專利名稱：基于siRNA的細(xì)胞特異性有效的分子和用于制備其的應(yīng)用試劑盒及其用途的制作方法
基于siRNA的細(xì)胞特異性有效的分子和用于制備其的應(yīng)用
試劑盒及其用途
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及基于“短干擾RNA”(siRNA)的特異性生物學(xué)有效分子。當(dāng)激活后， 所述生物學(xué)有效分子與靶基因的RNA相互作用，并與特定的內(nèi)切核糖核酸酶形成稱為 “RISC” (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)的RNA蛋白復(fù)合物。RISC復(fù)合物結(jié)合靶mRNA，并且內(nèi)切核酸酶切割靶mRNA。以這種方式抑制了基因表達(dá)，并由此防止形成靶蛋白?？梢允褂媚軌蚣?xì)胞特異性激活的生物學(xué)有效分子在例如衰老特異性治療中等來(lái)防止異常細(xì)胞并抑制它們的生長(zhǎng)，特別是治療腫瘤和病毒感染。通常，能夠細(xì)胞特異性激活的生物學(xué)有效分子可以用于調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的基因表達(dá)。但是通過(guò)生物學(xué)活性分子，其不僅可以降低基因的表達(dá)，還可以通過(guò)降低靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)增加基因表達(dá)。已經(jīng)描述了在真核細(xì)胞中通過(guò)引入短(19_23bp)雙鏈RNA分子(siRNA)來(lái)抑制基因表達(dá)，該RNA分子對(duì)靶基因的mRNA序列片段是特異性的Elbashir SM et al. Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells,Nature,2001 May 24，411(6836)，494-8 ;Liu Y et al. =Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb. 24，43 (7)，1921-7 ；US 5, 898, 031 ；US 7,056,704)。此類分子并不抑制基因的閱讀和mRNA的產(chǎn)生，但是siRNA引發(fā)破壞靶mRNA的細(xì)胞自身的機(jī)制。最后，抑制了特定蛋白的形成而不破壞其他基因的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。為了抑制基因的表達(dá)，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔將siRNA直接引入細(xì)胞。Ghang M et al. DownreguIation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol.2004 May, 1(1) ,74-7 ；Gilmore IR et al. :Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22.， Curr Drug Deliv.2006 Apr. ,3(2), 147-5 ；US 6，506，559)。這種方法的劣勢(shì)在于siRNA較不穩(wěn)定，但是這可以通過(guò)化學(xué)修飾而加以改善(US 6，107，094)。生物學(xué)有效分子的治療應(yīng)用中的一個(gè)特殊問(wèn)題是體內(nèi)應(yīng)用。對(duì)于此類應(yīng)用已經(jīng)提出了方法來(lái)穩(wěn)定 siRNA 以減少分解(Morrissey et. al. =Chemical Modifications of Synthetic siRNA, Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005)，并且還開發(fā)了諸如納米顆粒體內(nèi)-jetPEITM(Polyplus)的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)在體內(nèi)將siRNA引入細(xì)胞(Vernejoul et al. Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancer models, Cancer Research 62,2002, 6124-31 ；Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A :RNAi_mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine(PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12 (5),2005,461-6.).而且，還開發(fā)了方法來(lái)在體內(nèi)增加靶細(xì)胞的siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染(Ikeda et. al.Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA, Pharmaceutical Research, Vol.23, No. 8, August 2006)。然而，體內(nèi)施用生物學(xué)活性物質(zhì)通常伴隨全身效果的問(wèn)題。將這些物質(zhì)選擇性引入靶細(xì)胞并非足夠特異性的。對(duì)于僅對(duì)靶細(xì)胞具有選擇效果的siRNA分子這尤為不利。通過(guò)組織或細(xì)胞特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)染試劑(如抗體/抗原-標(biāo)記的納米顆粒、TAT蛋白側(cè)翼等) 并未實(shí)現(xiàn)足夠高的細(xì)胞特異性。結(jié)果是錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)染。另一種已知方法是通過(guò)偶聯(lián)熒光染料來(lái)使siRNA的生物學(xué)效果失活，并通過(guò)用特定波長(zhǎng)的光照射所述分子來(lái)將所述分子再轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊幕钚越Y(jié)構(gòu)。(QN Nguyen et al. Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta，2006)。這種激活從外部引發(fā)，并且無(wú)論如何都不是細(xì)胞特異性的。 因此，所述siRNA分子在激活后不僅在相應(yīng)靶細(xì)胞中具有效果，而且意外地在所有其他轉(zhuǎn)染細(xì)胞中具有效果。而且，也難以在體內(nèi)應(yīng)用這種機(jī)制。還已知通過(guò)偶聯(lián)形成的肽來(lái)使SiRNA的生物學(xué)效果失活，從而這些肽在靶細(xì)胞中通過(guò)靶細(xì)胞特異性活性肽酶而被分離，而它們?cè)诜前屑?xì)胞中保持無(wú)活性 (W0002008098569A2)。以這種方式可以高選擇性地激活靶細(xì)胞中基于siRNA的分子而不存在所述分子對(duì)其他細(xì)胞的細(xì)胞功能的不利效果。實(shí)踐證實(shí)，SiRNA與肽的連接并非不存在問(wèn)題，而且在分離一個(gè)或多個(gè)肽后，保留在siRNA上的接頭(linker)或者剩余的肽殘基破壞靶細(xì)胞中siRNA的效力。盡管siRNA 在肽偶聯(lián)時(shí)有效地失活，但是在肽分離后保留在siRNA上的經(jīng)檢驗(yàn)的接頭以及可能的所述肽殘基對(duì)引入RNA干擾具有不利效果，因而破壞siRNA的生物學(xué)效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是產(chǎn)生siRNA與一個(gè)或多個(gè)肽之間的連接，其中所述siRNA在肽分離后被激活而剩余的接頭和/或剩余的肽殘基不會(huì)顯著地破壞細(xì)胞中激活的siRNA的生物學(xué)效力。根據(jù)本發(fā)明，提供了特別的氨基Cn接頭(Cn = C1、C2、C3、C4、C5或C6)，例如氨基 C6接頭，由此siRNA在其3’和/或5’端共價(jià)偶聯(lián)至至少一個(gè)肽。這種共價(jià)偶聯(lián)使生物學(xué)有效siRNA分子失活。因此，特異性基因表達(dá)在轉(zhuǎn)染此類失活分子后未受抑制，只要甚至僅有一個(gè)偶聯(lián)的肽保留在siRNA分子上，這是由于不存在特異于靶細(xì)胞特的相應(yīng)酶。為了激活生物學(xué)有效分子，將一個(gè)或多個(gè)肽從siRNA分離，并且氨基Cn接頭以及可能的肽殘基保留在siRNA上。即使本發(fā)明的特別的接頭在所述一個(gè)或多個(gè)肽的分離后仍保留在siRNA上(以及可能的肽殘基在分離后也保留在siRNA上)，還是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)保留的接頭以及可能的所述保留的肽殘基對(duì)所分離分子的經(jīng)激活siRNA的效力幾乎沒(méi)有不利影響(或者如果有不利影響也是不明顯的)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)預(yù)期到保留在siRNA上的該分子的任何部分會(huì)降低siRNA的生物學(xué)效力。接頭，即提供給siRNA分子的氨基Cn接頭本身是已知的， 但是尚未用于可分離肽的偶聯(lián)。甚至本領(lǐng)域技術(shù)人員也不了解此類應(yīng)用。在本發(fā)明中，不被靶細(xì)胞的細(xì)胞特異性酶破壞的基于siRNA的分子(見(jiàn)W0002008098569A》在轉(zhuǎn)染入或轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞后，可靠地保持無(wú)活性，并且在分子斷裂時(shí)被激活而具有SiRNA的生物學(xué)效力。本發(fā)明的創(chuàng)造性效果已經(jīng)通過(guò)氨基C6接頭得到證實(shí)，而測(cè)試表明，所述接頭類型的更小或更大的結(jié)構(gòu)(如氨基02丄3、(4丄5接頭)也可以被使用而具有類似的效果。如已知的，合適的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)例如納米顆粒或包被分子如脂質(zhì)體可以用于將失活的活性成分分子轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中。在靶細(xì)胞中，所述失活的共價(jià)鍵可以通過(guò)細(xì)胞特異性方式由一種或多種細(xì)胞特異性酶所斷裂，所述細(xì)胞特異性酶與一個(gè)或多個(gè)偶聯(lián)肽的鍵合序列是相關(guān)的，因此目前在靶細(xì)胞中并與肽分離的分子的生物學(xué)效力被激活。然后，所述分子偶聯(lián)至靶細(xì)胞的特異的mRNA，并因此以也是已知的方式抑制該特異性細(xì)胞中的基因表達(dá)。在所述分子構(gòu)建體也可以進(jìn)入的生物體不同于預(yù)定靶細(xì)胞的所有其他細(xì)胞中，活性分成分子可靠地保持無(wú)活性，這是由于不存在一種或多種靶細(xì)胞特異性酶而使得生物學(xué)有效分子特別是siRNA與一個(gè)或多個(gè)肽之間的共價(jià)鍵被完全(沒(méi)有肽鍵被破壞)或部分 (并非所有的肽鍵均被破壞)保留。由于仍然存在共價(jià)肽鍵，生物學(xué)活性分子不與該細(xì)胞的 mRNA連接。盡管，例如在腫瘤治療中，要轉(zhuǎn)染的本發(fā)明的分子構(gòu)建體不僅以它們的失活(偶聯(lián))形式進(jìn)入或到達(dá)腫瘤疾病靶細(xì)胞，而且可以到達(dá)健康細(xì)胞(這在實(shí)際治療中幾乎不可避免)，所述分子的生物學(xué)效力僅選擇性地在腫瘤疾病靶細(xì)胞中或靶細(xì)胞處通過(guò)該處存在的細(xì)胞特異性酶而被激活，而受到活性成分影響的靶基因的表達(dá)則有效地被抑制。用于健康細(xì)胞繼續(xù)存在的這種基因表達(dá)和由此的蛋白形成則不受該活性成分的影響，盡管該分子構(gòu)建體存在于這些非疾病細(xì)胞(或?qū)τ陬A(yù)期的生物學(xué)效果并非期望的細(xì)胞)中，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀抢锸怯谰眯詿o(wú)活性的。由于通過(guò)靶細(xì)胞酶特異性失活/激活而實(shí)現(xiàn)的所述分子的高選擇性效力，要轉(zhuǎn)染的具有合適肽偶聯(lián)的生物學(xué)失活分子構(gòu)建體可以全身施用。所述分子構(gòu)建體可以偶聯(lián)至其他物質(zhì)(例如作為載體系統(tǒng)的納米顆粒)以保證它們更好的轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定。在本發(fā)明中，錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)染是不可避免的，但是錯(cuò)誤轉(zhuǎn)染的分子，即使它們?nèi)匀皇遣黄谕?，在并非靶?xì)胞的細(xì)胞中是生物學(xué)失活的。即使靶細(xì)胞中或靶細(xì)胞處的分子激活，這種狀態(tài)也不會(huì)改變，從而生物學(xué)效力僅選擇性地在靶細(xì)胞中形成，與已知的機(jī)制相反，實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的高細(xì)胞選擇性調(diào)控。而且，還可以考慮使用更小的雙鏈RNA分子代替18_23bp的siRNA分子。具有siRNA與一個(gè)或多個(gè)肽的共價(jià)鍵的此類分子的應(yīng)用可能性還描述于 W0002008098569A2o有利的是使用應(yīng)用試劑盒，其中提供了生物學(xué)有效分子，該生物學(xué)有效分子要被引入并經(jīng)由可選擇性接頭與選擇性肽偶聯(lián)(見(jiàn)W0002008098569A》。以安瓿形式的所述應(yīng)用試劑盒應(yīng)當(dāng)含有所有要求的成分，實(shí)際上還含有如下的選擇合適的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(如納米顆粒或脂質(zhì))、其他添加劑(如抗體、配體和聚乙二醇)以及一種或多種探針或者具有套管的注射器用于將混合物從安瓿內(nèi)容物中注射入含有靶細(xì)胞的介質(zhì)。根據(jù)用于應(yīng)用和施用所述分子的附加說(shuō)明書，用戶可以制備用于預(yù)期用途的合適應(yīng)用混合物并進(jìn)行應(yīng)用。此外，能夠用于制備所述生物學(xué)有效分子的應(yīng)用試劑盒也是可行的。合適的措施使提供此類應(yīng)用試劑盒，其特異性地用于所選擇的靶細(xì)胞和靶基因以
5及用于應(yīng)用的個(gè)別范圍(體外或體內(nèi))。


如附圖所示，提供使用氨基C6接頭的實(shí)施方案更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。圖1 通過(guò)經(jīng)氨基C6接頭將SiRNA與肽偶聯(lián)而失活的siRNA分子；氨基C6接頭的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖2 細(xì)胞特異性激活的siRNA分子，其中肽鍵被斷裂而氨基C6接頭以及肽殘基保留在siRNA分子上圖3 靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞中胱天蛋白酶-4的酶活性圖4 通過(guò)肽抑制的siRNA而使GFP基因表達(dá)細(xì)胞特異性減少的圖示圖1示出Cn = Cl、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn接頭的實(shí)例，氨基C6接頭的化學(xué)結(jié)構(gòu)本身已知。通過(guò)這種氨基C6接頭1，siRNA 2與肽3偶聯(lián)以用于其生物學(xué)失活(在細(xì)胞中siRNA效果的失活)。氨基C6接頭1與siRNA 2通過(guò)所述siRNA的反義鏈的5’端而偶聯(lián)。只要所述肽偶聯(lián)至該siRNA分子，siRNA分子保持生物學(xué)失活。如圖2所示，如果肽鍵被失活siRNA分子所轉(zhuǎn)染入的靶細(xì)胞中的細(xì)胞特異性酶所破壞(全部肽3的完全分離)，則剩余的siRNA分子會(huì)通過(guò)激活分子轉(zhuǎn)染所意圖的siRNA的已知細(xì)胞特異性效果而生物學(xué)激活(還參見(jiàn)W0002008098569A2)。令人驚訝地，在所述肽鍵的鍛煉后(見(jiàn)圖幻，盡管氨基C6接頭1以及可能的肽3 的殘基保留在siRNA分子的殘基上，仍然發(fā)生這種激活，即所述siRNA 2的生物學(xué)效果未被保留在該分子上的氨基C6接頭1和肽4的殘基損害或顯著損害。圖3示出切割酶胱天蛋白酶-4的細(xì)胞特異性活性。其中，胱天蛋白酶-4在靶細(xì)胞(Jeg-3絨毛膜癌細(xì)胞；黑條塊)中是有活性的，但是在非靶細(xì)胞(人胚腎，HEK ；亮條塊) 中是無(wú)活性的。因此，通過(guò)圖1的接頭結(jié)構(gòu)與胱天蛋白酶-4的靶肽偶聯(lián)而被抑制的siRNA 在含有胱天蛋白酶-4的靶細(xì)胞中被分離并以這種方式激活。圖4表示當(dāng)引入無(wú)功能的對(duì)照siRNA、用于減少GFP基因表達(dá)的siRNA以及可以由胱天蛋白酶-4激活的肽抑制siRNA時(shí)檢測(cè)的熒光強(qiáng)度。熒光的減少與siRNA的生物學(xué)活性相關(guān)。可以觀察到siRNA在靶細(xì)胞(Jeg-3絨毛膜癌細(xì)胞；黑條塊)中被激活，因此GFP 基因的表達(dá)減少，而在非靶細(xì)胞(人胚腎，HEK;亮條塊)中，該基因的表達(dá)未減少。即使接頭結(jié)構(gòu)和肽殘基(在這種情況下是與甘氨酸鍵合的氨基C6接頭)仍保留在激活的siRNA 上，該siRNA的效果仍然可以與正常siRNA的效果相當(dāng)。標(biāo)示列表1-氨基C6接頭2-siRNA3-用于失活siRNA的肽4-肽殘基
權(quán)利要求
1.基于SiRNA的細(xì)胞特異性有效分子，其用于生物學(xué)無(wú)活性地轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞以在其通過(guò)結(jié)合至mRNA并形成RISC復(fù)合物而生物學(xué)激活之后抑制靶細(xì)胞中的基因表達(dá)，所述siRNA 通過(guò)接頭偶聯(lián)至至少一個(gè)肽以用于其生物學(xué)失活，并且所述接頭在所述分子的生物學(xué)激活后保留在所述siRNA上，其中所述siRNAQ)通過(guò)Cn = Cl、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn 接頭(1)偶聯(lián)至所述至少一個(gè)肽(3)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中氨基C6接頭被提供為氨基Cn接頭。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中氨基C5接頭被用作氨基Cn接頭。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中氨基C4接頭被提供為氨基Cn接頭。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中氨基C3接頭被用作氨基Cn接頭。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中將氨基C2接頭提供為氨基Cn接頭。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中氨基Cl接頭被提供為氨基Cn接頭。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞特異性有效分子，其中轉(zhuǎn)染系統(tǒng)共價(jià)或非共價(jià)地偶聯(lián)至所述生物學(xué)有效分子，并且所述至少一個(gè)肽通過(guò)所述氨基Cn接頭共價(jià)偶聯(lián)以用于將所述分子轉(zhuǎn)染入或轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)染系統(tǒng)例如載體系統(tǒng)如納米顆粒、配體/抗體/抗原標(biāo)記物或分子，如納米顆粒、聚合物或脂質(zhì)，其用于將可選擇性激活的生物學(xué)有效分子包被以進(jìn)行它們的轉(zhuǎn)染，或者基于脂質(zhì)的方法或TAT蛋白側(cè)翼。
9.用于應(yīng)用或施用如權(quán)利要求1-8中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的細(xì)胞特異性有效分子的應(yīng)用試劑盒，其由以下部分組成
10.至少一個(gè)安瓿(安瓿A)，其含有SiRNA，所述SiRNA偶聯(lián)至用于失活目的經(jīng)選擇的肽，并且氨基Cn接頭偶聯(lián)至所述siRNA ；-至少另一個(gè)安瓿(安瓿B)，其含有轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，如納米顆?；蛑|(zhì)； -用于所述安瓿A和安瓿B的內(nèi)容物的稀釋和反應(yīng)緩沖劑；-一種或多種探針或者具有套管的注射器和其他所需材料，其用于將混合物從所述安瓿內(nèi)容物注射入含有所述靶細(xì)胞的介質(zhì)，以及 -用于應(yīng)用和施用的說(shuō)明書。
11.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用試劑盒，其含有至少一種其他物質(zhì)，例如用于所述生物學(xué)有效分子半選擇性偶聯(lián)至靶細(xì)胞的抗體和/或聚乙二醇鏈，用于錨定所述肽和所述生物學(xué)有效分子。
12.用于制備如權(quán)利要求1-8中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的細(xì)胞特異性有效分子的應(yīng)用試劑盒，其至少由以下部分組成-一個(gè)安瓿(安瓿A)，其含有可以偶聯(lián)至siRNA以用于其失活的一個(gè)或多個(gè)肽； -一個(gè)安瓿(安瓿B)，具有用于將所述一個(gè)或多個(gè)肽偶聯(lián)至所述siRNA的反應(yīng)緩沖劑； -一個(gè)安瓿(安瓿C)，其用于在所述肽偶聯(lián)至所述siRNA后修飾所述肽； -一個(gè)安瓿(安瓿D)，具有其他反應(yīng)緩沖劑； -系統(tǒng)，其用于在所述肽偶聯(lián)至所述siRNA后純化亞產(chǎn)物或終產(chǎn)物； -一種或多種注射裝置，如探針或者具有套管的注射器，用于將混合物從所述安瓿內(nèi)容物注射，以及其他所需材料，如滲析膜或反應(yīng)容器；以及 -用于應(yīng)用的說(shuō)明書。
全文摘要
基于siRNA的細(xì)胞特異性有效分子和用于制備其的應(yīng)用試劑盒及其用途。本發(fā)明的目的是產(chǎn)生siRNA與一個(gè)或多個(gè)肽之間的連接，其中所述siRNA在肽分離后被激活而剩余的接頭和/或剩余的肽殘基不明顯地破壞細(xì)胞中激活的siRNA的生物學(xué)效力。根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)或多個(gè)肽(3)通過(guò)諸如氨基C6接頭(1)的特定氨基Cn接頭偶聯(lián)至siRNA(2)，所述接頭不破壞或僅不明顯地破壞所述siRNA的生物學(xué)效力，盡管其保留在siRNA上以及盡管任何肽殘基保留在siRNA上。2.3所述分子用于，例如影響優(yōu)選疾病或感染的器官或細(xì)胞的基因表達(dá)或者降低細(xì)胞混合物中期望基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102348799SQ201080011796
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者D·伊姆霍夫, S·克恩, T·珀?duì)柭?申請(qǐng)人:耶拿市弗里德里?！は沾髮W(xué)