專利名稱：酮化合物的立體選擇性的酶促還原的方法
酮化合物的立體選擇性的酶促還原的方法本發(fā)明涉及酮化合物至對應(yīng)的手性羥基化合物的立體選擇性的、尤其是對映選擇性的酶促還原的方法，其中用對映選擇性的、NADH-特異性的氧化還原酶還原酮化合物。本發(fā)明具體地涉及選出的氧化還原酶在該方法中的應(yīng)用。光學(xué)活性的羥基化合物是有價值的手性結(jié)構(gòu)單元，被廣泛地用于合成藥理學(xué)活性的化合物、芳族物質(zhì)、信息素、農(nóng)用化學(xué)品和酶抑制劑。因此，在制藥領(lǐng)域中可以特別地發(fā)現(xiàn)對手性化合物、和因而對手性合成技術(shù)的日益增加的需要，因為在將來，外消旋的化合物難以用作藥品。前手性的酮化合物的不對稱還原是立體選擇性的催化的一個領(lǐng)域，其中與化學(xué)催化相比，生物催化構(gòu)成有力的競爭技術(shù)。不對稱的化學(xué)氫化需要使用高毒性的且環(huán)境有害的重金屬催化劑、極端的且因而能源密集的反應(yīng)條件、以及大量有機溶劑。此外，這些方法經(jīng)常以副反應(yīng)和不足的對映體過量為特征。在自然界，前手性的酮化合物至羥基化合物的還原和逆轉(zhuǎn)進行的氧化發(fā)生在許多生化途徑中，在初級代謝中和在次級代謝中，在每個生物體中，且由不同類型的仲醇脫氫酶 (ADH)和氧化還原酶催化。一般而言，這些酶是輔因子依賴性的。在不同的測序計劃中，在每種情況下，已經(jīng)鑒別出不同生物體的許多氨基酸序列， 其中它們大抵涉及未知活性、功能和對映選擇性和化學(xué)選擇性的氧化還原酶。最近，基于許多實例，可以證實氧化還原酶用于工業(yè)過程的原則適用性。最近，已經(jīng)能夠證實，分離的氧化還原酶在含有有機溶劑的含水/有機兩相系統(tǒng)中的應(yīng)用，也是非常有效的、經(jīng)濟的和即使在高濃度(> 5%)也是可行的。在描述的系統(tǒng)中， 通常難溶于水的要還原的酮化合物因而與有機溶劑一起形成有機相。另外，可以部分地省掉有機溶劑本身。在該情況下，有機相由要還原的酮化合物形成(EP 1 383 899)。通過同時進行的仲醇氧化，實現(xiàn)輔酶再生，為此，在大多數(shù)情況下，使用廉價的水混溶的2-丙醇(W0 2006/087235)。2-甲基_4_戊醇或2-辛醇用于再生輔因子NADH或NADPH同樣是有利的 (W0 2007/036257)。在近年來的專利文獻中，可以發(fā)現(xiàn)許多具有不同特異性和選擇性的氧化還原酶。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S-特異性的氧化還原酶和具有高對映選擇性的脫氫酶的不同實例，它們幾乎毫無例外地使用NADH作為輔因子，因而可以非常經(jīng)濟地用于上述工藝條件下。這樣的S-特異性的氧化還原酶的實例是來自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis ) (CPCR) (US 5，523，223 和 US 5，763，236; EnzymeMicrob. Technol. 1993 年 11 月；15(11):950-8) 和莢膜畢赤酵母O0ZcAia capsulata) (DE 10327454. 4)的羰基還原酶，來自紅串紅球菌 {Rhodococcus erythropolis) (RECR) (US 5，523，223)、褐色諾卡氏菌GVorcart/ia fusca) (Biosci. Biotechnol. Biochem. , 63(10) (1999)，第 1721-1729 頁；Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003年9月；62(4) :380-6; 2003年4月洸日電子出版物)和赤紅球菌 (.Rhodococcus ruber) (J. Org. Chem. 2003 年 1 月 24 日；68 O) 402-6)的羰基還原 BS° 此夕卜，描述了來自/PAot/oio/Y^/a muciIlaginosa>WtfMM (.Microbacterium spec.)、 Gordonia /Y/^ri/ 6 rii/7cia、豐對干畢赤酵母{Pichia stipitis) %WPichia trehalophila 白勺S-特異性的羰基還原酶(W0 2007/012428) 0從乳桿菌屬(Lac ο如以7ΛΛ5)的生物體中鑒別出R-特異性的仲醇脫氫酶的實例 高加索酸奶乳桿菌(LacioAaci^Az1S kefir、(US 5，200，335)、短乳桿菌 GacioAaciBw1S brevis) (DE 19610984 Al; Acta CrystalIogr. D Biol. CrystalIogr. 2000 年 12 月； 56 Pt 12:1696-8)、稍小乳桿菌(L^c o如c27ΛΛs組·/7or)(DE 10119274)和肉色明串珠菌 Ueuconostoc carnosum) (W0 2007/012428) 所有這些酶具有下述缺點，即需要NADPH作為輔因子，所述NADPH實際上比NADH更昂貴，因而涉及相對高的工藝成本。"R-特異性的”氧化還原酶是指這樣的酶，其將未取代的羰基化合物(例如，2- 丁酮、2-辛酮或苯乙酮)還原成對應(yīng)的R-羥基化合物(即，R-2- 丁醇、R-2-辛醇和R-2-苯基乙醇)。例如，R-特異性的氧化還原酶將4-鹵素-3-氧代丁酸酯還原成S-4-鹵素-3-羥基丁酸酯?！癝-特異性的氧化還原酶”是將未取代的羰基化合物(例如，2- 丁酮、2-辛酮或苯乙酮)還原成對應(yīng)的S-羥基化合物(即，S-2- 丁醇、S-2-辛醇和S-2-苯基乙醇)的ADH。例如，S-特異性的氧化還原酶將4-鹵素-3-氧代丁酸酯還原成R-4-鹵素-3-羥基丁酸酯。在本申請中，術(shù)語”特異性的”是指，形成的對應(yīng)的對映異構(gòu)體>95%。此外，在最近的專利文獻(EP1152054 Al、WO 2007/033928、WO 2006/046455、WO 2005/033094)中，描述了來自木蘭假絲酵母magnoliae)屬的酵母的許多非特異性的NADPH-依賴性的酶。除了 NADPH-依賴性以外，它們具有下述主要缺點，即它們不能用于具有底物偶聯(lián)的輔酶再生的方法中，而是總是需要第二個酶系統(tǒng)來進行輔酶再生。使用葡萄糖作為協(xié)同底物的葡萄糖脫氫酶優(yōu)選地用于該目的。另外，這些酶具有下述缺點，即它們通常是非特異性的，即，未取代的羰基化合物(例如，2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮)的還原通常產(chǎn)生外消旋的醇；僅在例外情況下，這些酶會選擇性地工作。因此，使用這些酶，通常不可能對映選擇性地還原底物，諸如4-鹵素-3-氧代丁酸酯、3-氧代酯或脂族酮，例如，2-辛酮。僅有非常有限數(shù)目的穩(wěn)健的、NADH-依賴性的和明顯R-特異性的氧化還原酶可供使用，它們可用于具有底物偶聯(lián)的輔酶再生的方法中，使用仲醇、優(yōu)選2-丙醇作為協(xié)同底物。描述了例如來自芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)的NADH-依賴性的R-特異性的氧化還原酶(EP 1179 595 Al)。但是，它表現(xiàn)出對2-丙醇非常低的活性，因此不適用于具有底物偶聯(lián)的輔酶再生的方法。在WO 2007/012428 中，描述了來自粉狀畢赤酵母(PicAia farinosa)和 Candida nemodendra的另外2種NADH-依賴性的R-特異性的氧化還原酶。其中已經(jīng)能證實，對于來自粉狀畢赤酵母的酶，使用2-丙醇的輔酶再生也是可能的，但是僅在至多15%(v/v)異丙醇的濃度。此外，已知來自賴氏菌fcei/soflia) (US 7，172,894 B2, Biosci. Biotechnol. Biochem.，70 (2)，2006,第 418_似6 頁)和 iferasia (W0 2004/027055)的 NADH-依賴性的酶，其中至少來自賴氏菌的酶是R-特異性的，且據(jù)信能夠?qū)崿F(xiàn)底物偶聯(lián)的輔酶再生。但是，現(xiàn)在已知的氧化還原酶、尤其是明顯R-特異性的酶，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以用于開發(fā)酮化合物的立體選擇性還原的整個市場潛力。一方面，這出于下述原因關(guān)于底物范圍、最佳PH以及溫度穩(wěn)定性和溶劑穩(wěn)定性，各個酶具有非常不同的性質(zhì)，它們經(jīng)常相互補充。因此，即使相對類似的同源酶也可能對一種特定底物表現(xiàn)出完全不同的轉(zhuǎn)化行為。另一方面， 并非幾乎所有描述的酶都被克隆并可在足夠的程度上過表達，這意味著，這些酶不可用于工業(yè)用途。為了盡可能寬廣地開發(fā)酶促的不對稱氫化的合成潛力，因此必須盡可能廣泛地?fù)碛幸幌盗胁煌墓I(yè)上可利用的氧化還原酶。同時，可以清楚地限定對能有利地在工業(yè)上應(yīng)用的酶的要求。因此，本發(fā)明的目的是，鑒別和提供穩(wěn)定的、NADH-依賴性的和R-特異性的氧化還原酶，它們適用于使用底物偶聯(lián)的輔酶再生將酮化合物還原為手性醇的方法。為此目的，必須提供對仲醇、尤其是對異丙醇具有盡可能高的穩(wěn)定性的氧化還原酶。此外，要提供的酶應(yīng)當(dāng)以在大腸桿菌(Escherichia coli)中良好的表達能力(>500單位/g大腸桿菌濕生物質(zhì))為特征。由于對在大腸桿菌中的穩(wěn)定性和表達能力的高要求，在本發(fā)明中已經(jīng)假定，細(xì)菌酶比來自酵母的酶更優(yōu)選。此外，本發(fā)明的目的是，鑒別氨基酸序列或基因序列，它們是重組表達穩(wěn)定的 NADH-依賴性的、(R)-特異性的氧化還原酶，且適用于在使用酶-偶聯(lián)的輔酶再生情況下的工藝技術(shù)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的序列通常表現(xiàn)出“短鏈”脫氫酶的已知特征，例如，用于輔因子結(jié)合的N-端Rossmann卷曲(Rossmann-Fold) GxxxGxG、在位置87處的NAG-基序(其用于穩(wěn)定化中央的β-折疊片結(jié)構(gòu))和在活性中心中的由S 139、Y 152和K 156組成的高度保守的催化三聯(lián)體。為了本申請的目的，使用kore Matrix BL0SUM62，通過“多路蛋白比對算法(multi-way protein alignment algorithm) ”，對蛋白序列中的各個同源氨基酸基團進行數(shù)字分配，并使用來自Sti^ptomyces hydrogenans (登記代碼2bhd_Mrex)的 3 α，20 β -羥基固醇脫氫酶作為參照。由于在因特網(wǎng)上可得到多個具有該標(biāo)簽(Signatur)的氨基酸序列，需要定義其它特征，以便限制該序列庫。發(fā)明人因此聲明，具有所述性質(zhì)的(R)-特異性的氧化還原酶必須另外表現(xiàn)出下述序列特征和模式
在位置37處的帶負(fù)電荷的氨基酸基團
在二聚化結(jié)構(gòu)域中的2個C-端基序[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[Τ; C; L]-[A; Τ; S]-[Q; V; R; L; P]
在位置 204-208 處的 R-ADH-標(biāo)簽H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R 在位置159 (在K 156下游4個位置)處的Val或Leu 在位置178處的Asn 在位置188處的脯氨酸基團。根據(jù)該模式，從由測序計劃可得到的序列庫中，選擇沒有現(xiàn)有的功能分配的下述序列，克隆，并表征它們的功能。表 權(quán)利要求
1.酮化合物至對應(yīng)的手性羥基化合物的立體選擇性的、尤其是對映選擇性的酶促還原方法，其中用對映選擇性的、NADH-特異性的氧化還原酶還原酮化合物，其特征在于，為了還原該酮化合物，使用這樣的多肽，其在位置204-208處表現(xiàn)出R-ADH-標(biāo)簽H-[P; A]-[I; A; Q； V; L]-[G; K]-R，且它們整體表現(xiàn)出下述其它結(jié)構(gòu)特征⑴ N-端 Rossmann 卷曲 GxxxGxG ,(ii)在位置87處的NAG-基序，(iii)由S139、Y 152和K 156組成的催化三聯(lián)體，(iv)在位置37處的帶負(fù)電荷的氨基酸基團，(ν)在二聚化結(jié)構(gòu)域中的2個C-端基序[A; S]-S-F和[V; I]-DG-[G; A]-Y-[Τ; C; L]-[A; Τ; S]-[Q; V; R; L; P],(vi)在位置159(在K 156下游4個位置)處的Val或Leu，(vii)在位置178處的Asn，*(viii)在位置188處的脯氨酸基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用這樣的多肽來還原酮化合物，(a)該多肽包含氨基酸序列SEQID NO: 1至SEQ ID N0:7之一，或(b)其中，至少70%的氨基酸與氨基酸序列SEQID NO: 1至SEQ ID NO:7之一的氨基酸相同，或(c)該多肽由選自SEQID N0:8至SEQ ID NO: 14的核酸序列編碼，或(d)編碼該多肽的核酸序列在嚴(yán)格條件下與在(c)中提及的核酸序列之一雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用通式I的酮化合物，
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用通式II的二酮作為酮化合物，
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，-由氧化還原酶/脫氫酶形成的氧化的輔因子NAD被連續(xù)再生，且-具有通SI^xRyCHOH的仲醇被用于輔因子再生，其中&和&彼此獨立地是支鏈的或直鏈的C1-C8-烷基，且C總數(shù)彡3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，選自2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇和2-辛醇的醇、優(yōu)選2-丙醇分別被用作協(xié)同底物或仲醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，基于總體積，所述酮化合物以 3%-50%、優(yōu)選5%-40%、尤其是10%-30%的量使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，TTN(總轉(zhuǎn)化數(shù)=酮化合物的摩爾數(shù)/使用的輔因子的摩爾數(shù))>103。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，它是在含水有機兩相系統(tǒng)中進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，另外使用選自乙醚、叔丁基甲基醚、二異丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷和環(huán)己烷的有機溶劑。
全文摘要
在酮化合物至對應(yīng)的手性羥基化合物的立體選擇性的、尤其是對映選擇性的酶促還原方法中，其中用對映選擇性的、NADH-特異性的氧化還原酶還原酮化合物，為了還原酮化合物，使用這樣的多肽，其在位置204-208處表現(xiàn)出R-ADH-標(biāo)簽H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R，且它們整體表現(xiàn)出下述其它結(jié)構(gòu)特征(i)N-端Rossmann卷曲GxxxGxG，(ii)在位置87處的NAG-基序，(iii)由S139、Y152和K156組成的催化三聯(lián)體，(iv)在位置37處的帶負(fù)電荷的氨基酸基團，(v)在二聚化結(jié)構(gòu)域中的2個C-端基序[A;S]-S-F和[V;I]-DG-[G;A]-Y-[T;C;L]-[A;T;S]-[Q;V;R;L;P]，(vi)在位置159(在K156下游4個位置)處的Val或Leu，(vii)在位置178處的Asn，和(viii)在位置188處的脯氨酸基團。
文檔編號C12P41/00GK102341501SQ201080010291
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者古普塔 A., 辰切爾 A., 博布科瓦 M. 申請人:Iep 有限責(zé)任公司