專利名稱：使用氣體團簇離子束技術(shù)改變生物材料表面濕潤性和/或其他生物相容性特征的方法以 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于植入哺乳動物體內(nèi)的生物材料，更具體地，涉及使用離子束技術(shù)，優(yōu)選氣體團簇離子束技術(shù)，用于改變濕潤性和/或改善經(jīng)改變的生物材料的性能的方法，使得所述經(jīng)改變的生物材料1)作為用于細胞在其表面上附著的宿主；幻促進在其表面上或在材料內(nèi)部的細胞增殖；；3)促進穿過此表面以及在該表面下的細胞滲透；和/或 4)促進隨后的新組織形成。
背景技術(shù)：
氣體團簇離子束(GCIB)照射已用于表面的納米級改變。在同時待決、共同擁有的專利申請?zhí)枮?2/210，018、名稱為“使用氣體團簇離子束技術(shù)改變醫(yī)療裝置表面濕潤性特征的方法和系統(tǒng)以及由此制備的醫(yī)療裝置”的美國專利中，已表明GCIB用于改變非生物材料表面的親水性。GCIB處理在半導(dǎo)體裝置和薄膜的制造中已經(jīng)得到了充分的證明。然而，迄今為止未知的是其在大部分哺乳動物和鳥類器官系統(tǒng)內(nèi)用于改變包括肌肉骨骼系統(tǒng) (例如骨、韌帶、肌腱、肌腱套、軟骨等)的組織的生物材料表面，以及用于改變例如上皮組織和內(nèi)皮組織的其他結(jié)締組織的潛在應(yīng)用。GCIB處理在韌帶表面上產(chǎn)生的就其作為用于細胞附著的宿主結(jié)構(gòu)的性能的物理改變迄今為止是未知的。通常已知，例如成纖維細胞和成骨細胞的貼壁依賴性細胞受益于親水表面而附著、生長或充分分化，它們還偏好帶電表面。 關(guān)于親水性，液滴接觸角(droplet contact angle)可用于測量濕潤性，減小的接觸角通常意味著較親水的表面。先前已使用許多方法來增大非生物表面上的親水性或改變電荷，例如噴砂、酸蝕刻、等離子噴涂涂層、CO2激光整平以及多種形式的清洗，包括機械、超聲、等離子和化學(xué)清洗技術(shù)。其他方法包括加入表面活性劑或使用具有不同濕潤性特征的膜或涂層。先前還未證明的是通過GCIB照射制備生物材料表面，用于通過增加表面的親水性或通過改變表面電荷狀態(tài)或表面化學(xué)性質(zhì)，或者通過其他機制的增強的細胞附著。高能常規(guī)離子束，加速的帶電原子或分子，廣泛用于形成半導(dǎo)體裝置結(jié)，通過濺射改變表面以及改變薄膜性質(zhì)。不同于常規(guī)離子，氣體團簇離子由在標準溫度和壓力下為氣態(tài)的材料(例如通常地氧氣、氮氣或例如氬氣的惰性氣體，但任何可冷凝的氣體都可用來產(chǎn)生氣體團簇離子)的大量(具有幾百到幾千平均值為數(shù)千的典型分布)弱結(jié)合的原子或分子團形成，每個團簇離子共用一或多個電荷，并通過高壓(依次從約3kV到約70kV或更高)共同加速以具有高的總能量。氣體團簇離子形成并加速之后，它們的電荷狀態(tài)會改變或變得不同(甚至被中和)，它們可破裂成較小的團簇離子和/或被中和的較小的團簇，但它們傾向于保持由于先前已通過高壓加速而產(chǎn)生的相對高的總能量。氣體團簇離子束已用于處理非生物材料的表面，以達到清洗、蝕刻、整平、膜生長等目的。它們以其在多數(shù)固體材料表面上的整平效果而著稱，并且已用來整平例如鉆石、硅和金屬的材料。不同于常規(guī)(單體或分子的)離子的作用，由于每個氣體團簇離子內(nèi)大量的原子和分子，并且由于它們微弱地結(jié)合，它們撞擊表面的作用非常淺。團簇經(jīng)碰撞而分裂，相比加速的團簇的總能量，每
4個原子或分子僅攜帶相對少量eV的能量。氣體團簇離子碰撞處的瞬間溫度和壓力會非常高，可出現(xiàn)多種表面化學(xué)、刻蝕和其他作用。(例如)通過將表面的鍵暴露(從而改變表面電荷狀態(tài))和/或通過將來自氣體團簇離子的活性原子或分子結(jié)合入表面(通過使用包含例如氧、氮、碳等活性原子或分子的氣體團簇離子)，表面化學(xué)可由GCIB照射改變。然而，這些作用非常淺，即在碰撞處以下至多延伸數(shù)十埃，因此對位于淺層碰撞處以下較深部位的任何材料，沒有顯著損害。在此應(yīng)用的術(shù)語“GCIB”、“氣體團簇離子束”和“氣體團簇離子” 意為包括它們的電荷狀態(tài)隨其加速全部或部分改變(包括被中和)的加速的束和離子。術(shù)語“GCIB”和“氣體團簇離子束”意為包括包含加速的氣體團簇的所有束，盡管它們也可包含非團簇粒子。由于滲透非常淺，具有深于數(shù)十埃(數(shù)納米)的可以忽略損害或改變的這一事實，GCIB是對于本發(fā)明而言優(yōu)選的離子束。一方面，本發(fā)明提供通過使用氣體團簇離子束技術(shù)用于生物材料表面增加濕潤性和/或改變化學(xué)性質(zhì)或電荷狀態(tài)和/或改變其他物理特性的方法。另一方面，本發(fā)明提供通過使用氣體團簇離子束技術(shù)用于制備針對新的細胞生長的附著、增殖、遷移等的生物材料表面的方法，可選地，用于刺激新的細胞分化成例如骨、纖維結(jié)締組織、上皮、內(nèi)皮等組織。再一方面，本發(fā)明提供通過使用氣體團簇離子束技術(shù)，以可控方式用于增加生物材料表面的一部分的濕潤性和/或用于制備針對新的細胞生長的附著、增殖、遷移等生物材料表面的方法。又一方面，本發(fā)明提供通過使用氣體團簇離子束技術(shù)的手術(shù)可移植的生物材料， 其含有具有增加的親水性的表面或表面部分和/或含有具有針對細胞滲透提高的性能的表面和/或作為用于新細胞附著、生長和分化的宿主的表面，可選地，所述生物材料用于刺激新細胞分化為組織，例如骨、纖維結(jié)締組織、上皮、內(nèi)皮等。另一方面，本發(fā)明提供用于手術(shù)植入和/或移植物的生物材料，以及用于包含移植物中特定細胞材料的生物材料的制備和手術(shù)植入的方法，可選地，所述方法用于刺激特定的細胞材料分化為組織，例如骨、纖維結(jié)締組織、上皮、內(nèi)皮等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的前述方面以及另外和其他方面和優(yōu)勢通過以下描述的發(fā)明實現(xiàn)。本發(fā)明在生物材料表面或表面一部分上應(yīng)用氣體團簇離子束(GCIB)處理以改變其表面性質(zhì)，例如表面親水性或濕潤性的程度和/或改善表面或表面一部分的適宜性，以作為新細胞生長和/或附著到生物材料的宿主，所述生物材料包括肌肉骨骼系統(tǒng)的組織， 例如骨、韌帶、肌腱、肌腱套、軟骨等。通過使用掩蔽技術(shù)或通過控制GCIB在表面上的射入或通過控制GCIB處理的空間廣度的其他手段，可以可控的方式改變表面特性，改變期望的區(qū)域而不改變其他的區(qū)域。從而，在期望的區(qū)域促進細胞附著于生物材料(當手術(shù)植入時)，而在不適于成功的手術(shù)結(jié)果的區(qū)域不促進細胞附著。發(fā)明人已用GCIB技術(shù)處理了例如骨和韌帶(在自然和脫細胞兩種狀態(tài)下)的肌肉骨骼系統(tǒng)組織的表面，并且已發(fā)現(xiàn)某些類型的GCIB處理引起生物材料表面的親水性增加，用于細胞生長和附著的表面適宜性改善。此處提供的實例是結(jié)構(gòu)性組織，但本發(fā)明并不限于結(jié)構(gòu)性組織。
為了產(chǎn)生圖形化的表面變化，可使用遮罩或束刻寫(beam writing)技術(shù)或用于控制工件表面暴露于GCIB處理的多種其他方式，以此方式限制表面特定區(qū)域的處理或在工件不同區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生不同類型的GCIB處理。使用的遮罩可以是遮蔽工件一部分使其不受 GCIB處理的機械遮罩。實現(xiàn)圖形化的表面變化不限于使用機械遮罩。本發(fā)明提供了用于手術(shù)移植組織的方法。所述方法包含以下步驟體外培養(yǎng)來自供體的移植組織，用離子束照射移植組織的至少第一部分，以及將移植組織手術(shù)植入受體。本發(fā)明還提供了用于手術(shù)移植的另一種方法，所述方法包含以下步驟體外培養(yǎng)來自供體的移植組織，將移植組織的至少第一部分脫細胞，凍干移植組織的第一部分的至少第二部分，照射移植組織的第二部分的至少第三部分，以及將移植組織手術(shù)植入受體。所述方法還包含以下可選步驟保存移植物組織用于進一步使用，遠程傳輸移植組織用于手術(shù)移植，在移植組織的至少第三部分的至少表面上接種細胞，以及允許細胞在移植組織表面或內(nèi)部以期望的程度附著和增殖。為了更好地理解本發(fā)明，及其另外的和進一步的目的，參考附圖以及詳細說明，將在權(quán)利要求中指定其范圍。


圖1是在GCIB領(lǐng)域已知類型并且適于實施本發(fā)明的氣體團簇離子束處理系統(tǒng)的示意圖；圖2是顯示工件夾具的氣體團簇離子束處理系統(tǒng)的局部放大視圖；圖3是顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的韌帶組織的GCIB照射從而測定的液滴接觸角下降的圖表；圖4是顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的骨組織的GCIB照射從而測定的液滴接觸角下降的圖表；圖5是顯示在對照韌帶樣本上細胞生長的顯微照片；圖6是顯示在根據(jù)本發(fā)明實施例處理的韌帶樣本上提高的細胞生長的顯微照片； 以及圖7是說明有益使用本發(fā)明改善的生物材料的示例性實施例的膝關(guān)節(jié)示意圖。
具體實施例方式參考附圖中圖1，其顯示了用于表面處理的現(xiàn)有技術(shù)中已知類型的典型的氣體團簇離子束(GCIB)處理器100。盡管不限于在此說明的具體構(gòu)件，處理器100由分成三個連通室的真空容器102、源室104、離子化/加速室106以及在其中包括工件夾具150的處理室108組成，所述工件夾具能夠為了由氣體團簇離子束處理而固定工件10。在使用過程中，三個室分別被真空抽氣系統(tǒng)146a、146b和146c排空至合適的操作壓力。保存于氣缸111中的可冷凝源氣112(例如氬氣或隊)在壓力下通過氣體計量閥113 和進氣管114進入滯止室116，并通過適當成形的噴嘴110噴射入實質(zhì)上較低壓力的真空， 生成超聲氣體射流118。射流中膨脹引起的冷卻使得氣體射流118的一部分冷凝成團簇，多數(shù)由從數(shù)百至數(shù)千(或者甚至數(shù)萬)弱結(jié)合的原子或分子組成。氣體分離開口 120部分地將還未冷凝成團簇射流的氣體分子從團簇射流中分離，從而使下游區(qū)域中的壓力最小化，如此高壓力將會有害的(例如電離器122、高壓電極1 和處理室108)。合適的可冷凝的源氣體112包括但不必限于惰性氣體(例如氬氣)、氮氣、二氧化碳和氧氣。含有氣體團簇的超聲氣體射流118形成之后，團簇在電離器122中被離子化。電離器122可以是從一個或多個白熱燈絲IM產(chǎn)生熱電子，并加速和引導(dǎo)電子引起它們與氣體射流118中的氣體團簇碰撞的電子碰撞電離器，在氣體射流118中，射流穿過電離器122。 電子碰撞從團簇中噴射出電子，引起部分團簇成為正電離子化的(positively ionized) 0 一組適當加偏壓的高壓電極126從電離器122中提取團簇離子，形成束，然后以加速勢 (通常從IkV至多達數(shù)十kV)加速團簇離子并將它們集中形成具有初始軌跡(initial trajectory) 154的GCIB 128。燈絲電源136提供電壓Vf以加熱電離器燈絲124。陽極電源134提供電SVa以加速從燈絲IM發(fā)射出的熱電子，使其攻擊含有氣體射流118的團簇以產(chǎn)生離子。提取電源138提供電壓Ve以加偏壓于高壓電極，從電離器122的電離區(qū)域提取離子并形成GCIB 128。加速電源140提供電壓VA。。以相對于電離器122加偏壓于高壓電極，從而產(chǎn)生等同于Va。。伏特(V)的總GCIB加速勢?？商峁┮粋€或多個透鏡電源(例如 142和144)以電勢(例如Vu和ν 2)加偏壓于高壓電極來集中GCIB 128。要被GCIB處理器100處理的工件10由工件夾具150支承，布置在GCIB 128的路徑中?？墒褂每蛇x固定器12用于在工件夾具150的附著位置上固定工件10，該固定器可以是夾子或夾鉗或其他固定設(shè)備(retaining item)。為了均勻處理工件10，工件夾具150設(shè)計為以下述方式適當?shù)夭倏v工件10，以符合均勻處理的要求。還參照圖2，任何非平面的，可以是球形或杯形、圓形、不規(guī)則、或其他非平面形態(tài) (可在生物材料中遇到)的工件表面，可關(guān)于束的入射在一系列角度范圍內(nèi)取向以獲得工件表面的最佳GCIB處理。這用到工件夾具150，其具有充分鉸接(articulated)以使所有要被處理的非平面的表面以與GCIB適當對齊而取向，以提供處理最佳化和均勻化的能力。 更具體地，當正被處理的工件10是非平面時，工件夾具150可由位于GCIB處理器100末端的機構(gòu)152旋轉(zhuǎn)和鉸接。鉸接/旋轉(zhuǎn)機構(gòu)152優(yōu)選地允許參照長軸155 (其可與GCIB 128 的初始軌跡154同軸)的360度的設(shè)備旋轉(zhuǎn)，以及參照垂直于軸155的軸157的充分鉸接， 以使工件表面保持在期望的束入射范圍內(nèi)。在某些情況下，取決于工件10的尺寸，需要掃描系統(tǒng)以產(chǎn)生大號工件的均勻照射。盡管對于GCIB處理是不必要的，可利用兩對正交取向的靜電掃描板130和132在廣大的處理區(qū)域上產(chǎn)生光柵或其他掃描圖樣。當實施這樣的束掃描時，掃描發(fā)生器156分別通過一對導(dǎo)線158和160向一對掃描板130和132提供X-軸和Y-軸掃描信號電壓。所述掃描信號電壓是引起GCIB 1 轉(zhuǎn)化成掃描的GCIB 148的不同頻率的普通三角形波，GCIB 148掃描工件10的整個表面。當不需要廣大區(qū)域上的束掃描時，處理通常局限在由束的直徑定義的區(qū)域。在工件表面的束的直徑可以通過選擇一或多個透鏡電源(例如顯示的142和144)的電壓(Vu 和/或U設(shè)置，以在工件處提供期望的束直徑。盡管沒有具體顯示，在圖1和圖2中，這樣的現(xiàn)有技術(shù)的GCIB處理系統(tǒng)典型地使用傳感器和電路用于測量和控制對于處理重要的 GCIB參數(shù)(例如加速勢、束流、束斑(beam focus)、氣體流、施加到工件上的束劑量、工件操縱等)，還使用額外的控制與自動控制用于自動處理和處理配方管理、選擇和控制。盡管圖1和2顯示了適于支持和操縱某些類型的平面的和簡單成形的非平面的工件的工件夾具以及操縱器，對于那些熟悉現(xiàn)有技術(shù)的來說會理解的是其他類型的簡單的和更加復(fù)雜的夾具和操縱器是已知的。例如，授予柯克帕特里克(Kirkpatrick)等的美國專利US 6，676，989教導(dǎo)了優(yōu)化用于處理例如血管支架的管狀或圓柱狀工件的夾具和操縱器。用于將生物材料的多個表面暴露給GCIB照射的操縱器對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會是已知的和/或使用普通技術(shù)可容易構(gòu)造的。實施試驗以確定對于生物材料的GCIB照射對液滴接觸角(作為親水性量度)的作用。使用小豬膝蓋獲取內(nèi)側(cè)副韌帶(MCL)和外側(cè)副韌帶(LCL)以及股骨干。仔細地將韌帶從其他疏松組織中解剖出來，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗，切成約Icm長乘它們約5mm 自然寬的塊。骨干切成約2cm長的圓筒，并進一步沿軸向下縱切成半圓形塊。通過使用鑷子脫下骨膜從所述塊除去骨膜，然后在PBS中漂洗。骨和韌帶組織樣本(包括對照)的隨后處理是一樣的。將組織在PBS中保存過夜。然后從PBS中移走組織樣本(骨和韌帶兩者)， 單獨地引入GCIB處理系統(tǒng)的處理室。處理室被排空至約100毫托(為了達到粗真空的排空時間對于骨樣本為約30分鐘，對于韌帶樣本約2分鐘)的粗真空。達到粗真空后，樣本隨后被引入高真空，以及暴露于高真空(約6X10_5托)。然后在高真空中用GCIB照射處理骨和韌帶組織的試驗樣本。對照樣本沒有被照射但經(jīng)受同樣的真空條件和持續(xù)時間。GCIB 照射由在30kV加速勢下對照射的表面實施每cm25X IO14氬氣團簇的表面劑量構(gòu)成。照射時間和相應(yīng)的高真空暴露持續(xù)時間對于骨和韌帶組織樣本兩者是約3分鐘和20秒。GCIB照射和/或真空暴露之后，在生物安全柜中過夜風(fēng)干組織樣本。通過使用液滴形狀分析系統(tǒng)(德國漢堡Krilss GmbH,型號DSA-10，具有Krilss DSA11.8版分析軟件)檢查樣本的濕潤性，所述系統(tǒng)用于確定水滴在組織樣本上的表面接觸角。對于骨和韌帶組織，照射過的樣本和未照射的對照樣本兩者進行同樣的測量。對于每次測量，將3微升去離子水液滴放置在每個表面(韌帶和骨，照射過的和未照射的對照) 上之后5秒獲取數(shù)據(jù)。所有測量在環(huán)境條件下實施，每次分析重復(fù)三次(每單個樣本上三次試驗)實施。相比未照射的對照樣本，結(jié)果顯示如由降低的接觸角所測量的對于GCIB照射過的韌帶和骨樣本親水性的增加。圖3是顯示對于GCIB照射過的和未照射過的對照樣本兩者，在韌帶組織樣本上三次測量中每次的液滴表面接觸角試驗結(jié)果的圖表300。在韌帶組織上使用去離子水的液滴接觸角測量表明對應(yīng)GCIB處理在韌帶組織上增加的親水表面。液滴接觸角從未照射的對照韌帶中的平均值55. 59+/-9. 03下降到GCIB照射過的樣本中的36. 09+/-10. 93 (變化的統(tǒng)計顯著性，ρ < 0. 004)。圖4是顯示對于GCIB照射過的和未照射過的對照樣本在骨組織樣本上三次測量中每次的液滴表面接觸角試驗結(jié)果的圖表400。在韌帶組織上使用去離子水的液滴接觸角測量表明對應(yīng)GCIB處理在韌帶組織上增加的親水表面。液滴接觸角從未照射的對照韌帶中的平均值72. 86+/-1. 47下降到GCIB照射過的樣本中的61. 42+/-1. 06 (變化的統(tǒng)計顯著性，ρ < 0. 015)。由于生物表面的GCIB處理導(dǎo)致更加親水的表面，做了額外的試驗以表明脫細胞韌帶的GCIB處理導(dǎo)致能被(例如)成纖維細胞更好地重新細胞化(re-cellularized) 的表面。使用豬的前交叉韌帶(ACL)塊，應(yīng)用公開的體外培養(yǎng)方法(羅斯《SMOtossSM)，喬什· R(Joshi R)和弗蘭克· CB(Frank CB) ；"Establishment and comparison of fibroblast cell lines from the medial collateral and anterior cruciate ligaments of the rabbi t"InVitro Cell Dev Biol 1990 ;26 :579-84.)獲取成纖維細胞。然后使用已建立方法的技術(shù)(伍德· T(WoodS T)，格拉澤· PF(Gratzer PF)； "Effectiveness of three extraction techniques in the development of a decellularized bone-anterior cruciate ligament-bone graft",Biomaterials 2005, 26 :7339-7349.)將從小豬膝蓋新鮮分離的LCL和MCL脫細胞。除了 GCIB照射，韌帶組織樣本(試驗樣本和對照兩者)隨后的處理是一樣的。脫細胞的組織在PBS中保存過夜。從PBS中移走脫細胞的組織樣本，單獨地引入GCIB處理系統(tǒng)的處理室。處理室被排空至約100毫托(為了達到粗真空的排空時間對于韌帶樣本為約 2分鐘)的粗真空。達到粗真空后，樣本隨后被引入高真空，以及暴露于高真空(約6X10—5 托)。然后在高真空中用GCIB照射處理脫細胞韌帶組織的試驗樣本。對照樣本沒有被照射但經(jīng)受同樣的真空條件和持續(xù)時間。GCIB照射由在30kV加速電下對照射的表面實施每 cm25X1014氬氣團簇的表面劑量構(gòu)成。照射時間和相應(yīng)的高真空暴露持續(xù)時間對于脫細胞韌帶組織樣本兩者(被照射的和對照)是約3分鐘和20秒。將懸浮于Sigma E1270細胞外基質(zhì)(ECM)中的約2 X IO5成纖維細胞放置在韌帶樣本的任何一面(用新細胞種植脫細胞和照射過的組織)，置于含有適當?shù)募毎L培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle Medium+10%胎牛血清+1 %青霉素/鏈霉素抗生素(由 ^witrogen提供))的管內(nèi)，允許生長18天，每3天定期換液。然后在福爾馬林中固定韌帶樣本，組織學(xué)處理，用蘇木精和曙紅染色。韌帶的顯微檢驗顯示了，相比那些沒有GCIB處理的對照，在接受GCIB處理的韌帶樣本上的高度提高的細胞附著和增殖。圖5顯示表明如上述處理的脫細胞豬韌帶組織504的未照射的對照樣本的表面區(qū)域502的顯微照片500，上述處理包括真空暴露，但沒有GCIB照射?？梢娦律L的成纖維細胞的1-至2-細胞層506附著于下面的韌帶組織504。圖6顯示表明如上述處理的脫細胞豬韌帶組織604GCIB照射過的樣本的表面區(qū)域 602的顯微照片600，上述處理包括真空暴露和GCIB照射。圖6中的放大倍率與圖5中的相同。在圖6中，可見新生長的成纖維細胞的3-至7-細胞層606在照射表面附著于下面的韌帶組織604。此外，可見大量新的成纖維細胞(例如608A、608B和608C)更深地嵌入脫細胞韌帶組織。新生長的成纖維細胞，除了已在GCIB照射表面上增殖，已開始遷移進入韌
市ο這些結(jié)果表明脫細胞韌帶表面的GCIB照射已產(chǎn)生對于成纖維細胞在外表面上附著、生長或增殖較有利的環(huán)境，由此存在更加旺盛的表面生長和增強的進入韌帶的遷移。進入韌帶的細胞遷移在用于手術(shù)移植的韌帶組織工程領(lǐng)域是重要的進步。生物材料的GCIB 處理可引起對于手術(shù)操作(例如ACL重建)顯著改善的臨床結(jié)果。迄今，ACL重建手術(shù)(例如)隨時間推移具有有限的成功，部分由于移植的韌帶或肌腱組織相當糟糕地整合入身體。GCIB處理的韌帶或肌腱會更加快速地整合，形成更加緊密結(jié)合的整合，其擴大由傳統(tǒng)的 ACL重建手術(shù)技術(shù)實現(xiàn)的益處。通常已知的是原代細胞在體外生長時脫分化。在培養(yǎng)中可加入多種生長和有絲分裂因子以保持細胞的初始基因型和形態(tài)。除了在anvitrogen)Dulbecco’ s Modified
9Eagle Medium+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素抗生素中所發(fā)現(xiàn)的，原代人成骨細胞在沒有額外生長或有絲分裂因子的情況下在組織培養(yǎng)板中生長兩至四代。在對照狀態(tài)下或已被GCIB以每cm25X IO14氬氣團簇照射的狀態(tài)下，將二至四代成骨細胞種植在鈦上，使得成骨細胞附著并增殖1、7或10天。隨后，使用TRIzol方法(Invitrogen)從細胞中提取RNA。 采用UV-分光光度法分析定量RNA之后，使用KcriptcDNA合成試劑盒(Bio-Rad)將同等量的RNA(1微克)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。為了已知參與骨發(fā)生的多種基因的表達分析，用IOOpg 生成的cDNA執(zhí)行實時聚合鏈反應(yīng)(實時PCR)，所述基因包括已知在骨形成和礦化過程中參與的堿性磷酸酶-肝、骨、腎(ALPL)，以及已知產(chǎn)生叫做鈣素(Osteocalcin)的骨蛋白的骨 Y-羧基谷氨酸(gla)蛋白(BGLAP)，針對管家基因GAPDH進行校正。所述分析在M^One 系統(tǒng)上，由TaqMan基因表達預(yù)混液和基因特異引物(所有的來自Applied Biosystems)實施，每種條件和時間點η = 3。使用CT方法獲得相對于對照結(jié)果的倍數(shù)變化。我們已經(jīng)表明在第10天相比非GCIB-處理的鈦，生長在氬氣GCIB-處理的鈦上的成骨細胞引起ALPL 中3. 41倍數(shù)的增加以及BGLAP中2. 66倍數(shù)的增加(變化的統(tǒng)計顯著性，ρ < 0. 05)，表明成骨細胞正在經(jīng)歷會引向骨發(fā)生的分化。從而單獨的表面的GCIB處理引起在GCIB處理的表面上增殖的細胞的分化。就生物材料來說，經(jīng)常需要由GCIB照射處理材料材料僅預(yù)先選擇的部分，然而最好不照射其他部分。在這樣的情形下，控制GCIB橫截面面積以及控制GCIB的掃描和/或偏斜以限制其照射范圍至僅期望的面積可控制生物材料選擇的部分暴露于GCIB。可選地， 可使用傳統(tǒng)的遮蔽技術(shù)控制生物材料的不需要照射的遮罩表面面積，以及暴露需要照射的表面面積。隨后，用散射或掃描GCIB照射遮罩以及通過遮罩暴露的生物材料。限制GCIB 照射至生物材料的選擇區(qū)域的多種其他方法對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的，并且意為包括在本發(fā)明中。生物材料的某些第一選擇的部分可通過在那些選擇的部分上實施第一 GCIB照射而被處理。生物材料的額外選擇的部分可通過實施一或多次額外的GCIB照射過程而被處理。額外的GCIB照射處理可使用不同的GCIB和真空處理條件，例如不同的GCIB劑量、或在氣體團簇離子中不同的組成氣體、或不同的束加速勢(引起不同的離子束能量和速度)。 額外選擇的部分可以是與第一選擇的部分不同的部分，或可以部分或完全對應(yīng)第一選擇的部分，或可以包括所有的第一選擇的部分加上額外的部分。可使用這樣的選擇性處理在細胞化和在手術(shù)移植(implant或grafting)之后隨后的整合入體內(nèi)方面引起不同期望的反應(yīng)。此外，任何提供的生物材料塊還可通過單獨的GCIB照射處理被均勻處理，隨后根據(jù)手術(shù)位置、其他藥劑或其他局部因子的使用以不同的積極方式響應(yīng)手術(shù)移植過程。例如， 用于ACL替代的肌腱可由單獨的GCIB照射處理被均勻處理。當被手術(shù)移植，由于局部影響， 接觸骨的某些部分促進成骨細胞提高的遷移、附著和分化，引起骨形成，其促進肌腱整合入錨定的骨，然而其他類型的細胞優(yōu)先吸引到不接觸骨的移植肌腱的其他部分。最重要的是， 包括發(fā)現(xiàn)于滑膜囊部分(在此移植物用作替代韌帶)的韌帶成纖維細胞的成纖維細胞優(yōu)先吸引到、附著并且進入移植物。通過直接使用適當?shù)纳L和分化因子，或通過使用含有TGFii或該家族成員的去除礦物質(zhì)的骨粉，細胞再生長可有利于期望的組織類型而分化，所述生長和分化因子例如富血小板血漿(PRP)；反義導(dǎo)向分子(RGMa、RGMb和/或RGMc)；包括巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素_1和_9(IL1、IL6)或腫瘤壞死因子α (TNFa)的細胞因子；包括TGFi^ _1、TGFi^ _2、TGFi^ _3和所有的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、激活素Α、生長分化因子(GDF)和Nodal的轉(zhuǎn)化生長因子(TGFi3超家族)成員；血小板衍生生長因子(PDGF-AA、-AB&-BB)；成纖維細胞生長因子(FGFs)；類胰島素生長因子(IGFs)；表皮生長因子(EGFs)；或血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)?？蛇x地，例如通過在原位使用來自脂墊的間質(zhì)干細胞的濃縮物，所述脂墊在關(guān)節(jié)滑膜腔(joint synovial space) 中或在從受體的股骨或其他位置抽取的骨髓的白細胞層(buffy coat layer)中發(fā)現(xiàn)，促進自然地分化為局部合適組織的細胞的再生長。圖7是說明有益使用本發(fā)明改善的生物材料用于在損傷關(guān)節(jié)中韌帶替代的示例性實施例的膝關(guān)節(jié)示意圖700。為說明目的顯示所述示意圖，其沒有必然地按照比例繪制。 膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶(ACL)斷裂是經(jīng)常需要替代損傷的ACL的手術(shù)移植的損傷。韌帶或肌腱或其一部分可作為替代移植物。移植物可以來于自體、同種異體或異種組織。存在多種傳統(tǒng)的手術(shù)修復(fù)技術(shù)。一種改善的方法使用脫細胞的、凍干的、GCIB照射過的圖7中標示作為移植物718的肌腱或韌帶組織。示意圖700顯示了在膝關(guān)節(jié)中ACL替代移植物的截面圖。股骨702的下端具有股骨軟骨706。脛骨704的上端具有脛骨軟骨708。軟骨706和軟骨708形成膝關(guān)節(jié)的鉸接接觸表面。股骨702和脛骨704的斷面線區(qū)域分別表示股骨702 和脛骨704的切斷面(僅為說明目的，非手術(shù)切斷)。為了方便，所述斷面顯示穿過替代移植物718所在的平面。通道710和712分別在股骨702和脛骨704中鉆出，還穿透骨之間的脛骨軟骨708和股骨軟骨706?？梢允褂枚喾N通道形態(tài)，通道710和712顯示的形態(tài)僅意為示例。為了簡要沒有顯示膝蓋骨，并且二者都不是圍繞關(guān)節(jié)以及保留沐浴關(guān)節(jié)的所有內(nèi)部表面的滑液的滑膜囊。本發(fā)明的替代移植物718被放置進通道710和712，分別由緊固件 714和716固定在股骨端和脛骨端?？梢允褂枚喾N緊固件和固定技術(shù)(包括金屬和生物可降解聚合物緊固件)的任何一個，緊固件714和716僅意為示例性的。移植物718具有插入和保留在股骨通道710中的股骨插入部分722以及具有插入和保留在脛骨通道中的脛骨插入部分720。在一實施例中，在手術(shù)放置和在關(guān)節(jié)中固定之前沒有重建脫細胞的、凍干的、GCIB 照射過的移植物718的組織。沐浴關(guān)節(jié)的滑液(未顯示)接觸包括股骨插入部分722和脛骨插入部分720的移植物718。滑液中的成纖維細胞(或存在于損傷和破壞的ACL的殘余纖維內(nèi))接觸移植物718，附著于移植物718，并在移植物718內(nèi)增殖。這些成纖維細胞生長，分化成適當?shù)捻g帶成纖維細胞，并最終重建健康的組織。在移植物718的股骨插入部分 722和脛骨插入部分720，移植物在此接觸脛骨中通道712和股骨中通道710的骨，所述插入部分720和722接觸含有血和骨的成骨細胞前體的骨組織。成骨細胞在移植物718的插入部分720和722的表面上擴展、附著、增殖，并分化成最終完全重塑和替代在移植物718 的插入部分720和722中的移植物結(jié)構(gòu)的骨組織。在另一實施例中，在手術(shù)放置移植物718之前，將成為插入部分720和722的移植物的部分和/或不和骨一起插入的移植物部分可由添加適當?shù)纳L和分化因子處理，所述生長和分化因子例如富血小板血漿(PRP)；反義導(dǎo)向分子(RGMa、RGMb和/或RGMc)；包括巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素_1和-9(IL1、IL6)或腫瘤壞死因子α (TNF)的細胞因子；包括TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3 和所有的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、激活素Α、生長分化因子(GDF)和Nodal的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF β超家族)成員；血小板衍生生長因子(PDGF-AA、-ΑΒ&-ΒΒ)；成纖維細胞生長因子 (FGFs)；類胰島素生長因子(IGFs)；表皮生長因子(EGFs)；或血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)。 可選地，例如通過在原位使用來自脂墊的間質(zhì)干細胞的濃縮物，所述脂墊在關(guān)節(jié)滑膜腔 (joint synovial space)中或在從受體的股骨或其他位置抽取的骨髓的白細胞層(buffy coat layer)中發(fā)現(xiàn)，促進自然地分化為局部合適組織的細胞的再生長，例如促進在插入部分720和722中附著和增殖的細胞趨向產(chǎn)生健康骨而分化。在另一實施例中，去除礦物質(zhì)的骨插入到通道710和712中，并與移植物718的插入部分722和720接觸以促進在插入部分720和722中附著和增殖的細胞趨向產(chǎn)生健康骨而分化，所述去除礦物質(zhì)的骨包含骨膠原和骨的其他非礦物成分，并可選擇地包括TGF-β 或其家族成員。在另一實施例中，將來自脂墊的干細胞原位施加到移植物718的插入部分720和 722以促進在插入部分720和722中附著和增殖的細胞趨向產(chǎn)生健康骨而分化，所述脂墊在關(guān)節(jié)滑膜腔(joint synovial space)中或在從受體的股骨或其他位置抽取的骨髓的白細胞層(buffy coat layer)中發(fā)現(xiàn)。盡管本發(fā)明為示例的目的已在此就包括骨、韌帶和肌腱的某些材料進行了說明， 可理解的是其他生物材料包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。盡管示例性實施例已就ACL關(guān)節(jié)修復(fù)進行了說明，可理解的是多種其他的關(guān)節(jié)和軟組織移植物受益于本發(fā)明，并意為包括在本發(fā)明內(nèi)。盡管本發(fā)明實施例已就新鮮的豬組織進行了教導(dǎo)，對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來說容易理解的是所使用的技術(shù)還可以常規(guī)變化其他組織進行使用，所述其他組織包括來自鳥類和包括人的其他哺乳動物的組織，并且發(fā)明人已通過實驗證實可用冰凍的和/或凍干的外植體組織以及新鮮的組織有益地使用本發(fā)明方法，具有相當?shù)慕Y(jié)果。使用對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法容易地凍干肌腱和韌帶組織。凍干的組織具有數(shù)個優(yōu)點，因此在本發(fā)明技術(shù)的諸多潛在應(yīng)用中是優(yōu)選的。由于這樣凍干的組織比新鮮或冰凍的組織釋放更少的水汽，在制備方面和在處理的離子照射階段過程中，凍干的組織在離子束照射工具上呈現(xiàn)較小的裝載量。此外，凍干的組織可以針對照射之后的重要時期沒有降解地保存，能夠以低成本傳統(tǒng)的運輸方法容易地運送或運輸至遠的地點用于手術(shù)移植。凍干的、照射過的組織可稍后在手術(shù)移植之前不久在手術(shù)操作地點被重建(例如用生理鹽水或用受體的體液或其他合適的液體)。同樣地，凍干的、照射過的組織可在手術(shù)移植之前不久在手術(shù)操作地點用細胞進行種植。甚至可以用來自受體身體的含有細胞的體液進行重建和細胞種植以增加移植物的相容性?？蛇x地，凍干的、照射過的組織能夠在凍干狀態(tài)下手術(shù)移植進受體，然后它們與受體的體液和細胞進行接觸，引起移植組織在移植位置的原位重建和細胞種植。通常，凍干的、照射過的組織的長保存期為移植組織的制備和成功移植的總體過程提供了相當程度的靈活性和實用性。用于以本發(fā)明方法使用的體外培養(yǎng)的移植材料可取自多種鳥和哺乳動物種類 (包括人)，通過本發(fā)明方法制備的移植材料的手術(shù)移植可以在多種哺乳動物種類(包括人)內(nèi)進行，這樣的移植物可以是根據(jù)移植組織各自的供體和受體的同種異體移植物、自體移植物或異種移植物。根據(jù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，用于獲取、培養(yǎng)和在組織(包括脫細胞組織和/或凍干的組織)上或內(nèi)種植新細胞的技術(shù)可使用來自預(yù)期移植受體或來自其他合適的供體源的細胞。在制備示例性豬的韌帶中使用的體外培養(yǎng)和脫細胞技術(shù)還可在肌腱組織上使用。因此，根據(jù)對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的技術(shù)，本發(fā)明方法可用于從供體(包括自體供體)或尸體移除肌腱、韌帶或其他組織，以脫細胞(當需要時)、 凍干(當需要時)、用特定的新細胞種植組織或為組織脫細胞用于細胞附著和增殖。通過使用照射技術(shù)，顯著提高了進入移植材料的新細胞附著和增殖成功，有助于提高移植物成功整合進受體的可能性，以及提高成功的整體醫(yī)學(xué)結(jié)果的可能性。 如在此使用，術(shù)語“生物材料”意為包括脫細胞的或自然細胞化狀態(tài) (ce 1 lularized state)下的、活的或死的、新鮮的、冰凍的、凍融的、凍干的、凍干后重建的 (lyophilized and reconstituted)、離子照射或沒有照射過的所有生物來源的組織材料， 包括但不限于包含肌腱、韌帶、骨、軟骨、軟組織和其他組織的材料。盡管本發(fā)明已就使用由特定加速勢形成和在特定劑量下實施的GCIBs進行了說明，對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可理解的是可使用其他的劑量和加速勢，這樣的變化可在GCIB照射的作用程度上產(chǎn)生變化。盡管本發(fā)明已就使用具有由氬氣組成的氣體團簇離子的GCIBs進行了說明，對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可理解的是還可有益地使用其他組分氣體和氣體混合物。這些包括惰性氣體、Ne、Ar、Xe和其他氣體，包括但不限于氣體氧氣、氮氣、二氧化碳、其他有機和無機的含碳氣體，進一步包括包含與其他氣體相混合的任何這些氣體的氣體混合物，這些變化可引起GCIB照射作用程度和類型上的變化。應(yīng)該理解的是本發(fā)明在前述說明和權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)還可納入多種更多和其他實施例。
權(quán)利要求
1.一種用于組織手術(shù)移植的方法，其特征在于，所述方法包含 體外培養(yǎng)來自供體的移植組織；使用離子束照射所述移植組織的至少第一部分；以及將所述移植組織手術(shù)植入受體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體是哺乳動物或鳥類，所述受體是哺乳動物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述移植組織是同種異體移植物、自體移植物或異種移植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述移植組織是韌帶組織或肌腱組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包含在所述照射之前凍干所述移植組幺口 /Ν ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包含在所述照射之前將所述移植組織的至少第二部分脫細胞，其中所述第一部分包含所述第二部分的至少一部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包含在所述凍干之前將所述移植組織的至少第二部分脫細胞，其中所述第一部分包含所述第二部分的至少一部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包含 獲取用于接種的細胞；以及在所述手術(shù)移植之前，將獲取的細胞接種至所述至少第一部分的至少第三部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述獲取的細胞從所述受體獲取。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包含在所述手術(shù)移植之前及所述凍干和所述照射之后，重建所述的移植組織。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，還包含在所述接種之前及所述凍干和所述照射之后，重建所述的移植組織。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述手術(shù)移植使得所述至少第二部分與來自所述受體的液體或細胞接觸，用于原位重建或接種。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包含在所述手術(shù)移植之前，將所述移植組織運輸至遠的地點用于所述手術(shù)移植。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述離子束是氣體團簇離子束。
15.一種用于手術(shù)移植的方法，其特征在于，所述方法包含 體外培養(yǎng)來自供體的移植組織；將所述移植組織的至少第一部分脫細胞；凍干所述移植組織的所述第一部分的至少第二部分；照射所述移植組織的所述第二部分的至少第三部分；可選地保存所述移植組織用于進一步的使用；可選地將所述移植組織運輸至遠的地點用于手術(shù)移植；可選地將細胞接種在所述移植組織的所述至少第三部分的至少一表面上；可選地允許所述細胞在所述移植組織表面或內(nèi)部的期望程度的附著和增殖；將所述移植組織手術(shù)植入受體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一部分或所述第二部分或所述第三部分至少具有共同的表面部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，還包含將所述移植組織暴露給包含選擇于由下述組成的組的成分的復(fù)合物 生長因子； 細胞因子； 分化因子；去除礦物質(zhì)的骨粉；以及干細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于手術(shù)移植組織的方法。該方法包含體外培養(yǎng)來自供體的移植組織，用離子束照射移植組織的至少第一部分，以及將移植組織手術(shù)植入受體的步驟。
文檔編號C12N5/07GK102348795SQ201080011665
公開日2012年2月8日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者勞倫斯·B·泰倫特, 理查德·C·什夫盧加, 約瑟夫·庫利, 肖恩·R·柯克帕特里克 申請人:艾克索喬納斯公司