專利名稱：免疫佐劑組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫佐劑組合物、疫苗組合物、對非人類動物的免疫方法、活化免疫細(xì)胞制劑以及所述制劑的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
作為與疫苗抗原的混合物來給藥的佐劑激活天然免疫，并通過抗原呈遞輔助誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答。已知有各種用于動物實驗的佐劑。一般的非生物來源的化合物由于其吸附抗原例如病原體的性質(zhì)被用作佐劑，這類化合物的實例包括氫氧化鈉、氫氧化鋁、磷酸鈣、明礬和羧乙烯聚合物。然而，這些沉淀性佐劑易于引起注射位點硬結(jié)。油性物質(zhì)例如液體石蠟、羊毛脂和弗氏佐劑，由于其囊封水性抗原溶液并形成膠束的能力也被用作佐劑。然而，因為這種油基佐劑與疫苗抗原的混合物形成包含膠束的乳液，因此混合物具有高粘度，其可能引起注射疼痛并易于引起注射位點硬結(jié)。除了上述佐劑之外，幾乎不引起內(nèi)毒素休克等的相對安全的細(xì)菌牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis) (BCG)，也被用作佐劑。然而，BCG菌體易于在注射位點處引起潰瘍。因為高效佐劑一般具有強(qiáng)毒性，因此一直希望開發(fā)安全有效的佐劑。JP-2008-100919-A描述了作為天然產(chǎn)物來源的佐劑的核酸/多糖復(fù)合物，所述復(fù)合物由具有天然磷酸二酯骨架和poly (dA)尾的CpG寡核苷酸和分子量為25000以上的 β -1，3-葡聚糖構(gòu)成。該專利文獻(xiàn)表明這種核酸/多糖復(fù)合物能夠促進(jìn)建立Thl細(xì)胞活性優(yōu)勢的細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生，因此該復(fù)合物可用作免疫佐劑。發(fā)明概述技術(shù)問題本發(fā)明的主要目的是提供新的免疫佐劑組合物。問題的解決方案為了解決上述問題，發(fā)明人進(jìn)行了廣泛研究并獲得下列發(fā)現(xiàn)(i)其中基因已被破壞的同源敲除小鼠(Zc3hl2a+小鼠)顯示出漿細(xì)胞數(shù)量的增加和漿細(xì)胞向肺的浸潤。小鼠還顯示出血清免疫球蛋白水平升高和自身抗體生產(chǎn)。(ii)大多數(shù)脾臟T細(xì)胞顯示出效應(yīng)/記憶細(xì)胞特征，并對T-細(xì)胞受體刺激做出響應(yīng)產(chǎn)生干擾素-Y。因此，Zc3hl2a的破壞激活獲得性免疫系統(tǒng)，結(jié)果漿細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞數(shù)量增加。(iii)來自k;3hl2a+小鼠的巨噬細(xì)胞顯示出對TLR(Toll樣受體)配體做出響應(yīng)，IL-6和IL-12p40的生產(chǎn)大量增加。相反，TNF的生產(chǎn)沒有對TLE配體作出響應(yīng)而顯著增加。因此，Zc3hl2a的破壞增加了特定細(xì)胞因子的生產(chǎn)。(iv) Zc3hl2a蛋白具有鋅指區(qū)并與RNA結(jié)合。(v)Zc3hl2a基因含有推定的N-端核酸酶結(jié)構(gòu)域，并且表達(dá)的蛋白具有核糖核酸酶活性。鑒于特定mRNA的降解有助于維持其穩(wěn)態(tài)，在小鼠中Zc3hlh核糖核酸酶活性的缺失抑制了分子、包括特定細(xì)胞因子的mRNA的降解，并增加了分子的生產(chǎn)。(vi)總之，這些發(fā)現(xiàn)表明ZC3hUa基因抑制劑或蛋白抑制劑可以適合用作免疫佐劑。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，并提供了下述免疫佐劑組合物、疫苗組合物、活化免疫細(xì)胞制劑和制劑的生產(chǎn)方法。(1)免疫佐劑組合物，所述組合物包含選自基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種作為活性成分。(2) (1)的免疫佐劑組合物，其還包含另一種免疫佐劑。(3)疫苗組合物，所述組合物包含疫苗抗原以及選自Zc3hl^i基因抑制劑和 Zc3hl2a蛋白抑制劑的至少一種。(4) (3)的疫苗組合物，其還包含另一種免疫佐劑。(5)對動物進(jìn)行免疫的方法，所述方法包含向非人類動物給藥( 或(4)的疫苗組合物。(6)活化免疫細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述方法包含將從對象收獲的免疫細(xì)胞與選自 Zc3hl2a基因抑制劑和ZC3hUa蛋白抑制劑的至少一種進(jìn)行接觸、從而活化免疫細(xì)胞的步
馬聚ο(7)活化的免疫細(xì)胞，所述細(xì)胞通過(6)的方法生產(chǎn)。(8)用于增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性的化合物，所述化合物是選自Zc3hlh基因抑制劑和ZC3hUa蛋白抑制劑的至少一種。(9)化合物在免疫佐劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述化合物是選自Zc3hl^i基因抑制劑和 Zc3hl2a蛋白抑制劑的至少一種。(10)用于增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性的方法，所述方法包含將疫苗抗原與選自 Zc3hl2a基因抑制劑和Zc3hlh蛋白抑制劑的至少一種進(jìn)行混合的步驟。(11)用于激活免疫力的組合物，所述組合物包含疫苗抗原以及選自Zc3hl^i基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種。(12)組合物在疫苗組合物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述組合物包含疫苗抗原以及選自基因抑制劑和ZC3hUa蛋白抑制劑的至少一種。發(fā)明的有利效果本發(fā)明的免疫佐劑組合物抑制基因或&池123蛋白的功能，從而激活獲得性免疫以及天然免疫。由于大多數(shù)常規(guī)佐劑只激活天然免疫，因此本發(fā)明的免疫佐劑組合物可用作不僅激活天然免疫而且激活獲得性免疫的強(qiáng)力佐劑。此外，因為所述免疫佐劑組合物是基因抑制劑或蛋白抑制劑，因此該免疫佐劑組合物可以被設(shè)計成核酸例如siRNA、低分子化合物等，并因此高度安全。附圖簡述

圖1是在LPS誘導(dǎo)下表達(dá)的基因(LPS誘導(dǎo)性基因)的Northern印跡分析結(jié)果 (a)和Zc3hl2a的細(xì)胞內(nèi)定位的Western印跡分析結(jié)果(b)。圖加是小鼠基因(野生型等位基因)、靶向載體(靶向構(gòu)建物)和靶等位基因的示意圖。圖2b是雜合雜交后代中的Southern印跡分析結(jié)果。圖2c是用LPS刺激的野生型(WT)和巨噬細(xì)胞的RNA的RT-PCR分析結(jié)果。圖3a是顯示了野生型(ZC;3hl2av+)和小鼠的存活率的圖。圖北是來自野生型和小鼠的脾臟(上圖)、腸系膜淋巴結(jié)(左下圖)和腹股溝淋巴結(jié)(右下圖)的照片。圖3c是來自野生型小鼠的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)的組織學(xué)照片。圖4是來自野生型(WT)和小鼠的肝臟和胰腺切片的組織學(xué)照片。圖5是顯示了小鼠中血清免疫球蛋白水平(a)、抗核抗體和抗雙鏈DNA 抗體生產(chǎn)的測量結(jié)果(b)和組織學(xué)檢查結(jié)果(C)的圖。圖6是顯示了來自小鼠的抗體染色的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖7是顯示了抗體染色的小鼠脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖8是顯示了在脾臟T細(xì)胞中對⑶3/^擬8刺激做出響應(yīng)而生產(chǎn)的干擾素-Y (a)、 IL-17(b)和 IL-4(c)的圖。圖9是顯示了抗體染色的小鼠脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖10是顯示了抗體染色的小鼠脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖11是顯示了來自野生型和&池123+骨髓嵌合小鼠的抗體染色脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖1 是顯示了通過ELISA測量的源自于刺激過的腹膜巨噬細(xì)胞的IL_6、 IL-12p40和TNF的濃度的圖。圖12b是使用源自于LPS刺激的巨噬細(xì)胞的RNA，對IL-6、 KC、TNF、I κ B α、RANTES, IP-IO和β -肌動蛋白的表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析結(jié)果。圖13是在野生型和腹膜巨噬細(xì)胞的微陣列分析的基礎(chǔ)上選擇的LPS誘導(dǎo)性基因的表達(dá)的熱圖表示。圖14是從野生型和巨噬細(xì)胞中的LPS誘導(dǎo)性基因的微陣列分析得到的熱圖表示和樹狀圖。圖15是用LPS刺激過的巨噬細(xì)胞的核提取物中，轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合活性的電泳遷移率變動分析(EMSA)的結(jié)果。圖16a是k;3hl2a mRNA的去穩(wěn)定機(jī)制的Northern印跡分析結(jié)果。圖16b是顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖。圖17是Northern印跡分析的結(jié)果(a)和顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖 (b)。執(zhí)行這些實驗是為了通過用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Tet-off細(xì)胞來確定IL-6 3，-UTR中的 Zc3hl2a響應(yīng)性區(qū)域。圖18是IL-6 3’ -UTR及其缺失構(gòu)建物的示意圖。圖19是作為RNA穩(wěn)定性的度量的螢光素酶活性的測量結(jié)果。圖20是IL-6 3’ -UTR及其缺失構(gòu)建物的示意圖。圖21是與IL-6 3，-UTR(1-403)mRNA結(jié)合的檢查結(jié)果。圖22是突變體蛋白表達(dá)水平的Northern印跡分析(a)和免疫印跡分析 (b)的結(jié)果。圖23是IL-6表達(dá)的Northern印跡分析(a)和免疫印跡分析(c)的結(jié)果，以及顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖(b)。圖M是小鼠和人類k;3hl2a中N-端和CCCH結(jié)構(gòu)域的序列比對。
圖25是k;3hl2a的N-端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型。圖沈是k;3hl2a的內(nèi)切核糖核酸酶活性的測量結(jié)果。圖27是&池123的內(nèi)切核糖核酸酶活性的測量結(jié)果。圖觀是Northern印跡分析的結(jié)果(a)和顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖 (b)。實施方案描述下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解釋。(I)免疫佐劑組合物本發(fā)明的免疫佐劑組合物包含選自ZC3hUa基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種作為活性成分。Zc3hl2aS@Toll樣受體(TLR)是識別微生物組分并喚起炎性和免疫應(yīng)答的受體。TLR刺激激活了一組復(fù)雜的基因表達(dá)，調(diào)控免疫應(yīng)答的幅度和持續(xù)時間。Zc3hl^i基因是可由TLR刺激誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)基因。ZC3hUa基因的堿基序列在NCBI中登記在登錄號NM_025079 下。Zc3hlh基因抑制劑ZC3hUa基因抑制劑可以是任何能夠抑制基因表達(dá)的物質(zhì)，抑制劑的實例包括低分子化合物、核酸、蛋白質(zhì)和糖蛋白。其中，由于易于用作藥物，低分子化合物是優(yōu)選的。此外，由于易于設(shè)計和低毒性，核酸例如siRNA、shRNA或stRNA也是優(yōu)選的。 siRNA和shRNA的設(shè)計方法是公知的，并分別描述在例如Elbashir，S. M.， Harborth, J. , Lendeckel, W. , Yalcin, A. , Weber, K.禾口 Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. (21個核苷酸的RNA雙鏈體在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中介導(dǎo)RNA干擾。)Nature 411，494-498.；以及 Paddison, P. J. , Caudy,A. A. ,Sachidanandam,R.& Hannon,G. J. Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells.(哺乳動物細(xì)胞中短發(fā)夾序列活化的基因沉默。) Methods Mol. Biol. 265,85-100(2004)。siRNA 和 shRNA 可以根據(jù)需要從 ABI，Dharmacon 等獲得。Zc3hl2a基因抑制劑的篩選可以通過例如下述過程來進(jìn)行將被測物質(zhì)與試驗細(xì)胞進(jìn)行接觸，所述試驗細(xì)胞用ZC3hUa基因表達(dá)質(zhì)粒和其中IL-6基因等的3’ -UTR被置于表達(dá)螢光素酶、熒光蛋白等的基因的下游的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；然后，使用螢光素酶測定法、熒光檢測等篩選被測物質(zhì)降低基因表達(dá)的能力。或者，將被測物質(zhì)與用含有調(diào)控區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的Zc3hlh基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的試驗細(xì)胞進(jìn)行接觸，然后使用Western印跡、Northern印跡等篩選被測物質(zhì)降低基因表達(dá)的能力。Zc3hUa蛋白抑制劑ZC3hUa蛋白抑制劑可以是能夠抑制蛋白活性的任何物質(zhì)，抑制劑的實例包括低分子化合物、核酸、蛋白質(zhì)以及糖蛋白。其中，由于易于用作藥物，低分子化合物是優(yōu)選的。Zc3hlh蛋白抑制劑的篩選可以通過例如下述步驟來進(jìn)行比較在存在和不存在被測物質(zhì)的情況下執(zhí)行的測定之間的RNA降解活性水平，并選擇降低RNA降解活性的物質(zhì)。具體來說，首先，如下合成重組人類&池1加蛋白。將人類基因(NCBI登錄號NM_025079)插入到質(zhì)粒例如pGEX_6Pl中，然后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21-Gold(DE3)pLysS(Stratagene)以表達(dá)蛋白。在該蛋白表達(dá)后，收集細(xì)胞并將其重懸浮在PBS中。通過超聲然后添加Triton X-100至終濃度為1 %并在4 °C下輕搖溫育30分鐘，使細(xì)胞裂解。然后通過離心除去碎片，并將上清液與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠 4B(GE Healthcare)在4°C下輕搖溫育30分鐘。收集樹脂并用PBS洗滌5次，重新懸浮在 PreScission 蛋白酶切割緩沖液(50mM Tris, 150mM NaCl, ImM EDTAiPlyM DTT)中。加 Λ PreScission蛋白酶(GE Healthcare) (80U)，并在4°C下輕搖溫育4小時。收集上清液并儲存在_80°C下，作為ZC3hUa蛋白溶液。接下來，使用體外轉(zhuǎn)錄方法合成具有與IL-6的3’ -UTR保守結(jié)構(gòu)域序列同源的序列的RNA。在體外轉(zhuǎn)錄中，RNA標(biāo)記使用[32P]標(biāo)記的RNA(5000cpm)來進(jìn)行。將該標(biāo)記的RNA與klBhUa蛋白在含有或不含5mM Mg(Oac)2的切割緩沖液05mM Hepes, 50mM KOAc 和 5 μ M DTT)中、在 Rnasinplus (40U) (Promega)存在下混合。使用 TRIzol(InvitroGen)純化切下的RNA，并通過使用6% TBE-尿素凝膠QnvitroGen)的變性PAGE和放射自顯影對其進(jìn)行分析。切下的RNA可以作為移動較快的RNA檢測到。將被測物質(zhì)作用于該系統(tǒng)以便篩選降低切割活性的物質(zhì)。但是，用于切割活性的分析方法不限于此。ZC3hUa蛋白抑制劑的篩選可以通過與上述不同的方法來進(jìn)行。例如，將被測物質(zhì)與試驗細(xì)胞進(jìn)行接觸，所述試驗細(xì)胞用1加基因表達(dá)質(zhì)粒和其中IL-6基因等的3 ’ -UTR 被置于表達(dá)螢光素酶、熒光蛋白等的基因的下游的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；然后，使用螢光素酶測定法、熒光檢測等篩選被測物質(zhì)降低基因表達(dá)的能力。制劑本發(fā)明的免疫佐劑組合物中上述抑制劑的濃度隨抑制劑的種類而異，但是可以是例如約 10 μ g/ml 至 100mg/ml。免疫佐劑組合物可以是無菌水性或非水性溶液、懸液或乳液的形式。免疫佐劑組合物還可以包含可藥用稀釋劑、助劑、載體等，例如鹽、緩沖劑等?？梢杂媱潓⒚庖咦魟┙M合物包含在人類的食品或飲料中或動物的飲用水或飼料中來攝入。也就是說，免疫佐劑組合物包括食品或飲料組合物。食品或飲料中抑制劑的濃度可以是例如約ι μ g/ml至100mg/ml。在免疫佐劑組合物中的抑制劑是核酸的情形中，該抑制劑可以是脂質(zhì)體制劑。含有核酸的脂質(zhì)體制劑的制備方法是公知的，這樣的方法描述在例如Whitehead ΚΑ, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers :advances in siRNA delivery.(抑制屏障 siRNA 遞送的進(jìn)展)Nat Rev Drug Discov. 20098(2) :129-38 中。除了上述抑制劑之外，本發(fā)明的免疫佐劑組合物還可以包含已知免疫佐劑?？梢越M合的免疫佐劑沒有具體限制，并可以是任何已知的免疫佐劑。這類已知免疫佐劑的實例包括被殺死的微生物例如弗氏完全佐劑和結(jié)核桿菌、以及amla佐劑。還包括由具有天然磷酸二酯骨架和poly (dA)尾的CpG寡核苷酸與分子量為25000以上的β_1，3_葡聚糖構(gòu)成的核酸/多糖復(fù)合物；瘧原蟲色素；和β-正鐵血紅素。準(zhǔn)備組合在免疫佐劑組合物中的免疫佐劑的濃度可以是例如約1 μ g/ml至100mg/ml。在本發(fā)明的免疫佐劑組合物含有多種組分的情形中，組分可以被混合包含或分開包含。(II)疫苗組合物上面描述的抑制劑可以與疫苗抗原組合并制成疫苗組合物。通過將抑制劑與疫苗抗原混合，可以增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性。除了上述抑制劑之外，疫苗組合物可以含有另一種已知的免疫佐劑。對疫苗的種類沒有具體限制，可以使用任何已知疫苗。已知疫苗的實例包括抗食物過敏原、室內(nèi)塵埃過敏原、花粉過敏原例如雪松花粉、或諸如動物毛發(fā)的過敏原的過敏疫苗?；ǚ圻^敏原的實例包括雪松花粉過敏原(Cry j 1和Cry j 2)、豚草過敏原(Ambal、 Amba2、Amba5、Ambt5和Ambp5)以及果園草過敏原(Dacg2)。食物過敏原的實例包括酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白、卵類粘蛋白、卵清蛋白和伴清蛋白。室內(nèi)塵埃過敏原的實例包括螨過敏原(Derfl、Derf2、Zen 1、Derpl 禾口 Derp2)。疫苗可以是感染疫苗，其實例包括失活的全細(xì)胞疫苗、亞基疫苗和類毒素。這些疫苗可以在動物中發(fā)展出針對病原體例如細(xì)菌、病毒、立克次氏體和寄生蟲的免疫性。在感染疫苗用于人類的情形中，疫苗可以針對例如流感例如甲型和乙型流感、脊髓灰質(zhì)炎病毒、日本腦炎、結(jié)核桿菌、人類乳頭瘤病毒、瘧原蟲、SARS、能夠侵染人類的禽流感、傷寒熱、副傷寒熱、鼠疫、百日咳或斑疹傷寒。在感染疫苗用于非人類動物的情形中，疫苗可以針對例如馬流感病毒、馬皰疹病毒、馬腦膜腦炎病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、貓泛白細(xì)胞減少癥、貓鼻氣管炎、傳染性牛鼻氣管炎、3型副流感、牛病毒性腹瀉、牛腺病毒、豬細(xì)小病毒、犬腺病毒、犬瘟病毒、犬細(xì)小病毒、犬副流感、禽流感、布魯氏菌病、弧菌病、鉤端螺旋體病、梭狀芽胞桿菌感染或沙門氏桿菌病。在本發(fā)明中使用的疫苗可以是癌癥疫苗。對癌癥疫苗沒有具體限制，并且可以是已知疫苗。癌癥疫苗可以是例如WT-I疫苗、抗乳腺癌的HER2/neU疫苗、抗惡性黑素瘤的 MAGE疫苗或抗結(jié)腸癌的CEA疫苗。疫苗組合物可以是無菌水性或非水性溶液、懸液或乳液的形式。疫苗組合物還可以含有可藥用的稀釋劑、助齊U、載體等，例如鹽、緩沖劑等。疫苗組合物中抑制劑的濃度可以是例如約10 μ g/ml至100mg/ml。在疫苗組合物與本發(fā)明的免疫佐劑之外的免疫佐劑組合的情況下，待組合的免疫佐劑的濃度可以是例如約1 μ g/ml至100mg/ml。疫苗組合物中疫苗的濃度可以是例如約1 μ g/ml至100mg/ml。本發(fā)明的疫苗組合物包括食品和飲料組合物。在疫苗組合物是食品或飲料組合物的情況下，組合物中抑制劑的濃度可以是例如約ι μ g/ml至100mg/ml。在疫苗組合物與本發(fā)明的免疫佐劑之外的免疫佐劑組合的情況下，待組合的免疫佐劑的濃度可以是例如約 1 μ g/ml至100mg/ml。食品或飲料組合物中疫苗的濃度可以是例如約1 μ g/ml至IOOmg/ ml ο在疫苗組合物包含多種組分的情況下，組分可以被混合包含或分別包含。(III)免疫佐劑組合物或疫苗組合物的使用上述的疫苗組合物可以作為免疫佐劑組合物與疫苗抗原的混合物給藥。或者，免疫佐劑組合物和疫苗抗原可以分開給藥。通過疫苗組合物的給藥，可以對動物進(jìn)行免疫。也就是說，可以激活動物的免疫力(獲得性免疫和天然免疫)。在免疫佐劑組合物含有上述抑制劑和另一種免疫佐劑的情況下，這些佐劑可以分開給藥，或者可以作為混合物給藥。在本發(fā)明的免疫佐劑組合物或疫苗組合物是藥物組合物的情況下，組合物可以治療性給藥。在免疫佐劑組合物或疫苗組合物是食品組合物的情況下，組合物可以非治療性給藥。本發(fā)明的免疫佐劑組合物或疫苗組合物可以給藥到具有免疫系統(tǒng)的任何動物 (人類或非人類)。動物的實例包括哺乳動物例如人、猴、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、豚鼠、大鼠和小鼠，以及鳥類例如雞、鴨和鵝。具體來說，本發(fā)明的免疫佐劑組合物或疫苗組合物可用作人類的過敏疫苗或感染疫苗、寵物例如狗和貓的過敏疫苗或感染疫苗、或家畜例如牛、豬和雞的感染疫苗。免疫佐劑組合物或疫苗組合物可以口服、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、經(jīng)皮或經(jīng)其他途徑接種?？梢杂媱潓⑸鲜龅谋景l(fā)明的免疫佐劑組合物或疫苗組合物包含在人類的食品或飲料中或包含在動物的飲用水或飼料中攝取。本發(fā)明的免疫佐劑組合物或疫苗組合物可以單劑給藥，或者可以采用約2天至8 周的間隔多劑給藥。疫苗的劑量可以根據(jù)目標(biāo)過敏或感染的種類、或根據(jù)準(zhǔn)備給藥疫苗的動物種類而變，但是單劑劑量可以是幾十納克至幾毫克。抑制劑的單劑劑量可以是約1 μ g/ml至100mg/ml。在免疫佐劑組合物或疫苗組合物與本發(fā)明的免疫佐劑之外的免疫佐劑組合的情況下，待組合的免疫佐劑的單劑劑量可以是約 1 μ g/ml 至 100mg/ml。(IV)疫苗細(xì)胞制劑將本發(fā)明的免疫佐劑組合物與從對象收獲的免疫細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)進(jìn)行接觸，從而活化免疫細(xì)胞。通過這種方式，可以獲得活化免疫細(xì)胞。預(yù)計活化免疫細(xì)胞向人類的給藥將引起活化免疫的疫苗效應(yīng)。這種活化免疫細(xì)胞制劑通?？梢造o脈內(nèi)給藥。收獲的免疫細(xì)胞可以在培養(yǎng)基例如RPMI中在細(xì)胞因子的存在下預(yù)培養(yǎng)。然后將免疫細(xì)胞與免疫佐劑組合物混合，并在適合于細(xì)胞生長的溫度例如約37°C下溫育約1至M 小時。免疫細(xì)胞和免疫佐劑組合物的使用比率可以是例如約1 1至1 10000。 實施例在實施例中使用的試劑和試驗方法如下?！丛噭┖图?xì)胞〉用于小鼠IL-4、IL-6、IL_12p40、IL-17、IFN-γ 和 TNF 的 ELISA 試劑盒從 R&D systems公司購買。小鼠ANA抗體(抗核抗體)ELISA試劑盒從Alpha Diagnostic公司購買。單克隆抗YYl (H-IO)抗體和HRP標(biāo)識的單克隆抗β-微管蛋白(D-IO)抗體從 SantaCruz公司購買。HRP標(biāo)識的抗FLAG抗體從Sigma公司購買。包括MALP-2的TLR配體、 poly(I:C)、源自于明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonella Minnesota) Re595株的脂多糖(LPS)、 R-848和 CpG寡核苷酸(0DN1668)，按照Kawagoe，T.等，Sequential control of Toll-like receptor-dependent responses by IRAKI and IRAK2.(通過 IRAKI 和 IRAK2 順序控制iToll樣受體依賴性應(yīng)答)Nat Immunol 9,684-91(2008)中所述獲得。小鼠用aiil 4. 0%巰基乙酸鹽培養(yǎng)基(Sigma)注射3天后，通過用冰冷的Hank’ s 緩沖鹽溶液(Invitrogen)洗滌腹膜腔，分離出腹腔滲出細(xì)胞。HEK 293 Tet-off細(xì)胞系從 Clontech公司購買。HEK 293細(xì)胞從ATCC購買?！幢磉_(dá)質(zhì)粒〉將&311123cDNA(NCBI 登錄號 NM_153159)插入到 pFLAG_CMV2 載體(Invitrogen) 中，得到Zc3hUa表達(dá)質(zhì)粒。pFLAG-CMV2載體(Invitrogen)用作Zc3hUa表達(dá)質(zhì)粒的空對照質(zhì)粒。使用上述&池1加表達(dá)質(zhì)粒，利用QuickChange II位點定向誘變試劑盒 (Stratagene)按照隨附的指導(dǎo)手冊執(zhí)行點突變(C306R或D141N)和CCCH結(jié)構(gòu)域的缺失。 含有全長(1-403)或部分(1-70、58-173或172-403) IL-63，-UTR序列的pGL3載體，由 Dr. W. Zhao禾口Dr. K. Kirkwood提供(Zhao，W.等，p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. (p38 α通過多個富含AU的元件穩(wěn)定白介素_6mRNA) J Biol Chem 沘3，1778-85 (2008))。按照 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的方法，將IL-6 3，-UTR cDNA 的部分(1-92、1-102、1-112、1-132、1-142 或 122-197)分別插入到 pGL3 載體中。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，將帶有或不帶有 IL-6 3，-UTR(77-108) 序列的 β -珠蛋白的 3，-UTR cDNA(1-130)、IL_12p40 的 3，-UTR cDNA(1-781)、CalcR 的 3'-UTR cDNA(1-1601)和Y-干擾素的3，_UTR cDNA(1-631)分別插入到pGL3載體中。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，將 IL-6 CDS 和 IL-6CDS+3，-UTR 插入到 pTREtight 載體(Clontech)中，分別產(chǎn)生了 pTREtight_IL6_CDS 和 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR。按照 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，將野生型 k3hl2a cDNA 和突變體(D141N) k3hl2a cDNA 插入到 pGEX-6Pl 載體(GE Healthcare)中，分別產(chǎn)生 pGEX_6PUc3hl2a 質(zhì)粒和 k3hl2a D141N突變體質(zhì)粒。按照Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的方法，將 IL-6 3，-UTRcDNA 插入到 pBluescript 中 T7 啟動子的下游，產(chǎn)生 pBluescript_IL63，-UTR(1-430) <ELISA>培養(yǎng)上清液中的IL-4、IL-6、IL-12p40、IL_17、IFN-γ和TNF-α以及血清中的小鼠ANA抗體，通過ELISA按照制造商的方案進(jìn)行測量。用于小鼠血清中IgM、IgGU IgG2a, IgG2b、IgG3和抗雙鏈DNA抗體的ELISA，按照下述文獻(xiàn)中描述的方法來進(jìn)行Sato，S.等， Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses. (激酶TAKl在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的基本功能)Nat. Immunol 6,1087-95(2005)；和 Fukuyama The inhibitory Fcgamma receptor modulates autoimmunity by limiting the accumulation of immunoglobulin G+anti-DNA plasma cells.(抑制性 Fc γ 受體通過限制免疫球蛋白G+抗DNA漿細(xì)胞的積累來調(diào)節(jié)自體免疫Nat Immunol 6，99-106 (2005)?！碞orthern印跡、免疫印跡和EMSA>Northern印跡、免疫印跡和EMSA按照下述文獻(xiàn)中描述的方法執(zhí)行Sato，S.等，
10Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses. (激酶TAKl在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的基本功能)Nat. Immunol 6，1087-95 (2005)?！囱簩W(xué)值的測定〉從野生型和小鼠制備的血樣的血液學(xué)分析在SRL Inc公司進(jìn)行?！戳魇郊?xì)胞術(shù)〉用于流式細(xì)胞分析的抗體從BD公司購買。通過過濾和輕柔吸打制備脾細(xì)胞懸液。 為了進(jìn)行表面染色，將細(xì)胞在4°C下維持在暗處。將細(xì)胞用冰冷的FACS緩沖液(含2% FCS、 0. 02% NaN3的PBS)洗滌，并與每種抗體溫育15分鐘，然后用FACS緩沖液清洗3次。FoxP3+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞用小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒(eBioscience)，按照制造商的說明書染色。 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子使用BD Cytofix/Cytoparm Plus固定/通透化試劑盒(BD)按照制造商的說明書染色。數(shù)據(jù)在FACS Calibur (注冊商標(biāo))或FACS Canto (注冊商標(biāo))II流式細(xì)胞儀 (BD)上獲取，并使用FlowJo (來自于Tree Mar的軟件)進(jìn)行分析。<RNA穩(wěn)定性的測量〉使用下列三種獨立方法測定mRNA的穩(wěn)定性。(1)巨噬細(xì)胞中mRNA的穩(wěn)定性將源自于野生型和小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞(lx IO6)分別用LPS(100ng/ ml)刺激2小時。然后向培養(yǎng)基加入放線菌素lK2yg/ml)以終止轉(zhuǎn)錄，并在指定時間后制備總RNA。對RNA進(jìn)行Northern印跡分析以確定IL_6、TNF、KC和β -肌動蛋白mRNA水平。O) Tet-off 系統(tǒng)將HEI^93 Tet-off 細(xì)胞(3x IO6)用 pTREtight_IL6_CDS (具有 IL-6 編碼序列) 或pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR(具有IL-6編碼序列和非編碼的3，-UTR序列)與野生型 ^^hlh表達(dá)質(zhì)?；蛲蛔凅w^^hlh表達(dá)質(zhì)?；蚩諏φ召|(zhì)粒一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3小時后，將細(xì)胞再分到三個60-mm平皿中并培養(yǎng)過夜。通過加入Doxdyg/ml)終止從pTREtight載體的mRNA轉(zhuǎn)錄，并在指定時間后制備總RNA。對RNA進(jìn)行Northern印跡分析以確定IL-6和 β-肌動蛋白mRNA水平。(3)螢光素酶測定法 將HEK293細(xì)胞用pGL3_IL6_3’ -UTR質(zhì)?；騪GL3空質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒或空對照質(zhì)粒一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)48小時后，將細(xì)胞裂解，并使用雙重螢光素酶報告測定系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System) (Promega)測定裂解液中的螢光素酶活性。 將細(xì)胞同時用海腎螢光素酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用作內(nèi)部對照。<體外RNA切割測定法>按照 Miyoshi, K.等，In vitro RNA cleavage assay for Argonaute-famiIy proteins.(對 Argonaute 家族蛋白的體外 RNA 切割測定法)Methods Mol Biol 442， 29-43(2008)中描述的方法，分析k;3hl2a的野生型和突變體形式的切割活性。在將重組 k;3hl2a蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的[32P]-標(biāo)記的RNA溫育后，將切開的RNA純化并通過變性PAGE 和放射自顯影進(jìn)行分析。具體來說，將重組蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的[32P]-標(biāo)記的RNA(5000cpm)，在含有或不含 5mM Mg (Oac)2 的切割緩沖液 Q5mM Hepes,50mM KOAc 和 5μΜ DTT)中、在 Rnasin plus(40U) (Promega)存在下混合。使用TRIzol (Invitrogen)純化切開的RNA，并通過使用6% TBE-尿
11素凝膠(Irwitrogen)的變性PAGE和放射自顯影進(jìn)行分析?！垂撬枰浦病祻囊吧托∈蠛托∈蠓謩e制備骨髓細(xì)胞。將制備的骨髓細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到經(jīng)致死性輻射的CD45. 1 C57BL/6小鼠中(小鼠在大阪大學(xué)微生物疾病研究所傳染病動物實驗資源中心飼養(yǎng))。在飲用水中向嵌合小鼠提供4周的新霉素和氨芐青霉素。在重構(gòu)后至少8周對小鼠進(jìn)行分析。來自嵌合小鼠的90%以上的脾細(xì)胞是CD45. 2陽性的。<Zc3hUa蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)〉在用pGEX_6PUc;3hl^i或k;3hl2a (D141N)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏桿菌 (Escherichia coli)BL21-Gold(DE3)pLysS(Stratagene)中表達(dá)蛋白。在蛋白表達(dá)后，收集細(xì)胞并將其重懸浮在PBS中。將細(xì)胞通過超聲裂解，然后加入Triton X-100至終濃度為 1%，并在4°C下輕搖溫育30分鐘。然后通過離心除去碎片，并將上清液與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B (GE Healthcare)在4°C下輕搖溫育30分鐘。收集樹脂并用PBS清洗5次，并重新懸浮在 PreScission 蛋白酶切割緩沖液(50mMTris，150mM NaCl, ImM EDTAiPlyM DTT)中。 加入PreScission蛋白酶(GE Healthcare) (80U)，并在4°C下輕搖溫育4小時。收集上清液并儲存在-80°C下，作為重組蛋白溶液。< [32P]標(biāo)記的RNA的合成>使用pBluescript-IL6 3’ -UTR (1-430)質(zhì)粒作為模板，合成具有 IL63’ -UTR 序列的RNA。體外RNA合成和[32P]標(biāo)記使用Riboprobe體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(ftOmega)，按照制造商的說明書進(jìn)行。5’ -末端標(biāo)記使用未標(biāo)記的RNA和激酶Max 5’ -末端標(biāo)記試劑盒(Ambion)， 按照制造商的說明書進(jìn)行。3’ -末端標(biāo)記通過將未標(biāo)記的RNA與T4 RNA連接酶(Takara) 和[32P]pCp(GE Healthcare)溫育來進(jìn)行。<RNA結(jié)合測定法〉將[32P]標(biāo)記的RNA (lx 106cpm)與重組蛋白或BSA (Pierce)在緩沖液Q5mM Hepes,50mM KOAc和5 μ M DTT)中混合，并在室溫下溫育20分鐘。然后加入肝素至終濃度為5 μ g/ml,并繼續(xù)溫育10分鐘。通過使用FUNA-UV-LINKER FS-800 (Funakoshi)，用 254-nm紫外光在距光源5cm處在冰上輻照20分鐘，對樣品進(jìn)行交聯(lián)。將交聯(lián)后的樣品用 RNaseT(IOOU)在室溫下處理20分鐘，然后用RNaseA (1 μ g)在37°C下處理15分鐘。在消化后，通過SDS-PAGE和放射自顯影分析與[32P]標(biāo)記RNA結(jié)合的蛋白?！次㈥嚵蟹治觥祵碜杂谝吧托∈?從日本CLEA購買)、MyD88+小鼠(通過下述文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生:Adachi 0, Kawai Τ, Takeda K, Matsumoto Μ, Tsutsui H, Sakagami Μ, Nakanishi K, Akira S.Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-I-and IL-18-mediated function. (MyD88 基因的靶向破壞導(dǎo)致 IL-1 和 IL-18 介導(dǎo)的功能喪失)Immunity. 1998Jul ；9(1) :143-50.)和1Trif+小鼠(通過下述文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生Yamamoto Μ, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho Τ, Sanjo H, Takeuchi 0, Sugiyama Μ, Okabe Μ, Takeda K, Akira S. Role of adaptor TRIF in the MyD88—independent toll-like receptor signaling pathway.(接頭 TRIF 在 MyD88 不依賴性 toll 樣受體信號傳導(dǎo)途徑中的作用)Science. 2003 Aug 1 ；301 (5633) :640-3)的腹膜巨噬細(xì)胞，用IOOng/ ml LPS刺激0、1和4小時。使用RNeasy試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)提取總RNA,并使用 superscript 選擇系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用 T7- (dT) 24 引物引發(fā)，從 10 μ g 總 RNA合成雙鏈cDNA。通過使用T7 RNA聚合酶，在生物素標(biāo)記的核糖核苷酸存在下按照制造商的方案(Enzo Diagnostics,Farmingdale,NY)執(zhí)行的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將cDNA用于制備生物素標(biāo)記的cRNA。使用RNeasy試劑盒^jiagen)純化cRNA產(chǎn)物，將其片段化，并按照制造商的方案，與Affymetrix小鼠表達(dá)陣列A430微陣列芯片(Affymetrix，Santa Clara, CA) 雜交。為了測定&池12￡1+巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)性基因，將腹膜巨噬細(xì)胞用lOOng/ml LPS 刺激。然后使用 TRIzol (Invitrogen Life Technologies)提取總 RNA 并使用 RNeasy 試劑盒進(jìn)一步純化。使用Ovation生物素RNA擴(kuò)增和標(biāo)記系統(tǒng)(Nugen)，按照制造商的方案，從 IOOng純化的RNA合成生物素標(biāo)記的cDNA。Affymetrix小鼠基因組430 2. O微陣列芯片的雜交、染色、清洗和掃描按照制造商的說明書進(jìn)行。使用R和Bioconductor affy軟件包計算穩(wěn)健多芯片平均(Robust multichip average,RMA)表達(dá)值。對于分層聚類來說，選擇在刺激后與O小時處相比RMA表達(dá)值增加2倍或5倍以上的探針。對與每個探針，將RMA表達(dá)值進(jìn)行變換以將平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差擬合到零和一。為了分析MyD88+和Trif+巨噬細(xì)胞中的LPS誘導(dǎo)基因，使用泊松(Pearson’ s)相關(guān)系數(shù)計算探針之間的距離作為距離函數(shù)。為了分析巨噬細(xì)胞中的LPS誘導(dǎo)基因，對RMA值進(jìn)行主成分分析，并使用第一至第五主成分計算探針之間的歐幾里得(Euclidean)距離。使用這些距離，采用沃德(Ward's) 法執(zhí)行分層聚類。這些計算和熱圖表示法的產(chǎn)生使用R和Bioconductor來進(jìn)行。〈免疫組織化學(xué)分析〉將組織用10%中性福爾馬林緩沖溶液固定，包埋在石蠟中，并切成5-μπι厚的切片。將切片在靶恢復(fù)溶液(Dako，Glostrup，丹麥)中在98°C下加熱40分鐘以促進(jìn)抗原恢復(fù)。將切片與用抗體稀釋劑(產(chǎn)品名ChemMate，Dako)l 50稀釋的抗小鼠IgA( α鏈) 的過氧化物酶標(biāo)識的山羊IgG級份(MP Biomedicals, LLC, Solon, OH)、或用抗體稀釋劑 1 25稀釋的抗小鼠IgG(完整分子)的過氧化物酶標(biāo)識的親和純化山羊F(AB’)2片段(MP Biomedicals)，在室溫下溫育30分鐘。與小鼠IgA和IgG免疫反應(yīng)的細(xì)胞使用二氨基聯(lián)苯胺(Dako)可視化。將切片用蘇木精輕度復(fù)染。將染色的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察?！唇Y(jié)構(gòu)模型建立〉如下所述構(gòu)建k;3hl2C N-端結(jié)構(gòu)域的模型。首先，將序列提交給BioInfoBank Meta服務(wù)器(http://bioinfo.pl)，并使用缺省設(shè)置建立排名前十的模型。然后通過將每個模型提交給&SAW功能注釋服務(wù)器(http:// pdbjs6.pdbj.org/SeSAff/)并選擇具有最高分值的模型，來選擇最佳模型。使用FFASO3 服務(wù)器(http://ffas. ljcrf. edu/ffas-cgi/cgi/ffas. pi)和 Modeller (Eswar，N.等， Comparative protein structure modeling using Modeller.(使用 Modeller 建立比較性蛋白結(jié)構(gòu)模型)，《生物信息學(xué)現(xiàn)代方法》(Curr Protoc Bioinformatics)第5章，5. 6 單元O006))，從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)模板2qip建立所選的模型。該模型也具有最高的3D Jury 分值，含有一簇保守天冬氨酸(D141、D226、SM2、D244和D248)，其在Flap內(nèi)切核酸酶 (例如PDB ID lut5)的活性位點中也是保守的(Feng, Μ.等，Roles of divalent metal ions in flap endonuclease-substrate interactions· (二H屬離子flap 內(nèi)切t亥酸酶-底物相互作用中的作用)Nat Struct Mol Biol 11,450-6 (2004)) 使用eF-surf 月艮務(wù)器(http://ef-site.hgc.jp/eF_surf/)禾口 eF—site(Kinoshita，K. & Nakamura，H. eF—site and PDBjViewer database and viewer for protein functional sites. (eF-site和PDBjViewer :用于蛋白質(zhì)功能位點的數(shù)據(jù)庫和瀏覽器)Bioinformatics 20， 1329-30(2004))制備靜電表面?！磳嵤├?>Zc3hl2a作為LPS誘導(dǎo)基因的鑒定為了全面調(diào)查Toll樣受體(TLR)誘導(dǎo)的基因表達(dá)，發(fā)明人使用來自LPS刺激的野生型(WT)、Myd88+和Trif+小鼠的小鼠巨噬細(xì)胞，執(zhí)行了微陣列分析。選擇了野生型細(xì)胞在刺激后1或4小時時其表達(dá)被誘導(dǎo)兩倍以上的214個基因。 這些LPS誘導(dǎo)基因的分層聚類顯示，它們可以分類成三個主要簇(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些簇中，第III簇中的基因以MyD88依賴性方式被快速誘導(dǎo)。該簇包含Tnf、NflibiZ和Zfp36 等。第III簇還包含編碼的基因(數(shù)據(jù)未顯示)。為了調(diào)查&31112￡1、IL-6、ΙκΒζ和 β -肌動蛋白的表達(dá)，從用 LPS(100ng/ml) 刺激指定時間長度的巨噬細(xì)胞提取總RNA，并進(jìn)行Northern印跡。結(jié)果顯示在圖Ia中。 Northern印跡分析證實，在小鼠巨噬細(xì)胞中，在LPS刺激后k;3hl2a mRNA被快速誘導(dǎo)，然后隨時間逐漸降低(圖la)。ZC3hUa具有CCCH型鋅指(Zf)基序，并與類似蛋白Zc3hl2b, Zc3hl2c和k3hl2d形成家族。使用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)，將 HEK293 細(xì)胞用或不用帶有 Flag 標(biāo)簽的ZC3hUa轉(zhuǎn)染。從用或不用帶有Flag標(biāo)簽的ZC3hUa轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞制備細(xì)胞質(zhì) (CP)和核提取物(NE)。使用抗FLAG抗體，通過Wfestern印跡測量&池12￡1的表達(dá)。使用抗β-微管蛋白抗體和抗YY-I抗體分別作為CP和NE的對照(上樣對照)。結(jié)果顯示在圖 Ib中。分級實驗顯示，ZC3hUa蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)而不是核中(圖lb)。〈實施例2>k3hl2a+小鼠的產(chǎn)生為了調(diào)查&池1加在體內(nèi)免疫應(yīng)答控制中的功能作用，發(fā)明人產(chǎn)生了 ZC3hUa缺陷(Zc3hl2a+)小鼠。使用Elongase (Invitrogen)，通過PCR從GSI-I胚胎干細(xì)胞分離含有k3hl2a的基因組DNA。將分離的含有的基因組DNA通過限制性酶作圖和測序分析進(jìn)行表征。 對靶向載體進(jìn)行設(shè)計，以用新霉素抗性基因代替含有CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)域的外顯子3至外顯子5。使用1. 1-千堿基(kb)的ClaI-BamI片段作為3，同源區(qū)，5. 9_kb的NotI-SalI片段用作5’同源區(qū)。將總共30yg的NotI線性化的載體經(jīng)電穿孔進(jìn)入GSI-I胚胎干細(xì)胞中。 在用G418 (Nacalai Tesque)選擇后，挑取藥物抗性克隆，并通過PCR和Southern印跡分析進(jìn)行篩選。將這些克隆分別微注射到源自于C57BL/6小鼠的囊胚(從日本CLEA購買)中， 并將囊胚移植到假孕雌性小鼠中。嵌合雄性小鼠與C57BL/6雌性小鼠的交配導(dǎo)致突變體等位基因傳遞到生殖系中。將生成小鼠互交以產(chǎn)生&池12&+小鼠。所有動物實驗在大阪大學(xué)微生物病研究所的動物實驗委員會批準(zhǔn)下進(jìn)行。圖加是小鼠基因(野生型等位基因)、靶向載體(靶向構(gòu)建物)和靶等位基因的示意圖。在圖加中，H表示Hindlll。圖2b是雜合雜交后代的Southern印跡分析結(jié)果。從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)提取基因組DNA，將其用HindIII切割，通過電泳分離，并與放射性標(biāo)記的探針雜交。Southern印跡顯示出對于野生型(v+)小鼠的5. 91Λ單一條帶，純合型("_)小鼠的3. Skb單一條帶，以及雜合型(+/_)小鼠的5. 9kb和3. Skb的兩個條帶。為了調(diào)查&池12￡1 mRNA的表達(dá)，本發(fā)明人使用圖加中顯示的兩種引物對RNA進(jìn)行了 RT-PCR 分析，所述引物是Fw :ATATGAGTGACCCTTGTGGAACGAAGC(SEQ ID :N0. 1)和 Rev TCTGTACACAGCATACATGTGTCCTCC (SEQ ID :N0. 2)。使用同樣的 RNA 分析 β -肌動蛋白基因的表達(dá)。圖2c顯示了用LPS(100ng/ml)刺激指定時間長度的的野生型(WT) (Zc3hl2a+/+) 和k3hl2a+巨噬細(xì)胞的RNA的RT-PCR分析結(jié)果。RT-PCR分析顯示出Zc3hlh的表達(dá)在 Zc3hl2a^巨噬細(xì)胞中受到抑制(圖2c)?！磳嵤├?>小鼠中胎兒期自體免疫疾病的早期發(fā)作小鼠按照孟德爾定律出生。它們中的大多數(shù)顯示出生長遲緩，并在出生
后12周內(nèi)自發(fā)死亡(圖3a)。圖3a是顯示了野生型(Zc3hl2a+/+)和Zc3hl2a^小鼠(n = 10)的存活率的圖。圖北是來自野生型(Zc3hl2av+)(頂部)和(底部)小鼠的脾臟(上圖)、腸系膜淋巴結(jié)(左下圖)和腹股溝淋巴結(jié)(右下圖)的照片。Zc3hl2a+小鼠
、+
顯示出嚴(yán)重脾腫大和淋巴腺病(圖北)。圖3c是來自野生型(Zc3hl2a+/+)和Zc3hl2a 鼠的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)(LN)的組織學(xué)照片。圖4是來自野生型(WT)和&池123+小鼠的肝臟和胰腺切片的H&E染色的結(jié)果。組織學(xué)檢查揭示出漿細(xì)胞在肺、膽管的保護(hù)上皮 (para印itheIium)和脾臟中的浸潤(圖3c和4)。漿細(xì)胞也在ZdhUa+淋巴結(jié)(LN)禾口脾臟中積累(圖3c)。在LN中，觀察到了肉芽腫形成和產(chǎn)生巨噬細(xì)胞融合的巨細(xì)胞。然而， 在小鼠的腸或關(guān)節(jié)中沒有觀察到炎性變化(數(shù)據(jù)未顯示)。血細(xì)胞的檢查結(jié)果顯示在表1中。ZC3hUa+小鼠顯示出白細(xì)胞和血小板數(shù)量增加，并患有嚴(yán)重貧血(表1)。表1中的數(shù)據(jù)是6個樣品的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(S. D.)。表1
血小板(χ IO4 mm-3)
白細(xì)胞(μΓ1) 活細(xì)胞(χ IOmm"3) 血紅蛋白(g/dl-1) 血細(xì)胞比容(％) MCV (μ3) MCH (pg) MCHC (%)
Zc3hl2a
+/+
Zc3hl2a
-I-
62.7 土 18.9 2083.3 士 652.4 841.7 ±30.0 14.7 土 0.4 49.9 土 1.5 59.3 士 1.2 17.5 ±0.5 29.3 士 0.5
134.1 ±27.9 6833.3 土 2309.7 450.7 ±89.5 6.1 士 1.5
26.1±3.8 58.5 ±3.9 13.5 土 1.5
23.2±3.0此外，小鼠發(fā)生所有被測試的免疫球蛋白同種型的高免疫球蛋白血癥 (高Y-球蛋白血癥)(圖如)。圖fe中顯示了 12a+小鼠中的血清免疫球蛋白水平。圖恥中顯示了小鼠中抗核抗體(AN)和抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生。統(tǒng)計
15學(xué)顯著性使用Student' s t-檢驗確定(* =P < 0. 05，** =P < 0. 01)。在Zc3hl2a^小鼠中觀察到了抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生(圖恥)。圖5c是用抗IgG和抗IgA抗體染色的肺切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果(組織學(xué)照片)。 浸潤在肺間質(zhì)組織中的漿細(xì)胞容易用抗IgG或抗IgA抗體染色(圖5c)。圖6顯示了小鼠中細(xì)胞畸變和細(xì)胞因子生產(chǎn)增加的檢查結(jié)果。圖6a至 6c顯示了脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。脾⑶19+B細(xì)胞中IgM和IgD的表達(dá)顯示在圖6a中，脾臟中漿細(xì)胞的比例顯示在圖6b中，脾T細(xì)胞中⑶62L和⑶44的表達(dá)顯示在圖6c中。關(guān)于上述結(jié)果，在三個獨立實驗中獲得了類似結(jié)果。圖7a是顯示了野生型和小鼠的抗體染色脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖7b是顯示了用抗R)xp3抗體和抗CD4抗體染色的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖8是顯示了在脾臟T細(xì)胞中對⑶刺激做出響應(yīng)而生產(chǎn)的干擾素-Y、 IL-17和IL-4的圖。誤差線表示兩份平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。在三次獨立實驗中獲得了類似結(jié)果。圖9a是用抗⑶4抗體染色、通透化并對干擾素-Y和IL-17進(jìn)行染色的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果。脾細(xì)胞通過與50ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA) (Sigma)、5mM鈣離子載體A23187(Sigma)和G0Igistop(BD)在完全培養(yǎng)基中37°C下溫育4小時來進(jìn)行刺激，并將刺激過的脾細(xì)胞用于上述分析。圖中的數(shù)字表示象限中的細(xì)胞比例。圖9b、10a和IOb是顯示了野生型和小鼠的抗體染色脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。圖11是小鼠中造血細(xì)胞參與漿細(xì)胞和效應(yīng)/免疫記憶T細(xì)胞的積累的檢查結(jié)果。在圖11所示的實驗中，來自野生型和^池123+骨髓嵌合小鼠的脾細(xì)胞用抗體染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞分析顯示，約70 %的⑶19+B細(xì)胞是IgM_IgD_而不是Ig+，表明大多數(shù) Zc3hl2a-7-小鼠B細(xì)胞在脾臟中經(jīng)歷了類別轉(zhuǎn)換(圖6a)。此外，在小鼠脾臟中存在豐富的⑶138+CD19du11漿細(xì)胞(圖6b)。還有，在脾臟⑶3+T細(xì)胞中⑶69的表達(dá)被上調(diào)，并且CD44highCD62LT細(xì)胞在外周積累(圖6c和7a)。然而，在野生型與Zc3hl2a^小鼠之間⑶4+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例相當(dāng)(圖7b)。用抗⑶3抗體刺激脾臟T細(xì)胞導(dǎo)致 IFN- γ而不是IL-17生產(chǎn)的增加(圖8和9a)。在Zc3hl2a^小鼠脾臟中Terl 19+成紅細(xì)胞群體較高，可能反映出對貧血的響應(yīng)(圖9b)。然而，在&池123+脾臟中，B細(xì)胞與T細(xì)胞的比率和⑶4+細(xì)胞與⑶8+細(xì)胞的比率沒有改變(圖IOa和10b)。為了調(diào)查造血細(xì)胞是否足以導(dǎo)致疾病發(fā)展，發(fā)明人將來自
小鼠的骨髓細(xì)胞移植到受體C57BL/6小鼠中。k;3hl2a+BM嵌合體顯示出延遲但是明顯的淋巴腺病的發(fā)生以及漿細(xì)胞和⑶44highCD62L_T細(xì)胞的積累，表明造血細(xì)胞對免疫疾患的發(fā)展有貢獻(xiàn)(圖11)。這些結(jié)果證實，ZC3hUa對于阻止以Ig產(chǎn)生性漿細(xì)胞和肉芽腫形成為特征的嚴(yán)重免疫疾病的發(fā)展來說，是必需的?！磳嵤├?>發(fā)明人然后調(diào)查了從巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
將來自于野生型和小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞用MALP-2 (1、10ng/ml)、 poly(I:C) (100μ g/ml)、LPS(10、100ng/ml)、R-848(10nM)或CpG_DNA(0. 1、1μΜ)刺激24小時。通過ELISA測量培養(yǎng)上清液中的IL-6、IL-12p40和TNF濃度。結(jié)果顯示在圖12a中。 在圖12a中，“med”表示沒有用上述物質(zhì)刺激的巨噬細(xì)胞(對照)。誤差線表示兩個平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。在三個獨立實驗中獲得了相似結(jié)果。從用LPS(IOOngAil)刺激指定時間長度的巨噬細(xì)胞提取總RNA，并進(jìn)行Northern 印跡以測量IL-6、KC、TNF、IκBa、RANTES、IP-10和β-肌動蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示在圖 12b 中。圖13是在野生型(Zc;3hl2av+)和腹膜巨噬細(xì)胞的微陣列分析的基礎(chǔ)上選擇的LPS誘導(dǎo)基因的表達(dá)的熱圖表示。然后，發(fā)明人在野生型和巨噬細(xì)胞中執(zhí)行了 LPS誘導(dǎo)基因的微陣列分析。如上所述，將野生型和&池12￡1+巨噬細(xì)胞用lOOng/ml LPS刺激0、1、2和4小時，并使用Affymetrix小鼠基因組430 2. 0微陣列芯片對總RNA進(jìn)行微陣列分析。數(shù)據(jù)按照上述進(jìn)行處理，在野生型和巨噬細(xì)胞中在刺激后1、2或4小時上調(diào)5倍以上的1045個基因被定義為LPS誘導(dǎo)基因。對基因進(jìn)行分層聚類，得到的熱圖和樹狀圖顯示在圖14中。 在圖14中，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)的基因簇用紅色矩形框突出。發(fā)明人調(diào)查了巨噬細(xì)胞中TLR信號傳導(dǎo)途徑的活化是否正常。將野生型和巨噬細(xì)胞用LPS(100ng/ml)刺激指定時間長度。制備核提取物，并使用針對NF-K B和AP-I的特異性探針通過電泳遷移率變動分析(EMSA)測量轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合活性(描述在 Sato, S.等，Essential function for the kinase TAKl in innate and adaptive immune responses.(激酶TAKl在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的基本功能)Nat Immunol 6,1087-95(2005)中)。結(jié)果顯示在圖15中。圖15中顯示的結(jié)果是三次獨立實驗的典型結(jié)果。如圖1 中所示，使用 TLR 配體、MALP-2(TLR2)、poly (I:C) (TLR3)、LPS(TLR4)、 R-848 (TLR7)和CpG-DNA (TLR9)進(jìn)行刺激，在Zc3hl2a^巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)了 IL-6和 IL-12p40生產(chǎn)的增加，但是TNF沒有增加。Northern印跡分析顯示出在巨噬細(xì)胞中IL-6mRNA而不是TNF、KC或I κ Na mRNA對LPS做出響應(yīng)而顯著增加(圖12b)。然后本發(fā)明人執(zhí)行了微陣列分析以評估野生型與&池123+巨噬細(xì)胞之間LPS誘導(dǎo)基因表達(dá)的差異。巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)基因的微陣列分析顯示，大多數(shù)LPS誘導(dǎo)基因在野生型和 Zc3hl2a^細(xì)胞中表達(dá)相當(dāng)(圖14)。然而，一組特別的基因在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。它們包括IL-6、Ifng、Calcr和Sprr2d(圖13)。在野生型與Zc3hl2a^巨噬細(xì)胞之間， 沒有觀察到由LPS引起的NF-K B或活化蛋白1 (AP-I)活化的差異，表明不參與初始TLR信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控(圖15)?！磳嵤├?>一些CCCH型zf蛋白牽涉到mRNA代謝例如mRNA剪接、聚腺苷化和mRNA崩解的調(diào)控。因此，推測可能在mRNA的不穩(wěn)定性中發(fā)揮作用，并使用IL-6對這種可能性進(jìn)行了調(diào)查。如上所述，將野生型和巨噬細(xì)胞用LPS刺激2小時，然后用放線菌素D 進(jìn)行處理。
圖16顯示了 Zc3hlh通過一組基因的mRNA的3，-UTR使它們不穩(wěn)定。圖16a顯示了使用提取的總RNA(10 μ g)對IL-6、TNF、KC和β -肌動蛋白探針的表達(dá)進(jìn)行RNA印跡分析的結(jié)果。在三次獨立實驗中獲得了相似結(jié)果。圖16b是顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖。在圖16b中，對放射自顯影圖進(jìn)行定量，并使用IL-6、TNF或Cxcll與Actb的比率來確定剩余mRNA水平。Zc3hl2a^巨噬細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比，IL_6mRNA而不是TNF或KC mRNA的半衰期增加(圖16a和16b)。這些結(jié)果表明，Zc3hl2a對IL_6mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控?！磳嵤├?>確定3，-UTR IL-6 中的 Zc3hl2a 響應(yīng)區(qū)為了確定&池1加表達(dá)是否控制IL_6mRNA，發(fā)明人按照1Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)說明書(TAKARA)中描述的方法，用含有在四環(huán)素響應(yīng)性啟動子(TRE)控制下的具有3’-非翻譯區(qū)(UTR)序列的IL-6編碼序列(⑶幻的質(zhì)粒(pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR)，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)與病毒轉(zhuǎn)錄因子VP-16的反式激活結(jié)構(gòu)域融合的四環(huán)素阻遏蛋白的HEK293細(xì)胞(Tet_off 293細(xì)胞)。在用強(qiáng)力霉素(Dox)處理后，IL-6mRNA的轉(zhuǎn)錄被終止，然后mRNA以溫育時間依賴性方式衰減(圖17a)。Zc3hlh的過表達(dá)極大加速了 IL-6mRNA的降解(圖17a和17b)。 相反，Zc3hUa不影響不帶有3，-UTR序列的mRNA(pTREtight-IL6-CDS)的表達(dá)(圖17a和 17b)。圖 17 顯示了使用從用 pTREtight-IL6-CDS 或 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR 與 Zc3hl2a表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ?空)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染的HEK293 Tet-off細(xì)胞提取的RNA的 Northern印跡分析(a)和通過放射自顯影獲得的剩余mRNA水平(b)的結(jié)果。在圖17a中，將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后3小時再分并溫育過夜。在D0X(lyg/ml)處理后制備總RNA，并通過Northern印跡分析確定IL-6和β -肌動蛋RNA水平。在圖17b中，對放射自顯影圖進(jìn)行定量，并使用IL-6與Actb的比率來確定剩余mRNA水平。圖19是螢光素酶活性測量結(jié)果。誤差線表示兩份平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S. D.)。在三次獨立實驗中獲得了相似結(jié)果。在圖19a和b中，將HEK293細(xì)胞用含有各種IL_6(圖19a) 3，-UTR和/或β-珠蛋白(圖19b) 3’ -UTR序列的pGL3質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ?空)質(zhì)粒一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在48小時后測量細(xì)胞裂解液的螢光素酶活性。在圖19c中，將HEK293細(xì)胞用帶有 IL-6、IL-12p40、CTR或干擾素1的3'-UTR的pGL3與Zc3hl2a表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ?空)質(zhì)粒一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在48小時后測量細(xì)胞裂解液的螢光素酶活性。 圖18是IL-63，-UTR及其缺失構(gòu)建物的示意圖。小鼠IL_6mRNA在其3，-UTR 中含有5個富含腺嘌呤-尿苷的元件(ARE)(圖18) (Zhao, W.等，p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. (p38 α 通過多個富含AU 的元件穩(wěn)定化白介素 _6mRNA) J Biol Chem 沘3，1778-85 (2008))。 此外，據(jù)報道，物種之間包含約30個核苷酸的保守元件(CE)對于IL_6mRNA的去 1 急定化是重要白勺(Paschoud, S.等，Destabilization of interleukin-6 mRNA requires a putative RNA stem-loop structure, an AU-rich element, and the RNA—binding protein AUF1.(白介素_6mRNA的去穩(wěn)定化需要推定的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)、富含AU的元件和 RNA 結(jié)合蛋白 AUFl)Mol Cell Biol 26,8228-41 (2006)) 為了調(diào)查 IL-6 3，-UTR 中對于產(chǎn)生k;3hl2a響應(yīng)性來說關(guān)鍵的區(qū)域，本發(fā)明人使用了一系列含有幾個IL-6 3’ -UTR區(qū)域的螢光素酶報告構(gòu)建物(PGL3)(圖18)。當(dāng)將全長IL-6 3’ -UTR(1_403)插入到報告基因中時，與單獨使用螢光素酶報告基因時相比，螢光素酶活性降低。Zc3hUa的共表達(dá)進(jìn)一步降低了 PGL3-IL6 3’-UTR(1-403)的螢光素酶活性(圖19a)。盡管Zc3hl2a的表達(dá)不改變 PGL3-IL6 3'-UTR(1-70)和 pGL3_IL6 3，-UTR(172-403)的螢光素酶活性，但在 k3hl2a 存在下PGL3-IL6 3，-UTR(56-173)的螢光素酶活性降低。IL-6 3，-UTR(56-173)包含兩個ARE 以及 CE (圖 19a)。IL-6 3，_UTR(122_197)不被 k3hl2a 去穩(wěn)定化，表明 ARE 對于 IL_6mRNA 的ZC3hUa介導(dǎo)去穩(wěn)定化不是關(guān)鍵的。相反，不含任何ARE的IL-6 3，-UTR(1-142)被表達(dá)去穩(wěn)定化(圖19a)。通過使用一組具有縮短的IL-6 3'-UTR的螢光素酶報告構(gòu)建物，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IL-6 (1-102)而不是IL-6(l-92)被去穩(wěn)定化(圖20)。圖 20是IL-6 3’-UTR及其缺失構(gòu)建物的示意圖。盡管pGL3_β -珠蛋白3’-UTR的螢光素酶活性不受&汕1加表達(dá)的影響，但向β-珠蛋白3，-UTR添加IL-6 3，-UTR (77-108)賦予了對Zc3hl2a的響應(yīng)性(圖19b)。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，IL-6 3'-UTR的CE對于Zc3hl2a介導(dǎo)的mRNA去穩(wěn)定化是重要的。ZC3hUa的表達(dá)降低了具有IL_12p40和降鈣素受體(CTR) 的3’ -UTR的報告基因的螢光素酶活性，但是不降低具有干擾素-Y的3’ -UTR的報告基因的螢光素酶活性(圖19c)，表明IL-6、IL-12p40和CTR mRNA受到ZC3hUa直接調(diào)控。干擾素-Y可能受到IL-12過表達(dá)的輔助性調(diào)控。<實施例7>接下來，本發(fā)明人調(diào)查了 ZC3hUa是否直接結(jié)合RNA。圖21是與IL_6 3’ -UTR(1-403)mRNA結(jié)合的UV交聯(lián)測定法的檢查結(jié)果。合成的ZC3hUa蛋白而不是牛血清白蛋白(BSA)與體外轉(zhuǎn)錄的11^-63，-肌1 (1-403)1 離結(jié)合，表明^^111加具有1 離結(jié)合能力(圖21)。<實施例8>CCCH Zf基序在IL_6mRNA去穩(wěn)定化中的作用本發(fā)明人測試了 Zc3hlh的CCCH序列對其在IL_6mRNA崩解中的作用是否是關(guān)鍵的。圖 2 是在用 pTREtight-IL6-CDS+3，-UTR 與各種不同量的編碼 Flag-Zc3hUa 或其突變體(C306R或ACCCH)的表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染、并用Dox處理指定時間長度的HEK293 Tet-off細(xì)胞中IL-6表達(dá)的Northern印跡分析結(jié)果。圖22b顯示了通過免疫印跡測定的 Zc3hl2a突變體蛋白的表達(dá)水平。圖22b中的箭頭指示表達(dá)的k;3hl2a蛋白。圖 23a 是在用 pTREtight_IL6_CDS+3，-UTR 與編碼 Flag4c3hl2a 或其突變體 (C306R或ACCCH)的表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染、并用Dox處理指定時間長度的HEK293 Tet-off 細(xì)胞中IL-6表達(dá)的Northern印跡分析結(jié)果。對放射自顯影圖進(jìn)行定量，并使用IL-6與Actb 的比率來確定剩余的mRNA水平(圖23b)。圖23c是^^hlh突變體蛋白的表達(dá)水平的免疫印跡結(jié)果。在CCCH zf結(jié)構(gòu)域中含有C306R突變的^^hUa和不具有CCCH結(jié)構(gòu)域(缺少 306-322位氨基酸)的k;3hl2a的表達(dá)，仍然能夠使IL_6mRNA去穩(wěn)定化(圖23a至23c)， 即使這些突變體蛋白當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)量低時降解IL-6mRNA的能力降低(圖22)。這些結(jié)果表明 CCCH基序在IL-6mRNA崩解的控制中發(fā)揮作用。
小鼠和人類k;3hl2a中N-端和CCCH結(jié)構(gòu)域的序列比對顯示在圖24中。在圖M 中，著色的部分是共有序列。黑點(·)表示在其他PIN結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中保守的天冬酰胺殘基，星號表示CCCH鋅指。序列比對表明在&池1加中剛好位于zf結(jié)構(gòu)域(300-324)之前的保守N-端結(jié)構(gòu)域(139-297)與PIN結(jié)構(gòu)域樣SCOP超家族共有遙遠(yuǎn)的同源性(圖。結(jié)構(gòu)建模以及隨后與其他PIN結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的比對，揭示出由Asp 141、Asn 144、Asp 226、Asp 244和Asp 248形成的保守的、帶負(fù)電的袋，對于鎂結(jié)合和酶活性有潛在的重要性(圖對和 25)。圖25是通過結(jié)構(gòu)建模產(chǎn)生的的N-端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型。圖沈和27是k;3hl2a的內(nèi)切核糖核酸酶活性的測量結(jié)果。在這些實驗中，將合成的RNA與預(yù)定量(不同量)的蛋白溫育。在圖263至沈(、273和27b中，左邊的道是RNA 尺寸標(biāo)志物。合成的的表達(dá)水平顯示在圖^a中，在存在或不存在5mMMg2+的情況下k3hl2a降解IL-6 3’ -UTR mRNA (1-403)的核糖核酸酶活性顯示在圖洸b中，Zc3hl2a ^P Zc3hl2a(D141N)蛋白的核糖核酸酶活性顯示在圖26c中。圖27a是5，-或3，-末端標(biāo)記的IL-6 3，-UTR mRNA(1-403)用各種不同量的重組蛋白進(jìn)行的體外切割測定的結(jié)果。圖27b是的核糖核酸酶活性的動力學(xué)分析結(jié)果。在圖27顯示的實驗中，將5’-或3’-末端標(biāo)記的IL-6 3'-UTR mRNA(1-403) 與重組k;3hl2a蛋白溫育指定時間長度。圖^a是IL-6表達(dá)的Northern印跡分析結(jié)果。將HEK293 Tet-off細(xì)胞用 pTREtight-IL6 full與k3hl2a(D141N) —起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后將細(xì)胞用Dox處理指定時間長度，并通過Northern印跡分析測量IL-6的表達(dá)。圖28b是顯示了剩余mRNA水平的時間過程的圖。從這些結(jié)果，發(fā)明人推測Zc3hlh蛋白的N-端結(jié)構(gòu)域可能是核糖核酸酶，并且合成的蛋白以Mg2+依賴性方式顯示出對IL-63，-UTR(1-403)mRNA的核糖核酸酶活性 (圖26a和^b)。Zc3hlh以相似的動力學(xué)降解5’ -標(biāo)記的RNA和3’ -標(biāo)記的RNA，表明
具有內(nèi)切核酸酶活性(圖27)。Zc3hl2a的活性在體外看來很大程度上是序列不依賴性的，因為具有各種不同序列的靶RNA幾乎完全被降解(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，Zc3hl2a D141N突變體不降解RNA，表明保守的袋確實起到核糖核酸酶活性位點的作用(圖26a和 26c)。k;3hl2aD141N突變體不能使含有IL-6 3'-UTR的RNA去穩(wěn)定化，表明核糖核酸酶活性對于Zc3hl2a的功能是必需的(圖23a和28)。〈結(jié)論〉這些實驗結(jié)果清楚地證明了 ZC3hUa對于抑制導(dǎo)致小鼠死亡的嚴(yán)重自體免疫疾病的發(fā)生來說是必需的。在&池12￡1+巨噬細(xì)胞中，由于mRNA崩解失效，IL-6和IL_12p40 的生產(chǎn)增加，但是TNF的生產(chǎn)沒有增加。已經(jīng)顯示，CCCH型鋅指蛋白通過與3’-UTR結(jié)合而控制 mRNA 崩解。例如，tristetraprolin (TTP)及其同源物 Zfp3611、Zfp3612 和 Zfp3613 對于 TNF、GM-CSF、QCCLl 等的mRNA 的崩解來說是關(guān)鍵的(Anderson，P. Post-transcriptional control of cytokine production.(細(xì)胞因子生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄后控制)Nat Immunol 9， 353-9(2008)；禾口 Datta，S.等，Tristetraprolin regulates CXCLl(KC)mRNA stability. (Tristetraprolin 調(diào)控 CXCLl (KC)mRNA 的穩(wěn)定性)J Immunol 180，2545-52 (2008))。老年TTP+小鼠由于TNF的產(chǎn)生發(fā)生自體免疫性關(guān)節(jié)炎(Taylor, G. Α.等，A pathogenetic role for TNF alpha in the syndrome of cachexia, arthritis, and autoimmunityresulting from tristetraprolin(TTP) deficiency. (TNF-α 在 tristetraprolin(TTP) 缺陷引起的惡病質(zhì)、關(guān)節(jié)炎和自體免疫綜合征中的病理作用)Immunity 4,445-54(1996)). 然而，沒有報道證明TTP+細(xì)胞響應(yīng)TLR刺激產(chǎn)生增加量的IL-6。有趣的是，失去k;3hl2a 不影響巨噬細(xì)胞中TNF mRNA的表達(dá)，表明TTP和Zc3hUa控制不同細(xì)胞因子的mRNA崩解。Zc3hlh靶向ARE之外的RNA序列，并且IL-6ARE看來受到未知的不依賴于的機(jī)制的調(diào)控。考慮到在&池123+小鼠中觀察到的意義深遠(yuǎn)的病理發(fā)現(xiàn)，IL-6和IL12p40 之外的基因也可能關(guān)鍵性地參與病理發(fā)生。鑒定對其他刺激做出響應(yīng)或其他細(xì)胞類型中的靶基因，將增進(jìn)我們對在小鼠中觀察到的異常現(xiàn)象的完整機(jī)制的了解。最近報道，ZC3hUa是單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)誘導(dǎo)的蛋白(Zhou，L.等，Monocyte chemoattractant protein-linduces a novel transcription factor that causes cardiac myocyte apoptosis and ventricular dysfunction. (It亥細(xì)IfililU蛋白 1 i秀導(dǎo)引起心肌細(xì)胞凋亡和心室機(jī)能障礙的新的轉(zhuǎn)錄因子)Circ Res 98，1177-85 (2006))，并且已顯示蛋白的過表達(dá)在巨噬細(xì)胞中通過抑制NF- κ B的活化來阻遏細(xì)胞因子產(chǎn)生 (Liang,J.等，A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages.(新的CCCH-鋅指蛋白家族調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的促炎性激活)J Biol Chem 283,6337-46 (2008)) 然而，本發(fā)明的實驗與該報道不一致，顯示出Zc3hUa參與mRNA崩解而不參與TNF調(diào)控。ZC3hUa蛋白具有負(fù)責(zé)IL_6mRNA崩解的內(nèi)在核糖核酸酶活性。其機(jī)制與其他ARE 介導(dǎo)的mRNA崩解途徑的調(diào)控相比是獨特的。例如，已經(jīng)顯示TTP召集脫腺苷酶以移除polyA 尾并促進(jìn)靶mRNA隨后被外切核酸酶的降解(Anderson, P.，Post-transcriptional control of cytokine production.(細(xì)胞因子生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄后控制)Nat Immunol 9，353-9 (2008))。 因此，有趣的是^池1加具有至少在體外不顯示出序列特異性的內(nèi)切核酸酶活性。靶特異性可以通過k;3hl2a的結(jié)合配偶體確定，或者可能在某些條件下具有用于降解的優(yōu)先序列。Zc3hl^i如何誘導(dǎo)mRNA崩解的機(jī)制是進(jìn)一步研究的關(guān)心課題。核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域在四個^池12家族成員中是保守的，并且該蛋白家族的同源物已在后生動物例如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(基因 ID :CG10889)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)(基因ID :C30F12. 1)中發(fā)現(xiàn)。因此，mRNA被核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域和CCCH zf結(jié)構(gòu)域的調(diào)控看來在進(jìn)化中是保守的。另一個含有CCCH zf基序的RING型遍在蛋白連接酶蛋白被稱為roquin，對于通過控制ICOS共刺激分子的表達(dá)來抑制自體免疫來說是必需的(Vinuesa，C. G.等，A RING-type ubiquitin ligase family member required to repress follicular helper T cells and autoimmunity.(抑制濾泡輔助性T細(xì)胞和自體免疫所需的RING型遍在蛋白連接酶家族成員)Nature 435,452-8 (2005)) 0 Roquin和幾種微小RNA看來共有抑制其降 M^i ICOS 3' -UTR RNA gg (Yu, D.等，Roquin represses autoimmunity by limiting inducible T-cell co-stimulator messenger RNA. (Roquin 通過限制誘導(dǎo)性 T 細(xì)胞輔刺激分子信使RNA來抑制自體免疫)Nature 450, 299-303 (2007)) 由于每種CCCH zf蛋白看來具有靶mRNA特異性，并且在哺乳動物基因組中已經(jīng)鑒定到60種CCCH類型的zf蛋白 (Liang， J.等，Genome-wide survey and expression profiling of CCCH-zinc finger family reveals a functional module in macrophage activation. (CCCH-鋒指家方矣
21的基因組廣度調(diào)查和表達(dá)；譜分析揭示出巨噬細(xì)胞活化中的功能性模塊)PLoS ONE 3， U88(K2008))，因此對于先天性免疫應(yīng)答的調(diào)控來說，控制mRNA崩解可能與控制轉(zhuǎn)錄同樣重要。
權(quán)利要求
1.免疫佐劑組合物，所述組合物包含選自ZC3hUa基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的免疫佐劑組合物，其還包含另一種免疫佐劑。
3.疫苗組合物，所述組合物包含疫苗抗原以及選自ZC3hUa基因抑制劑和^^hlh蛋白抑制劑的至少一種。
4.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其還包含另一種免疫佐劑。
5.對動物進(jìn)行免疫的方法，所述方法包含向動物給藥權(quán)利要求3的疫苗組合物。
6.活化的免疫細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述方法包含將從對象收獲的免疫細(xì)胞與選自 Zc3hl2a基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種進(jìn)行接觸、從而活化免疫細(xì)胞的步馬聚ο
7.通過權(quán)利要求6的方法生產(chǎn)的活化的免疫細(xì)胞。
8.用于增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性的化合物，所述化合物是選自Zc3hl^i基因抑制劑和 Zc3hl2a蛋白抑制劑的至少一種。
9.化合物在生產(chǎn)免疫佐劑中的應(yīng)用，所述化合物是選自Zc3hl^i基因抑制劑和 Zc3hl2a蛋白抑制劑的至少一種。
10.用于增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性的方法，所述方法包含將疫苗抗原與選自Zc3hl^i 基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種進(jìn)行混合的步驟。
11.用于活化免疫力的組合物，所述組合物包含疫苗抗原以及選自Zc3hl^i基因抑制劑和ZC3hUa蛋白抑制劑的至少一種。
12.包含疫苗抗原以及選自ZC3hUa基因抑制劑和蛋白抑制劑的至少一種的組合物在生產(chǎn)疫苗組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含選自Zc3h12a基因抑制劑和Zc3h12a蛋白抑制劑的至少一種組分作為活性成分的組合物。該組合物可以用作免疫佐劑。
文檔編號C12N5/10GK102378633SQ201080009788
公開日2012年3月14日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者審良靜男, 松下一史, 石井健, 竹內(nèi)理 申請人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué)