專利名稱：產(chǎn)生2n配子或未減數(shù)配子的植物的制作方法
產(chǎn)生2N配子或未減數(shù)配子的植物本發(fā)明涉及產(chǎn)生第二次分裂再組(Second Division Restitution, SDR)配子的植物，還涉及產(chǎn)生未減數(shù)配子(apomeiotic gamete)的植物，以及它們在植物育種中的用途。2n配子(也稱為二倍體配子(diplogamete))是具有體細(xì)胞染色體數(shù)目而不是配子體染色體數(shù)目的配子。已經(jīng)表明它們可用于幾種作物的遺傳改良(有關(guān)綜述，參見(例如)RAMANNA & JAC0BSEN，Euphytica 133，3_18，2003)。具體地，二倍體配子的產(chǎn)生使得不同倍數(shù)水平的植物之間能夠雜交，例如四倍體作物植物與其二倍體野生型親緣植物之間的雜交，從而在植物育種項目中使用它們的遺傳多樣性。2η配子的形成來源于減數(shù)分裂期間的異常(有關(guān)綜述，參見VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3，252-288，1985 或 BRETAGN0LLE & THOMPSON， New Phytologist 129， 1-22，1995)。在正常減數(shù)分裂中，染色體首先復(fù)制，從而產(chǎn)生了姐妹染色單體對。在該輪復(fù)制之后是兩輪分裂稱作減數(shù)分裂I和減數(shù)分裂II。減數(shù)分裂I期間，同源染色體重組并分離進(jìn)入兩個細(xì)胞，它們的每一個包含一套單倍體容量的染色體。在減數(shù)分裂II中，從減數(shù)分裂I中產(chǎn)生的兩個細(xì)胞進(jìn)一步分裂，姐妹染色單體分離。因此，由該分裂產(chǎn)生的孢子為單倍體并且?guī)в兄亟M的遺傳信息。導(dǎo)致2η配子形成的異常特別地包括異常胞質(zhì)分裂、跳過(skip)減數(shù)第一次或第二次分裂或者異常的紡錘體幾何形狀(有關(guān)綜述，參見VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3,252-288，1985 或 BRETAGN0LLE & THOMPSON,New Phytologist 129，1-22，1995)。這些異常導(dǎo)致產(chǎn)生了不同類型的未減數(shù)配子。例如，減數(shù)第一次分裂的失敗導(dǎo)致第一次分裂再組 (Firtst Division Restitution, FDR)配子，而減數(shù)第二次分裂的失敗導(dǎo)致第二次分裂再組(SDR)配子。盡管已經(jīng)在多種植物物種中報道了能夠產(chǎn)生2η配子的多種突變體，但是到目前為止，僅僅在分子水平上鑒定并表征了一個與2η花粉形成有關(guān)的基因。命名為 AtPSl (Arabidopsis thaliana parallel spindles)的該基因的失活產(chǎn)生了二倍體雄性孢子，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了有活力的二倍體花粉顆粒并且在子代中產(chǎn)生了自發(fā)的三倍體植物。在 2008年7月8日提交的歐洲專利申請08490672中和D' ERFURTH等人(PLoS Genet. 2008 Nov ；4(11) :el000274. Epub 2008 Nov 28)的出版物中公開了該基因及其在產(chǎn)生2n花粉中的用途。目前，本發(fā)明人已在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中鑒定了與植物中2η配子形成有關(guān)的另一個基因。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)該基因的失活導(dǎo)致跳過減數(shù)第二次分裂。這產(chǎn)生了二倍體雄性和雌性孢子，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了有活力的二倍體雄性和雌性配子， 即SDR配子。該基因在下文中將命名為OSDl (omission of second division)。擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的OSDl基因序列可在TA^數(shù)據(jù)庫中以登記號At3g57860獲得， 或者在GenBank數(shù)據(jù)庫中以登記號NM_115648獲得。該基因編碼243個氨基酸的蛋白質(zhì) (GenBank NP_191345)，其序列也在所附序列表中以SEQ ID N0:1表示。
之前在HASE等人(Plant J，46，317-26，2006)的出版物中已經(jīng)將擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的OSDl基因描述為“UVI4礦基因(UVI4-L)，該出版物描述了名為UVI4的其旁系同源基因。根據(jù)HASE等人，UVI4起到核內(nèi)復(fù)制(endo-reduplication)抑制子的作用，并且其是維持有絲分裂狀態(tài)所必需的，而OSDl (UVI4-L)似乎不是該過程所需要的。相反，如本文所示，OSDl似乎是使減數(shù)分裂I能夠向減數(shù)分裂II過渡所必需的。本發(fā)明人還在水稻(Oryza sativa)中鑒定了擬南芥(Arabidopsis thaliana) OSDl基因的直系同源基因。水稻(Oryza sativa)OSDl基因的序列可在OryGenes或TAIR 數(shù)據(jù)庫中以登記號0s02g37850獲得。它編碼了 234個氨基酸的蛋白質(zhì)，其序列在所附序列表中以 SEQ ID NO:;35 表示。擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的 OSDl蛋白在它們的序列全長上有23. 6%的同一性和35%的相似性。因此，本發(fā)明提供了獲得產(chǎn)生第二次分裂再組2η配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下文中稱作OSDl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 1 的AtOSDl蛋白或者與SEQ ID NO 35的OsOSDl蛋白有至少20%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，至少 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98%的序列同一性，或者有至少29%,以及按照優(yōu)先性提高的順序，至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或98%的序列相似性。除非另外指明，否則本文所提供的蛋白序列同一性和相似性值是以缺省參數(shù)使用BLASTP程序或者使用尼德爾曼-文施(Needleman-Wunsch)全局比對算法(使用缺省參數(shù)的EMBOSS成對比對Needle工具)對序列全長計算的。相似性計算是使用得分矩陣 BL0SUM62進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的SDR 2η配子在2η配子的所有常規(guī)應(yīng)用中是有用的，例如， 用于產(chǎn)生多倍體植物或使不同倍數(shù)性水平的植物間能夠雜交。它們還可用于基因作圖方法，例如，美國專利申請20080057583中公開的“逆向子代基因作圖(Reverse progeny mapping) ” 法。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過將OSDl的失活與兩個其它基因的失活相結(jié)合導(dǎo)致減數(shù)分裂完全被有絲分裂所取代但不影響隨后的有性過程的基因型，所述兩個其它基因中的一個基因(SP011-1)編碼了植物中有效減數(shù)分裂重組所必需的蛋白質(zhì)以及對其的抑制消除了重組和配對(GREL0N等人，Embo J，20，589-600，2001)，而其中的另一個基因(REC8， At2g47980)編碼減數(shù)分裂期間著絲粒單極定向所必需的蛋白質(zhì)(CHELYSHEVA等人，J Cell Sci, 118,4621-32,2005)以及對其的抑制改變了染色單體的分離。這種基因型在下文中被稱作MiMe (有絲分裂代替減數(shù)分裂，mitosis instead of meiosis) 0有絲分裂對減數(shù)分裂的這種代替導(dǎo)致未減數(shù)配子，其保留了所有的親代遺傳信息(BICKNELL & K0LTUN0W，Plant Cell,16 Suppl，S228-45，2004)。

圖1提供了下列項之機(jī)制之間比較的示意圖有絲分裂、正常減數(shù)分裂、osdl突變體中的減數(shù)分裂、缺少SP011-1活性的突變體(Atspoll-Ι)中的減數(shù)分裂、缺少SP011-1和 REC8活性的雙突變體(Atspol 1-1/Atrec8)中的減數(shù)分裂以及MiMe突變體中的減數(shù)分裂。在二倍體細(xì)胞的有絲分裂期間，染色體復(fù)制并且姐妹染色單體分離以產(chǎn)生子細(xì)胞，所述子細(xì)胞是二倍體的并且在遺傳上與初始細(xì)胞相同。在正常減數(shù)分裂期間，一輪復(fù)制后是兩輪染色體分離。在第一次分裂時，同源染色體重組并分離。減數(shù)分裂II更類似于有絲分裂，其導(dǎo)致姐妹染色單體平均分配。因此，所獲得的孢子是單倍體且?guī)в兄亟M的遺傳信息。在osdl突變體(本研究)中，減數(shù)分裂II被跳過，從而產(chǎn)生了二倍體孢子和具有重組遺傳信息的SDR配子。Atspoll-I突變體經(jīng)歷了不平衡的第一次分裂，隨后經(jīng)歷了第二次分裂，其導(dǎo)致不平衡孢子和不育。Atspol 1-1/Atrec8雙突變體經(jīng)歷了有絲分裂樣的分裂而不是正常的減數(shù)第一次分裂，隨后經(jīng)歷了不平衡的第二次分裂，其導(dǎo)致不平衡孢子和不育。在 osdl/Atspoll_l/Atrec8 三突變體(MiMe)中，Atspoll-Ι 和 Atrec8 突變的存在導(dǎo)致了有絲分裂樣的減數(shù)第一次分裂，而osdl突變的存在防止發(fā)生減數(shù)第二次分裂。因此，有絲分裂樣分裂取代了減數(shù)分裂。所獲得的孢子和配子在遺傳上與初始細(xì)胞是相同的?？蓪iMe突變體所產(chǎn)生的未減數(shù)配子以與SDR 2η配子相同的方式用于產(chǎn)生多倍體植物或者用于不同倍數(shù)性水平植物的雜交。對于無融合生殖(apomictic)植物(即下述植物能夠從胚珠的母系組織中形成種子，產(chǎn)生的子代是母系親代的遺傳克隆)的產(chǎn)生來說，它們也是受到關(guān)注的。盡管在超過400種被子植物中存在，但是極少有作物物種是無融合生殖的，并且通過雜交引入該特性的嘗試也失敗了(SAVIDAN，The Flowering of Apomixis :From Mechanisms to GeneticEngineering 2001 ；SPILLANE等人，Sexual Plant Reproduction,14,2001)。因此，本發(fā)明的另一個目標(biāo)是用于獲得產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下列蛋白質(zhì)a)如上所定義的OSDl蛋白；b)在植物中參與減數(shù)分裂重組起始的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自i)在下文中稱作SP011-1蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :2所示的SP011-1蛋白有至少40%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少60%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；ii)下文中稱作SP011-2蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :3所示的 SPOl 1-2蛋白有至少40%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少60%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；iii)下文中稱作PRDl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :4所示的PRDl 蛋白有至少25%,以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少35%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98%的序列相似性；iv)下文中稱作PAIRl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:5所示的 PAIRl蛋白有至少30%,以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少40%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；c)下文中稱作Rec8蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 6所示的Rec8 蛋白有至少40%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少45%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性。SEQ ID NO :2 表示擬南芥(Arabidopsis thaliana) SP011-1 蛋白的序列。該序列可在Swissprot數(shù)據(jù)庫中以登記號Q9M4A2獲得。SEQ ID NO :3 表示擬南芥(Arabidopsis thaliana) SPOl 1-2 蛋白的序列。該序列可在Swissprot數(shù)據(jù)庫中以登記號Q9M4A1獲得。SEQ ID NO :4表示擬南芥(Arabidopsis thaliana)PRDl蛋白的序列。該序列可在GenBank數(shù)據(jù)庫中以登記號ABQU642獲得。SEQ ID NO :5表示擬南芥(Arabidopsis thaliana)PAIRl蛋白的序列。該序列可在GenBank數(shù)據(jù)庫中以登記號NP_171675獲得。SEQ ID NO :6表示擬南芥(Arabidopsis thaiiana)Rec8蛋白的序列。該序列可在GenBank數(shù)據(jù)庫中以登記號NP_196168獲得。SPOll-U SP011-2、PRDU PAIRl和Rec8蛋白在高等植物、單子葉植物和雙子葉植物中是保守的。非限制性地例如單子葉植物中的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的 SP011-U SP011-2、PRDU PAIRl和Rec8蛋白的直系同源物，可引用水稻(Oryza sativa) 的 SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 和 Rec8 蛋白。水稻(Oryza sativa) SP011-1 蛋白的序列可在GenBank中以登記號AAP68363獲得；水稻(Oryza sativa) SP011-2蛋白的序列可在GenBank中以登記號NP_001061027獲得；水稻(Oryza sativa)PRDl蛋白的序列可在GenBank中以登記號EAD0311獲得；水稻(Oryza sativa)PAIRl蛋白的序列可在 SwissProt中以登記號Q75RY2獲得；水稻(Oryza sativa) Rec8蛋白的序列可在GenBank中以登記號AAQ75095獲得?？赏ㄟ^消除、阻斷或降低它們的功能，或者有利地通過阻止或下調(diào)相應(yīng)基因的表達(dá)，來獲得上述 OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 或 Rec8 蛋白的抑制。舉例來說，可通過誘變相應(yīng)基因或其啟動子，以及選擇部分地或完全地喪失所述蛋白質(zhì)活性的突變體，來獲得所述蛋白質(zhì)的抑制。例如，根據(jù)突變的性質(zhì)，編碼序列內(nèi)的突變可誘導(dǎo)失活蛋白質(zhì)或活性受損蛋白質(zhì)的表達(dá)；同樣地，啟動子序列內(nèi)的突變可引起所述蛋白質(zhì)表達(dá)缺乏或減少。例如，可通過編碼序列或者編碼所述蛋白質(zhì)之基因的啟動子或其部分的靶向缺失來進(jìn)行突變，或者可通過外源序列靶向插入到所述編碼序列或者所述啟動子中來進(jìn)行突變。還可通過誘導(dǎo)隨機(jī)突變來進(jìn)行，例如，通過EMS誘變或隨機(jī)插入誘變，接著篩選所需基因中的突變體。高通量誘變和篩選的方法在本領(lǐng)域中是可用的。舉例來說，可參見 TILLING (定向誘導(dǎo)基因組局部突變，如McCallum等人，2000中所述)。在OSDl基因內(nèi)的突變中，可根據(jù)該突變純合的植物的表型特征來鑒定導(dǎo)致產(chǎn)生 SDR 2n配子能力的那些突變這些植物可形成至少5 %，優(yōu)選地至少10 %，更優(yōu)選地至少 20%，更優(yōu)選地至少50%和最高100%的二分體形式的減數(shù)分裂產(chǎn)物。在參與植物中減數(shù)分裂重組起始之蛋白質(zhì)的編碼基因內(nèi)的突變中，如SP011-1基因或SP011-2、PRDl或PAIRl基因，可根據(jù)該突變純合的植物的表型特征(特別地，減數(shù)分裂I中存在單價染色體而不是二價染色體，和植物不育)來鑒定可用于獲得產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的那些突變。
在具有REC8基因內(nèi)突變的突變體中，可根據(jù)該突變純合的植物的表型特征(特別地，減數(shù)分裂中染色體斷裂，和植物不育)來鑒定可用于獲得產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的那些突變。根據(jù)用于獲得能夠產(chǎn)生SDR 2n配子之植物的本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案， 所述方法包括a)提供在OSDl基因之等位基因內(nèi)具有突變的植物，所述突變導(dǎo)致該等位基因所編碼蛋白質(zhì)的抑制，所述植物對該突變是雜合的；b)使步驟a)中的所述植物自交，以獲得所述突變純合的植物。根據(jù)用于獲得能夠產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，所述方法包括a)提供在OSDl基因之等位基因內(nèi)具有突變的植物，所述突變導(dǎo)致該等位基因所編碼蛋白質(zhì)的抑制，所述植物對該突變是雜合的；b)提供在選自SP011-1、SP011-2、PRD1或PAIRl之基因的等位基因內(nèi)具有突變的植物，所述突變導(dǎo)致所述等位基因所編碼蛋白質(zhì)的抑制，所述植物對該突變是雜合的；c)提供在REC8基因的等位基因內(nèi)具有突變的植物，所述突變導(dǎo)致所述等位基因所編碼蛋白質(zhì)的抑制，所述植物對該突變是雜合的；e)將步驟a)、b)和c)中的植物雜交，以獲得在OSDl基因之等位基因內(nèi)具有突變、 在選自SP011-1、SP011-2、PRD1或PAIRl的基因之等位基因內(nèi)具有突變以及在REC8基因之等位基因內(nèi)具有突變的植物，所述植物對每個突變是雜合的；f)將步驟e)中的植物自交，以獲得以下突變純合的植物，即OSDl基因內(nèi)的突變、 選自SP011-1、SPOl 1-2、PRDl或PAIRl的基因內(nèi)的突變和REC8基因內(nèi)的突變。作為替代，通過沉默相應(yīng)基因來獲得靶標(biāo)蛋白質(zhì)的抑制。用于植物中基因沉默的方法本身是本領(lǐng)域已知的。例如，可提及反義抑制或共抑制，例如美國專利5190065和 5283323中所述的。還可使用靶向所述蛋白質(zhì)mRNA的核酶。一些優(yōu)選的方法是通過RNA干擾(RNAi)誘導(dǎo)基因沉默的那些方法，其使用靶向待沉默基因的沉默RNA。在本領(lǐng)域中，有多種用于遞送沉默RNA的方法和DNA構(gòu)建體是可用的。在本文中，“沉默RNA”定義為可以序列特異性的方式通過與互補(bǔ)mRNA分子堿基配對使靶標(biāo)基因沉默的小RNA。特別地，沉默RNA包括小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)。起初，用于在植物中遞送沉默RNA的DNA構(gòu)建體包含靶基因cDNA的300bp或以上 (一般為300-800bp，盡管有時較短的序列也可誘導(dǎo)有效的沉默)的片段，其處于在所述植物中具有活性的啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。當(dāng)前，更廣泛使用的沉默RNA構(gòu)建體是可產(chǎn)生發(fā)夾RNA(hpRNA)轉(zhuǎn)錄本的那些。在這些構(gòu)建體中，靶基因的片段是反向重復(fù)的，一般在所述重復(fù)之間具有間隔區(qū)(有關(guān)綜述，參見WATSON等人，2005)。還可使用針對待沉默基因的人工微小RNA(amiRNA)(有關(guān)植物中沉默RNA特別是包括amiRNA的設(shè)計和應(yīng)用的綜述，參見例如 OSSOffSKI 等人(Plant J.，53，674-90，2008))。本發(fā)明提供了用于沉默選自O(shè)SDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的一個或更多個靶基因的工具，特別地，其包括靶向所述基因的hpRNA或amiRNA的表達(dá)盒。本發(fā)明的表達(dá)盒可包含，例如
-在植物細(xì)胞中有功能的啟動子；-200至lOOObp，優(yōu)選300至900bp的一個或更多個DNA構(gòu)建體，每個構(gòu)建體包含選自O(shè)SDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl和REC8的靶基因的cDNA片段或其互補(bǔ)片段，或者與所述片段有至少95%的同一性，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少96^^97^^98% 或99%的同一性的片段，所述DNA構(gòu)建體處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，hpRNA的表達(dá)盒包含-在植物細(xì)胞中有功能的啟動子，-一個或更多個發(fā)夾DNA構(gòu)建體，其在轉(zhuǎn)錄時能夠形成靶向選自O(shè)SDl、SPOll-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的基因的發(fā)夾 RNA ；所述DNA構(gòu)建體處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。一般地，所述發(fā)夾DNA構(gòu)建體包括i) 200至lOOObp，優(yōu)選300至900bp的第一 DNA 序列，其由靶基因的cDNA片段組成，或者與所述片段有至少95%的同一性，以及按照優(yōu)先性提高的順序，有至少96^^97^^98%或99%的同一性；ii)與所述第一 DNA互補(bǔ)的第二 DNA序列，所述第一和第二序列方向相反以及ii)分隔所述第一和第二序列的間隔序列，從而這些第一和第二 DNA序列在轉(zhuǎn)錄時能夠形成單個雙鏈RNA分子。所述間隔序列可以是隨機(jī)的DNA片段。然而，優(yōu)選地，使用可由靶標(biāo)植物細(xì)胞剪接的內(nèi)含子。它的大小一般為400 至2000個核苷酸長。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，amiRNA的表達(dá)盒包含-在植物細(xì)胞中有功能的啟動子，-一個或更多個DNA構(gòu)建體，其在轉(zhuǎn)錄時能夠形成靶向選自0SD1、SP011-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的基因的 amiRNA ；所述DNA構(gòu)建體處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。有利地，本發(fā)明的表達(dá)盒包含靶向OSDl基因的DNA構(gòu)建體。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，它包含靶向OSDl基因的DNA構(gòu)建體、靶向選自SP011-1、SP011-2、PRD1和PAIRl 的基因的DNA構(gòu)建體和靶向REC8的DNA構(gòu)建體。在本領(lǐng)域中，有許多適于在植物中表達(dá)異源基因的啟動子選擇是可用的。例如，它們可獲得自植物、植物病毒或細(xì)菌如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)。它們包括組成型啟動子，即在大多數(shù)組織和細(xì)胞中以及大多數(shù)環(huán)境條件下具有活性的啟動子，以及組織特異性或細(xì)胞特異性啟動子，它們僅在或主要在某些組織或某些細(xì)胞類型中具有活性，和可誘導(dǎo)型啟動子，它們被物理或化學(xué)刺激所激活，如來自線蟲感染的刺激。植物細(xì)胞中常用的組成型啟動子的非限制性實例有花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S 啟動子、Nos啟動子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶啟動子(rubiseo promoter)、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子。可在本發(fā)明中使用的器官或組織特異性啟動子特別地包括能夠?qū)е聹p數(shù)分裂相關(guān)表達(dá)的啟動子，如DMCl啟動子(KLIMYUK & J0NES，Plant J, 11,1-14,1997)；還可使用基因 OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 或 REC8 的任何內(nèi)源啟動子。 本發(fā)明的DNA構(gòu)建體一般還包括轉(zhuǎn)錄終止子(例如，35S轉(zhuǎn)錄終止子或胭脂堿合酶 (Nos)轉(zhuǎn)錄終止子)。 本發(fā)明還包括含有本發(fā)明嵌合DNA構(gòu)建體的重組載體。通常，所述重組載體還包含一個或更多個標(biāo)記基因，其使得能夠?qū)D(zhuǎn)化宿主進(jìn)行選擇。對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來說，適合載體的選擇以及將DNA構(gòu)建體插入其中的方法是熟知的。載體的選擇取決于預(yù)期宿主和所述宿主轉(zhuǎn)化的預(yù)期方法。在本領(lǐng)域中，對于多種植物物種、雙子葉植物或單子葉植物來說，植物細(xì)胞或植物的多種遺傳轉(zhuǎn)化方法是可用的。非限制性地例如，可提及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、通過微量注射、通過電穿孔的轉(zhuǎn)化、微彈轟擊(microprojectile)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)細(xì)胞，或者真核細(xì)胞，例如用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體遺傳轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。所述構(gòu)建體可瞬時表達(dá)；還可將它摻入到穩(wěn)定的染色體外復(fù)制子中， 或整合到染色體中。根據(jù)用于提供能夠產(chǎn)生SDR 2n配子之植物的本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案， 所述植物是轉(zhuǎn)基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化至少一個植物細(xì)胞；b)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以使得再生出植物，所述植物的基因組中具有包含所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)用于獲得能夠產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，所述植物是轉(zhuǎn)基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體的載體，含有靶向選自SP011-1、 SPOl 1-2,PRDl和PAIRl的基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體的載體和含有靶向REC8基因的本發(fā)明 DNA構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化至少一個植物細(xì)胞；b)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以使得再生出植物，所述植物的基因組中具有包含所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)用于獲得能夠產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案， 所述植物是轉(zhuǎn)基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體、靶向選自SPOl 1_1、SPOl 1_2、PRDl 和PAIRl的基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體的載體和含有靶向REC8基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化至少一個植物細(xì)胞；b)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以使得再生出植物，所述植物的基因組中具有包含所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還涵蓋了能夠產(chǎn)生SDR 2n配子或未減數(shù)配子的植物，它們可通過本發(fā)明的方法獲得。特別地，這包括包含下列的植物-OSDl基因內(nèi)的突變，其中由于該突變，OSDl蛋白被抑制；和-選自SP011-1、SP011_2、PRDl或PAIRl基因之基因內(nèi)的突變，其中由于該突變， 所述基因編碼的SP011-1、SPOl 1-2、PRDl或PAIRl蛋白被抑制；和-REC8基因內(nèi)的突變，其中由于該突變，RecS蛋白被抑制。這還包括被本發(fā)明的一個或更多個DNA構(gòu)建體遺傳轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選地，所述植物是轉(zhuǎn)基因植物，其中所述構(gòu)建體包含在整合到植物基因組中的轉(zhuǎn)基因中，從而使其在連續(xù)植物世代中傳遞。
靶向OSDl基因的嵌合DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致了 OSDl蛋白的下調(diào)，這為所述轉(zhuǎn)基因植物提供了產(chǎn)生2n SDR配子的能力。靶向OSDl基因的嵌合DNA構(gòu)建體，靶向選自 SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRD1和PAIRl之基因的嵌合DNA構(gòu)建體和靶向REC8基因的嵌合DNA構(gòu)建體的共表達(dá)導(dǎo)致由這三個基因所編碼的蛋白質(zhì)的下調(diào)，并且為所述轉(zhuǎn)基因植物提供了產(chǎn)生未減數(shù)配子的能力。本發(fā)明還涵蓋了產(chǎn)生SDR 2η配子的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)可通過本發(fā)明方法獲得的植物，和回收由所述植物產(chǎn)生的配子。優(yōu)選地，所述配子包含至少10%、更優(yōu)選地至少20%，以及按照優(yōu)先性提高的順序，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% 的有活力的2η配子。本發(fā)明還涵蓋了產(chǎn)生未減數(shù)配子的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)可通過本發(fā)明方法獲得的植物，和回收由所述植物產(chǎn)生的配子。優(yōu)選地，所述配子包含至少10%、更優(yōu)選地至少20 %，并且按照優(yōu)先性提高的順序，至少30 %、40 %、50 %、或60 %、70 %、80 %或90 % 的有活力的未減數(shù)配子。本發(fā)明適用于農(nóng)藝學(xué)所關(guān)心的廣泛的單子葉植物或雙子葉植物。非限制性地例如，可提及馬鈴薯、水稻、小麥、玉米、番茄、黃瓜、紫苜蓿、甘蔗、甘薯、木薯、苜蓿、大豆、麥草、香蕉、甜瓜、西瓜、棉花或觀賞植物，如玫瑰、百合、郁金香和水仙。通過以下詳細(xì)說明和附圖，本發(fā)明的上述和其它目的和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而，應(yīng)理解上述詳細(xì)說明僅是示例性的，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例實驗步驟植物材料和生長條件如VIGNARD 等人(PLoS Genet，3，1894-906，2007)中所述，培養(yǎng)擬南芥 (Arabidopsis)植物。對于萌發(fā)測定和細(xì)胞計數(shù)實驗，將擬南芥(Arabidopsis)在擬南芥培養(yǎng)基(ESTELLE & SOMERVILLE，Mol. Gen. Genet.，206，200-06，1987)上，在 21 °C，以 16h 光 /8h暗的光周期和70%的濕度進(jìn)行體外培養(yǎng)。遺傳分析使用兩個引物對，通過PCR(30個循環(huán)的94°C 30s、56°C 30s和72°C lmin)對植物進(jìn)行基因分型。對于每個基因型，表I中示出了引物對，并且在表II中示出了對插入片段特異性的引物對。表 I表I
權(quán)利要求
1.用于獲得產(chǎn)生第二次分裂再組2η配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下文稱作OSDl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :1的AtOSDl蛋白或與SEQ ID NO 35的OsOSDl蛋白有至少20%的序列同一性或至少四％的序列相似性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中OSDl蛋白的抑制是通過誘變OSDl基因或其啟動子而獲得的，并且選擇部分地或者完全地喪失了 OSDl蛋白活性的突變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中OSDl蛋白的抑制是通過在所述植物中表達(dá)靶向編碼所述蛋白質(zhì)之基因的沉默RNA而獲得的。
4.用于獲得產(chǎn)生未減數(shù)配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下列蛋白質(zhì)a)如權(quán)利要求1中所定義的OSDl蛋白；b)參與植物中減數(shù)分裂重組起始的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自i)下文中稱作SP011-1蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 2的SP011-1蛋白有至少40%的序列同一性，或至少60%的序列相似性； )下文中稱作SP011-2蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :3的SP011-2蛋白有至少40%的序列同一性，或至少60%的序列相似性；iii)下文中稱作PRDl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQID NO :4的PRDl蛋白有至少25%的序列同一性，或至少35%的序列相似性；iv)下文中稱作PAIRl蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQID NO :5的PAIRl蛋白有至少30%的序列同一性，或至少40%的序列相似性；c)下文中稱作RecS蛋白的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQID NO 6的RecS蛋白有至少40%的序列同一性，或至少45%的序列相似性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中OSDl、SPOl1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl或Rec8蛋白中至少之一的抑制是通過誘變編碼所述蛋白質(zhì)之基因或其啟動子而獲得的，并且選擇部分地或者完全地喪失了所述蛋白質(zhì)活性的突變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中OSDl、SPOl1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl或Rec8蛋白中至少之一的抑制是通過在所述植物中表達(dá)靶向編碼所述蛋白質(zhì)之基因的沉默RNA而獲得的。
7.表達(dá)盒，其包含-在植物細(xì)胞中有功能的啟動子；-至少一個選自下列的DNA構(gòu)建體a)200至IOOObp的一個或更多個DNA構(gòu)建體，每個所述構(gòu)建體包含選自0SD1、 SPOl 1-1、SP011-2、PRDl、PAIRl和REC8之靶基因的cDNA的片段，或其互補(bǔ)片段，或者與所述片段有至少95%的同一性的片段，所述DNA序列處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下；b)一個或更多個發(fā)夾DNA構(gòu)建體，其在轉(zhuǎn)錄時能夠形成靶向選自0SD1、SPOll-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 之基因的發(fā)夾 RNA ；c)一個或更多個DNA構(gòu)建體，其在轉(zhuǎn)錄時能夠形成靶向選自0SD1、SPOl 1-1、SPOl 1-2、 PRDl、PAIRl 和 REC8 之基因的 amiRNA ；所述DNA構(gòu)建體處于所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)盒，其包含靶向OSDl基因的DNA構(gòu)建體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)盒，其包含靶向OSDl基因的DNA構(gòu)建體，靶向選自SPOl1-1、 SP011-2、PRDl和PAIRl之基因的DNA構(gòu)建體以及靶向REC8的DNA構(gòu)建體。
10.重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項的表達(dá)盒。
11.產(chǎn)生第二次分裂再組2η配子的植物，其為含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因包含根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)盒。
12.產(chǎn)生未減數(shù)配子的植物，其可通過權(quán)利要求4至6中任一項的方法獲得。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的植物，其為含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因包含根據(jù)權(quán)利要求9的表達(dá)盒。
14.產(chǎn)生第二次分裂再組2η配子的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)可通過根據(jù)權(quán)利要求 1至3中任一項的方法獲得的植物，以及回收由所述植物產(chǎn)生的配子。
15.產(chǎn)生未減數(shù)配子的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)可通過根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項的方法獲得的植物，以及回收由所述植物產(chǎn)生的配子。
全文摘要
本發(fā)明涉及其中蛋白質(zhì)OSD1失活的植物，所述蛋白質(zhì)OSD1參與減數(shù)分裂I向減數(shù)分裂II的過渡。這些植物產(chǎn)生了第二次分裂再組(SDR)2n配子。本發(fā)明還涉及其中OSD1的失活與下述基因失活相組合的植物，所述基因即參與植物中減數(shù)分裂重組的基因以及參與減數(shù)分裂期間著絲粒單極定向的基因。這些植物產(chǎn)生了未減數(shù)配子。這些植物可用于植物育種。
文檔編號C12N15/82GK102308000SQ201080007059
公開日2012年1月4日 申請日期2010年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日
發(fā)明者伊莎貝爾·德弗思, 勞倫斯·克羅默, 妮科爾·弗羅熱, 拉裴爾·梅西耶, 西爾維·霍利韋特 申請人:國家農(nóng)藝研究院