專利名稱：干化學(xué)層中具有低活性的酶的快速反應(yīng)動力學(xué)的制作方法
干化學(xué)層中具有低活性的酶的快速反應(yīng)動力學(xué)本發(fā)明涉及一種用于測定分析物的方法及其合適診斷元件。診斷元件是臨床相關(guān)分析方法的重要組成部分。就此而論，主要焦點在分析物(例如代謝產(chǎn)物或底物)的測量上，其例如借助于對分析物特異的酶進行直接或間接的測定。在這種情況下，借助于酶-輔酶復(fù)合物將分析物轉(zhuǎn)化，并且隨后進行定量。在這個過程中，將待測分析物與合適的酶、輔酶和任選的介質(zhì)接觸，輔酶通過酶促反應(yīng)(例如氧化或還原)發(fā)生物理化學(xué)變化。如果另外使用介質(zhì)，這種介質(zhì)通常在分析物反應(yīng)期間將釋放的電子從還原的輔酶轉(zhuǎn)移到光學(xué)指示器或電極的導(dǎo)電組分，這樣的話可以例如通過光度測定或電化學(xué)檢測所述過程。校準(zhǔn)提供測量值和待測分析物濃度之間的直接關(guān)系。現(xiàn)有技術(shù)已知的診斷元件的特征在于有限的保存期限和對環(huán)境的特殊要求，例如冷卻或干儲存，以便實現(xiàn)所述保存期限。因此，在某些應(yīng)用形式下，例如由最終用戶自己實施的檢驗(諸如血糖自我監(jiān)控)的情況下，錯誤的結(jié)果可能歸因于錯誤的、被忽視的測量系統(tǒng)的不正確保存，這幾乎不能被消費者識別，并且可能導(dǎo)致相應(yīng)疾病的錯誤治療。錯誤的結(jié)果主要源于以下事實用于這類診斷元件的酶，輔酶和介質(zhì)通常對水分和熱產(chǎn)生敏感反應(yīng)， 并隨時間而失活。用于增加診斷元件穩(wěn)定性的已知措施是使用穩(wěn)定的酶，例如使用來自嗜熱生物的酶。此外，可以通過化學(xué)修飾具體來說是交聯(lián)來穩(wěn)定酶。此外，還可以添加酶穩(wěn)定劑諸如例如海藻糖，聚乙烯基吡咯烷酮和血清白蛋白，或可以在聚合物網(wǎng)絡(luò)中例如通過光聚合而封入酶。另一種穩(wěn)定酶的方法是通過位點特異性或非位點特異性引入的突變。就此而論， 通過編碼酶的DNA的靶向變化來特異性影響相應(yīng)酶性質(zhì)的重組技術(shù)的使用經(jīng)證明是特別合適的。Baik 等(Appl. Environ. Microbiol (2005)，71，3沘5)描述了來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)葡糖脫氫酶的3種突變體(包含氨基酸取代E170K，Q252L或 E170K/Q252L)的分離和表征。突變體E170K和Q252L在低鹽濃度和高pH值下只具有低穩(wěn)定性，而雙突變體在檢測條件下顯示顯著增加的穩(wěn)定性，這歸因于二聚體-二聚體界面上增強的相互作用。Vdzquez-Figueroa 等(ChemBioChem (2007), 8, 2 5)公開了一種熱穩(wěn)定葡糖脫氫酶的開發(fā)，其包括在來自枯草芽孢桿菌(Bacillus ·5油iihi)，蘇云金芽孢桿菌 {Bacillus thuringiensis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的葡糖脫氫酶的第155，170和252位引入氨基酸取代。就此而論，據(jù)稱突變E170K和Q252L，單獨以及組合的，導(dǎo)致來自枯草芽孢桿菌的葡糖脫氫酶的穩(wěn)定。但是，當(dāng)使用與野生型變體相比穩(wěn)定的酶(經(jīng)遺傳修飾)時，問題在于它們通常具有顯著低于對應(yīng)野生型酶的活性，從而造成每單位時間的更低底物轉(zhuǎn)換。如果考慮到在臨床和診斷化學(xué)(諸如血糖的檢測)中優(yōu)選使用具有高比活性的酶，通常無法接受使用穩(wěn)定酶作為使用天然酶的替代。另一個困難是，在各種情況下與每單位時間的高底物轉(zhuǎn)換相關(guān)的高酶活性通常只能由相應(yīng)的天然輔酶來實現(xiàn)。如果使用人工輔酶替代天然輔酶，則酶活性通常急劇降低，底物的轉(zhuǎn)換速率從而減少。因此作為本發(fā)明基礎(chǔ)的目標(biāo)是提供一種穩(wěn)定的診斷元件，具體來說用于測定葡萄糖，其中現(xiàn)有技術(shù)的缺點被至少部分消除。具體來說，診斷元件應(yīng)當(dāng)確保底物的高轉(zhuǎn)換速率，并同時確保酶以及輔酶的高穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明這個目的通過一種測定分析物的方法來實現(xiàn)，包括步驟
(a)將包含分析物的樣品與包括干試劑層的診斷元件接觸，所述干試劑層包含 (i)對分析物特異的突變脫氫酶和
( )人工輔酶，和
(b)測定所述分析物的存在或/和量。出人意料的，在本發(fā)明范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)，比色皿試驗中在人工輔酶存在的條件下具有極低活性的突變脫氫酶，在具有干試劑層(諸如測試條)的診斷元件中顯示更快的動力學(xué)， 并產(chǎn)生與天然輔酶(野生型輔酶)存在的條件下至少一樣高的轉(zhuǎn)換。其原因推定是由于以下事實成分的高濃度而不是酶的活性對轉(zhuǎn)換速率有決定性影響，就此而論，酶、輔酶、還原的輔酶、分析物和氧化的分析物之間的復(fù)合物形成狀態(tài)看起來是特別重要的。在這方面，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法提供，本文所述診斷元件中的分析物轉(zhuǎn)換速率等于或高于相應(yīng)診斷元件(包括相應(yīng)的野生型輔酶以替代人工輔酶)中的分析物轉(zhuǎn)換速率。與包括野生型輔酶的診斷元件中的分析物轉(zhuǎn)換速率相比，本發(fā)明所用診斷元件中的分析物轉(zhuǎn)換速率優(yōu)選的增加至少20%，更優(yōu)選的增加至少50%，和最優(yōu)選的增加至少100%，例如增加100%到200%O本申請使用的術(shù)語“突變的脫氫酶”或“脫氫酶突變體”是指天然脫氫酶(野生型脫氫酶)的遺傳修飾變體，其具有與野生型脫氫酶相比修飾的氨基酸序列，但具有相同的氨基酸數(shù)目，即在至少一個氨基酸中不同于野生型脫氫酶。突變的脫氫酶可以通過衍生自任何生物學(xué)來源的野生型脫氫酶的突變而獲得，其中術(shù)語“生物學(xué)來源”在本發(fā)明的意義中包括原核生物諸如細菌以及真核生物諸如哺乳動物和其他動物。突變的引入可以位點特異性的發(fā)生或非位點特異性的發(fā)生，優(yōu)選的使用本領(lǐng)域已知的重組方法位點特異性的發(fā)生，根據(jù)相應(yīng)的要求和條件，在天然脫氫酶的氨基酸序列內(nèi)產(chǎn)生至少一個氨基酸取代。與相應(yīng)的野生型脫氫酶比較，采用這種方式獲得并用于本發(fā)明方法的脫氫酶突變體優(yōu)選的具有增加的熱或/和水解穩(wěn)定性。這類突變體的實例尤其描述于Baik (Appl. Environ. Microbiol. (2005), 71, 3285) ,Vazquez-Figueroa (ChemBioChem (2007), 8, 2295)以及WO 2005/045016 A2，其內(nèi)容均在此明確通過援引并入。在本發(fā)明的背景中突變的脫氫酶與相應(yīng)野生型脫氫酶相比尤其優(yōu)選的具有降低的酶比活。本申請使用的術(shù)語“酶比活”(單位為U/mg酶)是指在指定條件下每分鐘和每毫克酶轉(zhuǎn)化的底物量。另一方面，術(shù)語“凍干物活性”是指在指定條件下每分鐘和每毫克包括酶以及輔助物質(zhì)的凍干物轉(zhuǎn)化的底物量。用于本發(fā)明方法的突變脫氫酶優(yōu)選的是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)-依賴性或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-依賴性的突變脫氫酶，其優(yōu)選的選自突變的醇脫氫酶(EC 1. 1. 1. 1 ；EC 1. 1. 1.2)，突變的L-氨基酸脫氫酶(1.4. 1.5)，突變的葡糖脫氫酶(EC 1. 1. 1.47)，突變的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 49)，突變的甘油脫氫酶 (EC 1. 1. 1.6)，突變的3-羥丁酸脫氫酶(EC 1. 1. 1.30)，突變的乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27; ECl. 1. 1.觀)，突變的蘋果酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 37)和突變的山梨醇脫氫酶。突變的脫氫酶尤其優(yōu)選的是突變的葡糖脫氫酶(EC 1. 1. 1. 47)。如果在本發(fā)明范圍內(nèi)使用突變的葡糖脫氫酶，它可以包含與相應(yīng)的野生型葡糖脫氫酶相比，基本上在其氨基酸序列的任意位置上的一個或多個修飾氨基酸。突變的葡糖脫氫酶優(yōu)選的包括在野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列的第170和252位中至少一個的突變， 其中在第170和252位具有突變的突變體是尤其優(yōu)選的。已經(jīng)證明當(dāng)突變的葡糖脫氫酶不含除這些突變外的進一步突變是有利的。第170或/和252位的突變基本上可以包括導(dǎo)致穩(wěn)定的任意氨基酸取代，例如，導(dǎo)致野生型脫氫酶的熱或/和水解穩(wěn)定性的增加。第170位的突變優(yōu)選的包括谷氨酸對精氨酸或賴氨酸的氨基酸取代，具體來說是谷氨酸對賴氨酸的氨基酸取代，而就第252位而言， 賴氨酸對亮氨酸的氨基酸取代是優(yōu)選的。用于產(chǎn)生上述葡糖脫氫酶突變體的野生型葡糖脫氫酶優(yōu)選的衍生自細菌，其中優(yōu)選的使用來自巨大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌的葡糖脫氫酶，特別是來自枯草芽孢桿菌的葡糖脫氫酶。在最優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)使用突變的葡糖脫氫酶GlucDH_E170K_K252L，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，通過來自枯草芽孢桿菌的野生型葡糖脫氫酶的突變獲得。根據(jù)本發(fā)明，除了對分析物特異的突變脫氫酶以外，本文描述的診斷元件還包括人工輔酶。本發(fā)明意義中的人工輔酶是與天然輔酶相比進行化學(xué)修飾的輔酶，其在大氣壓下與天然輔酶相比對水分，溫度(特別是0°c到50°C的范圍)，酸和堿(特別是PH 4到pH 10 的范圍)或/和親核物(諸如醇或胺)具有更高的穩(wěn)定性，因此在相同的環(huán)境條件下能夠比天然輔酶在更長時間內(nèi)顯示其活性。與天然輔酶相比，人工輔酶優(yōu)選的具有更高的水解穩(wěn)定性，在測試條件下對水解具有完全抗性是尤其優(yōu)選的。與天然輔酶相比，人工輔酶具有減少的結(jié)合常數(shù)，例如減少二分之一或更多的結(jié)合常數(shù)。可以在本發(fā)明方法范圍內(nèi)使用的人工輔酶的優(yōu)選實例是人工NAD(P)/NAD(P) H化合物，即天然煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或天然煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP/NADPH)的化學(xué)衍生物或式(I)的化合物
權(quán)利要求
1.用于測定分析物的方法，包括步驟(a)將包含分析物的樣品與包括干試劑層的診斷元件接觸，所述干試劑層包含 (i)對分析物特異的突變脫氫酶和( )人工輔酶，和(b)測定所述分析物的存在或/和量。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述診斷元件中的分析物轉(zhuǎn)換速率等于或高于包括相應(yīng)的野生型輔酶以替代人工輔酶的相應(yīng)診斷元件中的分析物轉(zhuǎn)換速率，尤其是高至少 20%。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于使用突變的脫氫酶，與相應(yīng)的野生型脫氫酶相比，所述突變的脫氫酶具有降低的酶比活。
4.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其特征在于使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/ NADH)-依賴性或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-依賴性突變的脫氫酶作為突變的脫氫酶。
5.權(quán)利要求1到4中任一項的方法，其特征在于使用突變的葡糖脫氫酶(EC 1. 1. 1.47)作為突變的脫氫酶。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述突變的葡糖脫氫酶包括相應(yīng)野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列第170位或/和第252位的突變，尤其是第170位和第252位的突變，其中第 170位的突變優(yōu)選的包括谷氨酸對精氨酸或賴氨酸的氨基酸取代，尤其是對賴氨酸，或/和第252位的突變優(yōu)選的包括賴氨酸對亮氨酸的氨基酸取代。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于所述突變的葡糖脫氫酶是通過來自巨大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌，尤其是來自枯草芽孢桿菌，的野生型葡糖脫氫酶的突變獲得的葡糖脫氫酶。
8.權(quán)利要求5到7中任一項的方法，其特征在于所述突變的葡糖脫氫酶具有SEQID NO: 1所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1到8中任一項的方法，其特征在于人工煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/ NADH)化合物，人工煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)化合物或式(I)的化合物
10.權(quán)利要求1到9中任一項的方法，其特征在于通式(II)的化合物或其鹽或任選的其還原形式被用作人工輔酶
11.權(quán)利要求1到10中任一項的方法，其特征在于carbaNAD被用作人工輔酶。
12.權(quán)利要求1到11中任一項的方法，其特征在于測試帶，測試盤，測試墊，測試條或測試條筒被用作診斷元件。
13.權(quán)利要求1到12中任一項的方法，其特征在于通過光度測定或熒光測定來測定分析物的存在或/和量。
14.用于測定分析物的診斷元件，包括干試劑層，其包含(a)對分析物特異的突變脫氫酶，和(b)人工輔酶。
15.權(quán)利要求14的診斷元件，其特征在于所述突變的脫氫酶具有SEQID NO: 1所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉以及一種用于測定分析物的方法以及其合適的診斷元件。
文檔編號C12Q1/32GK102325896SQ201080008545
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月19日
發(fā)明者加斯勒迪切 C., 霍恩 C., 海因德爾 D., 赫內(nèi)斯 J., 施姆克 R., 梅爾 T. 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司