌癥、心血管疾病、炎性病癥、糖尿病、黃斑變性和神經(jīng)病學(xué)病癥中具有極大的潛力。激酶抑制劑的例子包括但不限于鹽酸埃羅替尼(erlotinib hydrochloride) (Tarceva )、吉非替尼(gefitinib) (Iressa )、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate) (Nexavar )、 蘋果酸舒尼替尼(sunititnib malate) (Sutent )、達(dá)沙替尼(dasatinib) (Sprycel )、 凡德他尼(vandetanib) (Zactima )、拉帕替尼(Iapatinib) (Tykerb )、西羅莫司 (temsirolimus) (Toricel )、和甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate) (Gleevec )。術(shù)語“哺乳動(dòng)物”明確意圖包括溫血的脊椎動(dòng)物，包括但不限于人。術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷”一般指包含經(jīng)修飾的雜環(huán)堿基、經(jīng)修飾的糖模塊、或其任意組合的核苷。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的核苷是非天然的嘧啶或嘌呤核苷，如本文中所描述的。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷”、“嘧啶或嘌呤類似物”或“非天然存在的嘧啶或嘌呤”可互換使用，指包含非天然存在的堿基和/或非天然存在的糖模塊的核苷。出于本發(fā)明的目的，若堿基不是鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，則認(rèn)為它是非天然的。術(shù)語“調(diào)節(jié)”或“調(diào)節(jié)性”一般指變化，諸如應(yīng)答升高或TLR9介導(dǎo)的應(yīng)答的定性差
已術(shù)語“接頭”一般指可以經(jīng)由糖、堿基、或主鏈通過共價(jià)或非共價(jià)鍵合而附接于寡核苷酸的任何模塊。接頭可以用于附接兩個(gè)或更多個(gè)核苷或者可以被附接于寡核苷酸中的 5’和/或3’端核苷酸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，此類接頭可以是非核苷酸接頭。術(shù)語“非核苷酸接頭”一般指可以通過共價(jià)或非共價(jià)鍵合而附接于寡核苷酸的與核苷酸聯(lián)結(jié)不同的化學(xué)模塊。優(yōu)選地，此類非核苷酸接頭長約2埃至約200埃，而且可以為順式或反式取向。術(shù)語“核苷酸聯(lián)結(jié)”一般指在相鄰核苷之間經(jīng)由其糖連接兩個(gè)核苷的化學(xué)聯(lián)結(jié) (例如3’ _3’、2’ _3’、2’ _5’、3’ _5’)，其由磷原子和帶電荷或中性基團(tuán)組成(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或烴基膦酸酯)。術(shù)語“基于寡核苷酸的化合物”指由多個(gè)連接起來的核苷單元形成的多聚核苷。 核苷單元可以是病毒、細(xì)菌、細(xì)胞碎片、siRNA和微小RNA的一部分或者可以部分由病毒、 細(xì)菌、細(xì)胞碎片、siRNA和微小RNA制成。所述寡核苷酸也可以從現(xiàn)有的核酸來源(包括基因組或cDNA)獲得，但是優(yōu)選是通過合成方法生成的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)核苷單元包括雜環(huán)堿基和呋喃戊糖基、海藻糖、阿拉伯糖、2’ -脫氧_2’ -取代的核苷、2’ -脫氧-2’ -取代的阿拉伯糖、2’ -0-取代的阿拉伯糖或己糖基團(tuán)。核苷殘基可以通過多種已知的核苷間聯(lián)結(jié)之任一種而彼此偶聯(lián)。所述核苷間聯(lián)結(jié)包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烴基膦酸酯、烴基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酯、 氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、氨基乙酸酯(acetamidate)、 氨基甲酸酯、嗎啉代(morpholino)、硼代(borano)、硫醚、橋接氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)、橋接亞甲基膦酸酯、橋接硫代磷酸酯、和砜核苷間聯(lián)結(jié)。術(shù)語“基于寡核苷酸的化合物”還涵蓋具有一個(gè)或多個(gè)立體特異性的核苷間聯(lián)結(jié)(例如(Rp)-或(Sp)-硫代磷酸酯、烴基膦酸酯、或磷酸三酯聯(lián)結(jié))的多核苷。如本文中所使用的，術(shù)語“寡核苷酸”和 “二核苷酸”明確意圖包括具有任何所述核苷間聯(lián)結(jié)的多核苷和二核苷，無論所述連接是否包含磷酸根基團(tuán)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些核苷間聯(lián)結(jié)可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯聯(lián)結(jié)，或其組合。術(shù)語“肽”一般指具有足以影響生物學(xué)應(yīng)答(例如抗體生成或細(xì)胞因子活性)的長度和組成的氨基酸寡聚物，無論所述肽是否為半抗原。術(shù)語“肽”可以包括經(jīng)修飾的氨基酸 (無論是天然存在的還是非天然存在的)，其中所述修飾包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG 化、脂化(Iipidization)和甲基化。術(shù)語“TLR9激動(dòng)劑” 一般指能夠增強(qiáng)、誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)由TLR9介導(dǎo)的免疫刺激的基于寡核苷酸的化合物。術(shù)語“治療/處理”一般指意圖獲得有益的或期望的結(jié)果的方法，其可以包括減輕癥狀或延遲或改善疾病進(jìn)展。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 TLR9的基于寡核苷酸的激動(dòng)劑(“化合物”)。在下文表I中顯示了依照本發(fā)明的某些TLR9激動(dòng)劑。在此表中，除非在指明的情況中，基于寡核苷酸的TLR9激動(dòng)劑均具有硫代磷酸酯(PQ聯(lián)結(jié)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可可以使用磷酸二酯(PO)聯(lián)結(jié)，或PS和PO聯(lián)結(jié)的混合。除非在指明的情況中，否則所有核苷酸均是脫氧核糖核苷酸。表 I
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)性化合物，其包含具有選自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、 14、15、16、和17的序列的基于寡核苷酸的化合物。
2.一種組合物，其包含權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)性化合物和生理學(xué)可接受載體。
3.一種用于在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對所述受試者以藥學(xué)有效量施用依照權(quán)利要求1的化合物。
4.一種用于治療性處理患有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答會(huì)是有益的疾病或病癥的受試者的方法，所述方法包括對所述受試者以藥學(xué)有效量施用依照權(quán)利要求1的化合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體或變應(yīng)原引起的疾病。
6.依照權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療性化合物、靶向性治療劑、疫苗、佐劑、抗原、抗體、細(xì)胞毒劑、變應(yīng)原、抗生素、反義寡核苷酸、siRNA分子、適體、核酶、TLR激動(dòng)劑、激酶抑制劑、肽、蛋白質(zhì)、DNA疫苗、佐劑、共刺激分子、放射性同位素或電離輻射、或其組合。
7.依照權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體選自Panorex (Glaxo-Welcome)、 Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、Mylotarg (Wyeth)、Campath (Millennium) >Zevalin (IDEC and Schering AG)、Bexxar (Corixa/GSK)、Erbitux (Imclone/BMS)、Avastin (Genentech)禾口Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche)。
8.依照權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑選自吉西他濱、氨甲蝶呤、長春花新堿、 阿霉素、順鉬、含非糖的氯乙基亞硝基脲類、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星、 達(dá)卡巴嗪、紫杉醇、弗拉吉林、葡甲胺GLA、戊柔比星、亞硝脲氮芥和聚苯丙生、匪1270、BAY 12-9566、RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、MMP, MTA/LY231514、LY264618/ 洛美曲索、格拉默來、CI-994、TNP-470、Hycamtin /托泊替康、PKC412,伐司樸達(dá)/ PSC833、Novantrone /米托蒽醌、蘇拉明六鈉鹽/蘇拉明、巴馬司他、E7070、BCH-4556、 CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI64U0DN 698、TA 2516/ 馬米司他、BB2516/ 馬米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳桿菌制劑 DP 2202,FK 317、溶鏈菌制劑/0K-432、AD 32/戊柔比星、Metastron /鍶衍生物、泰道/替莫唑胺、阿霉素脂質(zhì)體/多柔比星脂質(zhì)體、優(yōu)他散/紫杉醇、Taxol /紫杉醇、希羅達(dá)/卡培他濱、氟鐵龍/去氧氟尿苷、西克羅派/ 口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/順鉬、HMR 1275/夫拉平度、CP-358 (774) /EGFR、CP-609 (754) /RAS 癌基因抑制劑、BMS-182751/ 口服鉬、UFT (替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol /左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增強(qiáng)劑、依立替康/左旋咪唑、Camptosar /依立替康、圖莫得/雷利特塞、Leustatin /克拉屈濱、Paxex/紫杉醇、Doxil /多柔比星脂質(zhì)體、楷萊/多柔比星脂質(zhì)體、Fludam /氟達(dá)拉濱、表阿霉素/ 表柔比星、DepoCyt /阿糖胞苷、ZD1839、LU 79553/雙-萘二甲酰亞胺、LU 103793/海兔毒素、楷替/多柔比星脂質(zhì)體、Gemzar /吉西他濱、ZD 0473 (AnorMED )、YM 116、 碘接種、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifex /異環(huán)磷酰胺、 Mesnex / 美司鈉、Vumon / 尼泊苷、Paraplatin / 碳鉬、順鉬(Plantinol) / 順鉬 (cisplatin)、依托泊苷(V印eside) / 依托泊苷(Etoposide), ZD 9331、Taxotere / 多西紫杉醇、鳥嘌呤阿糖苷前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、烷化劑諸如苯丙氨酸氮芥和環(huán)磷酰胺、氨魯米特、天冬酰胺酶、白消安、碳鉬、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、更生霉素、鹽酸柔紅霉素、磷雌氮芥、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羥基脲(羥基尿素)、異環(huán)磷酰胺、干擾素α _2a、α _2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類似物)、洛莫司汀 (CCNU)、鹽酸雙氯乙基甲胺(氮芥)、巰嘌呤、美司鈉、米托坦(鄰對滴滴滴(ο. P’ -DDD))、 鹽酸米托蒽醌、奧曲肽、普卡霉素、鹽酸丙卡巴胼、鏈佐星、枸櫞酸他莫昔芬、硫代鳥嘌呤、 塞替派、長春堿、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、紅細(xì)胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG;丙酮雙脒腙；MGBG)、噴司他丁(2’ -脫氧考福霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸長春地辛。
9.一種用于預(yù)防性處理有風(fēng)險(xiǎn)形成調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答會(huì)是有益的疾病或病癥的受試者的方法，所述方法包括對所述受試者以藥學(xué)有效量施用依照權(quán)利要求1的化合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述疾病或病癥是所述受試者中的癌癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體或變應(yīng)原引起的疾病。
11.依照權(quán)利要求9的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療性化合物、靶向性治療劑、疫苗、佐劑、抗原、抗體、細(xì)胞毒劑、變應(yīng)原、抗生素、反義寡核苷酸、siRNA分子、適體、核酶、TLR激動(dòng)劑、激酶抑制劑、肽、蛋白質(zhì)、DNA疫苗、佐劑、共刺激分子、放射性同位素或電離輻射、或其組合。
12.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體選自Panorex (Glaxo-Welcome)、 Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、Mylotarg (Wyeth)、Campath (Millennium) >Zevalin (IDEC and Schering AG)、Bexxar (Corixa/GSK)、Erbitux (Imclone/BMS)、Avastin (Genentech)禾口Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche)。
13.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述化療劑選自吉西他濱、氨甲蝶呤、長春花新堿、 阿霉素、順鉬、含非糖的氯乙基亞硝基脲類、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星、 達(dá)卡巴嗪、紫杉醇、弗拉吉林、葡甲胺GLA、戊柔比星、亞硝脲氮芥和聚苯丙生、匪1270、BAY 12-9566、RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、MMP, MTA/LY231514、LY264618/ 洛美曲索、格拉默來、CI-994、TNP-470、Hycamtin /托泊替康、PKC412,伐司樸達(dá)/ PSC833、Novantrone /米托蒽醌、蘇拉明六鈉鹽/蘇拉明、巴馬司他、E7070、BCH-4556、 CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI64U0DN 698、TA 2516/ 馬米司他、BB2516/ 馬米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳桿菌制劑 DP 2202、 FK 317、溶鏈菌制劑/0K-432、AD 32戊柔比星、Metastron /鍶衍生物、泰道/替莫唑胺、 阿霉素脂質(zhì)體/多柔比星脂質(zhì)體、優(yōu)他散/紫杉醇、Taxol /紫杉醇、希羅達(dá)/卡培他濱、 氟鐵龍/去氧氟尿苷、西克羅派/ 口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/順鉬、HMR 1275/夫拉平度、CP-358 (774) /EGFR、CP-609 (754) /RAS 癌基因抑制劑、BMS-182751/ 口服鉬、UFT (替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol /左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增強(qiáng)劑、依立替康/左旋咪唑、Camptosar /依立替康、圖莫得/雷利特塞、Leustatin /克拉屈濱、Paxex/紫杉醇、Doxil /多柔比星脂質(zhì)體、楷萊/多柔比星脂質(zhì)體、Fludam /氟達(dá)拉濱、表阿霉素/ 表柔比星、DepoCyt /阿糖胞苷、ZD1839、LU 79553/雙-萘二甲酰亞胺、LU 103793/海兔毒素、楷替/多柔比星脂質(zhì)體、Gemzar /吉西他濱、ZD 0473 (AnorMED )、YM 116、 碘接種、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifex /異環(huán)磷酰胺、 Mesnex / 美司鈉、Vumon / 尼泊苷、Paraplatin / 碳鉬、順鉬(Plantinol) / 順鉬(cisplatin)、依托泊苷(V印eside) / 依托泊苷(Etoposide), ZD 9331、Taxotere / 多西紫杉醇、鳥嘌呤阿糖苷前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、烷化劑諸如苯丙氨酸氮芥和環(huán)磷酰胺、氨魯米特、天冬酰胺酶、白消安、碳鉬、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、更生霉素、鹽酸柔紅霉素、磷雌氮芥、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羥基脲(羥基尿素)、異環(huán)磷酰胺、干擾素α _2a、α _2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類似物)、洛莫司汀 (CCNU)、鹽酸雙氯乙基甲胺(氮芥)、巰嘌呤、美司鈉、米托坦(鄰對滴滴滴(o. p’ -DDD))、 鹽酸米托蒽醌、奧曲肽、普卡霉素、鹽酸丙卡巴胼、鏈佐星、枸櫞酸他莫昔芬、硫代鳥嘌呤、 塞替派、長春堿、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、紅細(xì)胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG ；丙酮雙脒腙；MGBG)、噴司他丁(2’ -脫氧考福霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸長春地辛。
14.一種用于治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，包括對患有腫瘤的哺乳動(dòng)物與電離輻射組合施用依照權(quán)利要求1的化合物。
15.依照權(quán)利要求14的方法，其中在第O天時(shí)施用依照權(quán)利要求1的化合物，且在第2 天、第4天和第9天時(shí)以約3Gy的輻射施用輻射。
16.權(quán)利要求14的方法，其中在用電離輻射治療前約1小時(shí)至約4天施用所述化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的合成的化學(xué)組合物。具體地，本發(fā)明涉及產(chǎn)生獨(dú)特的細(xì)胞因子和趨化因子譜的Toll樣受體9(TLR9)的激動(dòng)劑。
文檔編號C12N15/117GK102300990SQ201080006050
公開日2011年12月28日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月30日
發(fā)明者E.坎迪馬拉, L.巴加特, M.普塔, S.阿格拉瓦爾, 王大慶, 郁東 申請人:艾德拉藥物股份有限公司