專(zhuān)利名稱(chēng)：用于抑制神經(jīng)變性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及篩選抑制神經(jīng)元變性的化合物的方法。更具體而言，該方法涉及篩選抑制APP通過(guò)神經(jīng)元變性的觸發(fā)事件從神經(jīng)元脫落的化合物。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域中已鑒定了隸屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多種配體和受體。包含于這類(lèi)配體中的是腫瘤壞死因子-α ( “ TNF-α ”)、腫瘤壞死因子-β ( “ TNF-β ”或 “淋巴毒素-α ”)、淋巴毒素-β ( "LT-β ”)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、0Χ-40 配體、4-1ΒΒ配體、LIGHT、Apo-I配體(也稱(chēng)為Fas配體或⑶95配體)、Apo_2配體(也稱(chēng)為Apo2L或TRAIL)、Apo-3配體(也稱(chēng)為T(mén)WEAK)、APRIL、OPG配體(也稱(chēng)為RANK配體、ODF 或 TRANCE)和 TALL-1 (也稱(chēng)為 BlyS, BAFF 或 THANK)(參見(jiàn)例如 Ashkenazi， Nature Review, 2 :420-430(2002) ；Ashkenazi 禾口 Dixit， Science,281 :1305-1308(1998)； Ashkenazi 禾口 Dixit，Curr. Opin. Cell Biol. ,11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr. Biol.， 7 :750-753 (1997)ffallach, CYTOKINE REFERENCE, Academic Press, 2000, 377-411 頁(yè)； Locksley 等，Cell，104 :487-501(2001) ；Gruss 和 Dower, Blood，85 :3378-3404(1995)； Schmid 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 :1881 (1986) ；Dealtry 等，Eur. J. Immunol., 17 :689(1987) ；Pitti 等，J. Biol. 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Med.，194 1441-1448 (2001))。還報(bào)道了 DR6的定向破裂導(dǎo)致增強(qiáng)的T輔助細(xì)胞2 (Th2)體外分化(Zhao等，JD。DR6激動(dòng)劑或拮抗劑在調(diào)節(jié)B細(xì)胞介導(dǎo)的病癥中的多種用途描述于2005年3月31日公開(kāi)的US 2005/0069540中。在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，DR6受體可以在調(diào)節(jié)氣道炎癥中發(fā)揮作用(Venkataraman 等，Immunol. Lett. , 106 :42-47 (2006))。用髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(M0G(35_55))誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型，發(fā)現(xiàn)與野生型(WT)同窩仔相比，DR6-/-小鼠對(duì)CNS疾病的發(fā)作和進(jìn)展都具有高抗性。 因此，DR6可以涉及調(diào)節(jié)白細(xì)胞浸潤(rùn)，并在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的誘導(dǎo)和進(jìn)展中發(fā)揮作用 Gchmidt 等，J. Immunol.，175 :2286-2292 (2005))。雖然已將多種TNF配體和受體家族成員鑒定為具有多樣的生物學(xué)活性和特性， 但很少報(bào)道過(guò)這類(lèi)配體和受體涉及神經(jīng)學(xué)相關(guān)的功能。例如，2004年8月沈日公開(kāi)的 W02004/071528描述了在鼠模型中抑制⑶95 (Fas)配體/受體復(fù)合體來(lái)治療脊髓損傷。TNF受體超家族成員p75是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT3)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白_4(NT4)的受體(p75的綜述參見(jiàn) Dechant 和 Barde Q002) Nature Neurosci. 5 (11) :1131-1136)。已知前-NGF (pro-NGF) 結(jié)合P75并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，提高水平的前-NGF見(jiàn)于阿爾茨海默病患者的腦中，已進(jìn)一步顯示，Abeta肽(與阿爾茨海默病相關(guān))與p75結(jié)合并誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Dechant和 Barde (2002) Nature Neurosci. 5 (11) :1131-1136)。因此，p75 似乎在阿爾茨海默病中發(fā)揮作用。p75還與軸突延伸及存在一些髓磷脂相關(guān)抑制劑的情況下的延伸抑制相關(guān)。 Nogo受體結(jié)合三種不同的髓磷脂相關(guān)的軸突延伸抑制劑髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)、 Nogo-66和少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓磷脂糖蛋白(OmgP)。Nogo受體與p75結(jié)合，且已表明p75 可以通過(guò)其與Nogo受體的結(jié)合在軸突延伸中發(fā)揮作用(Dechant和BardeQO(^)Nature Neurosci. 5(11) :1131-1136)。
發(fā)明概述在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供分離的死亡受體6( “DR6”)拮抗劑。本文中公開(kāi)的拮抗劑的某些實(shí)施方案抑制或阻斷DR6與其一個(gè)或多個(gè)同源配體(cognate ligand)間的相互作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文中公開(kāi)的DR6拮抗劑抑制或阻斷DR6與其同源配體—— 淀粉狀前體蛋白(“APP”)間的相互作用。DR6拮抗劑的實(shí)施方案可以包含抗體，如DR6抗體或APP抗體。這類(lèi)DR6拮抗性抗體可以例如是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，DR6拮抗劑可以包含抗-DR6抗體，其結(jié)合DR6胞外結(jié)構(gòu)域多肽或其片段，并可選地可以結(jié)合包含圖IA的氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。備選地，DR6拮抗劑可以包含抗-APP抗體，其結(jié)合APP多肽，并可選地可以結(jié)合包含圖IB (SEQ ID NO 6)的氨基酸66-81的APP多肽?？紤]的DR6拮抗劑還包含DR6免疫黏附素、DR6變體、DR6片段、其共價(jià)修飾形式、 或其融合蛋白質(zhì)、以及小分子拮抗劑。作為實(shí)例，DR6拮抗劑可以包含聚乙二醇化的DR6或與異源序列如附加表位、抗體片段如人Fe、或亮氨酸拉鏈融合的DR6的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域形式。本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方案還包括抑制或阻斷DR6與APP的結(jié)合的方法，其包括在其中DR6與APP的結(jié)合受抑制的條件下使DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6 拮抗劑。用于這類(lèi)方法中的典型DR6拮抗劑包含結(jié)合DR6或APP的抗體，以及可溶性DR6 多肽?？蛇x地，通過(guò)觀察它們抑制DR6與APP間的結(jié)合的能力來(lái)選擇DR6拮抗劑用于這些方法中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，這類(lèi)方法用于例如在體外組織培養(yǎng)物中抑制凋亡和 /或增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)/或存活。該方法考慮使用單類(lèi)DR6拮抗劑分子或兩類(lèi)或多類(lèi) DR6拮抗劑的組合。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供用于在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或再生或存活的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的DR6拮抗劑。在可選的實(shí)施方案中，DR6 拮抗劑的施用在該哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)，并阻斷神經(jīng)元細(xì)胞或組織的細(xì)胞死亡和變性。神經(jīng)元細(xì)胞或組織可以包含例如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元、連合神經(jīng)元、 軸突、小膠質(zhì)細(xì)胞和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于這類(lèi)方法中的 DR6拮抗劑可以包含結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力的抗體。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，用于這類(lèi)方法中的DR6拮抗劑可以包含結(jié)合DR6并抑制其結(jié)合APP的能力的抗體。備選地，DR6拮抗劑可以包含DR6免疫黏附素；與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白質(zhì)聚合物連接的DR6多肽；或DR6多肽變體。用于該方法中的DR6免疫黏附素可以包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的可溶性DR6受體。此外，本發(fā)明的DR6拮抗劑可以包含小分子。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供用于治療神經(jīng)障礙的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的DR6拮抗劑。在可選的實(shí)施方案中，該方法包括在哺乳動(dòng)物中治療阿爾茨海默病。用于這類(lèi)方法中的DR6拮抗劑可以包含結(jié)合APP并抑制其結(jié)合DR6的能力的抗體。DR6拮抗劑還可以包含DR6抗體。備選地，DR6拮抗劑可以包含DR6免疫黏附素；與選自聚乙二醇、 聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白質(zhì)聚合物連接的DR6多肽；DR6抗體或DR6變體。用于該方法中的DR6免疫黏附素可以包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的可溶性DR6受體。用于該方法中的抗-DR6抗體可以結(jié)合包含圖IA的氨基酸1-349或42-349的DR6受體。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括用于診斷患有神經(jīng)障礙或易感神經(jīng)障礙的患者的方法， 其包括從該患者獲得樣品，并針對(duì)DR6多肽變體的存在測(cè)試該樣品，該變體具有不同于SEQ ID N0:1的DR6多肽序列的多肽序列。通常，在這類(lèi)方法中將多肽變體鑒定為具有針對(duì)APP 多肽的親和力，該親和力不同于針對(duì)SEQ ID NO :1的DR6多肽序列觀察到的親和力。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供用于鑒定抑制DR6與APP的結(jié)合的目的分子的方法。這類(lèi)方法可以包括在存在或缺乏目的分子的情況下組合DR6和APP ；然后在存在該目的分子的情況下檢測(cè)DR6與APP的結(jié)合的抑制?？蛇x地，用在細(xì)胞表面表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行這類(lèi)方法；并進(jìn)一步包括檢測(cè)DR6活化或信號(hào)發(fā)放的抑制。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步包括通過(guò)這類(lèi)方法鑒定的分子?？蛇x地，目的分子是結(jié)合APP的抗體、結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供抗體，其能夠特異性結(jié)合APP配體、DR6受體和/或能夠調(diào)節(jié)與DR6和/或其配體和/或共同受體相關(guān)的生物學(xué)活性，并用于治療多種神經(jīng)障礙。在具體實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合DR6多肽胞外結(jié)構(gòu)域序列的抗體(在下文實(shí)施例中進(jìn)一步描述)。典型的抗體是結(jié)合APP或DR6，并針對(duì)它們抑制DR6與APP間的結(jié)合的能力進(jìn)一步選擇的那些?？蛇x地，該抗體是單克隆抗體?？蛇x地，該單克隆抗體包含由分別以保藏號(hào) PTA-8095、PTA-8094 或PTA-8096 保藏于 ATCC 的雜交瘤分泌的 3F4. 4. 8、4B6. 9. 7 或 1E5. 5. 7 抗體。還提供抗體，其結(jié)合的表位與3F4. 4. 8、4B6. 9. 7或1E5. 5. 7單克隆抗體結(jié)合的表位相同，該3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7或1Ε5. 5. 7單克隆抗體由以ATCC保藏號(hào)ΡΤΑ_8095、ΡΤΑ_8094或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系分別產(chǎn)生。在一方面，本發(fā)明涉及包含3F4. 4. 8、4B6. 9. 7 或1E5. 5. 7抗體的抗-DR6抗體，其顯示與抗體3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7或1Ε5. 5. 7至少相同的對(duì) DR6的親和力，和/或顯示與抗體3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7或1Ε5. 5. 7至少相同的生物學(xué)活性和/ 或潛能。還在其他具體實(shí)施方案中，提供產(chǎn)生單克隆抗體3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7或1Ε5. 5. 7，并分別以保藏號(hào)ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096保藏于ATCC的雜交瘤細(xì)胞系，及由分別以保藏號(hào)ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096保藏于ATCC的雜交瘤分泌的單克隆抗體3F4. 4. 8、 4Β6. 9. 7 或 1Ε5. 5. 7。還提供分離的抗-DR6單克隆抗體，其包含與DR6多肽結(jié)合，并競(jìng)爭(zhēng)性抑制由以 ATCC保藏號(hào)ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與該DR6 多肽結(jié)合的抗體。還提供嵌合的或人源化的抗-DR6抗體，其特異性結(jié)合DR6多肽，且包含(a)源自由分別以保藏號(hào)ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096保藏于ATCC的雜交瘤分泌的3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7或1Ε5. 5. 7抗體的序列?？蛇x地，這類(lèi)抗體可以包含源自3F4. 4. 8、 4Β6. 9. 7或1Ε5. 5. 7抗體的重鏈、輕鏈或可變區(qū)。還在另一方面，本發(fā)明涉及分離的編碼本文的抗-DR6抗體或抗體片段的核酸分子、包含這類(lèi)核酸分子的載體、包含這類(lèi)核酸分子的宿主細(xì)胞、及用于產(chǎn)生本文中的抗體和抗體片段的方法。本發(fā)明還涉及包含本文中定義的DR6拮抗劑和載體的組合物。該載體可以是可藥用載體，且該組合物可以進(jìn)一步包含其他藥劑。在另一方面，本發(fā)明涉及包含容器和包含于該容器內(nèi)的組合物的制品，其中該組合物包含本發(fā)明的DR6拮抗劑。制品可以進(jìn)一步包含在體外或在體內(nèi)使用DR6拮抗劑的說(shuō)明。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該說(shuō)明涉及神經(jīng)障礙的治療。在相關(guān)的方面，本發(fā)明的實(shí)施方案包括試劑盒，其包含第一容器、該容器上的標(biāo)簽和包含于該容器內(nèi)的組合物。在這類(lèi)試劑盒中，組合物包含對(duì)在至少一類(lèi)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中抑制凋亡有效的DR6拮抗劑，該容器上的標(biāo)簽或包含于該容器中的包裝說(shuō)明書(shū) (package insert)顯示該組合物可以用于在至少一類(lèi)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中抑制凋亡?？蛇x地，試劑盒包含其他組件，如包含可藥用緩沖液的第二容器，和/或用DR6拮抗劑在至少一類(lèi)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中抑制凋亡的說(shuō)明。本發(fā)明還提供本文所述的DR6拮抗劑和組合物在制備或制造用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)障礙，包括用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供用于篩選抑制神經(jīng)元變性的化合物的方法，其中將候選化合物加至其中存在神經(jīng)元變性的觸發(fā)事件的基于細(xì)胞的測(cè)定，該觸發(fā)事件正常情況下將導(dǎo)致APP從神經(jīng)元表面脫落。如果在候選化合物的存在下未觀察到脫落，則該候選化合物是神經(jīng)元變性的抑制劑，并可以用作神經(jīng)疾病和障礙(如但不限于阿爾茨海默病)及與損傷相關(guān)的變性的治療。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供用于抑制神經(jīng)變性的方法，其中使神經(jīng)細(xì)胞與 JNK抑制劑接觸。在其他實(shí)施方案中，提供在有需要的患者中抑制神經(jīng)變性的方法，其中對(duì)該患者施用有效量的JNK抑制劑，使得神經(jīng)變性減少。該患者可以是鑒定為患有神經(jīng)疾病的患者，或處于罹患神經(jīng)疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者。這類(lèi)疾病包含例如家族性和散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化(分別為FALS和ALS)、家族性和散發(fā)性帕金森病、亨廷頓病、家族性和散發(fā)性阿爾茨海默病及脊髓性肌萎縮(SMA)。在一些實(shí)施方案中，該患者是阿爾茨海默病患者。JNK抑制劑可以是本領(lǐng)域已知的任意抑制劑，且包含本領(lǐng)域已知的可以對(duì)患者施用的化合物。本發(fā)明還提供以上方法，其中還使用p75的拮抗劑，以通過(guò)阻止通過(guò)p75受體的 APP信號(hào)發(fā)放來(lái)抑制神經(jīng)變性。p75的拮抗劑可以包含例如阻止APP結(jié)合膜結(jié)合的p75的可溶性P75、結(jié)合p75的抗體、p75的免疫黏附素。上文所述的本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括抑制P75信號(hào)發(fā)放。
附圖簡(jiǎn)述圖IA顯示人DR6 cDNA的核苷酸序列(

圖1A_1，SEQ ID NO 2)、其衍生的氨基酸序列(圖 1A-2，SEQ ID NO :1)，及其結(jié)構(gòu)域架構(gòu)(domain architecture)的示意圖(圖 1A-3)。 在DR6示意圖中，顯示了包括假定的信號(hào)肽、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域基序、跨膜結(jié)構(gòu)域和死亡域的結(jié)構(gòu)域邊界。在此示意圖中，顯示了假定的信號(hào)肽、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域基序、跨膜結(jié)構(gòu)域和死亡域的假定的結(jié)構(gòu)域邊界。圖IB顯示人淀粉狀前體蛋白(APP) cDNA的695同種型的核苷酸序列(圖IB-I，SEQ ID NO 5)及其衍生的氨基酸序列(圖1B-2，SEQ ID NO 6)。 圖IC顯示人淀粉狀前體蛋白(APP)的751同種型的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。圖ID顯示人淀粉狀前體蛋白(APP)的770同種型cDNA的核苷酸序列(圖ID-I，SEQ ID NO 8)及其衍生的氨基酸序列(圖1D-2，SEQ ID NO :9)。參見(jiàn)例如UniProtKB/Swiss-prot entry P05067和包含涉及同種型ID P05067-1、同種型ID P05067-4和同種型ID P05067-8的公開(kāi)內(nèi)容的相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容(http://expasy. org/uniprot/P05067)。圖2A顯示，在發(fā)育階段E10. 5-E12. 5，DR6在包含脊髓的運(yùn)動(dòng)和連合神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的正在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中強(qiáng)表達(dá)。圖2B顯示DR6蛋白質(zhì)表達(dá)在軸突和胞體上。圖2C顯示DR6 mRNA表達(dá)在正在分化的神經(jīng)元中。圖3顯示背側(cè)脊髓(dorsal spinal cord)外植體存活測(cè)定中軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的圖示；顯示通過(guò)電穿孔將RNA干擾siRNA試劑與GFP表達(dá)質(zhì)粒一起引入胚胎連合神經(jīng)元。圖4A顯示，在背側(cè)脊髓存活測(cè)定中，通過(guò)小干擾RNA抑制DR6表達(dá)阻斷了連合軸突變性并阻止了神經(jīng)元細(xì)胞死亡。圖4B顯示RNAi抗性DR6 cDNA挽救了由DR6 siRNA阻斷的變性表型。圖5顯示，在背側(cè)脊髓存活測(cè)定中，拮抗性DR6抗體幫助阻斷軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。圖6提供機(jī)制示意圖和神經(jīng)元照片，顯示在外植體存活測(cè)定中，通過(guò)c-Jim N端激酶(JNK)的藥理學(xué)抑制減量調(diào)節(jié)DR6下游的胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放阻止了軸突變性和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。圖7顯示拮抗性DR6抗體對(duì)離體全胚培養(yǎng)物中脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的存活的神經(jīng)保護(hù)作用。圖8提供用切割胱天蛋白酶-3的抗體免疫染色的E 15. 5頸脊髓切片的照片，以顯示DR6的喪失導(dǎo)致DR6無(wú)效(null)胚胎的脊髓中和背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的減少。
圖9A顯示來(lái)自表達(dá)切割胱天蛋白酶-3的E15. 5 DR6 KO胚胎中的神經(jīng)元細(xì)胞的定量，其表明與DR6+/-同窩仔對(duì)照(DR6 hets)相比，DR6無(wú)效胚胎中神經(jīng)元細(xì)胞死亡減少約50%。圖9B提供細(xì)胞的照片，顯示DR6為運(yùn)動(dòng)軸突變性所需，如在存在和缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的情況下比較正常小鼠和DR6敲除小鼠所證實(shí)。圖9C提供細(xì)胞的照片，顯示DR6 敲除小鼠中損傷誘導(dǎo)的軸突變性延遲。圖IOA提供神經(jīng)元的照片，顯示抗-DR6抗體抑制由多樣的營(yíng)養(yǎng)因子喪失神經(jīng)元的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)撤走引起的軸突變性。圖IOB提供來(lái)自連合、感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中凋亡胞體的TUNEL染色顯示的其他照片數(shù)據(jù)，其顯示抗-DR6抗體抑制多樣的營(yíng)養(yǎng)因子喪失神經(jīng)元的變性。圖IlA提供連合神經(jīng)元的照片，顯示可以通過(guò)DR6-FC延遲連合軸突變性。圖IlB 提供感覺(jué)神經(jīng)元的照片，顯示可以通過(guò)DR6-Fc延遲NGF撤走誘導(dǎo)的感覺(jué)軸突變性。圖12A提供神經(jīng)元的照片，顯示用DR6-AP顯示軸突上的DR6結(jié)合部位。圖12B提供存在和缺乏NGF的情況下的神經(jīng)元照片，顯示NGF喪失后，DR6配體結(jié)合部位從軸突喪失。 圖12C提供發(fā)育階段E12. 5的BAX無(wú)效的感覺(jué)軸突的研究的照片，顯示Beta分泌酶(BACE) 抑制劑可以阻斷DR6-AP結(jié)合部位在NGF喪失后從感覺(jué)軸突消失。圖13A提供獲自多種Western印跡方法的數(shù)據(jù)的照片，其中用DR6-AP (左上)或抗-N-APP抗體(右上)探測(cè)來(lái)自神經(jīng)元細(xì)胞的多肽，以及(1)針對(duì)它們結(jié)合DR6的能力選擇，然后(2)用抗-N-APP抗體探測(cè)的多肽(底部，“DR6-ECD拉下(pull-down”))。此數(shù)據(jù)將淀粉狀前體蛋白(APP)鑒定為DR6胞外域結(jié)合配體。圖13B提供獲自多種印跡實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的照片，該實(shí)驗(yàn)允許顯示用DR6-AP探測(cè)的軸突條件培養(yǎng)基中的DR6配體(包括APP多肽)。此印跡數(shù)據(jù)鑒定出許多APP多肽，其包含35kDa處的N-端APP，以及C99-APP和C83/ C89 APP 多肽。圖14A提供神經(jīng)元的照片，顯示APP胞外域的脫落發(fā)生在NGF喪失后早期。圖14B 提供細(xì)胞的照片，顯示DR6胞外域結(jié)合由培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的APP。圖14C提供細(xì)胞的照片，顯示DR6是感覺(jué)軸突上主要的N-APP受體，且DR6無(wú)效的小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中APP結(jié)合部位顯著減少。圖14D提供細(xì)胞的照片，顯示DR6功能阻斷抗體破壞DR6胞外域與N-APP間的相互作用。圖15A提供神經(jīng)元的照片，顯示抗N-端APP的多克隆抗體在連合軸突測(cè)定中阻斷軸突變性。圖15B提供神經(jīng)元的照片，顯示抗N-端APP的多克隆抗體以及22C11抗-APP 單克隆抗體抑制由NGF去除誘導(dǎo)的局部軸突變性。圖15C提供神經(jīng)元的照片，顯示可以通過(guò)加入N-APP來(lái)挽救由β-分泌酶(BACE)活性的抑制阻斷的軸突變性。圖15D提供神經(jīng)元的照片，顯示通過(guò)RNAi去除APP使神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)由N-APP誘導(dǎo)的死亡敏感。圖16Α提供神經(jīng)元的照片，顯示DR6功能為Ν-ΑΡΡ誘導(dǎo)的軸突變性，而非Abeta觸發(fā)的變性所需。圖16Β提供神經(jīng)元的照片，顯示功能阻斷DR6抗體未能阻斷由Abeta觸發(fā)的軸突變性。圖17Α提供神經(jīng)元的照片，顯示通過(guò)JNK和上游胱天蛋白酶-8的抑制而不是通過(guò)下游胱天蛋白酶-3延遲軸突變性。圖17Β提供來(lái)自Ε12. 5外植體培養(yǎng)物的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的照片，顯示胱天蛋白酶-3在胞體中發(fā)揮作用，而胱天蛋白酶-6在軸突中發(fā)揮作用。圖17C提供感覺(jué)神經(jīng)元的照片，顯示雖然胱天蛋白酶-3并非軸突變性所需，但BAX為軸突變性所需。圖17D提供連合神經(jīng)元的照片，顯示胱天蛋白酶_3在胞體中發(fā)揮作用，而胱天蛋白酶_6在軸突中發(fā)揮作用。圖18顯示JNK功能為軸突變性所需。圖(A)顯示區(qū)室化的(“Campenot”)室的示意圖；上，修改自Campenot等(1991) J. Neurosci. 11 1126-1139 ；下，存在NGF的情況下或NGF喪失后的軸突和胞體區(qū)室的典型圖像(用TuJl染色)。(軸突區(qū)室的放大率是中央?yún)^(qū)室放大率的兩倍)。圖(B)顯示JNK抑制劑SP600125 (JNK-1、-2和-3的有效抑制劑 (Bennett 等(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24 13681-13686))阻斷 Campenot 室中感覺(jué)軸突的局部變性。Campenot室中感覺(jué)軸突的局部變性發(fā)生在NGF從軸突區(qū)室喪失之后。 圖上部顯示24小時(shí)時(shí)用NGF(50ng/ml)維持的培養(yǎng)物。圖中部顯示喪失后24小時(shí)的培養(yǎng)物(染色TuJl)。在喪失時(shí)加入3Ρ600125(10μΜ)時(shí)(圖下部)，24小時(shí)時(shí)在很大程度上阻斷了變性。圖(C)顯示實(shí)驗(yàn)范例的示意圖。連合(C)神經(jīng)元衍生自背側(cè)脊髓中的背側(cè)祖先(dorsal progenitor，dP)，并向底板(fp)發(fā)出軸突。將GFP質(zhì)粒(有或無(wú)其他質(zhì)粒和/ 或siRNA)電穿孔(顯示電極(紅色正極；藍(lán)色負(fù)極))入dP導(dǎo)致通過(guò)GFP標(biāo)記了 C神經(jīng)元及其軸突。當(dāng)用導(dǎo)蛋白-1培養(yǎng)背側(cè)脊髓外植體(DSC) 24小時(shí)時(shí)，軸突出現(xiàn)在膠原基質(zhì)中。在缺乏添加的營(yíng)養(yǎng)因子的情況下(-TF)，神經(jīng)元死亡，且其軸突在接下來(lái)的24小時(shí)內(nèi)變性。可以通過(guò)加入包含未鑒定的營(yíng)養(yǎng)因子的底板組織或底板條件培養(yǎng)基(+TF)來(lái)阻斷這些退化事件。圖(D)顯示在缺乏附帶(en passant)營(yíng)養(yǎng)因子(Wang等(1999)Nature 401 765-769)的情況下培養(yǎng)時(shí)，DSC外植體培養(yǎng)物中的連合神經(jīng)元在48小時(shí)內(nèi)以固定的方式變性(圖上部)；圖(D)下部顯示JNK抑制劑(10 μ M的L-JNKI-1)的加入在48小時(shí)時(shí)在很大程度上阻斷了 DSC外植體培養(yǎng)物中連合神經(jīng)元的固定的變性。圖19顯示野生型(圖Α)和DR6敲除(圖B) DRG神經(jīng)元中使用抗_DR6. 1 mAb的 Pio背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)免疫組織化學(xué)(IHC)染色。圖C顯示使用抗-BACE mAb的PlO DRG神經(jīng)元IHC染色。圖D顯示使用抗-APP mAb的Pl DRG神經(jīng)元IHC染色。圖20顯示缺乏(圖A)或存在(圖B) APP的情況下，PlO DRG神經(jīng)元中的神經(jīng)突增生測(cè)定。圖C顯示在存在APP的情況下觀察到的神經(jīng)突增生抑制中的定量結(jié)果。圖21顯示缺乏(圖A)或存在(圖B) APP的情況下的PlO DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突增生(neurite outgrowth)測(cè)定。圖C顯示存在APP的情況下的DR6敲除(DIT勺DRG神經(jīng)元中的神經(jīng)突增生。圖D顯示在存在或缺乏APP的情況下觀察到的神經(jīng)突增生抑制中的定量結(jié)果。圖22顯示缺乏和存在Nogo的情況下的神經(jīng)突增生抑制。圖片顯示野生型DRG神經(jīng)元中或PirB+/NgR+DRG神經(jīng)元中未用Nogo處理或用Nogo單獨(dú)處理的結(jié)果。圖23顯示抗-APP抗體(圖A)和抗-DR6抗體(圖B)對(duì)Nogo處理的PlO DRG神經(jīng)元的去抑制作用。圖24顯示抗-Abeta抗體(圖A)在存在和缺乏Nogo的情況下對(duì)PlO DRG神經(jīng)元的去抑制作用。圖25顯示胱天蛋白酶6抑制劑(圖A)和BACE抑制劑(圖B)在存在和缺乏Nogo 的情況下對(duì)PlO DRG神經(jīng)元的去抑制作用。圖26顯示Nogo處理增加了 APP脫落。圖A顯示存在和缺乏Nogo情況下的PlO DRG神經(jīng)元表面上的APP的定量；圖B顯示缺乏Nogo的情況下的DRG ；圖C顯示存在Nogo的情況下的DRG神經(jīng)元。圖27顯示用OmgP處理DRG神經(jīng)元的作用。圖A顯示存在或缺乏OmgP的情況下的DRG神經(jīng)元和存在抗-DR6抗體的情況下的去抑制。圖B顯示存在或缺乏OmgP的情況下的DRG神經(jīng)元和存在BACE抑制劑的情況下的去抑制作用。圖28顯示缺乏(圖A)或存在(圖B) APP的情況下的P7小腦顆粒神經(jīng)元(CGN) 中的神經(jīng)突增生測(cè)定。圖C顯示在存在APP的情況下觀察到的神經(jīng)突增生抑制中的定量結(jié)果ο圖29顯示抗-APP抗體(圖A)和抗-Abeta抗體(圖B)在存在或缺乏Nogo的情況下對(duì)P7 CGN的去抑制作用。圖30顯示胱天蛋白酶6抑制劑(圖A)和BACE抑制劑(圖B)在存在和缺乏Nogo 的情況下對(duì)P7 CGN的去抑制作用。圖31顯示Nogo處理增加了 APP脫落。圖A顯示存在和缺乏Nogo的情況下的P7 CGN表面上的APP的定量；圖B顯示缺乏Nogo的情況下的CGN ；圖C顯示存在Nogo的情況下的CGN。圖32顯示用OmgP處理CGN的作用。所顯示的是存在或缺乏OmgP的情況下的CGN 條形圖，及存在胱天蛋白酶_6抑制劑和BACE抑制劑的情況下的去抑制作用。圖33顯示缺乏(圖A)或存在(圖B) APP的情況下的P7 CGN神經(jīng)突增生測(cè)定。圖 C顯示存在APP和抗-DR6 mAb的情況下的神經(jīng)突增生。圖D顯示在存在或缺乏APP的情況下觀察到的神經(jīng)突增生抑制中的定量結(jié)果和存在抗-DR6 mAb的情況下去抑制作用的缺乏。圖34顯示DR6不表達(dá)于CGN中。圖A 用抗-DR6. 1染色的野生型CGN ；圖B 用抗-DR6. 1染色的DR6敲除CGN ；圖C 未加入堿性磷酸酶標(biāo)記的APP (APP-AP)的Dr6v_CGN ； 圖 D 加入 APP-AP 的 Dr6+/XGN ；圖 E 加入 APP-AP 的 DR6 敲除(DR6+) CGN。圖35顯示缺乏(圖A)或存在(圖B) APP的情況下的P7 CGN神經(jīng)突增生測(cè)定。圖 C顯示存在APP的情況下的p75敲除(p75+) CGN中的神經(jīng)突增生。圖D顯示在存在或缺乏 APP的情況下觀察到的神經(jīng)突增生抑制中的定量結(jié)果。圖36顯示半切除損傷范例的示意圖。圖A顯示半切除損傷的位置和生物素化葡聚糖胺(BDA)的注射；圖B顯示來(lái)自示意圖的分解圖的IHC，顯示很少或無(wú)皮層脊髓束(CST) 軸突延伸進(jìn)入損傷部位。圖37顯示DR6突變體在背側(cè)半切除損傷后顯示減少的軸突回縮和增加的CST軸突出芽。圖A顯示軸突回縮的曲線。圖B顯示對(duì)照和DR6敲除軸突中CST軸突異位出芽的條形圖。
發(fā)明詳述本文中描述或引用的技術(shù)和方法廣泛地為本領(lǐng)域技術(shù)人員良好地理解，并用常規(guī)方法普遍地使用，例如廣泛利用的分子克隆方法描述于Sambrook等，MOLE⑶LAR CLONING =A LABORATORY MANUAL 第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.中。根據(jù)需要，除非另作說(shuō)明，一般按照廠家定義的方案和/或參數(shù)來(lái)進(jìn)行涉及使用市售試劑盒和試劑的方法。在描述本方法和測(cè)定之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)佟?gòu)建體和試劑，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，并非旨在限制將僅通過(guò)所附權(quán)利要求來(lái)限制的本發(fā)明的范圍。應(yīng)注意，除非文中以其他方式清楚地指出，本文及所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“所述”和“該”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提到“一個(gè)遺傳改變”包括多個(gè)這類(lèi)改變，而提到“一個(gè)探針”包括提到一個(gè)或多個(gè)探針及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等等。說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中列舉的所有數(shù)字(例如氨基酸22-81,1-3 等)理解為受術(shù)語(yǔ)“約”的修飾。本文提到的所有出版物在此引用作為參考，以公開(kāi)和描述與這些出版物所被引用的方法和/或材料有關(guān)的方法和/或材料。本文引用的出版物是引用其在本申請(qǐng)的提交日期之前的公開(kāi)內(nèi)容。不應(yīng)將本文的任何內(nèi)容解釋為承認(rèn)本發(fā)明人沒(méi)有資格由于更早的優(yōu)先日期或居先的發(fā)明日期而先于這些出版物。
I.定義術(shù)語(yǔ)“淀粉狀前體蛋白”或“APP”包含由APP前mRNA編碼的多種多肽同種型，例如分別顯示于圖1B-1D中的APP695、APP751和App770同種型(從APP前mRNA的選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄物翻譯的同種型)，以及APP同種型的翻譯后加工部分。如本領(lǐng)域已知，從APP基因轉(zhuǎn)錄的APP前mRNA經(jīng)歷了選擇性外顯子剪接來(lái)產(chǎn)生許多同種型(參見(jiàn)例如Sandbrink 等，Ann NY Acad. Sci. 777 :281-287(1996)；及與 PubMed NCBI 蛋白質(zhì)位置登錄號(hào) P05067 相關(guān)的信息)。此選擇性外顯子剪接產(chǎn)生695、751和770氨基酸的三種主要的同種型(參見(jiàn)例如 Kang 等，Nature325 :733-736(1987) ；Kitaguchi 等，Nature 331 :530-532(1988)； Ponte 等，Nature 331:525-527(1988)和 Tanzi 等，Nature 331 :528-532 (1988)) 這些同種型中的兩種(App751和APP77tl)包含與Kunitz家族絲氨酸蛋白酶抑制劑(KPI)高度同源的 56殘基插入片段，并遍在表達(dá)。相反，缺乏KPI基序的較短的同種型APP695主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，例如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，并由于此原因而通常稱(chēng)為“神經(jīng)元APP”(參見(jiàn)例如 Tanzi 等，Science 235:880-884(1988) ；Neve 等，Neuron 1:669-677(1988)；和 Haas 等， J. Neurosci. 11 :3783-3793 (1991))。包含695、751和770的APP同種型經(jīng)歷顯著的翻譯后加工事件(參見(jiàn)例如Esch等 1990 ScienceM8 :1122-1124 ;Sisodia等 1990 Science 248 492-4%)。例如，這些同種型中的每一中被多種分泌酶和/或分泌酶復(fù)合體切割，這是產(chǎn)生包含含有APP胞外域的N-端分泌性多肽(sAPP α和SAPP β )的APP片段的事件。α -分泌酶或備選地β -分泌酶切割分別導(dǎo)致可溶性N-端APP多肽sAPP α和sAPP β的產(chǎn)生和胞外釋放，及對(duì)應(yīng)的膜錨定C-端片段C83和C99的滯留。隨后Y-分泌酶加工C83產(chǎn)生Ρ3 多肽。這是主要的分泌途徑，且是非促淀粉狀變的(non-amyloidogenic)。備選地，早老蛋白/呆蛋白介導(dǎo)的C99的Y-分泌酶加工釋放淀粉狀β多肽，淀粉狀-β 40(Abeta40)和淀粉狀-i342(Abeta^)(淀粉狀蛋白斑的主要成分)，及細(xì)胞毒性C-端片段，Y-CTF (50), Y-CTF (57)和Y-CTF(59)。證據(jù)表明，每個(gè)切割事件的相對(duì)重要性取決于細(xì)胞類(lèi)型。例如，非神經(jīng)元細(xì)胞優(yōu)選通過(guò)α -分泌酶途徑加工ΑΡΡ，該途徑在Abeta序列內(nèi)切割ΑΡΡ，從而產(chǎn)生 Abeta 的形成(參見(jiàn)例如 Esch 等 1990 Science 248 :1122-1124 ;Sisodia 等 1990 Science248 :492-495)。相反，神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)β -分泌酶途徑加工APP695的更大部分，該途徑通過(guò)至少兩個(gè)酶種類(lèi)的組合活性產(chǎn)生完整的Abeta。在神經(jīng)元細(xì)胞中，β-分泌酶在Abeta結(jié)構(gòu)域的氨基酸切割A(yù)PP695,釋放不同的N-端片段(sAPP β )。此外，Y -分泌酶在羧基端的備選位點(diǎn)切割ΑΡΡ，產(chǎn)生長(zhǎng)度為40 (Abeta4ci)或42 (Abete42)個(gè)氨基酸的Abeta種類(lèi)(參見(jiàn)例如 kubert 等 1993 Nature 361 :260-263 ;Suzuki 等 1994 Science264 :1336-1340 ；和 Turner 等 1996 J. Biol. Chem. 271 :8966-8970)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“ΑΡΡ”、“ΑΡΡ蛋白”和“ΑΡΡ多肽”包含天然APP序列和APP 變體及其加工片段。這些術(shù)語(yǔ)包含表達(dá)于包括人的多種哺乳動(dòng)物中的APP。APP可以內(nèi)源表達(dá)，如多種人組織譜系中天然發(fā)生的，或者可以通過(guò)重組或合成方法表達(dá)?！疤烊恍蛄笑ˇ宝薄?包含具有與源自自然界的APP相同的氨基酸序列的多肽(例如695、751和770同種型或其加工部分)。因此，天然序列APP可以具有來(lái)自包括人類(lèi)的任意哺乳動(dòng)物的天然存在的APP 的氨基酸序列。這種天然序列APP可以分離自自然界，或者可以通過(guò)重組或合成手段產(chǎn)生。 術(shù)語(yǔ)“天然序列ΑΡΡ”尤其包含天然存在的加工和/或分泌形式(例如，包含例如胞外域的可溶性形式)、天然存在的變體形式(例如選擇性剪接和/或蛋白酶解加工形式)和天然存在的等位基因變體。APP變體可以包含天然序列APP的片段或缺失突變體。用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的APP多肽包含上文所述的那些和以下非限制性實(shí)例。 可以選擇這些說(shuō)明性形式用于本發(fā)明的多種實(shí)施方案。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，APP多肽包含全長(zhǎng)APP同種型，如顯示于圖1B-1D中的APP695和/或APP751和/或APP770同種型。 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，APP多肽包含APP的翻譯后加工形式，例如經(jīng)歷了諸如α -分泌酶、β -分泌酶或Y -分泌酶的分泌酶切割的APP多肽(例如可溶性N-端片段，如sAPP α 和sAPPii)。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案中，可以選擇APP多肽，以包含一個(gè)或多個(gè)具體的結(jié)構(gòu)域，如N-端胞外域(參見(jiàn)例如Quast等，F(xiàn)ASEB J. 2003 ；17(12) 1739-41)、肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如 Rossiohn 等，Nat. Struct. Biol. 1999 年 4 月；6 (4) :327-31)、II 型銅(copper type II)(參見(jiàn)例如 Hesse 等，F(xiàn)EBS Letters 349(1) :109-116 (1994))或 Kunitz 蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如Ponte等，Nature ；331 (6156) :525-7 (1988))。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，APP多肽包含這樣的序列，觀察到該序列包含本文中公開(kāi)的DR6拮抗劑，如抗體或DR6免疫黏附素識(shí)別的表位，例如APP695的氨基酸22-81，其是包含單克隆抗體22C11結(jié)合表位的序列(參見(jiàn)例如 Hilbich 等，J. Biol. Chem. 268(35) :26571-26577 (1993)) 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，APP多肽不包含一個(gè)或多個(gè)具體的結(jié)構(gòu)域或序列，例如不包含某些N-端或C-端氨基酸的APP多肽(例如實(shí)施例12中公開(kāi)的人重組N-APP多肽)、不包含Kimitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的APP多肽(例如APP695)或不包含阿爾茨海默β 淀粉狀蛋白質(zhì)(Abeta)序列的APP多肽(例如不包含A β 4(1和/或A β 42序列的多肽sAPP β ) (參見(jiàn)例如Bond等，J. Struct Biol. 2003年2月；141 (2) =156-70) 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的APP多肽包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域或序列，但不包含其他結(jié)構(gòu)域或序列，例如包含N-端胞外域(或觀察為與DR6拮抗劑如單克隆抗體22C11結(jié)合的至少其部分)，但不包含處于一個(gè)或多個(gè)分泌酶切割位點(diǎn)C端的結(jié)構(gòu)域或序列的APP多肽，如β淀粉狀(Abeta)序列(例如sAPP α和sAPP β )。術(shù)語(yǔ)“ρ75”指軸突表面上的TNF受體超家族成員蛋白質(zhì)，據(jù)信其作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的受體。“Ρ75”包含本領(lǐng)域中提到的受體，其多核苷酸和多肽序列分別顯示于SEQ ID Ν0 17和SEQ ID N0:16中。人p75是427個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(見(jiàn)SEQ ID N0:16)，其具有假定的信號(hào)序列(氨基酸1-28)、胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸四-250)、柄結(jié)構(gòu)域(氨基酸189-250)、跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸251-272)、隨后的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸273-327)(每個(gè)結(jié)構(gòu)域都是就 SEQ ID NO :16 而言)(Underwood, CK 和 E. J. Coulson (2008) Int. J. Biochem. & Cell Biol. 40 (9) =1664-1668) 0人p75的非限制性實(shí)例的核酸和氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 16-17 (NM_002507)中。術(shù)語(yǔ)“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外域”或“EOT”指APP的形式，其基本上無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通常，可溶性E⑶將具有少于的這類(lèi)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選地， 將具有少于0.5%的這類(lèi)結(jié)構(gòu)域。應(yīng)理解，針對(duì)本發(fā)明的多肽鑒定的任意跨膜結(jié)構(gòu)域都是依據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定該類(lèi)型的疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)鑒定的。跨膜結(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變化，但該變化最可能在最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一端不超過(guò)約5個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ECD將由多肽的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列組成，該序列無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 (且不是膜結(jié)合的)。術(shù)語(yǔ)“APP變體”意指下文定義的APP多肽，其與具有圖1B-1D中所示的氨基酸序列的人APP、或其可溶性片段、或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約80%，優(yōu)選至少約85%、 86%、87%、88%、89%，更優(yōu)選至少約 90 %、91 %、92 %、93 %、94 %，最優(yōu)選至少約 95%、 96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。這類(lèi)變體包含，例如，在圖1B-1D的全長(zhǎng)或成熟序列的N端或C端添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的APP多肽，或在多肽的內(nèi)部序列或結(jié)構(gòu)域插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的APP多肽，包含來(lái)自其他物種的變體，但排除天然序列APP多肽?！癉R6”或“DR6受體”包含本領(lǐng)域中提到的受體，其多核苷酸和多肽序列顯示于圖 1A-1-1A-2中。Pan等已描述了稱(chēng)為“DR6”或“TR9”的TNF受體家族成員的多核苷酸和多肽序列(Pan 等，F(xiàn)EBS Lett. ,431 :351_356 (1998)；還見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 6，358，508 ;6，667，390 ； 6，919，078 ；6，949，358)。人DR6受體是655個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖1A-2)，其具有假定的信號(hào)序列(氨基酸1-41)、胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸42-349)、跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸350-369)、 隨后的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸370-655)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“DR6受體”包含天然序列受體和受體變體。這些術(shù)語(yǔ)包含表達(dá)于包括人類(lèi)的多種哺乳動(dòng)物中的DR6受體。DR6受體可以內(nèi)源表達(dá)，如多種人組織譜系中天然發(fā)生的，或者可以通過(guò)重組或合成方法表達(dá)?！疤烊恍蛄蠨R6受體”包含具有與源自自然界的DR6受體相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列DR6受體可以具有來(lái)自包括人類(lèi)的任意哺乳動(dòng)物的天然存在的DR6的氨基酸序列。這類(lèi)天然序列DR6受體可以分離自自然界，或者可以通過(guò)重組或合成手段產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列 DR6受體”尤其包含受體的天然存在的截短或分泌形式(例如，包含例如胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶性形式)、天然存在的變體形式(例如選擇性剪接形式)和天然存在的等位基因變體。 受體變體可以包含天然序列DR6受體的片段或缺失突變體。術(shù)語(yǔ)“胞外結(jié)構(gòu)域”或“ECD”指DR6受體的形式，其基本上無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通常，可溶性E⑶將具有少于的這類(lèi)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選地，將具有少于0.5%的這類(lèi)結(jié)構(gòu)域。應(yīng)理解，針對(duì)本發(fā)明的多肽鑒定的任意跨膜結(jié)構(gòu)域都是依據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定該類(lèi)型的疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確邊界可以變化，但其最可能在最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一端不超過(guò)約5個(gè)氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ECD將由多肽的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列組成，該序列無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(且不是膜結(jié)合的)。
術(shù)語(yǔ)“DR6變體”意指下文定義的DR6多肽，其與具有圖IA中所示的推斷的氨基酸序列的人DR6，或其可溶性片段，或其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約80%，優(yōu)選至少約 85%、86%、87%、88%、89%，更優(yōu)選至少約 90 %、91 %、92 %、93%、94%，最優(yōu)選至少約 95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。這類(lèi)變體包含，例如，在圖IA的全長(zhǎng)或成熟序列的N端或C端添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的DR6多肽，或在多肽的內(nèi)部序列或結(jié)構(gòu)域插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的DR6多肽，包含來(lái)自其他物種的變體，但排除天然序列的DR6多肽?？蛇x地，DR6變體包含DR6受體的可溶性形式，其包含具有至多 10個(gè)保守氨基酸取代的圖IA的氨基酸1-349或42-349。優(yōu)選地，這類(lèi)變體作為下文定義的DR6拮抗劑。以最廣泛的意義使用術(shù)語(yǔ)“DR6拮抗劑”，其包含在體外、原位、體內(nèi)或離體條件下部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體結(jié)合其同源配體，優(yōu)選其同源配體APP，或活化神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力的任意分子。作為實(shí)例，DR6拮抗劑可以部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活化在神經(jīng)元細(xì)胞或組織中導(dǎo)致凋亡或細(xì)胞死亡的神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力。DR6拮抗劑可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用來(lái)部分或完全阻斷、抑制或中和DR6，該機(jī)制包括但不限于通過(guò)阻斷、抑制或中和同源配體與DR6的結(jié)合；DR6與其同源配體(例如APP)間復(fù)合體的形成；DR6受體的寡聚化；DR6受體與異源共同受體間復(fù)合體的形成；同源配體與 DR6受體/異源共同受體復(fù)合體的結(jié)合；或DR6受體、異源共同受體及其同源配體間復(fù)合體的形成。DR6拮抗劑可以以直接或間接的方式發(fā)揮作用。本發(fā)明考慮的DR6拮抗劑包括但不限于APP抗體，DR6抗體，免疫黏附素，DR6免疫黏附素，DR6融合蛋白質(zhì)，DR6的共價(jià)修飾形式，DR6變體及其融合蛋白質(zhì)，或DR6的高級(jí)寡聚體形式(二聚體，團(tuán)聚體)，或DR6的同聚物或雜聚物形式，小分子，如JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的藥理學(xué)抑制劑，包括Jim N端激酶JNK活性的小分子和肽抑制劑，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的JNK上游發(fā)揮作用的蛋白激酶MLK和MKK活性的藥理學(xué)抑制劑，JNK與支架蛋白JIP-I結(jié)合的藥理學(xué)抑制劑，JNK與其底物如c-Jim或 AP-I轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體結(jié)合的藥理學(xué)抑制劑，JNK介導(dǎo)的其底物的磷酸化的藥理學(xué)抑制劑如 JNK結(jié)合結(jié)構(gòu)域(JBD)肽和/或JNK的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或包含JNK底物磷酸化位點(diǎn)的肽抑制劑，阻斷ATP與JNK結(jié)合的小分子，及阻斷底物與JNK結(jié)合的小分子。為了測(cè)定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活化神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力，可以進(jìn)行測(cè)定來(lái)評(píng)估DR6 拮抗劑對(duì)例如多種神經(jīng)元細(xì)胞或組織(如實(shí)施例中所述)，以及在中風(fēng)/腦缺血的體內(nèi)模型、神經(jīng)變性疾病的體內(nèi)模型，如帕金森病的小鼠模型、阿爾茨海默病的小鼠模型、肌萎縮性側(cè)索硬化ALS的小鼠模型、脊髓性肌萎縮SMA的小鼠模型、病灶性和整體性腦缺血的小鼠/大鼠模型(例如頸總動(dòng)脈阻塞模型或大腦中動(dòng)脈阻塞模型)中，或在離體全胚培養(yǎng)物中的作用?？梢砸砸阎捏w外或體內(nèi)測(cè)定形式進(jìn)行該多種測(cè)定，如下文所述或本領(lǐng)域已知并描述于文獻(xiàn)中的測(cè)定形式(參見(jiàn)例如McGowan等，Trends in Genetics, 22 281-289(2006) ；Fleming NeuroRx,2 495-503 (2005) ；Wong φ, Nature Neuroscience, 5 :633-639(2002))。確定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活化神經(jīng)元細(xì)胞或組織中的一種或多種胞內(nèi)信號(hào)或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的能力的測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方案包括在存在或缺乏DR6拮抗劑或潛在的DR6拮抗劑(即目的分子)的情況下組合DR6和APP ；然后在存在此DR6拮抗劑或潛在的DR6拮抗劑的情況下檢測(cè)DR6與APP的結(jié)合的抑制。“核酸”意在包含任意DNA或RNA。例如，存在于組織樣品中的染色體核酸、線粒體核酸、病毒核酸和/或細(xì)菌核酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”包含雙鏈核酸分子的任一條鏈或兩條鏈，且包含完整核酸分子的任意片段或部分。“基因”意指在編碼或轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)中具有功能性作用的任意核酸序列或其部分。基因可以由負(fù)責(zé)編碼功能蛋白質(zhì)的所有核酸組成，或者僅由負(fù)責(zé)編碼或表達(dá)蛋白質(zhì)的核酸的部分組成。核酸序列可以在外顯子、內(nèi)含子、起始或終止區(qū)、啟動(dòng)子序列、其他調(diào)節(jié)序列或基因的獨(dú)特鄰近區(qū)內(nèi)包含遺傳異常。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指所有天然存在的L-α _氨基酸。此定義意在包含正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸和高半胱氨酸。通過(guò)單字母或三字母命名識(shí)別氨基酸
權(quán)利要求
1.抑制神經(jīng)變性的方法，其包括(a)在其中DR6與APP的結(jié)合受抑制的條件下使DR6多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種DR6拮抗劑；(b)在其中APP與p75的結(jié)合受抑制的條件下使p75多肽和/或APP多肽暴露于一種或多種P75拮抗劑；或(c)在其中DR6和p75與APP的結(jié)合受抑制的條件下使DR6多肽、p75多肽和/或APP 多肽暴露于一種或多種DR6和p75拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含SEQ ID NO 1的氨基酸1-354的可溶性DR6多肽，和結(jié)合APP的抗體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種p75拮抗劑選自結(jié)合p75的抗體、可溶性 P75多肽，和結(jié)合APP的抗體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述可溶性p75多肽包含p75免疫黏附素。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的DR6 胞外結(jié)構(gòu)域序列。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述可溶性p75多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的p75 胞外結(jié)構(gòu)域序列。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含SEQID NO 1的氨基酸1-349 或42-349的DR6多肽。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制由分別以ATCC保藏號(hào) PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的 3F4. 4. 8、4B6. 9. 7 或 1E5. 5. 7 單克隆抗體的結(jié)合。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽與選自聚乙二醇、 聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體是單克隆抗體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制3F4.4. 8、 4B6. 9. 7或1E5. 5. 7抗體的結(jié)合。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述DR6多肽表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面，且與所述一種或多種DR6拮抗劑的結(jié)合抑制DR6活化或信號(hào)發(fā)放。
17.權(quán)利要求16的方法，其中在體外進(jìn)行所述方法來(lái)抑制一個(gè)或多個(gè)表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。
18.權(quán)利要求16的方法，其中在體內(nèi)進(jìn)行所述方法來(lái)抑制一個(gè)或多個(gè)表達(dá)DR6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述具有表達(dá)在細(xì)胞表面的DR6多肽的一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的至少一個(gè)是連合神經(jīng)元細(xì)胞、感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞。
20.權(quán)利要求16的方法，其中在患有神經(jīng)病癥或障礙的哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行所述方法。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙是肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、亨廷頓病或阿爾茨海默病。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙包含來(lái)自中風(fēng)的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷、腦或脊髓組織創(chuàng)傷，或神經(jīng)元組織中的損傷。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中的至少一種抑制DR6與包含 SEQ ID NO 6的氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中的至少一種抑制APP與包含 SEQ ID NO 1的氨基酸1-655的DR6多肽的結(jié)合。
25.權(quán)利要求3的方法，其中所述結(jié)合p75的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
26.權(quán)利要求3的方法，其中所述結(jié)合p75的抗體或可溶性p75多肽與選自聚乙二醇、 聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述p75多肽表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面，且與所述一種或多種P75拮抗劑的結(jié)合抑制DR6活化或信號(hào)發(fā)放。
28.權(quán)利要求27的方法，其中在體外進(jìn)行所述方法來(lái)抑制一個(gè)或多個(gè)表達(dá)p75的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。
29.權(quán)利要求27的方法，其中在體內(nèi)進(jìn)行所述方法來(lái)抑制一個(gè)或多個(gè)表達(dá)p75的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述具有表達(dá)在細(xì)胞表面的p75多肽的一個(gè)或多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的至少一個(gè)是連合神經(jīng)元細(xì)胞、感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞、背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、小腦顆粒神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞。
31.權(quán)利要求27的方法，其中在患有神經(jīng)病癥或障礙的哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行所述方法。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙是肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、亨廷頓病或阿爾茨海默病。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙包含來(lái)自中風(fēng)的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷、腦或脊髓組織創(chuàng)傷，或神經(jīng)元組織中的損傷。
34.治療患有神經(jīng)病癥或障礙的哺乳動(dòng)物的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的一種或多種DR6拮抗劑和一種或多種p75拮抗劑。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑選自結(jié)合DR6的抗體、包含 SEQ ID NO 1的氨基酸1-354的可溶性DR6多肽，和結(jié)合APP的抗體；且其中所述p75拮抗劑選自可溶性P75和結(jié)合p75的抗體。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的 DR6胞外結(jié)構(gòu)域序列。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含SEQID NO 1的氨基酸 1-349 或 42-349 的 DR6 多肽。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述結(jié)合DR6的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制由分別以ATCC保藏號(hào)PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的 3F4. 4. 8、4B6. 9. 7 或 1E5. 5. 7單克隆抗體的結(jié)合。
41.權(quán)利要求35的方法，其中結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
42.權(quán)利要求34的方法，其中所述結(jié)合APP的抗體是單克隆抗體。
43.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
44.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制單克隆抗體 22C11的結(jié)合。
45.權(quán)利要求30的方法，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
46.權(quán)利要求34的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中的至少一種抑制DR6與包含SEQ ID NO 6的氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。
47.權(quán)利要求34的方法，其中所述一種或多種DR6拮抗劑中的至少一種抑制APP與包含SEQ ID NO 1的氨基酸1-655的DR6多肽的結(jié)合。
48.權(quán)利要求34的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙是肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、亨廷頓病或阿爾茨海默病。
49.權(quán)利要求34的方法，其中所述神經(jīng)病癥或障礙包含來(lái)自中風(fēng)的神經(jīng)元細(xì)胞或組織損傷、腦或脊髓組織創(chuàng)傷，或神經(jīng)元組織中的損傷。
50.權(quán)利要求34的方法，其中對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用一種或多種其他治療劑。
51.權(quán)利要求34的方法，其中通過(guò)注射、輸注或灌注對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用所述一種或多種DR6拮抗劑。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述一種或多種其他治療劑選自NGF、凋亡抑制劑、EGFR 抑制劑、β -分泌酶抑制劑、Y -分泌酶抑制劑、膽堿酯酶抑制劑、抗-Abeta抗體和NMDA受體拮抗劑。
53.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性ρ75多肽包含ρ75免疫黏附素。
54.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性ρ75多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的 Ρ75胞外結(jié)構(gòu)域序列。
55.權(quán)利要求35的方法，其中所述結(jié)合ρ75的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
56.權(quán)利要求35的方法，其中結(jié)合ρ75的抗體或可溶性ρ75多肽與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
57.組合物，其包含(a)分離的DR6拮抗劑，其包含(i)結(jié)合包含SEQID NO=I的DR6多肽的單克隆抗體， 或(ii)可溶性DR6多肽，或(iii)結(jié)合包含SEQ ID NO 6的APP的單克隆抗體，其中所述 DR6拮抗劑抑制APP與DR6的結(jié)合；和(b)分離的p75拮抗劑，其包含(i)結(jié)合p75多肽的單克隆抗體，或(ii)可溶性p75多肽，其中所述P75拮抗劑抑制APP與p75的結(jié)合。
58.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。
59.權(quán)利要求58的分離的DR6拮抗劑，其中所述可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的DR6胞外結(jié)構(gòu)域序列。
60.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體結(jié)合包含圖1(SEQ ID NO 1)的氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。
61.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
62.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制由分別以ATCC保藏號(hào)PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7或1E5. 5. 7單克隆抗體的結(jié)合。
63.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合DR6的抗體或可溶性DR6多肽與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
64.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述DR6拮抗劑抑制DR6與包含SEQID NO 6的氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。
65.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述拮抗劑結(jié)合通過(guò)空間抑制來(lái)抑制DR6 與APP的結(jié)合的表位。
66.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
67.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述22C11單克隆抗體的結(jié)合。
68.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述結(jié)合APP的抗體與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
69.權(quán)利要求57的分離的DR6拮抗劑，其中所述拮抗劑抑制DR6與包含SEQID NO 6 的氨基酸66-81的APP多肽的結(jié)合。
70.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性p75多肽包含p75免疫黏附素。
71.權(quán)利要求35的方法，其中所述可溶性p75多肽包含與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合的 P75胞外結(jié)構(gòu)域序列。
72.權(quán)利要求35的方法，其中所述結(jié)合p75的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
73.權(quán)利要求35的方法，其中結(jié)合p75的抗體或可溶性p75多肽與選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的一種或多種非蛋白質(zhì)聚合物連接。
74.藥物組合物，其包含權(quán)利要求57-69的DR6拮抗劑和p75拮抗劑，及可藥用載體。
75.制品，其包含(a)物質(zhì)的組合物，其包含有效量的權(quán)利要求57-69的DR6拮抗劑；(b)物質(zhì)的組合物，其包含有效量的權(quán)利要求57-69的p75拮抗劑；(c)包含所述組合物的容器；和(c)附著于所述容器的標(biāo)簽，或包含在所述容器中的包裝說(shuō)明書(shū)，其提供所述DR6拮抗劑在治療神經(jīng)病癥或障礙中的用途的說(shuō)明。
76.試劑盒，其包含第一容器、所述容器上的標(biāo)簽和包含于所述容器內(nèi)的組合物；其中所述組合物包含對(duì)抑制至少一種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有效的第一活性劑、對(duì)抑制至少一種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有效的第二活性劑、所述容器上的標(biāo)簽或包含于所述容器中的包裝說(shuō)明書(shū)，其顯示所述組合物可以用來(lái)抑制至少一種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，所述組合物中的所述第一活性劑包含權(quán)利要求57-69的至少一種DR6拮抗劑，且所述組合物中的所述第二活性劑包含權(quán)利要求57-69的至少一種 P75拮抗劑；第二容器，其包含可藥用緩沖液；和用所述DR6拮抗劑和p75拮抗劑來(lái)抑制至少一種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡的說(shuō)明。
全文摘要
本發(fā)明提供用于篩選抑制神經(jīng)變性的化合物的方法。APP脫落可以是有用的神經(jīng)變性標(biāo)志，且抑制APP脫落的化合物可用作神經(jīng)變性的抑制劑。這類(lèi)化合物可以用于治療和/或預(yù)防多種神經(jīng)疾病、障礙和神經(jīng)元損傷，且可以增強(qiáng)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)、再生或存活。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102326083SQ201080008273
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者A·尼古拉耶夫, J·平克斯通古斯, M·泰西爾-拉維涅 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司