專利名稱：用于產(chǎn)生戊烯二酸的方法
用于產(chǎn)生戊烯二酸的方法本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)共表達(dá)戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)的重組微生物來(lái)進(jìn)行不飽和二羧酸的生物催化產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還涉及對(duì)應(yīng)的重組宿主，適合用于制備這類宿主的重組載體、表達(dá)盒和核酸，以及利用通過(guò)該生物催化產(chǎn)生方法獲得的該二羧酸來(lái)制備聚合物，例如聚酰胺或聚酯共聚物的方法。
背景技術(shù)：
戊烯二酸是累積在患有I型戊二酸血癥的個(gè)體中的a，￠-不飽和C5 二羧酸(2-戍烯二酸)(Hoffmann GF, Zschocke J (1999) Glutaric aciduria type I :fromclinical，biochemical and molecular diversity to successful therapy. JInheritMetab Dis 22:381-391)。戊烯二酸與二胺一起可以聚合為涉及Nylon 的聚酰胺。用于戊烯二酸的生物技術(shù)產(chǎn)生的理想材料可以是可以通過(guò)糖發(fā)酵產(chǎn)生的谷氨酸?；瘜W(xué)脫氨基a-氨基酸為a，￠-不飽和酸非常困難。相反，嚴(yán)格厭氧菌發(fā)酵氨基酸球菌 (Acidaminococcus fermentans)和共生梭菌(Clostridium symbiosum)可以容易地通過(guò)a-氧代戊二酸、(R)-2-羥基戊二酸、(R)-2-羥基戊二酰輔酶A和戊烯二酰輔酶A脫氨基谷氨酸為(E)-戍烯二酸(Buckel W(2001b) Unusual enzymes involved in five pathwaysofglutamate fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 57 :263-273)。發(fā)酵氨基酸球菌和共生梭菌不適合用于戊烯二酸的產(chǎn)生，因?yàn)樗鼈兠擊然煜┒］o酶A為巴豆酰輔酶A。尚未建立起這些生物的遺傳操作。因此，不能將編碼戊烯二酰輔酶A脫羧酶的基因減弱至低水平，而徹底缺失將剝奪這些生物產(chǎn)生ATP的能力。此外，最終的目的是不從谷氨酸，而從發(fā)酵氨基酸球菌和共生梭菌不能在其上生長(zhǎng)的葡萄糖產(chǎn)生戊烯二酸。因此，本發(fā)明的目的是提供用于戊烯二酸和相關(guān)二羧酸或其對(duì)應(yīng)的鹽的發(fā)酵性生物催化產(chǎn)生的適宜方法。附圖
描述圖I顯示戊烯二酸產(chǎn)生的途徑。用1、2和3編號(hào)最后的步驟的酶。I :2_羥基戊二酸脫氫酶；2 :戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶；3 :2_羥基戊二酰輔酶A脫水酶。圖2圖示其中插入2-羥基戊二酸脫氫酶(hgdH)和戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(gctAB)(亞基A和B)的編碼序列(圖2B)的重組質(zhì)粒pACY⑶uet-1 (圖2A)的構(gòu)建。圖3圖示其中插入2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶(亞基hdgA和hgdB)及其激活蛋白(activator, hdgC)的編碼序列(圖3B)的重組質(zhì)粒pASK_IBA3plus (圖3A)的構(gòu)建。發(fā)明概述通過(guò)本發(fā)明教導(dǎo)的用于產(chǎn)生不飽和二羧酸化合物，如戊烯二酸或結(jié)構(gòu)上類似的戊烯二酸化合物(式I)的生物催化方法來(lái)解決上述問(wèn)題，該方法包括在共表達(dá)戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)的重組微生物中轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)的2-羥基取代的二羧酸，以便形成該不飽和二羧酸。例如，為了將大腸桿菌(Escherichia coli)轉(zhuǎn)化為戊烯二酸生產(chǎn)者，本發(fā)明人表達(dá)了編碼2-羥基戊二酸脫氫酶(HgdA，圖I中的I)、戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(GcdAB，2)、2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶(HgdAB，3)及其激活蛋白(HgdC，3)的六個(gè)基因。該新途徑可以在衍生自葡萄糖的a -氧代戊二酸處經(jīng)Embden-Meyerhof途徑和檸檬酸循環(huán)轉(zhuǎn)向。發(fā)明詳述I.優(yōu)選實(shí)施方案在本發(fā)明的第一實(shí)施方案中，提供用于產(chǎn)生通式I的不飽和二羧酸化合物的生物催化方法，尤其是這種化合物的E形式的生物催化方法HOOC-CH = CH-X-COOH (I)其中，X代表優(yōu)選具有1、2、3或4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、任選不飽和、任選取代的烴基；
該方法包括-在允許形成希望的產(chǎn)物的條件下，且尤其是或任選在存在輔酶A(CoA)源，如脂酰輔酶A，如C2-C6脂酰輔酶A，且尤其是乙酰輔酶A的情況下(該輔酶A源可以具有任意來(lái)源，如對(duì)該微生物而言是內(nèi)源的，即由該微生物產(chǎn)生，或者外源的，即加至該微生物或產(chǎn)生培養(yǎng)基)，和/或任選在存在形成式I的化合物所需或改善式I化合物的形成的任意其他外源或內(nèi)源因子的情況下，在共表達(dá)戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(E. C. 2. 8. 3.12)和2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)的重組微生物中轉(zhuǎn)化2-羥基取代的二羧酸III化合物，以便形成該式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III)其中X如上文所定義；-和任選各自以其鹽的形式或作為游離酸，以基本上純的立體異構(gòu)體的形式(例如Z形式或尤其是E形式)或作為立體異構(gòu)體的混合物分離該式I的化合物。在式I的化合物中，該基團(tuán)X優(yōu)選可以選自n是從I至4的整數(shù)的(CH2)n、CH =CH、CH2-C ( = 0)或 CH = C (OH)。尤其是，X 選自 CH2、C2H4' CH = CH 和 CH = C (OH)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過(guò)該重組微生物在2-羥基戊二酸脫氫酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的轉(zhuǎn)化中形成該2-羥基取代的二羧酸III :HOOC-C ( = 0) -CH2-X-COOH (II)其中X定義于上文。尤其是，該重組微生物可以也共表達(dá)該2-羥基戊二酸脫氫酶。在本發(fā)明的該方法中，將該式II的氧代-二羧酸化合物加至該重組微生物或通過(guò)該重組微生物發(fā)酵性產(chǎn)生該式II的氧代-二羧酸化合物。尤其是，本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)至少一個(gè)重組微生物，該微生物衍生自親本微生物，該親本微生物具有產(chǎn)生該式II的2-氧代-二羧酸化合物作為代謝途徑的中間產(chǎn)物的能力，還具有異源表達(dá)上述酶和蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)的能力。例如，該微生物是代謝谷氨酸和/或葡萄糖的需氧或厭氧重組菌，且該式II的化合物是通過(guò)谷氨酸(例如通過(guò)谷氨酸脫氫酶的作用)和/或葡萄糖(例如通過(guò)Embden-Meyerhof途徑和Krebs或朽1檬酸循環(huán))的生物降解形成的2-氧代戊二酸。為了進(jìn)一步輔助或改善目的產(chǎn)物的形成，和/或減少或避免否者將減少或降低由該微生物形成的目的產(chǎn)物的實(shí)際量或濃度的不希望的副產(chǎn)物或次級(jí)產(chǎn)物(通過(guò)目的產(chǎn)物的代謝形成)的形成，根據(jù)需要，可以失調(diào)涉及該谷氨酸或葡萄糖代謝的一種或多種，例如2、3、4或5種個(gè)體酶。尤其是,該代謝谷氨酸和/或葡萄糖的重組菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌，例如大腸桿菌，如菌株大腸桿菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株(Stratgene)。還可以去除負(fù)責(zé)氯霉素抗性的CodonPlus質(zhì)粒。在本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案中，該2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)包含
2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶(E.C.4.2. I.)和任選包含該酶的激活蛋白(如果為誘導(dǎo)和/或維持預(yù)期的脫水酶活性所需)。該激活蛋白可以為建立脫水酶活性所需。根據(jù)本發(fā)明，該酶和蛋白質(zhì)(戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶、激活蛋白、2-羥基戊二酸脫氫酶)具有原核或真核來(lái)源。尤其是，它們可以源自不同的微生物屬或菌株。例如，并非絕對(duì)要求用于建立脫水酶活性的脫水酶和激活蛋白源自相同的微生物屬或菌株，只要該激活蛋白與用于生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的脫水酶相配合(激活脫水酶)。在具體實(shí)施方案中，該酶和激活蛋白源自相同或不同的能夠?qū)⒐劝彼徂D(zhuǎn)化為戍烯二酸的厭氧菌。例如，該厭氧菌選自氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、梭菌屬(Clostridium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)或消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)的 細(xì)菌，尤其是發(fā)酵氨基酸球菌、共生梭菌、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、包括所有亞種的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)或不解糖消化鏈球菌(Peptostreptococcus asacch arolyticus)。尤其是，該2-羥基戊二酸脫氫酶(HgdH)包含以下中的至少一個(gè)氨基酸序列SEQ ID NO :16 (FN0487,注釋為D-乳酸脫氫酶-具核梭桿菌具核亞種(Fusobacteriumnucleatum subsp. nucleatum) ATCC 25586 ；GeneID :991766)或 SEQ ID NO :2 (1XDW_A (發(fā)酵氨基酸球菌))；或與該序列中的至少一個(gè)具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99 %序列同一性，且仍保持預(yù)期的酶活性(或功能)，即可以作為HgdH酶應(yīng)用的序列；例如，該酶可以是同二聚體，例如發(fā)酵氨基酸球菌酶；例如與來(lái)自具核梭桿菌的酶顯示61%序列同一性的發(fā)酵氨基酸球菌酶。尤其是，可以是異八聚體(a J4)的該戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(GctAB)(a)包含至少一個(gè)a (A)亞基和至少一個(gè)P (B)亞基，其中該a亞基包含SEQ IDNO 4的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該P(yáng)亞基包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為GctAB酶應(yīng)用；或(b)包含至少一個(gè)a亞基和至少一個(gè)0亞基，其中該a亞基包含SEQ IDNO 22的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該P(yáng)亞基包含SEQ ID NO :24的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為GctAB酶應(yīng)用；或(c)包含至少一個(gè)a亞基和至少一個(gè)0亞基，其中該a亞基包含SEQ IDNO :18的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該P(yáng)亞基包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為GctAB酶應(yīng)用。尤其是，可以是每個(gè)A亞基和每個(gè)B亞基中具有一個(gè)[4Fe_4S]簇的異二聚體(AB)或三聚體(ABD)的該2-羥基戊二酸輔酶A脫水酶(a)包含至少一個(gè)a (A)亞基和至少一個(gè)P (B)亞基，其中該a亞基包含SEQ IDNO 26的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該P(yáng)亞基包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為脫水酶應(yīng)用；或(b)包含至少一個(gè)a (A)亞基、至少一個(gè)@⑶亞基和至少一個(gè)8⑶亞基，其中該a亞基包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該^亞基包含SEQ IDNO 32的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該\亞基包含SEQ IDNO :34的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為脫水酶應(yīng)用；或(c)包含至少一個(gè)a亞基和至少一個(gè)0亞基，其中該a亞基包含SEQ IDNO 8的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中該P(yáng)亞基包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列或與該序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性，即可以作為脫水酶應(yīng)用。尤其是，該激活蛋白包含SEQ ID NO :12、36或38中的至少一個(gè)氨基酸序列或與該序列中的至少一個(gè)具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的活性，即可以作為脫水酶激活蛋白應(yīng)用；且可以是在兩個(gè)亞基之間具有[4Fe-4S]簇的同二聚體。
在另一具體實(shí)施方案中，該2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶來(lái)自共生梭菌(SEQ IDN0:8和/或10);而該2-羥基戊二酸脫氫酶(SEQ ID NO :2)、該戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SEQID NO :4和/或6)和該激活蛋白(SEQ IDNO 12)來(lái)自發(fā)酵氨基酸球菌；或者彼此獨(dú)立地從其衍生，并具有與親本序列至少50%同一，例如具有至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持預(yù)期的酶活性或激活蛋白活性。該蛋白質(zhì)可以以活性四級(jí)結(jié)構(gòu)的形式存在，或者可以以其活性片段或亞基的形式存在。此外，該蛋白質(zhì)和酶可以各自由核酸序列編碼，該核酸序列適合于具有產(chǎn)生該式II的2-氧代-二羧酸的能力的該微生物的密碼子選擇。此外，該蛋白質(zhì)和酶可以由包含于單個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體中的核酸序列編碼，該核酸序列可以在該載體中編碼為單個(gè)或多個(gè)拷貝。此外，該共表達(dá)的蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)對(duì)該重組微生物而言是異源的。本發(fā)明還涉及-表達(dá)盒，其包含編碼上文定義的酶或蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)不同核酸序列(即編碼通過(guò)式III的化合物產(chǎn)生式I的化合物所必需的酶/蛋白質(zhì)組(或亞組)所需的序列組(或亞組))的組合，該序列與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接；-重組載體，其包含該表達(dá)盒中的至少一個(gè)；-用至少一個(gè)這種載體轉(zhuǎn)化的重組原核或真核宿主。
尤其是，這類重組宿主具有產(chǎn)生式(II)的2-氧代-二羧酸化合物的能力，該式
(II)的2-氧代-二羧酸化合物通過(guò)由該至少一個(gè)載體編碼的該表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)轉(zhuǎn)化為式(I)的化合物。例如，該宿主可以是埃希氏菌屬的細(xì)菌的重組菌株。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備聚酰胺或聚酯的方法，該方法包括a)通過(guò)本文中所述的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物；b)分離該化合物，任選隨后氫化，以去除C = C雙鍵；和c)使步驟b)獲得的該化合物與至少一個(gè)適宜的多價(jià)可聚合胺單體或多價(jià)可聚合羥基化合物聚合。尤其是，該多胺是二胺、三胺或其混合物，且該多價(jià)羥基化合物是二醇或三醇或其 混合物。例如，可以在存在適宜的催化劑，例如酸或堿催化劑的情況下進(jìn)行該聚合反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備聚合物的方法，該方法包括a)通過(guò)上文定義的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物；b)分離該化合物；和c)使步驟b)獲得的該化合物與至少一個(gè)適宜的不飽和可聚合單體聚合。例如，可以在存在適宜的自由基引發(fā)劑的情況下進(jìn)行該聚合。適宜的共聚單體是可以應(yīng)用于自由基引發(fā)的聚合的那些，例如包含至少一個(gè)可聚合的C = C鍵的單體，如乙烯基、丙稀基和甲基丙稀基。在本文中所述的方法的另一實(shí)施方案中，為了進(jìn)一步優(yōu)化本發(fā)明的方法，可以失調(diào)(上調(diào)或下調(diào))該重組微生物中直接或間接影響式(I)、(II)或(III)的至少一種化合物的形成和/或分解的生物合成途徑的至少一個(gè)基因，例如1、2、3或4個(gè)基因。2.具體術(shù)語(yǔ)的解釋除非另有說(shuō)明，認(rèn)為表述“戊烯二酸”或表述“戊烯二酸化合物”或表述“不飽和二羧酸”或“不飽和二羧酸化合物”是同義詞。本發(fā)明獲得的(式I的)戊烯二酸或二羧酸化合物可以是游離酸的形式、該酸的部分或完全鹽(complete salt)的形式、或酸和其鹽的混合物的形式。二羧酸“鹽”包含例如金屬鹽，例如戊烯二酸鋅；該酸的一或二堿金屬鹽，如一鈉鹽、二鈉鹽、一鉀鹽和二鉀鹽；以及堿土金屬鹽，例如鈣鹽或鎂鹽。術(shù)語(yǔ)“生物催化方法”指在存在本文中定義的酶的催化活性的情況下，即在存在分離的純酶或粗酶、或含有或表達(dá)這種酶活性的整個(gè)微生物細(xì)胞的情況下進(jìn)行的任意方法。術(shù)語(yǔ)“立體特異性的”意指通過(guò)酶以至少90% ee、優(yōu)選至少95% ee、尤其是至少98% ee或至少99% ee的高對(duì)映體過(guò)量或純度形成幾種立體異構(gòu)體或?qū)τ丑w中的一種。按照下式計(jì)算ee%值ee%= [XA_XB]/[XA+XB] * 100其中，Xa和Xb分別指對(duì)映體A或B的摩爾分?jǐn)?shù)?！傲Ⅲw異構(gòu)體”的實(shí)例是E異構(gòu)體和Z異構(gòu)體或R對(duì)映體和S對(duì)映體。必須以它最廣泛的意義理解“失調(diào)”，且其包括通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的不同手段提高或降低或完全關(guān)閉酶(靶酶)活性。適宜的方法包括，例如，增加或減少基因和/或酶分子在生物中的拷貝數(shù)，或修飾影響其酶活性的酶的另一特征，然后其對(duì)所討論的代謝途徑或與該途徑偶聯(lián)的任意途徑或酶促反應(yīng)產(chǎn)生希望的作用。適宜的遺傳操作還可以包括但不限于改變或修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)(例如通過(guò)去除強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多重啟動(dòng)子)；修飾特定基因的染色體定位；改變鄰近特定基因的核酸序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子；減少特定基因的拷貝數(shù)；修飾涉及特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如調(diào)節(jié)蛋白、阻抑蛋白、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等)；或本領(lǐng)域中常規(guī)的失調(diào)特定基因的表達(dá)的其他常規(guī)手段(包括但不限于反義核酸分子的使用)；或敲除或阻斷靶蛋白的表達(dá)的其他方法?！皵U(kuò)增”的優(yōu)選方式是“向上”突變，其例如通過(guò)使用強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的基因擴(kuò)增和/或增強(qiáng)酶活性的點(diǎn)突變來(lái)提高基因活性?！叭趸钡膬?yōu)選方式是“向下”突變，其例如通過(guò)使用弱表達(dá)信號(hào)的基因缺失或破壞和/或破壞或降低酶活性的點(diǎn)突變來(lái)降低基因活性。術(shù)語(yǔ)“異源的”或“外源的”指本文中所述的序列，其由本文中定義的經(jīng)遺傳操作的微生物引入或產(chǎn)生(轉(zhuǎn)錄或翻譯)，且該微生物在該操作前不包含或不產(chǎn)生該序列。具體而言，該微生物在該操作前不包含或表達(dá)該異源酶活性，或可以包含或表達(dá)具有可比較的 活性或特異性的內(nèi)源酶，該內(nèi)源酶由不同的編碼序列或由不同氨基酸序列的酶編碼，且該內(nèi)源酶可以與該外源酶轉(zhuǎn)化相同的底物。本發(fā)明的“親本”微生物是具有產(chǎn)生式(II)的化合物作為中間產(chǎn)物的能力的任意微生物。“中間產(chǎn)物”理解為以并非必然在分析上可直接檢測(cè)的濃度在化學(xué)或生化過(guò)程期間瞬時(shí)地或持續(xù)地形成的產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^(guò)第二化學(xué)或生化反應(yīng)從該生化過(guò)程去除該“中間產(chǎn)物”?！爸亟M宿主”可以是包含克隆載體或表達(dá)載體的任意原核或真核細(xì)胞。此術(shù)語(yǔ)還意在包含已在遺傳上改造為在宿主細(xì)胞的染色體或基因組中包含所克隆的基因的那些原核或真核細(xì)胞。適宜的宿主的實(shí)例見(jiàn)Sambrook等，MOLECULAR CLONING A LABORATORYMANUAL,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。術(shù)語(yǔ)“重組微生物”包含已在遺傳上對(duì)其進(jìn)行改變、修飾或改造(例如遺傳改造)，使得它與其所衍生自的天然存在的微生物或“親本”微生物相比顯示改變的、修飾的或不同的基因型和/或表現(xiàn)型(例如在遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時(shí))的微生物(例如細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等)。如本文中所使用，“基本上純的”蛋白質(zhì)或酶意指希望的純化的蛋白質(zhì)基本上游離于污染細(xì)胞成分，如通過(guò)聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)后的單一條帶所證明。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”還意在描述這樣的分子，其因本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的一個(gè)或多個(gè)純度特征或同質(zhì)性特征而是同質(zhì)的。例如，就諸如以下的參數(shù)而言，基本上純的酶或蛋白質(zhì)將在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)偏差內(nèi)顯示恒定和可再現(xiàn)的特征分子量、層析遷移、氨基酸組成、氨基酸序列、封閉或未封閉的N端、HPLC洗脫圖、生物學(xué)活性及其他這類參數(shù)。但是，該術(shù)語(yǔ)并非意在排除該酶或蛋白質(zhì)與其他化合物的人工或合成混合物。此外，該術(shù)語(yǔ)并非意在排除任選分離自重組宿主的融合蛋白質(zhì)。3.本發(fā)明的其他實(shí)施方案3. I本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明不限于明確提到的酶/蛋白質(zhì)，還擴(kuò)展至其功能等同物。
具體地公開的酶在本發(fā)明的范圍內(nèi)的“功能等同物”或“類似物”或“功能突變”是其此外還具有希望的生物學(xué)功能或活性，例如酶活性的多種多肽。例如，“功能等同物”意指這樣的酶，其在用于酶活性的測(cè)試中顯示比本文中定義的酶高或低至少1-10%、或至少20%、或至少50%、或至少75%、或至少90%的活性。本發(fā)明的“功能等同物”還尤其意指突變體，其在上文所述的氨基酸序列的至少一個(gè)序列位置中具有與具體地指出的氨基酸不同的氨基酸，但仍具有上述生物學(xué)活性之一。因此，“功能等同物”包含可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位獲得的突變體，其中所述改變可以發(fā)生在任意序列位置中，只要它們產(chǎn)生具有本發(fā)明的特性譜的突變體。如果反應(yīng)性模式在突變體和未改變的多肽間性質(zhì)上一致，即如果例如以不同的速率轉(zhuǎn)化相同的底物，則也尤其提供功能等價(jià)性。適宜的氨基酸取代的實(shí)例顯示在下表中
原始?xì)埢〈膶?shí)例
AlaSer
ArgLys
AsnGin; His
AspGlu
CysSer
GlnAsn
GluAsp
GlyPr。
HisAsn ; Gln
NeLeu; Val
LeuNe; Val
LysArg ; Gln ; Glu
MetLeu ; Ne
PheMet; Leu ; Tyr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp ; Phe
ValHe; Leu以上意義上的“功能等同物”也是所述多肽的“前體”，以及該多肽的“功能衍生物”和“鹽”。在該情況下，“前體”是多肽的具有或不具有希望的生物學(xué)活性的天然前體或合成前體。表述“鹽”意指本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子的羧基的鹽以及氨基的酸加成鹽。羧基的鹽可以以已知的方式產(chǎn)生，且包含無(wú)機(jī)鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽和鋅鹽，及與有機(jī)堿，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等的鹽。本發(fā)明還涵蓋酸加成鹽，例如與無(wú)機(jī)酸，如鹽酸或硫酸的鹽，及與有機(jī)酸，如乙酸和草酸的鹽。還可以用已知技術(shù)在功能氨基酸側(cè)基上或在它們的N端或C端產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的“功能衍生物”。這類衍生物包含例如可通過(guò)與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得的羧酸基團(tuán)的脂肪族酯、羧酸基團(tuán)的酰胺；通過(guò)與?；磻?yīng)產(chǎn)生的自由氨基的N-酰胺衍生物；或通過(guò)與?；磻?yīng)產(chǎn)生的自由羥基的0-酰基衍生物?！肮δ艿韧铩边€天然包含可以從其他生物獲得的多肽，以及天然存在的變體。例如，可以通過(guò)序列比較確定同源序列區(qū)的區(qū)域，且可以根據(jù)本發(fā)明的具體參數(shù)測(cè)定等同的酶?！肮δ艿韧铩边€包含本發(fā)明的多肽的片段，優(yōu)選單個(gè)結(jié)構(gòu)域或序列基序，其例如顯示希望的生物學(xué)功能。此外，“功能等同物”是融合蛋白質(zhì)，其具有處于功能性N端或C端結(jié)合(即無(wú)融合蛋白質(zhì)部分的實(shí)質(zhì)性相互功能缺損)中的上述多肽序列或從上述多肽序列衍生的功能等同物之一及至少一個(gè)功能上不同的其他異源序列。這些異源序列的非限制性實(shí)例是例如信號(hào)肽、組氨酸錨或酶。還包含于本發(fā)明中的“功能等同物”是具體地公開的蛋白質(zhì)的同源物。這些具有上文所述的百分比同一性值。該值指與具體地公開的氨基酸序列的同一性，且可以按照Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8)，1988, 2444-2448 的算法計(jì)算。還可以從BLAST比對(duì)、算法blastp (蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST)或通過(guò)應(yīng)用下文給出的Clustal設(shè)置來(lái)計(jì)算％同一丨I"生值。本發(fā)明的同源序列的百分比同一性尤其意指相對(duì)于本文中具體地公開的氨基酸序列之一的總長(zhǎng)度的氨基酸殘基百分比同一性。 在可能的蛋白質(zhì)糖基化的情況下，本發(fā)明的“功能等同物”包含去糖基化或糖基化形式以及可以通過(guò)改變糖基化模式獲得的修飾形式的上文指定的類型的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)誘變，例如通過(guò)蛋白質(zhì)的點(diǎn)突變、加長(zhǎng)或縮短來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的這類功能等同物或同源物?？梢酝ㄟ^(guò)篩選突變體，例如縮短突變體的組合數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定本發(fā)明的蛋白質(zhì)的這類功能等同物或同源物。例如，可以通過(guò)核酸水平的組合誘變來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的多變數(shù)據(jù)庫(kù)，例如通過(guò)酶促連接合成的寡核苷酸的混合物。存在可以用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生可能的同源物的數(shù)據(jù)庫(kù)的許多方法?？梢栽谧詣?dòng)化DNA合成儀中進(jìn)行簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成，然后可以將合成的基因連接入適宜的表達(dá)載體。簡(jiǎn)并基因組的使用使得可能在編碼希望的可能的蛋白質(zhì)序列組的混合物中提供所有序列。簡(jiǎn)并寡核苷酸的合成方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如 Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39 :3 ;Itakura 等.(1984) Annu.Rev. Biochem. 53 :323 ;Itakura 等.(1984)Science 198 :1056 ;Ike 等.(1983)NucleicAcids Res. 11 :477)。在現(xiàn)有技術(shù)中，已知幾種用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或縮短產(chǎn)生的組合數(shù)據(jù)庫(kù)的基因產(chǎn)物，及用于以選擇的特性篩選基因產(chǎn)物的cDNA文庫(kù)的技術(shù)?？梢孕薷倪@些技術(shù)用于快速篩選通過(guò)本發(fā)明的同源物的組合誘變產(chǎn)生的基因庫(kù)?；诟咄糠治龅淖畛Ｓ糜诤Y選大基因庫(kù)的技術(shù)包括將基因庫(kù)克隆在可以復(fù)制的表達(dá)載體中，用產(chǎn)生的載體數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化適宜的細(xì)胞，并在這樣的條件下表達(dá)組合基因，在該條件中，希望活性的檢測(cè)便于載體的分離，該載體編碼檢測(cè)其產(chǎn)物的基因。為了鑒定同源物，可以將提高功能突變體在數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率的技術(shù)Recursive Ensemble Mutagenesis (REM)與篩選測(cè)試組合使用(Arkin和 Yourvan(1992)PNAS 89 :7811-7815 ;Delgrave 等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。3. 2編碼核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本文中定義的酶/蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還涉及與本文中明確公開的序列具有某種程度的“同一性”的核酸。兩個(gè)核酸間的“同一性”意指每種情況下核酸全長(zhǎng)內(nèi)的核苷酸同一性。例如，可以利用來(lái)自Informax(USA)公司的Vector NTI Suite 7. I程序計(jì)算同一性，該程序按以下設(shè)置利用 Clustal Method (HigginsDG, Sharp PM. Fast and sensitive
multiple sequence alignments on amicrocomputer.Comput Appl. Biosci. 1989 年 4 月；5(2) :151-1)多重比對(duì)參數(shù)
缺口開放罰分10
缺口延伸罰分10
缺口分開罰分范圍8 缺口分開罰分關(guān) 比對(duì)延遲的％同一性40
殘基特異性缺口關(guān)
親水殘基缺口關(guān)
轉(zhuǎn)換權(quán)重0配對(duì)比對(duì)參數(shù)
FAST算法開
K 元組大小(tuplesize)I
缺口罰分3
窗口大小5
最佳對(duì)角線的數(shù)目5備選地，可以按照Chenna、Ramu、Sugawara、Hideaki、Koike、Tadashi、Lopez、Rodrigo、Gibson、Toby J、Higgins、Desmond G、Thompson、Julie D. Multiple sequencealignment with the Clustal series ofprograms. (2003)Nucleic Acids Res 31(13)3497-500，網(wǎng)頁(yè) http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw/index, html# 和以下設(shè)置測(cè)定同
一性DNA缺口開放罰分15.0
DNA缺口延伸罰分6.66
DNA矩陣同一性
蛋白質(zhì)缺口開放罰分10.0
蛋白質(zhì)缺口延伸罰分0.2
蛋白質(zhì)矩陣Gonnet 蛋白質(zhì)/DNA ENDGAP -I
蛋白質(zhì)/DNA GAPDIST 4
可以通過(guò)從核苷酸構(gòu)件化學(xué)合成，例如通過(guò)雙螺旋的單個(gè)重疊、互補(bǔ)的核酸構(gòu)件的片段縮合，以已知的方式產(chǎn)生本文中提到的所有核酸序列(單鏈和雙鏈的DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)?？梢岳缤ㄟ^(guò)亞磷酰胺(phosphoamidite)法(Voet, Voet,第二版,Wiley Press, New York, pages 896-897),以已知的方式進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。利用DNA聚合酶的Klenow片段累積合成的寡核苷酸和填充缺口和連接反應(yīng)，以及一般的克隆技術(shù)描述于Sambrook等(1989)中，見(jiàn)下文。本發(fā)明還涉及編碼以上多肽之一的核酸序列(單鏈和雙鏈的DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)及其可以例如用人工核苷酸類似物獲得的功能等同物。本發(fā)明涉及分離的核酸分子(其編碼本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)或其具有生物學(xué)活性的片段)和核酸片段(其可以例如用作用于鑒定或擴(kuò)增本發(fā)明的編碼核酸的雜交探針或引物)二者。此外，本發(fā)明的核酸分子可以包含來(lái)自編碼遺傳區(qū)的3'和/或5'端的非翻譯序列。本發(fā)明還涉及與具體地描述的核苷酸序列或其片段互補(bǔ)的核酸分子。本發(fā)明的核苷酸序列使得可能產(chǎn)生可以用于在其他細(xì)胞類型和生物中鑒定和/或克隆同源序列的探針和引物。這類探針或引物一般包含在“嚴(yán)格”條件(見(jiàn)下文)下雜交在本發(fā)明的核酸序列的有義鏈或?qū)?yīng)的反義鏈的至少約12、優(yōu)選至少約25，例如約40、50或75個(gè)連續(xù)的核苷酸上的核苷酸序列區(qū)。“分離的”核酸分子是從該核酸的天然來(lái)源中存在的其他核酸分子分開的，此外，如果它是通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的，則可以基本上游離于其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者如果它是化學(xué)合成的，則可以游離于化學(xué)前體或其他化學(xué)品?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本發(fā)明提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子。例如，可以用具體地公開的全序列之一或其片段作為雜交探針并使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989中所述),從適宜的cDNA文庫(kù)分離cDNA。此外，可以使用根據(jù)此序列構(gòu)建的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)分離包含所公開的序列之一或其片段的核酸分子。可以將以此方式擴(kuò)增的核酸克隆入適宜的載體中，并可以通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)表征。還可以例如使用自動(dòng)化DNA合成儀，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成方法產(chǎn)生本發(fā)明的寡核苷酸。例如通過(guò)基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，可以例如通過(guò)常用的雜交技術(shù)或PCR技術(shù)從其他細(xì)菌分離本發(fā)明的核酸序列或其衍生物、這些序列的同源物或部分。這些DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件中與本發(fā)明的序列雜交?！半s交”意指多核苷酸或寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)條件中與幾乎互補(bǔ)的序列結(jié)合的能力，而在這些條件中不發(fā)生非互補(bǔ)配偶體間的非特異性結(jié)合。為此，序列可以90-100%互補(bǔ)。互補(bǔ)序列能夠相互特異性結(jié)合的特性用于例如Northern印跡或Southern印跡中、或PCR或RT-PCR中的引物結(jié)合中。有利地用保守區(qū)的短寡核苷酸進(jìn)行雜交。但是，還可能用本發(fā)明的核酸的更長(zhǎng)的片段或全序列進(jìn)行雜交。這些標(biāo)準(zhǔn)條件取決于所使用的核酸(寡核苷酸、更長(zhǎng)的片段或全序列)或取決于用哪種類型的核酸(DNA或RNA)進(jìn)行雜交而不同。例如，DNA DNA雜交體的解鏈溫度比相同長(zhǎng)度的DNA RNA雜交體的解鏈溫度低約10°C。
例如，取決于具體核酸，標(biāo)準(zhǔn)條件意指溫度在42°C和58°C之間、在具有0. I至5 X SSC (I X SSC = 0. 15 M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7. 2)間的濃度的含水緩沖溶液中或還在存在50%甲酰胺的情況下，例如42°C，在5XSSC、50%甲酰胺中。有利地，用于DNA DNA雜交體的雜交條件是0. IXSSC和約20°C至45°C間，優(yōu)選約30°C至45°C間的溫度。對(duì)于DNA RNA雜交體，雜交條件有利地是0. I X SSC和約30°C至55°C間，優(yōu)選約45°C至55°C間的溫度。這些指出的用于雜交的溫度是針對(duì)具有約100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度和50%的G+C含量的核酸計(jì)算的不存在甲酰胺的情況下的解鏈溫度值的實(shí)例。用于DNA雜交的實(shí)驗(yàn)條件描述于相關(guān)的遺傳學(xué)教科書，例如Samtoook等，1989中，且可以例如取決于核酸的長(zhǎng)度、雜交體的類型或G+C含量，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的公式計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從以下教科書獲得關(guān)于雜交的其他信息Ausubel等(編輯)，1985, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York ;Hames 和 Higgins (編輯)，1985, Nucleic AcidsHybridization A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,Oxford ;Brown (編輯)，1991, Essential Molecular Biology A Practical Approach, IRLPress at Oxford University Press, Oxford。尤其可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行“雜交”。這類雜交條件例如描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch, E. F. , Maniatis, T. Molecular Cloning (A Laboratory Manual),第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989,第 9. 31-9. 57 頁(yè)中或 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6 中。“嚴(yán)格”雜交條件尤其意指于42°C在由50%甲酰胺、5父35((7501111似(1，751111檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml變性的剪切鮭精DNA組成的溶液中過(guò)夜孵育，然后于65°C用0. IXSSC洗滌濾膜三次。本發(fā)明還涉及具體地公開或可衍生的核酸序列的衍生物。因此，本發(fā)明的其他核酸序列可以衍生自本文中明確公開的序列，并因單個(gè)或幾個(gè)核苷酸的添加、取代、插入或缺失而與它不同，且編碼具有希望的特性譜的多肽。本發(fā)明還包含含有所謂的沉默突變或與具體地指出的序列相比，已按照特殊最初生物或宿主生物的密碼子選擇改變的核酸序列，及其天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體。
它還涉及可以通過(guò)保守氨基酸取代(例如通過(guò)具有相同電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸取代所討論的氨基酸)獲得的序列。本發(fā)明還涉及通過(guò)序列多態(tài)性衍生自具體地公開的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性可以由于天然變異而在群體內(nèi)的個(gè)體間存在。這些天然變異通常在基因的核苷酸序列中產(chǎn)生1-5%的變異。本發(fā)明的核酸序列的衍生物意指例如等位基因變體，其在全序列范圍內(nèi)在所衍生的氨基酸水平具有至少60%同源性、優(yōu)選至少80%同源性、尤其優(yōu)選至少90%同源性(關(guān)于氨基酸水平的同源性，應(yīng)參考上文針對(duì)多肽給出的詳細(xì)內(nèi)容)。有利地，在序列的部分區(qū)域內(nèi)，同源性可以更高。此外，衍生物還將理解為本發(fā)明的核酸序列的同源物，例如動(dòng)物、植物、真菌或細(xì)菌的同源物，縮短的序列，編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。例如，在本文中明確公開的序列中給出的整個(gè)DNA區(qū)域內(nèi)，同源物在DNA水平具有至少40%、優(yōu)選至少60%、尤其優(yōu)選至少70%、更尤其優(yōu)選至少80%的同源性。 此外，衍生物還將理解為例如與啟動(dòng)子的融合?？梢酝ㄟ^(guò)至少一個(gè)核苷酸交換、至少一個(gè)插入、倒位和/或缺失來(lái)修飾添加至所述核酸序列的啟動(dòng)子，但不損傷該啟動(dòng)子的功能性或效力。此外，可以通過(guò)改變其序列或可以與甚至不同屬的生物的更有效的啟動(dòng)子完全交換來(lái)提高啟動(dòng)子的效力。3. 3功能突變體的制備本領(lǐng)域的讀者還意識(shí)到產(chǎn)生功能突變體的方法。取決于所應(yīng)用的技術(shù)，本領(lǐng)域的讀者可以在基因或非編碼核酸區(qū)域(其例如可以對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)具有重要性)中產(chǎn)生隨意突變或定向突變，然后可以產(chǎn)生適宜的基因文庫(kù)。因此所需的分子生物學(xué)方法都是本領(lǐng)域公知的，并例如由Sambrook和Russell，Molecular Cloning.第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 描述。對(duì)本領(lǐng)域的讀者而言，修飾基因并因而修飾編碼的蛋白質(zhì)的方法是公知的，例如-位點(diǎn)專一誘變，其中特異性取代基因的單個(gè)或多個(gè)核苷酸(Tix)WerMK(編輯)1996;In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)；-飽和誘變，其中可以在基因的任意位置中交換或添加任意氨基酸的密碼子(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994)Nucleic Acids Res22 :1593 ；BarettinoD, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22 :541 ；BarikS (1995)Mol Biotechnol 3:1);-易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中通過(guò)不正確地執(zhí)行功能的DNA聚合酶的作用突變核苷酸序列(Eckert KA, Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18 :3739)；-SeSaM法(序列飽和法(Sequence Saturation Method)),其中通過(guò)聚合酶避免優(yōu)選的取代(Schenk 等，Biospektrum,第 3 卷,2006, 277-279)；-基因在增變菌株中的傳代，例如由缺損的DNA修復(fù)機(jī)制看來(lái)，該菌株顯示核苷酸序列的增加的突變發(fā)生(GreenerA, Callahan M, Jerpseth B(1996)An efficient randommutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In Trower MK(Hrsg. ) Invitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey);或
-DNA混編，其中形成并消化一組密切相關(guān)的基因，其中用片段作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中形成全長(zhǎng)嵌合基因(Ste_er WPC(1994)Nature370 389 ；Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91 :10747)。通過(guò)應(yīng)用所謂的定向進(jìn)化技術(shù)(參見(jiàn)例如Reetz MT和Jaeger K-E (1999),Topics Curr Chem 200 31 ；Zhao H，Moore JC, Volkov AA, Arnold FH(1999), Methodsfor optimizing industrial enzymes by directed evolution, In Demain AL, DaviesJE(Hrsg. )Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Societyfor Microbiology),本領(lǐng)域的讀者將能夠特異性大規(guī)模制備功能突變體。在第一步驟中，例如通過(guò)應(yīng)用上述方法中的任一種來(lái)產(chǎn)生具體蛋白質(zhì)的文庫(kù)。然后例如通過(guò)應(yīng)用細(xì)菌或噬菌體展示系統(tǒng)來(lái)表達(dá)該文庫(kù)。可以選擇表達(dá)顯示希望的特征譜的功能突變體的那些基因，并進(jìn)行進(jìn)一步突變?？梢缘刂貜?fù)突變和選擇或篩選的步驟，直至所獲得的突變體之一顯示希望的特征譜?？梢酝ㄟ^(guò)迭代法進(jìn)行有限數(shù)目的突變，例如I至5個(gè)突變，并可以評(píng)價(jià)它們對(duì)所討 論的酶特征的影響，并可以逐步選擇進(jìn)一步改善的突變體。然后可以以基本上相同的方式對(duì)該選擇的突變體進(jìn)行進(jìn)一步突變。可以以此方式顯著減少待評(píng)價(jià)的單突變體的數(shù)目。本發(fā)明的教導(dǎo)提供關(guān)于所討論的酶/蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和序列的重要信息，根據(jù)這些信息，將可能產(chǎn)生具有希望的修飾特征譜的其他酶/蛋白質(zhì)。尤其是，可以確定所謂的熱點(diǎn)(即序列區(qū))，其潛在地可以適合進(jìn)一步突變，以修飾或產(chǎn)生希望的酶/蛋白質(zhì)特征。3. 4本發(fā)明的構(gòu)建體本發(fā)明還涉及在調(diào)節(jié)核酸序列的遺傳控制下包含編碼本發(fā)明的多肽或融合蛋白質(zhì)的核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體；以及包含這些表達(dá)構(gòu)建體中的至少一個(gè)的載體。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)單元”意指具有表達(dá)活性的核酸，其包含本文中定義，并在與待表達(dá)的核酸或基因功能性結(jié)合后調(diào)節(jié)表達(dá)(即此核酸或此基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯)的啟動(dòng)子。因此，在此背景中，它還稱為“調(diào)節(jié)核酸序列”。除啟動(dòng)子外，還可以存在其他調(diào)節(jié)元件，例如增強(qiáng)子。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建體”意指與待表達(dá)的核酸或待表達(dá)的基因功能性結(jié)合的表達(dá)單元。因此，與表達(dá)單元不同，表達(dá)盒不僅包含調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸序列，還包含將由于轉(zhuǎn)錄和翻譯而表達(dá)為蛋白質(zhì)的核酸序列。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”或“過(guò)量表達(dá)”描述由對(duì)應(yīng)的DNA編碼的微生物中的一種或多種酶的胞內(nèi)活性的產(chǎn)生或增加。為此，可能將基因插入生物中、通過(guò)另一基因取代現(xiàn)有基因、增加一個(gè)或多個(gè)基因的拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動(dòng)子或使用編碼對(duì)應(yīng)的具有高活性的酶的基因，且可以任選組合這些措施。優(yōu)選地，本發(fā)明的這類構(gòu)建體包含各編碼序列5'上游的啟動(dòng)子和3'下游的終止序列及任選包含其他常用的調(diào)節(jié)元件(在每種情況下與編碼序列功能性連接)。根據(jù)本發(fā)明，“啟動(dòng)子”、“具有啟動(dòng)子活性的核酸”或“啟動(dòng)子序列”意指與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性結(jié)合并調(diào)節(jié)此核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸。在此背景中，“功能性”或“有效”結(jié)合意指例如具有啟動(dòng)子活性的核酸之一和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列及任選其他調(diào)節(jié)元件(例如使得能夠轉(zhuǎn)錄核酸的核酸序列和例如終止子)以這樣的方式順次排列，使得各調(diào)節(jié)元件可以在核酸序列的轉(zhuǎn)錄中執(zhí)行其功能。這并非必然需要化學(xué)意義上的直接結(jié)合。遺傳控制序列，如增強(qiáng)子序列還可以從更遠(yuǎn)的位置或甚至從其他DNA分子發(fā)揮其對(duì)靶序列的功能。優(yōu)選其中將待轉(zhuǎn)錄的核酸序列放置在啟動(dòng)子序列之后(即在3'端)，使得兩個(gè)序列相互共價(jià)結(jié)合的排列。啟動(dòng)子序列和待通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列間的距離可以少于200bp (堿基對(duì))、或少于IOObp或少于50bp。除啟動(dòng)子和終止子外，可以提到的其他調(diào)節(jié)元件的實(shí)例是前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等。適宜的調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel，Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA (1990)中。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體尤其包含選自本文中明確提到的那些或其衍生物和同源物的序列，以及可以從本文中明確提到的氨基酸序列衍生的核酸序列，其有利地與用于控制(例如增加)基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號(hào)有效結(jié)合或功能性結(jié)合。除這些調(diào)節(jié)序列外，這些序列的天然調(diào)節(jié)仍然可以存在于實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因之前，并可以任選已在遺傳上改變，使得天然調(diào)節(jié)被關(guān)閉，基因的表達(dá)增加。核酸構(gòu)建體還可以具 有更簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，即無(wú)任何其他額外的調(diào)節(jié)信號(hào)插入編碼序列之前，且未去除天然啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。反而沉默天然調(diào)節(jié)序列，使得調(diào)節(jié)不再發(fā)生，并增加基因表達(dá)。優(yōu)選的核酸構(gòu)建體還有利地包含與啟動(dòng)子功能性結(jié)合的前述增強(qiáng)子序列中的一個(gè)或多個(gè)，其允許增加核酸序列的表達(dá)。還可以在DNA序列的3/端插入其他有利的序列，如其他調(diào)節(jié)元件或終止子。構(gòu)建體中可以包含本發(fā)明的核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝。構(gòu)建體還可以包含任選用于對(duì)該構(gòu)建體的選擇的其他標(biāo)記，如抗生素抗性基因或營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因。適宜的調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包含于有利地應(yīng)用于革蘭氏陰性菌中的啟動(dòng)子，如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-> lac-、lpp-lac-、IacIq、_T7_、T5_、T3_、gal-、trc-、ara_、rhaP (rhaPBAD) SP6_、A -Pr-或\ -Pl啟動(dòng)子中。其他有利的調(diào)節(jié)序列包含于例如革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子ace、amy和SP02中，酵母或真菌啟動(dòng)子ADCl、MF a、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。還可以用人工啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)。為了表達(dá),將核酸構(gòu)建體有利地在允許基因在宿主中的最佳表達(dá)的載體，例如質(zhì)?；蚴删w中插入宿主生物。除質(zhì)粒和噬菌體外,載體還將理解為意指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其他載體，例如病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒；轉(zhuǎn)座子；IS元件；噬粒；黏粒；和線狀或環(huán)狀DNA。這些載體可以在宿主生物中自主復(fù)制或可以通過(guò)染色體復(fù)制。這些載體代表本發(fā)明的另一實(shí)施方案。適宜的質(zhì)粒是，例如，在大腸桿菌中pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223_3、pDHE19. 2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113_Bl、入 gtll 或 pBdCI ;在諾卡氏菌形放線菌(Nocardioform actinomycetes)中pJAM2;在鏈霉菌屬(Streptomyces)中:pIJ101、pIJ364、pIJ702 或 pIJ361 ;在芽孢桿菌屬(Bacillus)中:pUB110、pC194 或 pBD214 ;在棒桿菌屬(Corynebacterium)中PSA77 或 pAJ667 ;在真菌中pALSl、pIL2 或 pBB116 ;在酵母中2 a M、pAG_l、YEp6、YEp13或 pEMBLYe23 ;或在植物中pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004 或 pDH51。前述質(zhì)粒代表可能的質(zhì)粒的少量選擇。其他質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并將見(jiàn)于例如書CloningVectors (Pouwels P. H 等編著，Elsevier, Amsterdam-NewYork-Oxford, 1985, ISBN 0 444904018)中。實(shí)驗(yàn)部分中還提到了其他適宜的質(zhì)粒。在載體的另一實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的核酸的載體可以有利地以線狀DNA的形式插入微生物中，并通過(guò)異源或同源重組整合入宿主生物的基因組中。此線狀DNA可以包含線性化載體如質(zhì)?；蛑皇潜景l(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸。為了異源基因在生物中的最佳表達(dá)，根據(jù)該生物中利用的具體密碼子使用改變核酸序列是有利的。可以根據(jù)所討論的生物的其他已知基因的計(jì)算機(jī)評(píng)價(jià)容易地測(cè)定密碼子使用。本發(fā)明的表達(dá)盒的產(chǎn)生基于適宜的啟動(dòng)子與適宜的編碼核苷酸序列和終止子信號(hào)或多腺苷酸化信號(hào)的融合。為此，使用常用的重組和克隆技術(shù)，如例如T. Maniatis、E.F. Fritsch 和 J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)中以及 T. J. Silhavy、M. L. Berman和 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)中和 AusubeI,F. M.等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience (1987)中所述。有利地將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入用于在適宜的宿主生物中表達(dá)的宿主特異性載體中，以允許基因在宿主中的最佳表達(dá)。載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并將見(jiàn)于例如“Cloning Vectors^(PouweIs P. H.等，Publ. Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。3. 5本發(fā)明的可以使用的宿主取決于背景，術(shù)語(yǔ)“微生物”意指起始微生物(野生型)或本發(fā)明的遺傳上修飾的微生物或二者。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“野生型”意指對(duì)應(yīng)的起始微生物，且并非必然需要對(duì)應(yīng)于天然存在的生物。利用本發(fā)明的載體，可以產(chǎn)生重組微生物，其已例如用本發(fā)明的至少一個(gè)載體轉(zhuǎn)化，且可以用于本發(fā)明的發(fā)酵性產(chǎn)生。有利地，將上文所述的本發(fā)明的重組構(gòu)建體插入適宜的宿主系統(tǒng)中并表達(dá)。優(yōu)選地，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的常用的克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，以確保所述核酸在各表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。適宜的系統(tǒng)描述于例如 Current Protocols inMolecular Biology, F. Ausubel 等，Publ. Wiley Interscience,New York 1997 或 Sambrook 等 Molecular Cloning A Laboratory Manual.第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989 中。親本微生物通常是具有從葡萄糖和/或谷氨酸產(chǎn)生戊烯二酸，尤其是(E)-戊烯二酸的能力的那些。優(yōu)選地，它們尤其是梭菌目(Clostridiales)和梭桿菌目(Fusobacteriales)的細(xì)菌。尤其是，必需提到物種發(fā)酵氨基酸球菌(DSM20731)、共生梭菌(DSM 934)、球孢梭菌(DSM 1294)、不解糖消化鏈球菌(ATCC 14963)和具核梭桿菌具核亞種(DSM 15643)。ATCC指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American type strain culturecollection),而DSM指德國(guó)微生物和細(xì)菌培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。本發(fā)明的宿主生物優(yōu)選包含本發(fā)明中描述的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體中的至少一個(gè)，其編碼上文定義的酶活性。3. 6本發(fā)明的戊烯二酸產(chǎn)物的發(fā)酵性產(chǎn)生本發(fā)明涉及用于發(fā)酵性產(chǎn)生戊烯二酸和式(I)的相關(guān)化合物的方法?？梢栽诜峙椒ㄖ谢蛟谘a(bǔ)料分批或反復(fù)的補(bǔ)料分批方法中連續(xù)或不連續(xù)地培養(yǎng)本發(fā)明所使用的重組微生物。已知的培養(yǎng)方法的綜述將見(jiàn)于Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik I.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag, Stuttgart,1991))中或 Storhas 的教科書(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994)中。待使用的培養(yǎng)基必須以適當(dāng)?shù)姆绞綕M足特定菌株的需要。手冊(cè)"Manual of Methods for General Bacteriology " of the American Society forBacteriology (Washington D. C. , USA, 1981)中給出了用于多種微生物的培養(yǎng)基的描述?？梢园凑毡景l(fā)明使用的這些培養(yǎng)基一般包含一種或多種碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素和/或微量元素。優(yōu)選的碳源是糖類，如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。還可以通過(guò)復(fù)合化合物，如糖蜜，或來(lái)自糖精制的其他副產(chǎn)物來(lái)向培養(yǎng)基添加糖類。添加多種碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸；醇，如甘油、甲醇或乙醇；和有機(jī)酸，如乙酸或乳酸。氮源通常是有機(jī)或無(wú)機(jī)氮化合物或包含這些化合物的物質(zhì)。氮源的實(shí)例包含氨氣或銨鹽，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨；硝酸鹽；尿素；氨基酸；或復(fù)合氮源，如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白質(zhì)、酵母提取物、肉膏等。氮源可以分開使用或作為混合物使用?？梢源嬖谟谂囵B(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽化合物包含鈣、鎂、鈉、鈷、鑰、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。可以用無(wú)機(jī)含硫化合物，例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物，以及有機(jī)硫化合物，如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol)作為硫源。可以用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或?qū)?yīng)的含鈉鹽作為磷源。為了將金屬離子保持在溶液中，可以向培養(yǎng)基添加螯合劑。尤其適宜的螯合劑包含二羥基酚，如兒茶酚或原兒茶酸；或有機(jī)酸，如檸檬酸。本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以包含其他生長(zhǎng)因子，如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其包含例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆素。生長(zhǎng)因子和鹽通常來(lái)自培養(yǎng)基的復(fù)合成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。此外，可以向培養(yǎng)基添加適宜的前體。培養(yǎng)基中化合物的精確組成強(qiáng)烈地取決于具體的實(shí)驗(yàn)，且必須針對(duì)每一具體情況單獨(dú)決定。關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可以見(jiàn)于教科書"Applied Microbiol. Physiology, APracticalApproach" (Publ. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997)第 53-73 頁(yè)，ISBN 0 19963577 3)中。還可以從供應(yīng)商獲得生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如Standard I (Merck)或BHI (Brainheart infusion, DIFC0)等。
培養(yǎng)基的所有成分都通過(guò)加熱(2. Obar和121°C下20分鐘)或通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾消毒。這些成分可以一起消毒，或根據(jù)需要分開消毒。培養(yǎng)基的所有成分可以在生長(zhǎng)開始時(shí)存在，或者任選，可以連續(xù)添加或通過(guò)分批給料來(lái)添加。培養(yǎng)溫度通常在15°C和45V之間，優(yōu)選25°C至40°C，且在實(shí)驗(yàn)期間可以保持恒定或可以改變。培養(yǎng)基的pH值應(yīng)在從5至8. 5的范圍內(nèi)，優(yōu)選約7. O?？梢酝ㄟ^(guò)加入堿性化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸來(lái)在生長(zhǎng)期間控制用于生長(zhǎng)的PH值?？梢杂孟輨?，例如脂肪酸聚乙二醇酯來(lái)控制泡沫。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基添加具有選擇作用的適宜物質(zhì)，例如抗生素?？梢詫⒀趸蚝鯕怏w混合物，例如環(huán)境空氣送入培養(yǎng)物中，以維持有氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常從20°C至45°C。連續(xù)培養(yǎng)，直至形成最大量的希望的產(chǎn)物。這通常在10小時(shí)至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。可以任選通過(guò)高頻超聲、通過(guò)高壓(例如在弗氏壓碎器中)、通過(guò)滲透裂解(osmolysis)、通過(guò)去垢劑、裂解酶或有機(jī)溶劑的作用、利用勻漿器或通過(guò)所列方法中的幾種的組合來(lái)破碎細(xì)胞。
3. 7產(chǎn)物分離本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括回收戊烯二酸或相關(guān)化合物的步驟。術(shù)語(yǔ)“回收”包括從培養(yǎng)基提取、收集、分離或純化產(chǎn)物?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的任意常規(guī)分離或純化方法進(jìn)行化合物的回收，其包括但不限于用常規(guī)樹脂(例如陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂、非離子型吸附樹脂等)處理、用常規(guī)吸附劑(例如活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、氧化鋁等)處理、改變pH、溶劑萃取(例如用常規(guī)溶劑，如醇、乙酸乙酯、己烷等)、蒸餾、透析、過(guò)濾、濃縮、結(jié)晶、重結(jié)晶、PH調(diào)節(jié)、凍干等。例如，可以通過(guò)先去除微生物來(lái)從培養(yǎng)基回收戊烯二酸。然后剩余的培養(yǎng)液穿過(guò)或經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂，以去除不需要的陽(yáng)離子，然后穿過(guò)或經(jīng)過(guò)陰離子交換樹脂，以去除不需要的無(wú)機(jī)陰離子和有機(jī)酸。3. 8聚合物在另一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生聚酯或聚酰胺(例如nylon 或相關(guān)聚合物)的方法，其包括上文所述的步驟用于產(chǎn)生戊烯二酸化合物。以已知的方式使戊烯二酸化合物與二胺、三胺或多胺反應(yīng)來(lái)得到聚酰胺，或者與二醇、三醇或多元醇反應(yīng)來(lái)獲得聚酯。例如，使戊烯二酸型化合物與含有4至10個(gè)碳的多胺或多元醇反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供制備聚合物，尤其是共聚物的方法，該方法包括通過(guò)其中所述的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物，分離該化合物；并優(yōu)選在存在聚合引發(fā)劑，例如焦硫酸過(guò)氧化鈉(sodium peroxide disulfate,NAPS)作為自由基引發(fā)劑的情況下使該化合物與至少一個(gè)適宜的不飽和可聚合單體聚合。作為用于進(jìn)行以上聚合反應(yīng)的適宜共聚物的非限制性實(shí)例，可以提到多元醇，如乙二醇、丙二醇、甘油、具有2至8個(gè)甘油單位的聚甘油、赤蘚醇、季戊四醇和山梨醇；多胺，如二胺、三胺和四胺，如乙二胺、丙二胺、丁二胺、新戊二胺、亞己基二胺、辛二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、二亞丙基三胺、三亞丙基四胺、二亞己基三胺、氨丙基乙二胺和雙氨丙基乙二胺。聚亞烷基多胺也是適宜的多胺。高級(jí)多胺可以存在于與二胺的混合物中。有用的二胺包含例如I，2-二氨基乙烷、I，3-二氨基丙烷、I，4-二氨基丁燒、I，5- 二氨基戍燒、1，6- 二氨基己燒、1,8- 二氨基辛燒；
鏈烯，尤其是C2-C12鏈烯，其是具有2至12個(gè)碳原子的單不飽和直鏈或支鏈烴，例如乙稀;1-或2_丙?。?_、2_和3_ 丁稀；2~甲基-丙?。?-、2_、3_和4_戍??；1-、2_、3-、4-和 5-己烯；1-、2-、3-、4-、5-和 6-庚??；或 1-、2-、3-、4-、5-、6-和 7-羊烯；I-癸烯；
I-十二烯；以及它們的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體；單不飽和C3-C8羧酸，如丙烯酸或(C1-C7烷基)丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、衣康酸；單烯鍵不飽和C3-C8 —元羧酸與C1-C2tl鏈烷醇、C5-C8環(huán)烷醇、苯基-C1-C4鏈烷醇或苯氧基-C1-C4鏈烷醇的酯，實(shí)例是丙烯酸與C1-C2tl鏈烷醇的酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸2-丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十二酯和丙烯酸十八酯；丙烯酸與C5-Cltl環(huán)烷醇的酯，如丙烯酸環(huán)己酯；丙烯酸與苯基-C1-C4鏈烷醇的酯，如丙烯酸芐酯、丙烯酸2-苯基乙酯和丙烯酸I-苯基乙酯；丙烯酸與苯氧基-C1-C4鏈烷醇的酯，如丙烯酸2-苯氧基乙酯；甲基丙烯酸與C1-C2tl鏈烷醇 (優(yōu)選C1-Cltl鏈烷醇)的酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基 丙烯酸2- 丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸十二酯和甲基丙烯酸十八酯；甲基丙烯酸與C5-Cltl環(huán)烷醇的酯，如甲基丙烯酸環(huán)己酯；甲基丙烯酸與苯基-C1-C4鏈烷醇的酯，如甲基丙烯酸芐酯、甲基丙烯酸2-苯基乙酯和甲基丙烯酸I-苯基乙酯；和甲基丙烯酸與苯氧基-C1-C4鏈烷醇的酯，如甲基丙烯酸2-苯氧基乙酯；單烯鍵不飽和C4-C8 二羧酸與C1-C2tl鏈烷醇的二酯，如馬來(lái)酸或延胡索酸與C1-Cm鏈烷醇的二酯，實(shí)例是馬來(lái)酸二甲酯、馬來(lái)酸二乙酯、馬來(lái)酸二正丁酯、延胡索酸二甲酯、延胡索酸二乙酯和延胡索酸二正丁酯；單烯鍵不飽和C3-C8 —元羧酸的C1-C2tl烷基酰胺和二 -C1-C2tl烷基酰胺，尤其是例如丙烯酸和甲基丙烯酸的C1-C2tl烷基酰胺和二 -C1-C2tl烷基酰胺；單烯鍵不飽和羧酸的酰胺，如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；具有3至8個(gè)碳原子的單烯鍵不飽和一元羧酸和二羧酸的酐，如丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、馬來(lái)酸酐或衣康酸酐；具有3至8個(gè)碳原子的單烯鍵不飽和一元羧酸或二羧酸的羥基-C2-C4烷基酯，如丙烯酸2-羥乙酯、丙烯酸2-羥丙酯、丙烯酸3-羥丙酯、丙烯酸2-羥丁酯、丙烯酸4-羥丁酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥丙酯、甲基丙烯酸3-羥丙酯、甲基丙烯酸2-羥丁酯、甲基丙烯酸4-羥丁酯；單烯鍵不飽和磺酸及其鹽，實(shí)例是乙烯基磺酸、烯丙基磺酸、甲代烯丙基磺酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2-丙烯酰胺基乙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基乙磺酸、2-丙烯酰氧基乙磺酸、2-甲基丙烯酰氧基乙磺酸、
3-丙烯酰氧基丙磺酸和2-甲基丙烯酰氧基丙磺酸；具有3至5個(gè)碳原子的單烯鍵不飽和腈，如丙烯腈和甲基丙烯腈；N-乙烯基雜環(huán)，如N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己內(nèi)酰胺、N-乙烯基咪唑；和具有至少一個(gè)聚-C2-C4烯化氧基團(tuán)的單烯鍵不飽和化合物，實(shí)例是聚-C2-C4烷撐二醇或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撐二醇的乙烯醚和烯丙醚、具有3至8個(gè)碳原子的單烯鍵不飽和一元羧酸和二羧酸與聚-C2-C4烷撐二醇或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撐二醇的酯、具有3至8個(gè)碳原子的單烯鍵不飽和一元羧酸和二羧酸與聚-C2-C4烷撐二醇胺或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撐二醇胺的酰胺；具有至少一個(gè)堿性氮原子或季銨化氮原子的烯鍵式不飽和化合物，如氯化二烯丙基二甲銨、N-甲基-N-乙烯基咪唑鎗鹽如氯化物、硫酸酯或硫酸二甲酯、N-(2-( 二甲氨基)乙基)丙烯酰胺、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯、
2-(N，N-二甲氨基)乙基丙烯酰胺、3-(N，N-二甲氨基)丙基丙烯酰胺、3-(N，N-二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲氨基)乙基甲基丙烯酰胺、氯化丙烯酸2-(N，N，N-三甲銨)乙酯、氯化甲基丙烯酸2-(N，N，N-三甲銨)乙酯、氯化2-(N，N，N-三甲銨)乙基甲基丙烯酰胺、氯化3-(N，N，N-三甲銨)丙基丙烯酰胺、氯化3-(N，N，N-三甲銨)丙基甲基丙烯酰胺、氯化2-(N，N，N-三甲銨)乙基丙烯酰胺，及對(duì)應(yīng)的硫酸酯和硫酸二甲酯；乙烯基芳香族單體，如苯乙烯、a-甲基苯乙烯、乙烯基甲苯、叔丁基苯乙烯、乙烯基吡啶；
具有I至20個(gè)碳原子的脂肪族羧酸的乙烯酯和烯丙酯，實(shí)例是乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、十二酸乙烯酯和十八酸乙烯酯；共軛二烯，如丁二烯和異戊二烯；和鹵代乙烯系化合物，如氯乙烯(乙烯基氯)、1，I-二氯乙烯(亞乙烯基二氯)、氟乙烯、I，I- 二氟乙烯和四氟乙烯。除非另有說(shuō)明，燒基可以指C1-C7燒基，且可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、2-丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、I-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、1，I-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、I-乙基丙基、正己基、I-甲基戊基、2-甲基戊基、
3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，2-二甲基丁基、1，3- 二甲基丁基、2，3- 二甲基丁基、1，I- 二甲基丁基、2, 2_ _■甲基丁基、3, 3_ _■甲基丁基、I，I，2- 二甲基丙基、1,2,2- 二甲基丙基、I-乙基丁基、2_乙基丁基、I-乙基_2_甲基丙基、正庚基、2_庚基、3_庚基、2_乙基戍基、I-丙基丁基等。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的許多可能的變異也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)部分除非另有說(shuō)明，通過(guò)應(yīng)用遺傳工程、通過(guò)培養(yǎng)微生物的化學(xué)化合物的發(fā)酵性產(chǎn)生中和產(chǎn)物的分析和分離中使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備、方法、化學(xué)品和生化藥品來(lái)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。還參見(jiàn)上文中引用的Sambrook等和Chmiel等。材料和方法a)材料所有化學(xué)品和生化藥品來(lái)自Roche (Mannheim,德國(guó))、Sigma (Deisenhofen,德國(guó))和AppliChem。用于DNA操作的酶、DNA大小標(biāo)記、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和用于SDS/PAGE的分子量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自Fermentas GmbH (St. Leon-Rot,德國(guó))。大腸桿菌菌株BL21來(lái)自Stratagene。測(cè)序引物購(gòu)自MWG-Biotech AG (Ebersberg,德國(guó))。輔酶A來(lái)自MPBiomedicals。從對(duì)應(yīng)的酸酐制備戍二酸和乙酸的輔酶A酯(Simon,E. J & Shemin,D. (1953)J. Am. Chem. Soc. 75, 2530)。b)生物和生長(zhǎng)
于室溫在缺氧條件下在補(bǔ)充了 50mM MOPS、3mM鹽酸半胱氨酸、IOmM谷氨酸鈉、多種濃度的核黃素和FeCl2的Standard I培養(yǎng)基(I. 5 %蛋白胨、0. 3 %酵母提取物、IOOmMNaCl、5mM葡萄糖；Merck,Darmstadt)上培養(yǎng)用于克隆的大腸桿菌DH5 a和用于表達(dá)的大腸桿菌BL21。c)酶活性測(cè)定于室溫下在包含0. IM Tris/HCl pH 8. 0、0. 2mM NADH和2_羥基戊二酸脫氫酶的0.5ml總體積的比色杯中測(cè)量2-羥基戊二酸脫氫酶活性。加入ImMa-氧代戊二酸后，在 340nm 監(jiān)測(cè) NADH 的吸光度降低(e = 6. 3mM-lcm_l) (Bresser J(1997) (R)-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase aus Acidaminococcus fermentans. PhD Thesis,Philipps- Universita t Marburg,德國(guó)；Martins BM, Macedo-Ribeiro S, Bresser J,Buckel ff, Messerschmidt A(2005)Structural basis for stereo-specific catalysisin NAD.-dependent (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase from Acidaminococcusfermentans. Febs J 272 :269-281)。
于室溫在有氧條件下進(jìn)行戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定。在412nm跟蹤吸光度的提高，A e = Mmr1CnT1。測(cè)定中使用的試劑是0. IM磷酸鉀pH 7. O、0. 2M乙酸鈉、ImM草酰乙酸、ImM 5，5' -二硫代雙(2-硝基苯甲酸鹽)(DTNB)、20 ii g檸檬酸合成酶、0. ImM戊二酰輔酶 A,總體積 0. 5ml (Buckel ff, Dorn U, Semmler R (1981) Glutaconate CoA-transferasefrom Acidaminococcus fermentans. Eur J Biochem 118 :315-321 ;Jacob U, Mack M,Clausen T, Huber R, Buckel ff, Messerschmidt A (1997)Glutaconate CoA-transferasefrom Acidaminococcus fermentans the crystal structure reveals homology withother CoA-transferases. Structure5 :415-426)。于室溫在缺氧條件下在包含50mM Mops/KOH pH 7. 0、IOmM二硫蘇糖醇、5mM MgCl2,0. ImM連二亞硫酸鹽、0.4mM ATP和具有激活蛋白的2-羥基戊二酸脫氫酶的0. 5ml總體積的比色杯中測(cè)量2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶活性。孵育10分鐘后，用2mM乙酰輔酶A和2mM (R) -2-羥基戊二酸起始反應(yīng)。在290nm跟蹤由戊烯二酰輔酶A的形成引起的吸光度提高(e = 2. 2mM_1cm_1) (Kim J, Darley DJ, Buckel ff, Pierik AJ(2008)An allylicketyl radical intermediate in clostridial amino-acid fermentation. Nature 452 239-242)。用2mM乙酰輔酶A、50mM磷酸鉀pH7. 0,0. 25mM NADPH、戊烯二酸及用催化劑量的戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、戊烯二酰輔酶A脫羧酶[3，5，6]和巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶[9]，通過(guò)酶促反應(yīng)測(cè)定戊烯二酸。用分光光度計(jì)在340nm測(cè)量NADP+的形成。通過(guò)在20mM硫酸中、使用C18反相柱、具有210nm UV檢測(cè)的室溫下的HPLC來(lái)測(cè)
定戊烯二酸。d)其他生物化學(xué)方法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Bio-Rad微測(cè)定(microassay)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在Mini Protein 儀器(Bio-Rad, Heidelberg,德國(guó))中進(jìn)行 SDS-PAGE。用考馬斯亮藍(lán)(Serva,Heidelberg,德國(guó))染色蛋白質(zhì)。實(shí)施例I :基因的克隆克隆方法
按(SambrookJ & Russell Dff(2001)Molecular Cloning a Laboratory Manual,第三版 Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)中所述進(jìn)行DNA的常規(guī)操作、PCR和重組質(zhì)粒的構(gòu)建。使用包含Ndel和XhoI限制位點(diǎn)的以下引物，用PfuUltra High-Fidelity DNA 聚合酶(Stratagene,美國(guó))進(jìn)行 gctAB 的 PCR 擴(kuò)增NdeI 5 ' -ATGGTA C A T A T G T GAGTAAAGTAATGACGTTAAAAGACGCAATCG-3'(SEQ ID NO 39)和XhoI 5' -ATGGTACTCGAGTTATTTTGCTTCC GTGGGGACCTGG-3'(SEQ ID NO 40)分別從pET-Duet-1和pJF118HE將來(lái)自發(fā)酵氨基酸球菌的基因hgdH(2_羥基戊二酸脫氫酶)和gctAB (戍烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶)亞克隆入pACY⑶uet-1載體(Novagen) (SEQ ID NO: 13)(圖 2) (Fiirste JP, Pansegrau ff, Frank R, Blocker H, Scholz P,Bagdasarian M,Lanka E(1986)Molecular cloning of the plasmid RP4 primase regionin a multi-host-range tacP expression vector)。對(duì)于來(lái)自共生梭菌的hgdAB (2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶)及其來(lái)自發(fā)酵氨基酸球菌的激活蛋白hgdC的克隆，使用了 pASK-IBA3plus載體(IBA GmbH, GSttillgen，德國(guó))(SEQ ID NO :14)(圖 3)。用于pACYO)uet-l載體中的hgdH的連接和轉(zhuǎn)化條件將pASKIBA7+(實(shí)驗(yàn)室收藏)中的hgdH亞克隆入pETDuet (與下文所述相同的方法)，然后轉(zhuǎn)移至可以表達(dá)至多8個(gè)基因(IOkb)的pACY⑶uet-1。連接前，用限制酶BamHI和 EcoNI (Fermentas)于 37°C下分別處理 pETDuet_hgdH 和 pACYCDuet-1 載體 I 小時(shí)(表I)。表I 用 BamHI 和 EcoNI 消化
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生通式I的不飽和二羧酸化合物的生物催化方法 HOOC-CH = CH-X-COOH(I) 其中 X代表直鏈或支鏈、任選不飽和、任選取代的烴基； 該方法包括 任選在存在輔酶A源的情況下，在共表達(dá)編碼戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(E. C. 2. 8. 3. 12)和2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)的基因的重組微生物中轉(zhuǎn)化通式III的2-羥基取代的二羧酸化合物，以便形成所述式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III) 其中 X如上文所定義； 和任選以基本上純的立體異構(gòu)體的形式或作為立體異構(gòu)體的混合物分離所述式I的化合物。
2.權(quán)利要求I的方法，其中X選自η是從I至4的整數(shù)的(CH上、CH= CH、CH2-C(=O)或 CH = C (OH)。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中由所述重組微生物通過(guò)2-羥基戊二酸脫氫酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的轉(zhuǎn)化形成所述2-羥基取代的二羧酸 III HOOC-C ( = O) -CH2-X-COOH (II) 其中 X定義于上文。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述重組微生物共表達(dá)所述2-羥基戊二酸脫氫酶的基因。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將所述式II的氧代-二羧酸化合物加至所述重組微生物或通過(guò)所述重組微生物發(fā)酵性產(chǎn)生所述式II的氧代-二羧酸化合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物是代謝谷氨酸和/或葡萄糖的需氧菌或厭氧菌，且其中所述式II的化合物是2-氧代戊二酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述代謝谷氨酸和/或葡萄糖的重組菌選自埃希氏菌屬。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)包含2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶(E. C. 4. 2. I.-)和任選包含所述酶的激活蛋白。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶和激活蛋白是原核或真核來(lái)源。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述酶和激活蛋白源自相同或不同的具有轉(zhuǎn)化谷氨酸為戊烯二酸的能力的厭氧菌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述厭氧菌選自氨基酸球菌屬、梭菌屬、梭桿菌屬、消化鏈球菌屬的細(xì)菌。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述厭氧菌是發(fā)酵氨基酸球菌、共生梭菌、球孢梭菌、包括所有亞種的具核梭桿菌或不解糖消化鏈球菌。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述 a)2-羥基戊二酸脫氫酶(HgdH)包含SEQ ID NO 2或16的氨基酸序列、或與該序列具有至少50%同一性的序列；b)戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(GctAB)包含SEQID NO :4和/或6、SEQID NO : 18和/或.20，或SEQ ID NO 22和/或24的氨基酸序列、或與該序列具有至少50%同一性的序列； c)2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶包含SEQ ID NO :8和/或10、SEQ IDNO :26和/或28，或SEQ ID NO 30,32和/或34的氨基酸序列、或與該序列具有至少50%同一性的序列； d)c)的激活蛋白(HdgC)包含SEQID NO :12、36或38的氨基酸序列、或與該序列具有至少50%同一性的序列。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶來(lái)自共生梭菌，而所述2-羥基戊二酸脫氫酶、所述戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和所述激活蛋白來(lái)自發(fā)酵氨基酸球菌。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)均由核酸序列編碼，該核酸序列適合于具有產(chǎn)生所述式II的2-氧代-二羧酸能力的所述微生物的密碼子使用。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)由包含于一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體中的核酸序列編碼。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述共表達(dá)的蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)對(duì)所述重組微生物而言是異源的。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生式I的化合物，其中X選自CH2X2H4XH=CH、CH = C (OH)。
19.表達(dá)盒，其包含各自編碼權(quán)利要求I至17中任一項(xiàng)定義的酶或蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)不同核酸序列的組合，該序列與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接。
20.重組載體，其包含權(quán)利要求19的至少一個(gè)表達(dá)盒。
21.用權(quán)利要求20的至少一個(gè)載體轉(zhuǎn)化的重組原核或真核宿主。
22.權(quán)利要求21的重組宿主，其具有產(chǎn)生式(II)的2-氧代-二羧酸化合物的能力，該式(II)的2-氧代-二羧酸化合物通過(guò)由所述至少一個(gè)載體編碼的所述表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)轉(zhuǎn)化為式(I)的化合物。
23.權(quán)利要求22的宿主，其是埃希氏菌屬細(xì)菌的重組菌株。
24.制備聚酰胺的方法，該方法包括 a)通過(guò)權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物； b)分離所述化合物，任選隨后氫化，以去除C= C雙鍵；和 c)使步驟b)獲得的所述化合物與至少一個(gè)適宜的多價(jià)胺單體聚合。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述多胺是二胺、三胺或其混合物。
26.制備聚酯的方法，該方法包括 a)通過(guò)權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物； b)分離所述化合物，任選隨后氫化，以去除C= C雙鍵；和 c)使步驟b)獲得的所述化合物與至少一個(gè)適宜的多價(jià)醇聚合。
27.制備聚合物的方法，該方法包括 a)通過(guò)權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)的方法制備上文定義的通式(I)的單不飽和二羧酸化合物； b)分離所述化合物；和c)使步驟b)獲 得的所述化合物與至少一個(gè)適宜的不飽和可聚合單體聚合。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)共表達(dá)戊烯二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和2-羥基戊二酰輔酶A脫水酶系統(tǒng)的重組微生物來(lái)進(jìn)行不飽和二羧酸的生物催化產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還涉及對(duì)應(yīng)的重組宿主，適合用于制備這類宿主的重組載體、表達(dá)盒和核酸，以及利用通過(guò)該生物催化產(chǎn)生方法獲得的該二羧酸制備聚酰胺或聚酯共聚物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/44GK102782144SQ201080011703
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者I·久爾杰維奇, O·策爾德?tīng)? W·布克爾 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司