專利名稱：孤獨(dú)癥譜系障礙的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷和治療孤獨(dú)癥譜系障礙的方法，尤其是用于診斷和治療以頭部尺寸(周長)增加和社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙的方法。
背景技術(shù)：
孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorders, ASD)是高度遺傳的，在同胞兄弟姐妹中有2-3 %的再發(fā)率，而在同卵雙胞胎中有60-90 %的一致率。然而，已知的遺傳原因 (例如，單基因疾病如脆性X(Fragile-X)或結(jié)節(jié)性硬化癥，或者染色體異常)造成約10% 的ASD病例。因此，大部分ASD病例目前病因不明。目前的估計是許多基因彼此之間以及與環(huán)境因素之間的相互作用造成了 ASD易感性。發(fā)明概述根據(jù)對PTEN和/或SLC6A4雜合小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，本申請人已確定這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物是孤獨(dú)癥譜系障礙的生物標(biāo)志。根據(jù)PTEN和/或SLC6A4表達(dá)產(chǎn)物的生物化學(xué)相互作用，本申請人已確定5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑出人意料地成為人ASD治療的可行候選物。提供了針對孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)的生物標(biāo)志，尤其是針對以頭部尺寸(周長) 增加和社交行為缺陷為特征的ASD的生物標(biāo)志。所述生物標(biāo)志是導(dǎo)致PTEN表達(dá)或功能降低(PTEN缺陷)的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)改變和/或?qū)е耂LC6A4表達(dá)或功能降低(SLC6A4 缺陷)的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)改變?？梢杂米魃飿?biāo)志的表觀遺傳學(xué)改變的實(shí)例包括導(dǎo)致 TGF-β上調(diào)的炎癥(抑制PTEN的轉(zhuǎn)錄)和暴露于花生四烯酸(抑制PTEN)(見Covey等， Oncogene. 26(39) :578457_92，2007)。ASD的另一生物標(biāo)志是升高的循環(huán)血清素水平。還提供了治療ASD的方法。在一些實(shí)施方案中，所述治療方法包括降低腦血清素的可獲得性。在一些具體實(shí)施方案中，用SLC6A4的激動劑來降低腦血清素的可獲得性。在另一些實(shí)施方案中，所述治療方法包括降低PI3激酶通路的激活或抑制血清素受體類型 5-HT2c通路。在一些具體實(shí)施方案中，ASD的標(biāo)志是以下的一個或多個PTEN缺陷、SLC6A4 缺陷、頭部尺寸(周長)增加、循環(huán)血清素增加。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了治療孤獨(dú)癥譜系障礙的方法。所述方法包括對需要該治療的對象施用一種或多種治療性分子，所述治療性分子為5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑是對治療所述對象有效的量的(1) 5-HT2c受體、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、Akt、mTOR、Creb和/或 NF-K B的拮抗劑或抑制劑，和/或Q)GSK-3i3激活子的激動劑。在一些實(shí)施方案中，施用5-HT2C受體的拮抗劑或抑制劑，優(yōu)選可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述5-HT2C受體的拮抗劑或抑制劑是SBM2084。在一些實(shí)施方案中，SB242084的施用劑量是約0. 1-lmg/kg/天。在另一些實(shí)施方案中，SB242084 的施用劑量是約l-10mg/kg/天。在又一些實(shí)施方案中，SBM2084是以約0. l-10mg/kg的劑量間歇施用的。在一些實(shí)施方案中，5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑并未作為非典型抗精神病藥物、選擇性血清素再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)或PPAR-γ激動劑銷售(截至本申請?zhí)峤蝗?。在某些實(shí)施方案中，5-HT2c受體信號通路的拮抗劑或抑制劑不是利培酮、奧氮平、齊拉西酮、氟西汀或噻唑烷二酮類。在一些實(shí)施方案中，施用PUK的拮抗劑或抑制劑，優(yōu)選可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述PUK的拮抗劑或抑制劑是舒尼替尼(SUTENT )。在一些實(shí)施方案中，施用Akt的拮抗劑或抑制劑，優(yōu)選可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。在某些實(shí)施方案中，Akt的拮抗劑或抑制劑是氯氮平或尼非那韋(VIRACEPT)。在一些實(shí)施方案中，施用mTOR的拮抗劑或抑制劑，優(yōu)選可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。在某些實(shí)施方案中，mTOR的拮抗劑或抑制劑是雷帕霉素(西羅莫司)。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括施用Creb的拮抗劑或抑制劑、NF-κ B的拮抗劑或抑制劑或者GSK_3i3激活子的激動劑，優(yōu)選其中每個可以進(jìn)入腦中。在一些實(shí)施方案中，所述對象是人。在一些實(shí)施方案中，所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑經(jīng)口、靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或鞘內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之后施用。在一些實(shí)施方案中，所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之前預(yù)防性施用。在一些實(shí)施方案中，所述對象沒有其他需要用所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑治療的癥狀。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測試所述對象的PTEN缺陷和/或SLC6A4缺陷和/或循環(huán)血清素的增加。在某些實(shí)施方案中，僅在所述測試檢測到PTEN缺陷和/或 SLC6A4缺陷和/或增加的循環(huán)血清素時對所述對象施用所述5-HT2c受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測試所述對象的巨頭畸型(腦過度生長)和 /或社交行為缺陷(如社交互動缺陷和/或在社交記憶缺陷)。在某些實(shí)施方案中，僅在所述測試檢測到巨頭畸型和/或社交行為缺陷時對所述對象施用所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括對所述對象施用針對孤獨(dú)癥譜系障礙的第二治療劑，其中所述第二治療劑和所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑以有效治療所述對象的組合量施用。在某些實(shí)施方案中，所述第二治療劑是利培酮、奧氮平、齊拉西酮、 氟西汀或PPAR-γ激動劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療孤獨(dú)癥譜系障礙的方法。所述方法包括向需要該治療的對象施用有效量的以下分子來治療所述對象一種或多種降低5-HT2C受體、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、Akt、mTOR、Creb和/或NF-κ B表達(dá)的分子，和/或一種或多種升高GSK_3i3表達(dá)的分子。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種降低表達(dá)的分子是一種或多種誘導(dǎo)RNA干擾的分子。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種誘導(dǎo)RNA干擾的分子是一種或多種短干擾核酸(siNA)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種siNA分子是短干擾RNA(siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、小 RNA (micro-RNA，miRNA)和短發(fā)夾 RNA(shRNA)分子。在一些實(shí)施方案中，所述對象是人。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種降低表達(dá)的分子和的分子經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或鞘內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種降低表達(dá)的分子和的分子在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之后施用。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種降低表達(dá)的分子和的分子在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之前預(yù)防性施用。在一些實(shí)施方案中，所述對象沒有其他需要用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和 /或一種或多種升高表達(dá)的分子治療的癥狀。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測試所述對象的PTEN缺陷和/或SLC6A4缺陷和/或循環(huán)血清素的增加。在某些實(shí)施方案中，僅在所述測試檢測到PTEN缺陷和/或 SLC6A4缺陷和/或增加的循環(huán)血清素時對所述對象施用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測試所述對象的巨頭畸型(腦過度生長)和 /或社交行為缺陷(例如在社交互動缺陷和/或社交記憶缺陷)。在某些實(shí)施方案中，僅在所述測試檢測到巨頭畸型和/或社交行為缺陷時對所述對象施用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括對所述對象施用針對孤獨(dú)癥譜系障礙的第二治療劑。所述第二治療劑和所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子以有效治療所述對象的組合量施用。在某些實(shí)施方案中，所述第二治療劑是5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。在另一些實(shí)施方案中，所述第二治療劑是利培酮、奧氮平、 齊拉西酮、氟西汀或PPAR-Y激動劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于診斷以頭部尺寸(周長)增加和/或社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙的方法。所述方法包括分析來自對象的生物樣品中一種或多種孤獨(dú)癥譜系障礙的生物標(biāo)志是否存在。所述一種或多種生物標(biāo)志是，例如(I)Pten基因和/或Slc6a4基因中一種或多種突變或表觀遺傳學(xué)變化的存在，和/或( 相對于循環(huán)血清素水平的正常范圍，循環(huán)血清素水平的升高。所述一種或多種孤獨(dú)癥譜系障礙生物標(biāo)志的存在表明所述對象患有以頭部尺寸(周長)增加和/或社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙。在一些實(shí)施方案中，所述Pten基因和/或Slc6a4基因中的一種或多種突變或表觀遺傳學(xué)變化導(dǎo)致PTEN的表達(dá)或功能降低和/或SLC6A4的表達(dá)或功能降低。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括編寫表明所述對象的孤獨(dú)癥譜系障礙狀態(tài)的報告。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給對所述患者施用健康護(hù)理的臨床醫(yī)生提供生
/或一種或多種升高表達(dá) /或一種或多種升高表達(dá) /或一種或多種升高表達(dá)物樣品的分析。在一些實(shí)施方案中，所述社交行為缺陷是指社交互動缺陷和/或社交記憶缺陷。參照本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些和其他方面以及各種優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用將更加明顯。本發(fā)明的每個方面可以涵蓋多種實(shí)施方案，其可通過下文的描述來理解。


圖1. Pten+ ；Slc6a4+/_小鼠的巨頭畸形圖 1 (A)雄性 Pten+/+ ；Slc6a4+/+、Pten+廠；Slc6a4+/+、Pten+/+ ；Slc6a4+/"和 Pten+廠； Slc6a4+/-小鼠腦的代表性背視圖。12周齡時收集腦。圖1⑶和(C)與野生型對照相比，Pten和Slc6a4單倍體不足 (haploinsufficient)的小鼠顯示腦量的顯著增加。(B)與 Pten+/+;Slc6a4+/+小鼠、Pten+; Slc6a4+/+小鼠和Ptenv+ ；Slc6a4v_小鼠相比，雌性Ptenv_ ；Slc6a4v_小鼠的腦量顯著增加 (F3j42 = 20. 6 ;P < 0. 001)。η = 10 只 Pten+/+ ；Slc6a4+/+ 小鼠，10 只 Pten+廠；Slc6a4+/+ 小鼠，10 只 Pten+/+ ；Slc6a4+廠小鼠和 13 只 Pten+ ；Slc6a4+/"小鼠。(C)與 Pten+/+ ；Slc6a4+/+ 小鼠、Pten+廠；Slc6a4+/+ 小鼠和 Pten"+ ；Slc6a4"_ 小鼠相比，雄性 Pten"_ ；Slc6a4"_ 小鼠的腦量顯著增加(F3,33 = 30 . 0 ;P < 0. 001)。η = 6 只 Pten+/+ ；Slc6a4+/+ 小鼠，6 只 Pten+ ； Slc6a4+/+ 小鼠，11 只 Pten+/+ ；Slc6a4+廠小鼠和 11 只 Pten+廠；Slc6a4+廠小鼠。*P < 0. 05，**P <0. OKTukey HSD檢驗(yàn))。8_12周齡。將數(shù)據(jù)以體重歸一化以補(bǔ)償動物之間的體重差異。圖2. Ptenv_小鼠的行為表征。圖2(A)用于測定社交接觸行為的裝置的靜態(tài)圖像。將社交刺激小鼠放置在室1 里的丙烯酸籠中，室3的丙烯酸籠子保持空置作為對照。對象小鼠在室2開始測定，對測定錄像10分鐘，然后量化在每個室中停留時間的百分比。圖2(B)和(C)數(shù)據(jù)顯示在包含裝有刺激小鼠籠子的室(室1)、空室(室幻或包含沒有刺激小鼠的籠子的室(室3)停留時間的百分比。所有測試小鼠為12周齡。(B)在雌性中，相對于室3Ptenv+小鼠顯示對室1的顯著偏好，但是在Ptenv_小鼠中未見此偏好。 (C)在雄性中，相對于室3Ptenv+和Ptenv_小鼠都顯示對室1的偏好。
< 0. 05，在室1和室3之間組內(nèi)比較方差分析。η =每種基因型17只雄性，12只雌性。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。 在每組的柱中，順序是左邊柱=室1，中間柱=室2，右邊柱=室3。圖2(D)Pten+/-小鼠聽覺驚嚇應(yīng)答的前脈沖抑制。所有測試小鼠為12周齡。與 Ptenv+小鼠相比，Ptenv-小鼠在背景之上12db或16db的前脈沖有顯著的驚嚇抑制缺陷。 *P < 0. 05，給定前脈沖強(qiáng)度的基因型間的比較方差分析。η =每種基因型12只小鼠(6只雌性)。在每組的柱中，順序是左邊柱=Ptenv+,右邊柱=Ptenv_。圖3. Pten和Slc6a4單倍體不足小鼠的社交行為和前脈沖抑制 3 (A) 8 周齡雌性 Pten"+ ；Slc6a4+/+ 小鼠(n = 13)、Ptenv_ ；Slc6a4+/+ 小鼠(n = 13) ,Pten+/+ ；Slc6a4"_ 小鼠(η = 11)和 Pten"_ ；Slc6a4"_ 小鼠(η = 13)的社交接觸數(shù)據(jù)。 乍<0.05，室1和室3間組內(nèi)比較方差分析。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。在每組的柱中，順序是左邊柱=室1，中間柱=室2，右邊柱=室3。圖3 (B)用于基因型間分析的表示為接觸回避得分(approach-avoidance score) 的圖(A)的社交接觸數(shù)據(jù)。與 Pten"+ ；Slc6a4+/\Pten+/" ；Slc6a4+"和 Pten+" ；SlC6a4"_小鼠相比，Pten+ ；Slc6a4+/-小鼠在室1與社交刺激小鼠在一起的時間顯著減少(F3,49 = 25 . 3 ； P < 0. 001)。*P < 0. 05，**P < 0. 01 (Tukey HSD 檢驗(yàn))。圖3 (C) 8周齡雄性小鼠的社交接觸和認(rèn)知數(shù)據(jù)。在試驗(yàn)1中，刺激小鼠(位于室 1)和對象小鼠互動10分鐘。然后將它們隔離30分鐘。然后進(jìn)行試驗(yàn)2，其中所述對象小鼠和刺激小鼠互動 5 分鐘。Ptenv+ ；Slc6a4+/+ 小鼠(n = 12)，Pten+^ ；Slc6a4+/+ 小鼠(n = 10)，Pten+/+ ；Slc6a4+廠小鼠(n = 8)和 Pten+廠；Slc6a4+廠小鼠(n = 8)。*Ρ < 0. 05，室 1 和室3間組內(nèi)比較方差分析。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。在每組的柱中，順序是左邊柱=室1，中間柱=室2，右邊柱=室3。圖3 (D) 8周齡Pten"_ ；Slc6a4+/"小鼠驚嚇應(yīng)答的前脈沖抑制。Pten"_ ；Slc6a4+/+小鼠和Ptenv_ ；Slc6ad、鼠在背景之上16db的前脈沖有顯著的驚嚇抑制缺陷(F3,46 = 3. 6 ； P < 0. 05)。*P < 0. 05 (Tukey HSD 檢驗(yàn))。η = 11 只 Pten+/+ ；Slc6a4+/+ 小鼠(8 只雌性)， 10 只 Pten"- ；Slc6a4+/+ 小鼠(7 只雌性)，13 只 Pten+/+ ；SlC6a4"_ 小鼠(7 只雌性)和 13 只 Pten"- ；Slc6a4+/"小鼠(9 只雌性)。圖4.基因型間和基因型內(nèi)腦量和社交能力的相關(guān)性 4 (A) 8 周齡雌性 Pten+/+ ；Slc6a4+/+ (η = 7)，Pten+廠；Slc6a4+/+ (η = 8)，Pten+/+ ； Slc6a4+/-(n = 10)和Ptenv_ ；Slc6a4v_(n = 11)小鼠的腦量群體平均值(以體重歸一化) (X軸)和社交接觸回避得分(Y軸)的圖。r = -0. 98。(B至E)對按照基因型整理的圖(A)的個體對象所作的腦量(以體重歸一化)(X 軸)和社交接觸回避得分(Y軸)的圖。圖 4 (B)Pten+；Slc6a4+/+ ]r = 0.77 ；I3 < 0. 05 (r 到 P 轉(zhuǎn)換)。
圖 4(C)Pten+廠；Slc6a4+/+ ]r = 0.70 ；I3 < 0. 05
圖 4OOPten+"；Slc6a4+廠]r = 0.60 ；I3 = 0. 07
圖 4 (E)Pten"-；Slc6a4+廠]r = 0.65 ；I3 < 0. 05組的大小與圖3A-B中報道的那些不同，因?yàn)椴⑽磳λ袦y定了社交接觸的動物
進(jìn)行腦量測量。圖5 :5-HT2cR拮抗劑SB M2084對Pten單倍體不足小鼠的社交接觸行為的影響。 測試小鼠是雌性同胎小鼠，8周齡。在測定開始前20分鐘，向所述小鼠腹膜內(nèi)注射0. 3mg/ kg的SB M2084或載體。將社交刺激小鼠放置于室1，而同樣的空籠放置于室3。將所述對象小鼠與刺激小鼠互動花費(fèi)時間的百分比以10分鐘量化。用SB M2084處理的Pten單倍體不足小鼠顯示了對與刺激小鼠互動的顯著偏好，相反，載體處理的該基因型小鼠未顯示這種偏好。對載體處理組，η = 6 ；對SB 242084處理組，η = 8。*Ρ < 0. 05，室1和室3間組內(nèi)比較方差分析。在每組的柱中，順序是左邊柱=室1，中間柱=室2，右邊柱=室3。圖6 對氣味識別和辨別的嗅覺習(xí)慣化/去習(xí)慣化的測定顯示，Pten和Slc6a4單倍體不足小鼠對新氣味的習(xí)慣化和去習(xí)慣化模式并未改變。方差分析顯示每個時間點(diǎn)時基因型之間的差異不顯著。動物在6-9周齡時進(jìn)行測試。η = 10只Pten"+ ；Slc6a4+/+(8只雌性)，10 只 Pten"- ；Slc6a4+/+(8 只雌性)，9 只 Pten+/+ ；Slc6a4+/"(4 只雌性)，9 只 Pten"—； Slc6a4+、4 只雌性)。圖7 血清素和PII信號通路如何可以通過與Slc6a4和Pten相互作用來影響腦大小和社交能力的模型。Slc6a4影響血清素受體可獲得的細(xì)胞外血清素(5-HT)的量。Pten結(jié)合5-HT2C受體并拮抗其作用。血清素信號也可活化PII通路。推測的下游效應(yīng)物包括 mTOR、GSK-3 β、Creb和NF-κ B，所有這些都有能力影響腦形態(tài)形成、生長和神經(jīng)元功能。應(yīng)理解附圖僅是示例性的，并非是實(shí)施本發(fā)明所必需的。發(fā)明詳述能增進(jìn)對特發(fā)性孤獨(dú)癥(idiopathic autism)的了解的兩個基因是PTEN和 SLC6A4。PTEN作為PI3-激酶(PI3K)通路的負(fù)調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用(1)。已在孤獨(dú)癥和巨頭畸型的一部分患者個體中鑒定到雜合PTEN突變，從而使得患病個體成為PTEN單倍體不足 (2-5) 0認(rèn)知障礙的臨床表型表現(xiàn)在PTEN單倍體不足個體中是多樣的。因此，已提出攜帶 PTEN突變的孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)患者個體可能代表了篩選ASD臨床表型的第二位置遺傳修飾物的敏感組G)。SLC6A4編碼血清素的膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它影響該神經(jīng)遞質(zhì)的細(xì)胞外水平。認(rèn)為SLC6A4是ASD候選易感性基因和ASD的第二位置遺傳修飾物(6，7)。已報道在攜帶低表達(dá)的Slc6a4啟動子多態(tài)性等位基因的ASD個體中有腦過度生長(8)和嚴(yán)重的社交行為障礙(9)。此外，SLC6A4調(diào)節(jié)細(xì)胞外血清素的水平，而且被重復(fù)報道最多的ASD外周生物標(biāo)志之一是患ASD個體的細(xì)胞外血清素水平的增加(6)。ELISA測定和類似的免疫吸附測定可用于測定循環(huán)血清素水平。已與ASD聯(lián)系起來的血清素水平彡對照(非ASD)人群平均數(shù)的2倍標(biāo)準(zhǔn)差?？紤]到它們與ASD的聯(lián)系，PTEN和SLC6A4均是潛在的外周生物標(biāo)志，因?yàn)檫@兩個基因都是多效的并且在CNS外表達(dá)和發(fā)揮作用。然而，這些標(biāo)志表達(dá)水平變化的作用需要生物和行為測量的驗(yàn)證。有證據(jù)提示，血清素通路(其中Slc6a4發(fā)揮作用)與PII通路 (Pten對其起作用)在腦中有交叉。已發(fā)現(xiàn)Pten與血清素受體5_HT2c之間物理相互作用的證據(jù)，Pten的磷酸酶活性調(diào)節(jié)該受體的活性(10)。而且，對神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行的幾項(xiàng)研究已證明，血清素受體激動劑活化Akt，而且該活化以PII依賴的方式發(fā)生((11) 中綜述)。然而，盡管血清素和PII通路均與ASD的發(fā)病機(jī)制有很大關(guān)聯(lián)，這種相互作用對 ASD相關(guān)的生物和行為表型的重要性至今仍未明確。在Cowden綜合征患者(ASD患者的一個亞群)中，PTEN的錯義突變通常集中在外顯子5的核心催化磷酸酶結(jié)構(gòu)域，而這通常使該蛋白質(zhì)的磷酸酶作用失活(12)。作為模擬這些遺傳病變的小鼠模型，我們利用了之前生成的Pten突變系，其中外顯子5缺失，因而核心催化磷酸酶結(jié)構(gòu)域缺失(1 。該突變等位基因純合的小鼠無法存活；然而，該等位基因雜合的小鼠可存活至成年，從而使其成為研究Pten單倍體不足的腦結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育結(jié)果和篩選該表型的第二位置遺傳和環(huán)境修飾物的可靠工具。除PTEN外，也將PI3-激酶通路的其他抑制物的突變與ASD相關(guān)聯(lián)，尤其是結(jié)節(jié)性硬化綜合癥基因TSCl和TSC2(14)以及神經(jīng)纖維瘤蛋白1(15，16)。因此，Pten單倍體不足小鼠是一種通用工具，其中富有ASD候選基因的信號通路即PI3-激酶通路被活化。這些小鼠也提供了探索有關(guān)孤獨(dú)癥的基因-環(huán)境相互作用對腦尺寸和行為方式之影響的更廣泛問題的機(jī)會?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們確認(rèn)5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑出人意料地恢復(fù)了 Pten單倍體不足小鼠的功能，因此它對孤獨(dú)癥譜系障礙的治療是有用的。因此，在一些方面，本發(fā)明涉及對患孤獨(dú)癥譜系障礙或被認(rèn)為患孤獨(dú)癥譜系障礙的對象施用有效量的一種或多種5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑，以治療所述對象。術(shù)語“治療”旨在包括對病癥的預(yù)防、改善、防止或治愈。出現(xiàn)病癥之后治療的目的在于減少、改善或完全消除所述病癥和/或其一種或多種相關(guān)癥狀，或防止其惡化。在開始出現(xiàn)病癥之前對對象的治療(即預(yù)防性治療)旨在降低發(fā)生該病癥的風(fēng)險和/或減輕其嚴(yán)重性(如果后來發(fā)生病癥)。本文所用術(shù)語“預(yù)防”涉及預(yù)防性治療具有發(fā)生病癥風(fēng)險的對象，其中所述治療導(dǎo)致所述對象發(fā)生病癥的可能性減小，或?qū)е屡c不進(jìn)行該治療相比，所述病癥的嚴(yán)重性更低的可能性增加。對于患所述病癥的對象，與未如本文所述按照本發(fā)明治療的對象相比，治療可減少、改善或完全消除患所述病癥和/或其一種或多種其相關(guān)癥狀， 或阻止其惡化。“對象”應(yīng)指人或動物，包括但不限于狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、嚙齒動物 (例如大鼠和小鼠)以及靈長類動物(例如猴)。優(yōu)選的對象是人對象。所述人對象可以是兒童、成年或老年對象。所述對象可以已知患有特定的適合此種治療的孤獨(dú)癥譜系障礙，或可以被認(rèn)為患有此種障礙。在一些實(shí)施方案中，所述對象沒有其他需要用所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑治療的癥狀。在臨床上將孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)診斷為有單一病因和復(fù)雜的多基因病因。孤獨(dú)癥譜系障礙的特征是交際技能、社交互動的不同程度缺陷，以及受限、重復(fù)和固定的行為模式° 它包括孤獨(dú)癥、PDD-N0S(pervasive developmental disorder not otherwise specified，未分類廣泛發(fā)育障礙)、阿斯伯格綜合癥(Asperger syndrome)、雷特氏綜合征(Rett syndrome)禾口童年瓦角軍性障石導(dǎo)(childhood disintegrative disorder)(見 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-1V)。本領(lǐng)域已知幾種用于評估對象的社交和交流發(fā)展的篩選工具，可以用其來幫助篩選和診斷孤獨(dú)癥譜系障礙。這些工具包括幼兒孤獨(dú)癥對照表(Checklist of Autism in iToddlers, CHAT)、修訂的幼兒孤獨(dú)癥對照表(modified Checklist for Autism in iToddlers, M-CHAT)、兩歲兒童孤獨(dú)癥的篩選工具(Screening Tool for Autism in Two-Year-01 ds, STAT)、社交交流問卷(Social Communication Questionnaire, SCQ)(對四歲及以上兒童)、孤獨(dú)癥譜系篩選問卷(Autism Spectrum Screening Questionnaire, ASSQ)、阿斯伯格綜合征的澳大利亞標(biāo)準(zhǔn)(Australian Scale for Asperger' s Syndrome) 以及兒童阿斯伯格綜合征測試(Childhood Asperger Syndrome Test，CAST)。通常，診斷性評價可包括神經(jīng)和遺傳評估以及深度認(rèn)知和語言測試。專門為診斷孤獨(dú)癥開發(fā)的另外的檢測包括修訂的孤獨(dú)癥診斷訪談(Autism Diagnosis Interview-Revised，ADI-R)、孤獨(dú)癥診斷觀察時間表(Autism Diagnostic Observation Schedule, AD0S-G)和兒童孤獨(dú)癥分級標(biāo)準(zhǔn)(Childhood Autism Rating kale，CARS)。本文所述方法對除孤獨(dú)癥譜系障礙外的其他疾病有更廣泛的應(yīng)用。所述方法還可用于治療躁狂癥、精神分裂癥、強(qiáng)迫癥以及一系列相關(guān)的人格和情緒障礙。如本文所述，用5-HT2c(血清素)受體通路的拮抗劑或抑制劑(在本文中可以等價地單獨(dú)地稱為拮抗劑或抑制劑)來治療孤獨(dú)癥譜系障礙。本文所用的“5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑”是部分或全部阻斷、抑制或中和5-HT2C受體信號通路或PUK信號通路的生物活性的任何分子。這些拮抗劑或抑制劑可以以降低或升高5-HT2C受體信號通路或PI3K信號通路的個體多肽活性的方式作用于所述個體多肽，效果是對經(jīng)5-HT2C受體信號通路或PUK信號通路傳導(dǎo)的信號進(jìn)行拮抗或抑制。例如，5-HT2C受體信號通路或PUK信號通路的拮抗劑或抑制劑可以是(l)5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PII)、Akt(蛋白激酶B/PKB)、mT0R、Creb或NF- κ B的拮抗劑或抑制劑，或( GSK-3 β的激動劑或活化劑。所述拮抗劑或抑制劑還可以是逆向激動劑，例如對5-HT2c受體信號通路的多肽(例如5-HT2c 受體)有負(fù)效應(yīng)的分子。見圖7的5-HT2C受體信號通路示意圖。盡管5-HT2C的活化(抑制)是PII信號通路的重要活化要素(抑制要素)，本領(lǐng)域已知該通路包括比圖7所示的更多的要素。PUK信號通路的另外的活化要素是IGFl 對IGFl受體的活化。因此，IGFl和相關(guān)分子可以以本文描述的方式用于治療孤獨(dú)癥譜系障礙，特別是本文指出的孤獨(dú)癥譜系障礙中的亞類。合適的IGFl和相關(guān)治療性分子在 W02008/153929(公開內(nèi)容通過參考并入本文)中有描述，例如在12-17頁。在另外的實(shí)施方案中，可以本文所述的方法中使用(作為主要治療，特別是對本文指出的ASD亞類，或作為第二治療)PPAR-γ激動劑(例如噻唑烷二酮類類(TZDs)，包括羅格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)、曲格列酮(Rezulin)、MCC_555、來格列酮和環(huán)格列酮)來治療PTEN或SLC6A4缺陷的個體，這是因?yàn)檫@些分子通過對PTEN轉(zhuǎn)錄的上調(diào)來拮抗 PI3K 通路(見例如 Zhang 等，Cancer Biol Ther. 2006. (8) :1008-14 ；Teresi 等，Int J Cancer. 2006. 118(10) :2390-8 ；Patel 等，Curr Biol. 2001. 11(10) :764-8)。合適的拮抗劑或抑制劑包括小分子(特別是有機(jī)小分子)、拮抗劑抗體或其抗原結(jié)合片段、5-HT2C受體信號通路天然組分的片段或氨基酸序列變體、肽、誘導(dǎo)降低5-HT2C 受體信號通路之多肽表達(dá)的RNA干擾的核酸、反義寡核苷酸等。鑒定拮抗劑或抑制劑的方法包括將5-HT2C受體信號通路的多肽與候選分子接觸，測量一種或多種通常與該多肽相關(guān)的生物活性的可測變化。其他鑒定拮抗劑或抑制劑的方法包括將細(xì)胞與候選分子接觸， 測量5-HT2C受體信號通路的多肽或編碼5-HT2C受體信號通路多肽的核酸的表達(dá)的可測變化。5-HT2c受體的示例性拮抗劑或抑制劑包括SB 242084 (6-氯代_5_甲基-l-[[2-(2-甲基吡啶-3-基氧基)吡啶-5-基]氨基甲?；鵠二氫吲哚)(見例如 Bromidge 等，J. Med. Chem. 40 :3494-3496,1997 ；Kennett 等，Neuropharmacology 36 609-620,1997)、SB 243213(5-甲基 _1_[ [_2_[ (2-甲基 _3_ 吡啶基)氧基]_5_ 吡啶基] 氨基甲?；鵠-6-三氟甲基二氫吲哚鹽酸鹽)(見例如Wood等，Neuropharmacology. 41 (2) 186-199，2001)、RS 102221 (N-{5_[5_O，4-二氧代-1，3，8-三氮雜螺[4.5]癸 _8_ 基) 戊?；鵠-2，4- 二甲氧基苯基}-4-(三氟甲基)苯磺酰胺)(見例如Bonhaus等， Neuropharmacology. 36 :621-629,1997), SB 206553、SB 200646A、SB 221284、SB 204741、 SB 228357、SB 200646、VALD0XAN ⑧(阿戈美拉汀，S 20098)(見例如 Loo 等，Int Clin Psychopharmacol 2002 Sep ； 17 (5) :239-47)、酮色林(Bonanno 等，Eur J Pharmacol 126 317-321)、利坦絲林、azamianserine、(+)-反式-1-(5-氯代-3-(4-氟代苯基)_1_ 茚滿基)-4- (3-異丙基-2-咪唑啉酮-1-基)乙基)-哌嗪、2，5- 二甲基-3- (4-氟代苯基)-1- [1- [2-咪唑啉-2-酮-1-基)乙基]-哌啶-4-基]-IH-吲哚、氟西汀、德倫環(huán)烷、mirtaz印ine、米安色林、萘法唑酮、曲拉唑酮、YM 35992、Ro 60-0759 ((+)-反式-8-乙基-7-羥基-9-甲氧基-2-甲基-1，3，4，4a，5，IOb-六氫苯并[h]異喹啉_6 QH)-酮)、0rg 38457、Org 12962、EGIS 8465、EGIS-9933，對5_HT2c受體起作用的抗精神病藥如舍吲哚、 奧氮平和利培酮，LY 53857、麥角芐酯、美舒麥角、pir印erone、spiroperone、氯氮平、達(dá)泊西汀、美西麥角、舍氮平、Ro 60-0491 (N-(2-萘基)-N' _(3_吡啶基)脲1 IHCUN-(2-H 基)-N' -(3-吡啶基)-鹽酸脲)、S16924、氰美馬嗪、naphtoxazine(SDZ NVI-085)、 S32006(Dekeyne 等，Psychopharmacologia 199 :549-568,2008)和以下所述的另外的拮抗劑或抑制劑分子W0 96/23783、WO 97/48699、W097/48700、WO 2002/014273、EP1782813、 Hamprecht 等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 17 (2) :424-7 (2007) > Hamprecht 等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(2) :428-33(2007)和 Bromidge 等，Bioorg Med Chem Lett. 10(16) 1867-1870(2000)。應(yīng)注意之前所述的用于治療孤獨(dú)癥譜系障礙的一些分子可作為5-HT2c受體信號通路或PUK信號通路的拮抗劑或抑制劑發(fā)揮作用。這些分子(例如利培酮、奧氮平、齊拉西酮、氟西汀和PPAR-γ激動劑(例如本文所述的))在本文所述的治療孤獨(dú)癥譜系障礙的某些方法中不被使用。這些分子(例如利培酮、奧氮平、齊拉西酮、氟西汀和PPAR-γ激動劑(例如本文所述的))在本文所述的治療孤獨(dú)癥譜系障礙的某些方法中不被使用(作為第二治療性分子除外)。因此在某些實(shí)施方案中，將這些分子用作Pten或Slc6a4單倍體不足的ASD個體的主要治療和/或用作治療任何ASD個體的第二治療性分子。在某些實(shí)施方案中，5-HT2c受體的拮抗劑或抑制劑是SB M2084或RS 102221。在一些實(shí)施方案中，所述5-HT2c受體的拮抗劑或抑制劑對5_HI^a和/或5_HT2b 受體有超過5倍的選擇性、超過10倍的選擇性、超過20倍的選擇性、超過30倍的選擇性、 超過40倍的選擇性、超過50倍的選擇性、超過60倍的選擇性、超過70倍的選擇性、超過20 倍的選擇性、超過80倍的選擇性、超過90倍的選擇性、超過100倍的選擇性，或超過150倍的選擇性。在某些實(shí)施方案中，所述5-HT2c受體的拮抗劑或抑制劑對其他5-HT、多巴胺和腎上腺素受體有相似的選擇性。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)的示例性拮抗劑或抑制劑包括LY^4002 (2_ (4_嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)、渥曼青霉素、SU6668(3-[2，4- 二甲基-5-(2-氧代-1，2- 二氫-吲哚-3-基亞基甲基)-1Η-吡咯-3-基]-丙酸)、蘋果酸舒尼替尼(SUl 1M8，SUTENT⑧)、染料木黃酮G ‘，5，7-三羥基異黃酮)、PX-866 (Ihle等， Mol Cancer Ther, 4 (9), 1349-1357, 2005), XL147 (Exelixis)和在美國公布的申請 2008/0306057A1 (見例如
段和
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段、權(quán)利要求和其中引用的公布的申請)和2008/0293706A1 (見例如，
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段和權(quán)利要求)中描述的另外的PI3K拮抗劑。Akt也被稱為蛋白激酶B(PKB)。Akt的拮抗劑或抑制劑可是Aktl、Akt2和/或 Akt3的拮抗劑或抑制劑。示例性拮抗劑或抑制劑包括LY^4005(lL-6-羥甲基-手性-肌醇 2 (R) -2-0-甲基-3-0-十八烷基碳酸鹽)、氯氮平、ALX-349 (Alexis Biochemical ； San Diego, CA)、VQD-002 ( —水合磷酸曲西立濱，VioQuest Pharmaceuticals))、磷脂酰肌醇醚脂類似物、奈非那韋(VIRACAPT)、Akt/蛋白激酶B信號抑制劑_2 (Yang等，Cancer Res，64 (13),4394-4399，2004)和 WO 2006/113837、Zhu 等，Bioorg. Med Chem Lett. 16 3150-3155(2006)和 Lindsley 等，Current Cancer Drug Targets. 8(1) :7-18(2008)中描述的另外的Akt拮抗劑。mTOR 拮抗劑包括納巴霉素(西羅莫司)、temsirolimus (CCI-779，Wyeth ； Nat Genet. 2004 ;36 :585-95 J Clin Oncol. 2004 ;22 :2336-47)、依維莫司(RAD001,Novartis) > deforolimus (AP23573, ARIAD Pharmaceuticals) > feftll^ (ABT 578) > SDZ RADGO-O(2-羥乙基)-雷帕霉素)和雷帕霉素前藥以及WO 2008/027013中描述的類似物。NV-128 (Novogen Limited)使 Akt-mT0R/p70s6k 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)解偶聯(lián)。Creb拮抗劑、NF- κ B拮抗劑和GSK-3 β激動劑也可用于本文描述的治療方法。在所有實(shí)施方案中，可進(jìn)入腦中(例如穿過血腦屏障)的拮抗劑是優(yōu)選的。各種替代形式的5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑(例如本文所述的鹽、溶劑化物、或小有機(jī)分子的多晶形物)也用于治療本文所述的孤獨(dú)癥譜系障礙。這些替代形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在某些實(shí)施方案中，5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑是誘導(dǎo)RNA干擾的分子，例如對5-HT2C受體信號通路中的多肽的基因轉(zhuǎn)錄本具有特異性的短干擾核酸(siNA)。 例如，本文所述的治療性方法中適于被拮抗或被抑制的基因的基因產(chǎn)物(例如5-HT2C受體、PI3K、Akt、mT0R、Creb和NF- κ B)可以用這種方式抑制。所述siNA減少5_HT2c受體信號通路中多肽的mRNA和蛋白質(zhì)的量，從而抑制5-HT2c受體信號通路。作為短干擾核酸(siNA)的抑制劑分子包括短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、 小RNA(miRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子，用這些分子來抑制靶基因的表達(dá)。本發(fā)明的 siNA (例如siRNA)通常通過靶RNA轉(zhuǎn)錄本的剪切/降解或靶信使RNA (mRNA)的翻譯抑制來對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個實(shí)施方案中，siRNAs是外源遞送至細(xì)胞的。在一個具體實(shí)施方案中，siRNA分子是專門針對5-HT2c受體、磷酸肌醇_3激酶(PI3K)、Akt (蛋白激酶B/ PKB)、mTOR、Creb 或 NF- κ B 產(chǎn)生的。本發(fā)明的短干擾核酸(siNA)可不進(jìn)行修飾或被化學(xué)修飾。本發(fā)明的siNA可以化學(xué)合成、從載體中表達(dá)或酶學(xué)合成。本發(fā)明還提出了能通過RNA干擾(RNAi)抑制細(xì)胞中基因表達(dá)或活性的多種化學(xué)修飾的合成的短干擾核酸(siNA)分子。使用化學(xué)修飾的siNA改進(jìn)了天然siNA分子的多種特性，例如通過對體內(nèi)核酸酶降解的抗性增加和/或改進(jìn)的細(xì)胞攝取。而且，有多種化學(xué)修飾的siNA可保留其RNAi活性。例如，在一些情況下，修飾siRNA 以改變效力、靶親和力、安全性和/或穩(wěn)定性(使它們對細(xì)胞內(nèi)降解能借具有抗性或部分抗性)。例如，可將siRNA進(jìn)行修飾(例如硫代磷酸化)以增加對核酸酶降解的抗性、結(jié)合親和力和/或攝取。另外，疏水化和生物綴合增強(qiáng)了 siRNA的遞送和靶向性(De Paula等， RNA. 13(4) :431-56，2007)，而具有核糖二氟代甲苯甲?；?ribo-difluorotoluyl)核苷酸的siRNA保持基因沉默活性(Xia等，ASCChem. Biol. 1(3) 176-83，2006)。已產(chǎn)生了對Sl核酸酶降解更具抗性的具有酰胺連接的寡核糖核苷的siRNA (Iwase R等2006 Nucleic Acids Symp Ser 50:175-176)。另外，對siRNA的2’ -糖位置和磷酸二酯鍵的修飾提高了血清穩(wěn)定性而不損失效力(Choung 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 342 (3) :919-26, 2006)。在一個研究中，包含2’ -脫氧-2’ -氟代-β-D-阿拉伯糖核酸(FANA)的反義寡核苷酸在抑制效力和對降解的抗性方面比硫代磷酸酯寡核苷酸、2’-0_甲基-RNA/DNA嵌合寡核苷酸和 siRNA 更佳(Ferrari N 等 2006Ann N Y Acad Sci 1082 :91-102)。在一些實(shí)施方案中，siNA是由基因組整合的轉(zhuǎn)基因或基于質(zhì)粒的表達(dá)載體編碼和表達(dá)的shRNA分子。因此，在一些實(shí)施方案中，能夠抑制基因表達(dá)的分子是編碼小干擾核酸的轉(zhuǎn)基因或基于質(zhì)粒的表達(dá)載體。這些轉(zhuǎn)基因和表達(dá)載體可利用聚合酶II或聚合酶 III啟動子來使這些shRNA表達(dá)并且在細(xì)胞中生成功能性siRNA。前一種聚合酶允許使用
14經(jīng)典的蛋白表達(dá)策略，包括可誘導(dǎo)的和組織特異性表達(dá)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因和表達(dá)載體受控于組織特異性啟動子。在另一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因和表達(dá)載體受控于可誘導(dǎo)的啟動子，例如四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。制作和使用這些發(fā)夾RNA以在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行基因沉默的實(shí)例在以下文章中描述，例如，O^addison等，Genes Dev, 2002,16 =948-58 ； McCaffrey 等，Nature，2002，418 :38-9 ；McManus 等，RNA 2002,8 :842-50 ；Yu 等，Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 :6047-52)。本文的一個實(shí)施方案給出了使用基因治療來遞送編碼一種或多種小干擾核酸的一種或多種表達(dá)載體(例如基于病毒的基因治療)，其能抑制例如5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(？11)3吐(蛋白激酶8/ 1 )、1111101 、0吐或順-1^8的表達(dá)。本文所用的基因治療是著眼于通過遞送一種或多種編碼治療性基因產(chǎn)物(包括shRNA)的表達(dá)載體至病變細(xì)胞來治療基因疾病(例如癌癥)的治療。構(gòu)建和遞送表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。因此，本發(fā)明給出了特異性靶向編碼例如5-HT2c受體、磷酸肌醇_3激酶(PI3K)、 Akt (蛋白激酶B/PKB)、mTOR、Creb或NF- κ B的核酸的siRNA (shRNA等)的體外應(yīng)用和包含siRNA (shRNA等)和可藥用載體的體內(nèi)藥物制劑，所述siRNA (shRNA等)可以是修飾的 siRNA (shRNA等)以增加他們在生理?xiàng)l件下的的穩(wěn)定性和/或細(xì)胞攝取。在某些實(shí)施方案中，5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑是反義核酸。反義核酸包括短寡核苷酸和較長的核酸。優(yōu)選地，所述反義核酸與5-HT2c受體信號通路中一種或多種多肽的編碼序列或5’非翻譯序列部分互補(bǔ)并結(jié)合，從而抑制功能性多肽的翻譯。其他降低或阻止轉(zhuǎn)錄的反義核酸也是有用的。因此本發(fā)明包括反義寡核苷酸，其與編碼5-HT2C受體信號通路中多肽的核酸分子選擇性結(jié)合以降低所述多肽的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯)。本文所用術(shù)語“反義寡核苷酸”描述寡核苷酸，其是寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、修飾的寡核糖核苷酸或修飾的寡脫氧核糖核苷酸，其在生理?xiàng)l件下與包含編碼5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、Akt (蛋白激酶B/PKB) ,mTOR,Creb或NF- κ B基因的DNA雜交，從而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和/或該mRNA的翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，反義寡核苷酸的確切長度及其與靶點(diǎn)的互補(bǔ)程度取決于所選的特定靶點(diǎn)，包括靶點(diǎn)的序列以及組成該序列的具體堿基。優(yōu)選地，構(gòu)建和排列所述反義寡核苷酸以使其在生理?xiàng)l件下與靶點(diǎn)選擇性結(jié)合，即在生理?xiàng)l件下，與靶序列的雜交比與靶細(xì)胞內(nèi)的任何其他序列的雜交顯著更高。根據(jù)5-HT2C受體、磷酸肌醇-3激酶 (PI3K)、Akt (蛋白激酶B/PKB)、mTOR、Creb或NF- κ B的核酸序列(包括等位或同源基因組和/或cDNA序列)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇以及合成多個本發(fā)明所用的合適的反義分子的任一種。為了具有充分的選擇性和強(qiáng)抑制作用，這些反義寡核苷酸應(yīng)包含至少10個(更優(yōu)選至少15個)與靶點(diǎn)互補(bǔ)的連續(xù)堿基，但在某些情況下，短至7個堿基長度的經(jīng)修飾寡核苷酸已成功地用作反義寡核苷酸(Wagner等，Nature Biotechnol. 14 :840 844，1996)。最優(yōu)選地，所述反義寡核苷酸包含20-30個堿基的互補(bǔ)序列。盡管可選擇對基因或mRNA轉(zhuǎn)錄本的任何區(qū)域反義的寡核苷酸，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸對應(yīng)N端或5’上游位點(diǎn)，例如翻譯起始、轉(zhuǎn)錄起始或啟動子位點(diǎn)。另外，3’非翻譯區(qū)域可作為靶點(diǎn)。以mRNA剪切位點(diǎn)作為靶點(diǎn)也在本領(lǐng)域中使用，但是如果發(fā)生選擇性mRNA剪切則可能更不優(yōu)選。另外，反義優(yōu)選以預(yù)計不會有mRNA 二級結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)(見例如 &iinio 等，Cell Mol. Neurobiol. 14(5) =439-457,1994)和預(yù)計蛋白質(zhì)不會結(jié)合的位點(diǎn)作為靶點(diǎn)。最后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地從數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的文獻(xiàn)中得到對應(yīng)于5-HT2c受體信號通路中多肽的cDNA序列和基因組DNA。因此，本發(fā)明還提供了這樣的反義寡核苷酸，其與對應(yīng)于編碼5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、Akt (蛋白激酶B/PKB)、mT0R、Creb或NF- κ B核酸的基因組DNA互補(bǔ)。類似地，不用過多實(shí)驗(yàn)，能使用與等位或同源cDNA和基因組DNA的反義作用。在一組實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸可由“天然”脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或任何其組合構(gòu)成。即一個天然核苷酸的5’端和另一個天然核苷酸的3’端可如天然系統(tǒng)中那樣通過磷酸二酯核苷間鍵連接進(jìn)行共價連接。這些寡核苷酸可通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法制備，其可以人工或通過自動合成儀進(jìn)行。它們也可通過載體重組產(chǎn)生。然而，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸還可以包括“修飾的”寡核苷酸。即所述寡核苷酸可以用多種方法修飾，這些方法不會阻止它們與它們的靶點(diǎn)雜交， 但是增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或靶向性，或者以另外方式增強(qiáng)它們治療的效果。本文所用的術(shù)語“修飾的寡核苷酸”描述了一種寡核苷酸，其中(1)至少兩個其核苷酸通過合成的核苷間鍵共價連接(即一個核苷酸的5’端和另一核酸的3’端之間除磷酸二酯鍵之外的鍵)和/或⑵將通常不與核酸相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)與寡核苷酸共價連接。優(yōu)選的合成的核苷間鍵是硫代磷酸酯、磷酸烷基酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯和肽。術(shù)語“修飾的寡核苷酸”也涵蓋有共價修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾的寡核苷酸包括具有這樣的骨架糖的寡核苷酸，其在3’位置共價連接到除羥基外的低分子量有機(jī)基團(tuán)，在5’位置共價連接到除磷酸基團(tuán)以外的有機(jī)基團(tuán)。因此修飾的寡核苷酸可包括’-0-烷基化核糖基團(tuán)。另外，修飾的寡核苷酸可包括如阿拉伯糖的糖來代替核糖。因此本發(fā)明給出了在生理?xiàng)l件下與編碼5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、Akt (蛋白激酶B/PKB)、1^( 、(>吐或順-1^8的核酸互補(bǔ)并且雜交的反義分子的體外用途以及包含修飾的所述反義分子和可藥用載體的體內(nèi)藥物制劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸可由在細(xì)胞內(nèi)引入的表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生。合適載體的選擇和設(shè)計是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力和判斷范圍內(nèi)的。包含所有表達(dá)必需元件的表達(dá)載體可購得而且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。見例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。根據(jù)該實(shí)施方案，細(xì)胞通過將編碼反義核酸的異源DNA(RNA)引入到細(xì)胞中而進(jìn)行遺傳改造。所述反義核酸放置于轉(zhuǎn)錄元件的可操作控制下，以允許反義核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)。遞送反義核酸的其他載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的?？墒褂枚喾N技術(shù)將本發(fā)明反義核酸弓丨入細(xì)胞，這取決于核酸是在體外還是體內(nèi)弓丨入宿主。這些技術(shù)包括核酸-CaP04沉淀轉(zhuǎn)染、核酸與DEAE相聯(lián)系的轉(zhuǎn)染、用包含目的核酸的病毒轉(zhuǎn)染或感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等等。對于某些用途，優(yōu)選將核酸靶向至特定細(xì)胞。 在這種情況下，用于將本發(fā)明的核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或其他病毒；脂質(zhì)體)可以具有與其連接的靶分子。例如，分子(例如對靶細(xì)胞表面膜蛋白具有特異性的抗體或靶細(xì)胞上受體的配體)可結(jié)合或并入所述核酸遞送運(yùn)載體中。在使用脂質(zhì)體來遞送本發(fā)明的核酸時，可以將與內(nèi)吞相關(guān)的表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)整合入脂質(zhì)體制劑中，以靶向和/或促進(jìn)攝取。這些蛋白質(zhì)包括針對特定細(xì)胞類型的衣殼蛋白或其片段、 在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白質(zhì)的抗體、靶向細(xì)胞內(nèi)定位并增長細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)等等。 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，聚合物遞送系統(tǒng)也已成功用于將核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)。這些系統(tǒng)甚至允許核酸的口服遞送。在某些實(shí)施方案中，5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑是特異性結(jié)合該通路多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，其導(dǎo)致該多肽的催化活性降低。本發(fā)明的抗體由多種方法的任一種制備，所述方法包括對動物施用蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、表達(dá)蛋白質(zhì)或其片段的細(xì)胞等等，以誘導(dǎo)多克隆抗體。單克隆抗體的生產(chǎn)是根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)實(shí)施的。本領(lǐng)域公知的是，僅抗體分子的一小部分(互補(bǔ)位)參與了抗體與
( —Clark, W. R. , 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley&Sons, Inc. , New York ；Roitt, I.,1991, Essential Immunology,第 7 版，Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如，pFc，和 Fc 區(qū)域是補(bǔ)體級聯(lián)的效應(yīng)物，但不參與抗原結(jié)合。已酶切掉pFc’區(qū)域的抗體或產(chǎn)生時無pFc’區(qū)域的抗體(稱為F(ab' )2片段)保留了完整抗體的兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。類似地，已酶切掉Fc區(qū)域的抗體或產(chǎn)生時無Fc區(qū)域的抗體(稱為Fab片段)保留了完整抗體分子的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。 Fab片段由共價結(jié)合的抗體輕鏈和抗體重鏈的一部分(稱為Fd)組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(一個Fd片段可與多達(dá)10個不同的輕鏈聯(lián)系而不改變抗體特異性)，而且Fd片段獨(dú)立地保留了表位結(jié)合能力。如本領(lǐng)域公知的，抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)含有直接與抗原表位相互作用的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和維持互補(bǔ)位三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)(FR)(—般參見Clark，1986 ；Roitt, 1991)。在 IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈內(nèi)均有四個構(gòu)架區(qū)(FRl至FR4)，它們分別被三個互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rl至⑶舊)分隔開。⑶R(尤其是⑶R3區(qū)域，更尤其是重鏈⑶舊)很大程度上決定了抗體的特異性。本領(lǐng)域公認(rèn)的是哺乳動物抗體的非CDR區(qū)可用非特異性或異種特異性抗體的類似區(qū)域替換，而保持原來抗體的表位特異性。這最明顯地體現(xiàn)在“人源化”抗體的開發(fā)和利用中，其中將非人CDR共價接入人FR和/或Fc/pFc’區(qū)域，來產(chǎn)生功能性抗體。見例如美國專利 4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762 和 5，859，205。完全的人單克隆抗體也可通過對轉(zhuǎn)入了人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的大部分的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫來制備。 免疫這些小鼠(例如XenoMouse (Abgenix)，HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))之后，單克隆抗體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)來制備。這些單克隆抗體含有人免疫球蛋白的氨基酸序列，因此當(dāng)施用于人時不會引起人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。因此，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是顯而易見的是，本發(fā)明也給提供F(ab' )2,Fab,Fv和Fd片段；Fc和/或FR和/或CDRl和 /或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域用同源的人或非人序列替換的嵌合抗體；FR和/或CDRl和 /或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域用同源的人或非人序列替換的嵌合F(ab' ) 2片段抗體；FR 和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域用同源的人或非人序列替換的嵌合Fab片段抗體；和FR和/或CDRl和/或CDR2區(qū)域用同源的人或非人序列替換的嵌合Fd片段抗體。本發(fā)明還包括所謂的單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域抗體以及重鏈抗體。因此，本發(fā)明涉及特異結(jié)合5-HT2C受體信號通路的多肽并且抑制功能活性的多種大小和類型的多肽。這些多肽也可從抗體技術(shù)外的來源取得。例如，這些多肽結(jié)合劑可以通過可易于在溶液、固定化形式中制備的簡并肽文庫來提供，或作為噬菌體展示文庫提供。 也可合成由包含一種或多種氨基酸的肽合成的組合文庫。還可合成肽和非肽合成結(jié)構(gòu)的文庫。5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑以有效治療對象的孤獨(dú)癥譜系障礙的量施用。有效量是足以提供醫(yī)學(xué)上期望的反應(yīng)的治療性分子的劑量。例如，期望的反應(yīng)可以是抑制孤獨(dú)癥譜系障礙的進(jìn)展。這可涉及僅暫時減緩孤獨(dú)癥譜系障礙的進(jìn)展，盡管更優(yōu)選地，它涉及永久阻止孤獨(dú)癥譜系障礙的進(jìn)展。這可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)診斷方法監(jiān)測。應(yīng)理解，本發(fā)明的治療性分子用于治療或預(yù)防孤獨(dú)癥譜系障礙，即它們可預(yù)防性地用于有發(fā)生孤獨(dú)癥譜系障礙風(fēng)險的對象。因此，有效量是指可以降低孤獨(dú)癥譜系障礙發(fā)生風(fēng)險、降低其嚴(yán)重性或可能完全防止其發(fā)生的量。涉及確定有效量的因素是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，而且可以僅用常規(guī)試驗(yàn)完成。通常優(yōu)選地，使用本發(fā)明治療性分子(單獨(dú)或者與其他治療性分子或治療方案組合) 的最大劑量，即根據(jù)合理醫(yī)療判斷的最高安全量。然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，患者可由于醫(yī)療原因、生理原因或幾乎任何其他原因堅持要求更低劑量或可忍受劑量。5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑可通過單獨(dú)施用、在藥物組合物內(nèi)或者與其他治療性分子或治療方案組合施用。任選的，其他治療性分子可同時或順次施用。當(dāng)同時施用所述其他治療性分子時，它們可在相同的或獨(dú)自的制劑中施用，但是同時施用。當(dāng)所述其他治療性分子和5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑的施用在時間上分開時， 所述其他治療性分子之間以及與5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑之間可以順次施用。施用這些分子之間的時間間隔可是幾分鐘或可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或12小時，或更長，包括1、2、3、4、5、6、7天或更長。本發(fā)明方法中使用的藥物組合物優(yōu)選無菌，而且在適于施用給對象的單位重量或體積中包含有效量的5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑以產(chǎn)生期望的反應(yīng)。施用于對象的5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑的劑量可根據(jù)不同參數(shù)選擇，尤其是根據(jù)使用的施用方式和對象的狀態(tài)。其他因素包括期望的治療時長。如果在應(yīng)用的起始量時對象的反應(yīng)不充分，可使用患者耐受力允許范圍的更高量(或通過不同的、更局部的遞送方式地遞送的有效的更高量)。一種或多種5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑的劑量可由醫(yī)生或獸醫(yī)個人來調(diào)整，尤其是在任何并發(fā)癥的情況下。通常治療有效量在0. Olmg/ kg至約1000mg/kg之間，優(yōu)選在約0. l-10mg/kg之間，例如約0. 1-lmg/kg/天之間，或在約 l-10mg/kg/天之間，每天一個或多個施用量，施用一天或多天。將藥劑有效遞送至期望的組織、細(xì)胞或體液的多種施用方式是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明分子的施用包括但不僅限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、外用、積存注射、植入、釋放時間模式、腔內(nèi)、鼻內(nèi)、吸入、鞘內(nèi)、眼內(nèi)和受控釋放。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物通過腸胃外、經(jīng)粘膜(例如經(jīng)口)、鼻、鞘內(nèi)、直腸、陰道內(nèi)、舌下、粘膜下或透皮引入。腸胃外施用是不通過消化道而是通過一些其他途徑(例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、 腹膜內(nèi)、眶內(nèi)、囊內(nèi)、脊椎內(nèi)、胸骨內(nèi)、動脈內(nèi)或皮內(nèi)施用)施用。對于本文所述的有機(jī)小分子，優(yōu)選經(jīng)口施用。技術(shù)人員可領(lǐng)會選擇施用模式需考慮的具體有利條件和不利條件。
本發(fā)明不限于本文公開的具體施用模式。本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)(例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，第 20 片反，Lippincott， Williams and Wilkins, Baltimore MD, 2001)提供了用于遞送多種藥物制劑和藥物載體制劑的施用方式和制劑。其他用于本發(fā)明的藥劑施用的方案是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，其中劑量、施用方案、施用位點(diǎn)、施用方式等與本文介紹的不同。對非人哺乳動物施用本發(fā)明的藥劑(例如為測試目的或獸用治療目的)以與上述基本相同的條件實(shí)施。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明對人和動物疾病均適用。施用時，本發(fā)明的藥物制劑以可藥用的量和可藥用的組合物使用。術(shù)語“可藥用，， 是指不干擾活性成分的生物活性效力的無毒物質(zhì)。這些制劑可常規(guī)地包括鹽、緩沖劑、防腐劑、可相容載體和任選的其他治療性分子。當(dāng)用在藥物中時，鹽應(yīng)是可藥用的，但不可藥用的鹽可方便地用于制備其可藥用的鹽，因而未排除在本發(fā)明的范圍外。這些藥理可接收鹽和可藥用鹽包括但不限于從以下酸中制備的那些鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、 醋酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而且，可藥用的鹽可作為堿金屬鹽或堿土鹽 (例如鈉、鉀或鈣鹽)制備。如期望，藥劑或組合物可與可藥用載體組合。本文所用術(shù)語“可藥用載體”是指一種或多種適合對人施用的可相容固體或液體填充物、稀釋劑或包封物質(zhì)。術(shù)語“載體”表示有機(jī)或無機(jī)成分，是天然的或合成的，活性成分與其組合以方便應(yīng)用。藥物組合物的成分還能以沒有很大地削弱所期望的藥效的相互作用的方式與本發(fā)明的藥劑混合，并且相互之間
混合ο藥物組合物可包含如上所述的合適的緩沖劑，包括醋酸、磷酸、檸檬酸、甘氨酸、硼酸、碳酸、重碳酸、氫氧化物(和其他堿)以及上述化合物的可藥用鹽。任選地，藥物組合物還可包含合適的防腐劑，例如苯扎氯銨、氯代丁醇、對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。藥物組合物可方便地以單位劑型存在，而且可通過制藥領(lǐng)域公知的任何方法制備。所有方法包括將活性劑與包含一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合的步驟。一般來說， 組合物通過均一和緊密地將活性化合物與液體載體、精細(xì)分割的固體載體或二者相結(jié)合而制備，之后如有需要，將產(chǎn)品塑形。當(dāng)期望將其全身遞送時，可將5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑配制為腸胃外注射施用，例如通過推注或連續(xù)輸注。注射制劑可與額外的防腐劑一起以單位劑型存在，例如在安瓿內(nèi)或多劑量容器內(nèi)。組合物可為懸液、溶液或油中的乳化液或水性運(yùn)載體中的乳化液的形式，而且可包含制備劑(formulatory agent)如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。腸胃外施用的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸液可作為合適的油性注射懸液制備。合適的親脂性溶劑或運(yùn)載體包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂質(zhì)體。水性注射懸液可包含增加懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述懸液還可包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解性以制備更濃縮溶液的試劑?；蛘撸龌衔锟梢允欠勰┬问?，并且在使用前與合適的運(yùn)載體(例如鹽水、緩沖液或無菌無熱原的水)重構(gòu)。適合口服施用的組合物可以分離的單位存在，例如膠囊、片劑、丸劑、錠劑，每個包含預(yù)定量的活性化合物。其他組合物包括水性液體或非水性液體中的懸液(例如糖漿、酏劑、乳液)或凝膠。用于口服的藥物制劑可作為固體賦形劑獲得，任選地將產(chǎn)生的混合物磨碎并且將顆?；旌衔锛庸?，如期望在加入合適的輔劑后獲得藥片或糖衣藥丸核。特別地，合適的賦形劑是填充劑，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇)或纖維素制劑(例如玉米淀粉、 小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。如期望可加入崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)。任選地，口服制劑也可在鹽水或緩沖液中配制，即用EDTA 來中和內(nèi)部酸性環(huán)境，或可不用任何載體而施用。還特別提出的是上述組分的口服劑型。所述組分可經(jīng)化學(xué)修飾以使該衍生物的口服遞送有效。通常，使用的化學(xué)修飾是將至少一個結(jié)構(gòu)連接至組分分子本身，其中所述結(jié)構(gòu)允許(a)抑制蛋白水解，和(b)從胃或腸攝取入血流。還期望的是增加組分的總體穩(wěn)定性以及增加體內(nèi)的循環(huán)時間。對于組分(或衍生物)，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員有可用的制劑，其不會在胃里溶解，而會在十二指腸或腸內(nèi)的其他位置釋放物質(zhì)。優(yōu)選地，該釋放會通過保護(hù)所述分子或在胃環(huán)境外(例如腸內(nèi))釋放生物活性分子而避免胃環(huán)境的不利作用。為了確保充分的胃抗性，對至少pH 5.0不滲透的包衣是必需的。用作腸包衣的更常見的惰性成分的實(shí)例是醋酸纖維素酯(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸(HPMCP)、 HPMCP 50,HPMCP 55、聚醋酸乙烯酯鄰苯二甲酸(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和蟲膠。這些包衣可用作混合的膜。包衣或包衣混合物也可用在片劑上，其目的并不在于針對胃的防護(hù)。這可包括糖衣或使片劑更容易吞咽的包衣。膠囊可由硬殼(如明膠)組成，以遞送干燥的治療劑(即粉末)；對液體形式，可用明膠軟殼。優(yōu)良的殼材料可是稠淀粉或其他可食用紙。對于丸劑、 錠劑、模壓片劑或研磨片劑，可以使用濕塊化技術(shù)(moist massing technique)。用惰性材料可稀釋或增加治療性分子的體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇、乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、修飾的葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽可也用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些市售的稀釋劑是i^st-FL0、EmdeX、STA-Rx 1500、Emcompress 禾口 Avicell。可以將崩解劑包含在將治療劑制成固體劑型的制備中。用作崩解劑的物質(zhì)包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商品化崩解劑Explotab。羥基乙酸淀粉鈉、苯酚甲醛離子交換樹脂、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮、羧甲基纖維素酸、天然海綿和膨潤土均可使用。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉末狀樹膠可作用崩解劑和粘合劑，而且這些可包括粉末狀樹膠如瓊脂、Karaya或黃蓍膠。藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。還可以用粘合劑將治療性分子保持在一起以形成硬片劑，它包括來自天然產(chǎn)物 (例如阿拉伯橡膠樹、黃蓍膠、淀粉和明膠)的物質(zhì)。其他的包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均可用于顆?；鲋委焺┑拇既芤褐?。
抗摩擦劑可包含于治療性制劑中以防止配制過程中的粘連。潤滑劑可用作治療劑和模壁之間的層，這些可包括但不限于硬脂酸(包括其鎂鹽和鈣鹽)、聚四氟乙烯(PTFE)、 液體石蠟、植物油和蠟。也可使用可溶性潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉鎂、 各種分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和Carbowax 6000?？商砑釉谂渲七^程中可改善藥物流動性并且在壓制過程中幫助重排的助流劑。助流劑可包括淀粉、滑石、氣相白炭黑和水合硅鋁化合物。為了幫助治療劑溶解到水性環(huán)境中，可添加表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可包括陰離子去污劑，例如十二烷基硫酸鈉、琥珀磺酸二辛鈉和二辛酯磺酸鈉?？墒褂藐栯x子去污劑，可包括苯扎氯或芐索氯銨?？勺鳛楸砻婊钚詣┌谥苿﹥?nèi)的可能的非離子型去污劑的名單是聚桂醇400、聚氧基-40-硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10，聚氧乙烯氫化蓖麻油50和聚氧乙烯氫化蓖麻油60、單硬脂酸甘油酯、多山醇酯40、多山醇酯60、多山醇酯65和多山醇酯80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可單獨(dú)或以不同比例的混合物存在于制劑中?？捎糜诳诜乃幬镏苿┌ㄓ擅髂z制成的推入裝配膠囊(push-fit capsule)，以及用明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠囊。推入裝配膠囊可包含活性成分與以下物質(zhì)的混合填充劑(例如乳糖)，粘合劑(例如淀粉)，和/或潤滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊里，活性化合物可溶解于或懸浮于合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可添加穩(wěn)定劑。對于鼻內(nèi)或吸入施用，5-HT2c受體信號通路的拮抗劑或抑制劑可以以加壓包裝或噴霧器提供的噴霧的形式與合適的拋射劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)一起方便地遞送。在加壓噴霧的情況下，劑量單位可通過提供閥門以遞送計量的量來確定。在吸入器或吹入器中所用的膠囊和藥筒(例如明膠的) 可被配制成包含化合物和合適粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本文還給出了 5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑的肺部遞送。在吸入時所述分子被遞送至哺乳動物的肺部，并轉(zhuǎn)運(yùn)穿過肺上皮的壁進(jìn)入血流。所給出的用于本發(fā)明實(shí)施的是設(shè)計用于治療性產(chǎn)品肺部遞送的多種醫(yī)療裝置，其包括但不限于噴霧器、計量吸入器和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。還給出了對本發(fā)明藥物組合物的鼻(或鼻內(nèi))遞送。對鼻施用治療性產(chǎn)品之后， 鼻遞送允許本發(fā)明的藥物組合物通過鼻直接進(jìn)入血流，而不需要使所述產(chǎn)品在肺部沉積。對于鼻施用，有用的設(shè)備是連接有計量噴霧器的小硬瓶。在一個實(shí)施方案中，計量劑量的遞送是通過將本發(fā)明的藥物組合物溶液吸入一定體積的室內(nèi)，該室具有其大小能在室內(nèi)的液體被壓縮時通過形成噴霧來霧化和噴霧制劑的孔。壓縮所述室以施用本發(fā)明的藥物組合物。在一個具體實(shí)施方案中，所述小室是活塞裝置。這些設(shè)備是市售的。或者，使用帶有孔或開口的塑料擠壓瓶，所述孔或開口的大小能在擠壓時通過形成噴霧來霧化噴霧制劑。開口通常在瓶子頂部，而且頂部通常逐漸變細(xì)以部分適應(yīng)噴霧制劑在鼻腔中的有效施用。優(yōu)選地，鼻吸入器會提供計量的量的噴霧制劑以施用定量劑量的藥物。除前面描述的制劑外，化合物也可作為積存(cbpot)制劑配制。這種長效制劑可與合適的聚合物或疏水材料(例如在可接受油中的乳化劑)或離子交換樹脂一起或作為微溶的衍生物(例如作為微溶的鹽)配制。藥物組合物也可包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物(例如聚乙二醇)。5-HT2C受體信號通路的抑制劑或拮抗劑適用于多種藥物遞送系統(tǒng)。關(guān)于藥物遞送方法的簡要綜述，見Langer，Science 249 1527-1533，1990，通過引用并入本文。5-HT2C受體信號通路的抑制劑或拮抗劑可包含于控制釋放系統(tǒng)中。術(shù)語“控制釋放”是指任何含有藥物的制劑，藥物從制劑中釋放的方式和曲線是受控的。這是指立即以及非立即釋放制劑，其中非立即釋放包括但不限于持續(xù)釋放和延遲釋放制劑。所用術(shù)語“持續(xù)釋放”(也被稱為“延長釋放”)，是其慣用意義，指藥物制劑在延長的時間內(nèi)提供藥物的逐步釋放，優(yōu)選但非必需地，這導(dǎo)致在延長的時間內(nèi)血中的藥物水平基本穩(wěn)定。所用術(shù)語“延遲釋放”是其慣用意義，指一種藥物制劑，其中所述制劑的施用和藥物從中釋放之間有時間延遲。“延遲釋放”可以或可以不涉及在延長的時間內(nèi)藥物的逐步釋放，因此可以或可以不 “持續(xù)釋放”。使用長期的持續(xù)釋放植入物可尤其適用于治療慢性病癥。本文所用的“長期”釋放是指構(gòu)建和安排植入物以在至少7天(優(yōu)選30-60天)中遞送活性成分的治療性水平。長期持續(xù)釋放植入物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，而且包括以上所述釋放系統(tǒng)中的一些。本發(fā)明還涉及使用藥盒。在本發(fā)明的某些方面，所述藥盒可以包括藥物制劑瓶、藥物制劑稀釋劑瓶和本文所述的5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。含有藥物制劑稀釋劑的瓶是任選的。稀釋劑瓶包含稀釋劑(例如生理鹽水)用于稀釋所述分子的濃縮溶液或凍干粉末。說明書可包括將特定量的稀釋劑與特定量的濃縮藥物制劑混合從而制備用于注射或輸注的最終制劑的說明。說明書可包括用有效量的分子治療對象的說明。應(yīng)理解， 包含制劑的容器(不論容器是罐、有間隔的瓶、有間隔的安瓿、輸液袋等等)可包含標(biāo)記，例如當(dāng)制劑已高壓滅菌或以其他方式滅菌時顏色改變的常規(guī)標(biāo)記。還根據(jù)本文對孤獨(dú)癥譜系障礙生物標(biāo)志的鑒定提出了診斷方法和這種診斷方法與治療的聯(lián)合使用。所述診斷方法可用于幫助選擇適當(dāng)?shù)闹委熀?或患者群(例如用于臨床試驗(yàn))。所述診斷方法包括評估對象中是否存在孤獨(dú)癥譜系障礙生物標(biāo)志，特別是對以頭部尺寸(周長)增加和/或社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙。如本文所述，在一些實(shí)施方案中，社交行為缺陷是社交互動缺陷和/或社交記憶缺陷。例如，如本文所述，以頭部尺寸(周長)增加和社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙與以下相關(guān)和/或由其引起=Pten基因和/或Slc6a4基因突變或變化，其導(dǎo)致如本文所述的該基因單倍體不足。因此，可篩選對象是否具有這些突變、變化或單倍體不足。所述診斷方法還可包括測試對象的巨頭畸型(腦過度生長)和/或社交能力降低(社交接觸行為缺陷)。更具體地，所述診斷方法包括分析生物樣品是否存在導(dǎo)致PTEN的表達(dá)或功能降低(PTEN缺陷)的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)變化，和/或?qū)е耂LC6A4的表達(dá)或功能降低(SLC6A4 缺陷)的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)變化。另外或可選地，所述診斷方法包括分析對象生物樣品中循環(huán)血清素的增加。ELISA測定和類似的免疫吸附測定可用于測定循環(huán)血清素的水平。與ASD相關(guān)的血清素的水平> 對照(非ASD)人群平均數(shù)之上的2倍標(biāo)準(zhǔn)差。此外，HPLC、質(zhì)譜和蛋白質(zhì)陣列也可用來測定循環(huán)血清素的水平。所述診斷方法還可與本文所述的治療方法聯(lián)合。診斷和治療方法的聯(lián)合可用于指導(dǎo)治療，例如在治療之前使用診斷方法以確定治療對象。診斷和治療方法的聯(lián)合也可用于監(jiān)測治療過程和/或病癥過程，例如在治療期間或治療之后使用診斷方法以確定對對象的治療效果。診斷方法與治療方法聯(lián)合的這種應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行。可在治療之前實(shí)施診斷方法以確定對對象用本文所述的5-HT2c受體信號通路的拮抗劑或抑制劑進(jìn)行治療的合適性?；加衅渌写朔N遺傳基礎(chǔ)并且適于本文所述治療的疾病、病癥和障礙的對象也可用相同的方法診斷和治療。尤其是攜帶Pten基因和/或Slc6a4 基因所靶向的基因或5-HT2c受體下游基因的突變或變化的對象適于本文所述的治療，而且可用相同的方法診斷和治療。標(biāo)準(zhǔn)的臨床診斷方法在本領(lǐng)域是公知的。通常這些方法包括從對象獲取樣品，該樣品可以是(但不限于)組織樣品、活檢樣品、流體樣品(例如血液、尿液、唾液、腦脊液) 等，然后對樣品進(jìn)行診斷程序。專業(yè)人員能使用許多公知的方法學(xué)來分析樣品，例如多種核酸檢測和擴(kuò)增方法(包括以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的方法)和多種蛋白質(zhì)檢測方法(包括以抗體為基礎(chǔ)的檢測方法)。在其他情況下，可以使用成像技術(shù)以進(jìn)行非侵入性診斷。通過下述實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)以任何方式解釋為對本發(fā)明的進(jìn)一步限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 :Pten和血清素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的單倍體不足共同影響腦尺寸和社交行為材料和方法動物所用的品系為B6. 129-PtentmlEps(13)(來自Frederick的國家癌癥研究所) 和B6. 129-Slc6a4tmlKpl(23)(來自Taconic)。在它們各自的機(jī)構(gòu)中，每個品系與C57BL/6 背景雜交10代以達(dá)到遺傳同質(zhì)(congenicity)。我們通過兩種交配得到本研究的小鼠 Pten+廠；Slc6a4+/+XPten+/+ ；Slc6a4+/+ 小鼠以產(chǎn)生 Pten+/+ ；Slc6a4+/+( “野生型”)和 Pten+ ； Slc6a4+/+( "Pten 單倍體不足”)小鼠，和 Pten+ ；Slc6a4+/+XPten+/+ ；Slc6a4"_ 小鼠以產(chǎn)生 Pten+/+ ；Slc6a4+廠("Slc6a4 單倍體不足”)和 Pten+廠；Slc6a4+廠("Pten 和 Slc6a4 單倍體不足”)小鼠。我們發(fā)現(xiàn)由于Pten+ ；Slc6a4+/-小鼠在胚胎期和產(chǎn)后早期的高死亡率，這種方法比Ptenv_X Slc6a4v_交配策略更具優(yōu)勢。行為測試在8周齡或12周齡進(jìn)行。所有動物以每籠2-5只小鼠成組飼養(yǎng)，基因型之間的飼養(yǎng)沒有差異。自由獲取食物和水，對動物保持12小時的光/暗周期。所有行為測試在光周期將要結(jié)束時實(shí)施。實(shí)驗(yàn)根據(jù)麻省理工學(xué)院動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)的協(xié)議并且按照 NIH的指南來實(shí)施。社交接觸將小鼠放置在頂部開口的具有不透明壁的丙烯酸盒中04”長X12” 寬X12”高)。盒子分為三個室(8”長X12”寬)，通過不透明的丙烯酸板隔開，板上有孔以供室之間通行。作為標(biāo)記，將室由左到右編號為1、2和3。室1中，將不熟悉的野生型性別和品系匹配小鼠放置在透明圓柱型丙烯酸籠內(nèi)(直徑4”X8”高)，其上具有很多孔以允許適當(dāng)通風(fēng)以及兩只小鼠之間的視覺、觸覺和嗅覺接觸。將相同的空籠置于室3。保持試驗(yàn)之間測試房間中的設(shè)備方向不變。我們之前發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)放置設(shè)備相對于測試房間的方向不會改變結(jié)果。測試之前，每天使刺激小鼠和對象小鼠單獨(dú)習(xí)慣社交接觸設(shè)備5分鐘，持續(xù) 3天。在測試當(dāng)天，小鼠再次習(xí)慣設(shè)備5分鐘。在此期間，觀察對象小鼠對室1或3的偏好性——任何基因型都未觀察到這種偏好性。之后將刺激小鼠放置到設(shè)備中，并進(jìn)行10分鐘的試驗(yàn)錄像。將得到的視頻導(dǎo)入到ImageJ軟件(http://rsb. info. nih. gov/ij/)，用計算機(jī)輔助評分，其中用自行編寫的腳本將每個室定義為目的區(qū)域，定量小鼠在每個目的區(qū)域里時的幀數(shù)。由不知道基因型的受訓(xùn)觀察員將所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行手工檢查以確保準(zhǔn)確性。嗅覺操作方法修改自(30，59)。每只小鼠放置入與飼養(yǎng)籠相同的干凈塑料籠內(nèi)， 并允許適應(yīng)環(huán)境5分鐘。將用10 μ 1蒸餾水潤濕的棉簽通過籠蓋在IOcm的高度插入一分鐘。用新棉簽將棉簽更換兩次，共提供三次，隨后用10 μ 1香草提取物(Frontier，Norway， ΙΑ)潤濕的棉簽進(jìn)行3次1分鐘的插入。提供香草之后，將5μ1檸檬提取物(Simply Organic, Boulder, CO)潤濕的棉簽提供三次，每次一分鐘。每次提供棉簽，記錄距離棉簽小于3cm的嗅聞的頻率和持續(xù)時間(秒)。前脈沖抑制我們使用了 ASR-PR01聽覺驚嚇反射測試設(shè)備(Med Associates, St. Albans, VT)。測試之前，將小鼠放入測試室1小時以適應(yīng)環(huán)境。開始試驗(yàn)前，使小鼠適應(yīng)設(shè)備2分鐘。試驗(yàn)以3-8秒(隨機(jī))的間隔進(jìn)行。試驗(yàn)由40ms的單獨(dú)驚嚇刺激(IlOdb白噪聲)或100ms之前有20ms白噪聲前脈沖(背景(60bd白噪聲)之上8db、12db或16db) 的驚嚇刺激組成。用驚嚇反射軟件(Med Associates, St. Albans, VT)記錄每種刺激設(shè)置的 5個試驗(yàn)。結(jié)果為了測試Pten和Slc6a4之間潛在的相互作用，我們首先需要確定與ASD相關(guān)的表型讀出。ASD中最廣泛報道的神經(jīng)解剖學(xué)異常之一是巨頭畸型，其在成人中有10-30%的發(fā)病率，發(fā)育中發(fā)病率高達(dá)60% (17)。對ASD患者的研究表明，腦尺寸與ASD相關(guān)測量中的行為表型嚴(yán)重性呈正相關(guān)(18，19)。小鼠腦內(nèi)Pten的條件性敲除的報告描述了巨頭畸型表型，其中細(xì)胞體大小和軸突肥大的增加可能引起了這些表型00-22)。我們通過將Pten單倍體不足小鼠與攜帶有前述Slc6a4功能喪失等位基因的品系雜交而產(chǎn)生了 Pten和Slc6a4 復(fù)合雜合突變小鼠0；3)。我們集中研究生殖細(xì)胞雜合小鼠以將臨床相關(guān)性最大化。為了檢查Pten或Slc6a4單倍體不足小鼠是否表現(xiàn)出腦過度生長，我們獲得了總腦量的測量值，以體重歸一化以說明身體大小的變化。這些數(shù)據(jù)表明，Pten或Slc6a4的單倍體不足雄性或雌性中均導(dǎo)致了巨頭畸形表型(圖1A-C)。而且，Pten+;SlC6a4"_小鼠有額外的腦過度生長表型，該表型比Pten或Slc6a4單倍體不足小鼠中觀察到的更嚴(yán)重(圖1A-C)。盡管對生長的作用的細(xì)胞機(jī)制還有待確定，這些數(shù)據(jù)表明Pten和Slc6a4共同作用以影響與ASD相關(guān)的表型，即腦過度生長。上述結(jié)果證明，Pten單倍體不足小鼠可以是檢查以與多基因ASD相關(guān)的方式與 Pten相互作用的第二位點(diǎn)遺傳修飾物以及測試環(huán)境改變的影響和治療性化合物的影響的有用工具。為研究Pten單倍體不足小鼠是否具有對ASD相關(guān)行為表型的表面有效性 (surface validity)，我們用幾個行為測定來測試12周齡小鼠。我們所用的測定測試社交能力(這反映了患ASD個體中所見的主要診斷性缺陷04))以及前脈沖抑制(對感覺運(yùn)動
24門控的測量，據(jù)報道這在患ASD的個體中是異常的05-217))。為了測試社交行為中可能起混淆作用的因素(嗅覺功能)，我們對Pten單倍體不足小鼠和對照進(jìn)行在習(xí)慣化-去習(xí)慣化測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小鼠反應(yīng)正常(圖6)，這表明他們嗅覺功能沒有重大障礙。為測試社交接觸行為，我們使用一種設(shè)備的改變形式，其中小鼠要選擇與不熟悉的性別和年齡匹配的刺激小鼠還是無生命物體互動08二9)(圖2A)。盡管兩種性別的野生型小鼠對在社交室內(nèi)存留均顯示了明顯的偏好，Pten單倍體不足的雌性小鼠未顯示出這種偏好，而且它們在社交和非社交室存留的時間大致相等(圖2B)。雄性Pten單倍體不足小鼠在社交接觸行為上未表現(xiàn)出同樣的缺陷(圖2C)。在Pten單倍體不足小鼠和對照的感覺運(yùn)動門控測試中， 我們發(fā)現(xiàn)兩種性別均在聽覺驚嚇反應(yīng)的前脈沖抑制中存在缺陷(圖2D)。我們關(guān)于Pten單倍體不足小鼠的結(jié)果與CNS特異Pten條件性敲除小鼠(其中對動物做了多種ASD相關(guān)表型測試)的行為結(jié)果大體一致01)。不同之處是在雄性中所見的社交接觸的最初傾向，其中條件性敲除顯示缺陷，而Pten單倍體不足小鼠并未顯示。這些差異最有可能是由于這兩個回補(bǔ)模型中遺傳操作的不同性質(zhì)。鑒定這些模型中不同行為表型的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)應(yīng)對 Pten如何影響與ASD相關(guān)的神經(jīng)回路發(fā)展提供更深入理解。為了測試我們在Pten+A雌性小鼠中觀察的社交接觸表型是否可被Slc6a4單倍體不足改變(如同對腦尺寸那樣)，我們檢查了 8周齡雌性野生型、Pten單倍體不足、Slc6a4 單倍體不足和Pten+ ;slc6a4+/_復(fù)合突變小鼠。Slc6a4單倍體不足和Pten+ ；Slc6a4+/_小鼠在嗅覺習(xí)慣化-去習(xí)慣化測試中反應(yīng)正常(圖6)，這提示這些小鼠的嗅覺沒有重大障礙。 我們發(fā)現(xiàn)Slc6a4單倍體不足小鼠與野生型小鼠相比，在社交接觸測定中顯示出對與刺激小鼠互動偏好的下降，盡管這沒有低于顯著性閾值。然而，Pten+ ；Slc6a4+/-小鼠對與刺激小鼠互動沒有表現(xiàn)出顯著的偏好(圖3A)。用社交接觸回避得分08)(在社交室1的時間減去在非社交室3的時間)來分析這些數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)Ptenv- ；SlC6a4v_小鼠與刺激小鼠互動時間比野生型、Pten單倍體不足、或Slc6a4單倍體不足小鼠顯著減少(圖。該結(jié)果與以下結(jié)論一致，即Pten和Slc6a4的單倍體不足加合性作用以影響與ASD相關(guān)的行為表型一社交接觸。為了進(jìn)一步檢查Ptenv_雄性小鼠的社交接觸，我們測試了 8周齡雄性野生型、 Pten單倍體不足、Slc6a4單倍體不足和Ptenv_ ；Slc6a4v_小鼠的社交接觸和認(rèn)知行為。為此，我們根據(jù)用于測試Oxytocin敲除小鼠(其顯示了正常的起始社交調(diào)查行為，但是30分鐘后的再暴露時未能認(rèn)出相同的社交目標(biāo))的社交認(rèn)知的試驗(yàn)方案調(diào)整我們的3室裝置 (30-32)。與我們在12周齡雄性野生型和Pten單倍體不足小鼠中的發(fā)現(xiàn)一致(圖2C)，在第一個10分鐘試驗(yàn)中(試驗(yàn)1)，我們沒有觀察到雄性組中任一基因型的社交互動偏好的顯著變化(圖3C)。在對相同社交目標(biāo)的再接觸的試驗(yàn)2中(5分鐘)，野生型小鼠在調(diào)查對照和含有刺激小鼠的室時表現(xiàn)出同樣的興趣，據(jù)推測該作用是由于習(xí)慣(圖3C)。相反， Pten單倍體不足、Slc6a4單倍體不足和Ptenv_ ；Slc6a4+/"小鼠在第一次和第二次試驗(yàn)中沒有顯示出社交調(diào)查偏好的減弱(圖3D)。這一發(fā)現(xiàn)提示Pten和Slc6a4單倍體不足可能有損雄性小鼠的社交認(rèn)知；然而，有必要進(jìn)行進(jìn)一步測試以將社交認(rèn)知通路(即催產(chǎn)素-后葉加壓素-多巴胺)中的特異性缺陷和社交互動中的持續(xù)興趣區(qū)分開。在前脈沖抑制測試中，Pten和Slc6a4單倍體不足之間關(guān)系似乎是顯性上位的 (epistatically dominant)而不是疊加的，其中Pten單倍體不足和Pten+廠；Slc6a4+廠小鼠與野生型相比均有顯著的損害，而相互比較則沒有(圖3D)。這提示對于行為背后的腦環(huán)路發(fā)育而言，Pten和Slc6a4之間的相互作用可能有一定程度的特異性。我們推測，Pten 和Slc6a4的共同作用對涉及社交行為的環(huán)路的組裝和功能尤其重要，與對腦尺寸的控制一樣，但對參與其他與ASD相關(guān)的行為(例如感覺運(yùn)動門控)的環(huán)路并不是必需的。我們接下來研究了在基因型之間和在每個基因型內(nèi)社交接觸表型是否與腦尺寸相關(guān)。分析群平均值揭示了腦尺寸(相對于體重)與基因型之間的社交接觸回避得分之間呈負(fù)相關(guān)(圖4A)。出人意料的，每個基因型中單個對象的分析顯示了每組的這些測量值之間明顯正相關(guān)，而Slc6a4單倍體不足小鼠可能是個例外，其表現(xiàn)出更多的變化性(圖4B 至E)。這表明Pten和Slc6a4的單倍體不足導(dǎo)致伴隨腦尺寸增加的社交能力降低。然而， 在每一個這些基因型中，組內(nèi)因素似乎引起了伴隨腦尺寸增加的社交能力升高。血清素信號(包括Slc6a4)和PII通路(包括Pten)可相互作用而影響腦發(fā)育的機(jī)制在圖7中說明。一種可能性是Pten和血清素受體可以調(diào)節(jié)方式進(jìn)行物理相互作用，從而影響腦發(fā)育。在神經(jīng)元中，Pten結(jié)合5-HT2c受體，并通過其磷酸酶活性限制該受體的激動劑誘導(dǎo)活化，并且調(diào)節(jié)在腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的激發(fā)率(10)。我們進(jìn)行了 5-HT2C受體的特異性拮抗劑SB 242084(33)對雌性Pten單倍體不足小鼠的社交接觸行為影響的初步測試，發(fā)現(xiàn)這種藥物可補(bǔ)償社交接觸行為的缺陷(圖幻。有趣的是，已報道的減輕孤獨(dú)癥癥狀的三種藥(非典型抗精神病藥物利培酮(34)和奧氮平(3 和抗抑郁藥氟西汀(36))除對血清素和多巴胺通路的其他成員有公知的作用外，均對5-HT2C受體有拮抗作用。根據(jù)我們在本文中報道的發(fā)現(xiàn)，我們提出對5-HT2C受體的拮抗可能與這些藥物在孤獨(dú)癥中的作用相關(guān)。討論關(guān)于腦的結(jié)構(gòu)和功能，我們發(fā)現(xiàn)兩種性別的Pten單倍體不足小鼠都有腦過度生長，而且雌性在社交接觸行為方面有缺陷。我們發(fā)現(xiàn)這些表型可以疊加方式被Slv6a4單倍體不足改變。這些發(fā)現(xiàn)是驚人的，因?yàn)楣陋?dú)癥影響雄性超過雌性，比例約為4 1。目前我們不知道為何在Pten單倍體不足小鼠的社交行為中觀察到性別的不同作用。重要的是要強(qiáng)調(diào)，我們使用的社交接觸測定僅涉及了嚙齒動物中可能與ASD相關(guān)的社交行為的一方面。有必要進(jìn)行進(jìn)一步的行為測試(例如超聲發(fā)聲或社交獎勵)以充分表征這些小鼠社交缺陷的程度和性質(zhì)；可能這些測試還可揭示雄性Pten單倍體不足小鼠的缺陷。然而，在我們測定中這些性別差異的一個有趣的可能線索來自免疫系統(tǒng)功能障礙(特別是自身免疫) 與ASD之間聯(lián)系的證據(jù)報告(19，37，38)。尸檢研究還顯示ASD中幾個神經(jīng)性炎癥的標(biāo)志的表達(dá)升高(39)。重要的是，Ptenv_小鼠有免疫系統(tǒng)異常(包括自身免疫)而且與雄性小鼠相比，這些作用在雌性小鼠更加明顯GO)。這表明Pten單倍體不足小鼠會是研究性別和免疫系統(tǒng)功能紊亂對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響的有用模型。我們提出血清素受體5-HT2cR的調(diào)節(jié)是ASD潛在治療性靶點(diǎn)。除SB 24208夕卜， 已經(jīng)開發(fā)了其他幾種藥物，其對5-HT2cR的拮抗作用比利培酮(34)、奧氮平(3 和氟西汀(36)更具特異性；我們預(yù)計這些也可用作ASD的治療劑。這些藥物的實(shí)例包括FR 260010(41)和RS 102221 (42) 除作用于血清素受體5_HT2cR外，還有可能的是PII/Akt 通路直接由血清素信號調(diào)節(jié)。在培養(yǎng)的嚙齒動物海馬神經(jīng)元中，加入5-HT1A受體激動劑可激活A(yù)kt，而且該激活可通過PII的藥理抑制而被阻止03)。早在胚胎發(fā)育中期，5-HT1A受體就在腦中表達(dá)G4)，這提示甚至從形態(tài)發(fā)生的早期階段，該受體的活性改變可更改腦發(fā)育的過程。5-HT1B受體的刺激也能激活A(yù)ktGO。有證據(jù)表明，這種受體調(diào)節(jié)軸突對新腦皮層發(fā)育的導(dǎo)向因子的應(yīng)答G6)，并且作用于該受體的過量的血清素是Slc6a4敲除小鼠中特異性細(xì)胞構(gòu)筑異常的原因G7)。這兩種機(jī)制均指向能夠影響形態(tài)發(fā)生、生長和神經(jīng)元功能的分子，包括mTOR、GSK-3 β、Creb和NF- κ B。有趣的是，血清素刺激增加小鼠腦中 GSK-3 β在位磷酸化水平08)，以及血清素缺陷降低了小鼠腦中GSK-3 β在位磷酸化水平09)。GSK-3i3在義沖位由Pten通過Akt調(diào)節(jié)參與了神經(jīng)元極性的建立和維持(50)，據(jù)報道磷酸化GSK-3i3升高的水平與CNS中條件性敲除Pten的小鼠腦中的水平一樣。雖然將需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個模型，但對于一部分患有ASD的個體而言，血清素和Pten-PII通路共同指向的分子可能被證明是有用的生物標(biāo)志和治療性靶點(diǎn)。我們的數(shù)據(jù)還提示，本研究所檢查基因型間的腦尺寸與社交能力之間存在負(fù)相關(guān)。然而，在給定的基因型組內(nèi)的動物個體水平上，我們發(fā)現(xiàn)在腦尺寸和社交能力之間有顯著的正相關(guān)。我們將這一發(fā)現(xiàn)解釋為社交能力在改變腦尺寸上是有益和有害的兩種方式。 我們已確定Pten和Slc6a4單倍體不足疊加地導(dǎo)致腦尺寸的相關(guān)增加以及社交能力的降低?？赡茏鳛槠淅^發(fā)作用并且可能反映環(huán)境對神經(jīng)可塑性的影響，我們推測特異性的通路以有關(guān)社交能力的有益方式影響腦尺寸。而在孤獨(dú)癥中，臨床數(shù)據(jù)表明了頭圍和社交能力之間的負(fù)相關(guān)(18，19)，許多研究的證據(jù)表明，靈長類動物和其他動物的腦尺寸和社交復(fù)雜性之間存在正相關(guān)(在(51)中綜述)。不同的生物學(xué)通路影響腦尺寸并導(dǎo)致關(guān)于社交能力的不同結(jié)果的可能性可能有助于解釋這一悖論。我們提出這一假說，即這些通路可作為物種內(nèi)及物種間社交行為改變的進(jìn)化基礎(chǔ)發(fā)揮作用。我們的結(jié)果還表明，總體腦尺寸可作為篩選與血清素與PII通路的相互作用的方便的表型讀出。今后的研究將旨在表征引起本文報告的解剖學(xué)和行為表型的機(jī)制，以及遺傳、環(huán)境和藥理操作如何影響這些表型。會令人感興趣的是檢查所提出的ASD病理生理機(jī)制(包括刺激/抑制率的增加(5 和額葉皮質(zhì)中局部相對于長距離連接性的改變 (53))在這個模型中是否明顯。ASD中已觀察到從頭基因組拷貝數(shù)的變異率升高(54)。由于Pten具有維持基因組穩(wěn)定性的作用，而且Pten缺失導(dǎo)致雙鏈DNA碎片的累積(55，56)， PTEN單倍體不足的背景可增加繼發(fā)改變事件發(fā)生的可能性，例如與ASD相關(guān)基因的拷貝數(shù)異化。至于環(huán)境改變因素，多氯聯(lián)苯(PCB)是一類能干擾新皮層發(fā)育的有機(jī)化合物，并且它是ASD病因中與遺傳易感性相互作用的候選因素(57)。有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明一種PCB(PCB77) 通過PII通路改變一氧化氮信號和NF- κ B的活性，而且這種作用可通過抑制PII而抵消 (58)。鑒于PTEN作為PII信號的負(fù)調(diào)節(jié)子的作用，我們提出這一假說，即PTEN單倍體不足可能是對暴露于環(huán)境毒素(影響PII通路(例如PCB))應(yīng)答的ASD易感性的遺傳風(fēng)險因子反應(yīng)。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1.一種用于治療孤獨(dú)癥譜系障礙的方法，其包括對需要該治療的對象施用一種或多種治療性分子，所述治療性分子是5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑是對治療所述對象有效的量的(1) 5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、Akt、mT0R、Creb和/或NF- κ B 的拮抗劑或抑制劑，和/或0)GSK-3i3激活子的激動劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中施用5-HT2C受體的拮抗劑或抑制劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述5-HT2C受體的拮抗劑或抑制劑是可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述5-HT2c受體的拮抗劑或抑制劑是SBM2084。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述SBM2084的施用劑量是約0.1-lmg/kg/天。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述SBM2084的施用劑量是約l-10mg/kg/天。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述SBM2084以約0.l-10mg/kg的劑量間歇施用。
9.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑并未作為非典型抗精神病藥物、選擇性血清素再攝取抑制劑(SSRI)或PPAR-γ激動劑上市 (截至本申請?zhí)峤蝗?。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑不是利培酮、 奧氮平、齊拉西酮、氟西汀或噻唑烷二酮類。
11.權(quán)利要求1的方法，其中施用PUK的拮抗劑或抑制劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述PI3K的拮抗劑或抑制劑是可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述PUK的拮抗劑或抑制劑是舒尼替尼(SUTENT1 )。
14.權(quán)利要求1的方法，其中施用Akt的拮抗劑或抑制劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述Akt的拮抗劑或抑制劑是可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述Akt的拮抗劑或抑制劑是氯氮平或尼非那韋 (VIRACEPT)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中施用mTOR的拮抗劑或抑制劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述mTOR的拮抗劑或抑制劑是可以進(jìn)入腦中的拮抗劑或抑制劑。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述mTOR的拮抗劑或抑制劑是雷帕霉素(西羅莫司)。
20.權(quán)利要求1的方法，其中施用Creb的拮抗劑或抑制劑。
21.權(quán)利要求1的方法，其中施用NF-KB的拮抗劑或抑制劑。
22.權(quán)利要求1的方法，其中施用GSK-3i3激活子的激動劑。
23.權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象是人。
24.權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或鞘內(nèi)施用。2
25.權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之后施用。
26.權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)的方法，其中所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之前預(yù)防性施用。
27.權(quán)利要求1至沈中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象沒有其他需要用所述5-HT2c受體信號通路的拮抗劑或抑制劑治療的癥狀。
28.權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)的方法，其還包括測試所述對象的PTEN缺陷和/或 SLC6A4缺陷和/或循環(huán)血清素的增加。
29.權(quán)利要求28的方法，其中僅在所述測試檢測到PTEN缺陷和/或SLC6A4缺陷和/ 或循環(huán)血清素的增加時對所述對象施用所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。
30.權(quán)利要求1至四中任一項(xiàng)的方法，其還包括測試所述對象的巨頭畸型(腦過度生長)和/或社交行為缺陷，如社交互動缺陷和/或社交記憶缺陷。
31.權(quán)利要求30的方法，其中僅在所述測試檢測到巨頭畸型和/或社交行為缺陷時對所述對象施用所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。
32.權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)的方法，其還包括對所述對象施用針對孤獨(dú)癥譜系障礙的第二治療劑，其中所述第二治療劑和所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑以有效治療所述對象的組合量施用。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述第二治療劑是利培酮、奧氮平、齊拉西酮、氟西汀或 PPAR- γ激動劑。
34.一種用于治療孤獨(dú)癥譜系障礙的方法，其包括對需要該治療的對象施用有效量的以下分子來治療所述對象一種或多種降低 5-HT2c受體、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、Akt、mT0R、Creb和/或NF- κ B表達(dá)的分子，和/或一種或多種提高GSK-3i3表達(dá)的分子。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述一種或多種降低表達(dá)的分子是一種或多種誘導(dǎo)RNA 干擾的分子。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述一種或多種誘導(dǎo)RNA干擾的分子是一種或多種短干擾核酸(siNA)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述一種或多種siNA分子是短干擾RNA(siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、小 RNA(miRNA)和短發(fā)夾 RNA (shRNA)分子。
38.權(quán)利要求34至37中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象是人。
39.權(quán)利要求34至38中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種提高表達(dá)的分子經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或鞘內(nèi)施用。
40.權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之后施用。
41.權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子在診斷為孤獨(dú)癥譜系障礙之前預(yù)防性施用。
42.權(quán)利要求34至41中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象沒有其他需要用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種升高表達(dá)的分子治療的癥狀。
43.權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)的方法，其還包括測試所述對象的PTEN缺陷和/或SLC6A4缺陷和/或循環(huán)血清素的增加。
44.權(quán)利要求43的方法，其中僅在所述測試檢測出PTEN缺陷和/或SLC6A4缺陷和/ 或循環(huán)血清素的增加時對所述對象施用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種提高表達(dá)的分子。
45.權(quán)利要求34至44中任一項(xiàng)的方法，其還包括測試所述對象的巨頭畸型(腦過度生長)和/或降低的社交能力(社交接觸行為缺陷)。
46.權(quán)利要求45的方法，其中僅在所述測試檢測出巨頭畸型和/或降低的社交能力時對所述對象施用所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種提高表達(dá)的分子。
47.權(quán)利要求34至46中任一項(xiàng)的方法，其還包括對所述對象施用針對孤獨(dú)癥譜系障礙的第二治療劑，其中所述第二治療劑和所述一種或多種降低表達(dá)的分子和/或一種或多種提高表達(dá)的分子以有效治療所述對象的組合量施用。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述第二治療劑是所述5-HT2C受體信號通路的拮抗劑或抑制劑。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述第二治療劑是利培酮、奧氮平、齊拉西酮、氟西汀或 PPAR- γ激動劑。
50.一種用于診斷以頭部尺寸(周長)增加和/或社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙的方法，其包括分析來自對象的生物樣品中孤獨(dú)癥譜系障礙的一種或多種生物標(biāo)志是否存在，其中所述一種或多種生物標(biāo)志是(I)Pten基因和/或Slc6a4基因中一種或多種突變或表觀遺傳學(xué)變化的存在，和/或(2)相對于循環(huán)血清素水平的正常范圍，循環(huán)血清素水平的增加，其中孤獨(dú)癥譜系障礙的所述一種或多種生物標(biāo)志的存在表明所述對象患有以頭部尺寸(周長)增加和/或社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述Pten基因和/或Slc6a4基因的一種或多種突變或表觀遺傳學(xué)變化導(dǎo)致PTEN的表達(dá)或功能降低和/或SLC6A4的表達(dá)或功能降低。
52.權(quán)利要求50或51的方法，其還包括準(zhǔn)備表明所述對象的孤獨(dú)癥譜系障礙狀態(tài)的報生1=1 O
53.權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)的方法，其還包括給對所述患者施用健康護(hù)理的臨床醫(yī)生提供所述生物樣品的分析。
54.權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)的方法，其中所述社交行為缺陷是社交互動缺陷和/或社交記憶缺陷。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷和治療孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorders)的方法，尤其是用于診斷和治療以頭部尺寸(周長)增加和社交行為缺陷為特征的孤獨(dú)癥譜系障礙的方法。
文檔編號C12N15/09GK102348798SQ201080011989
公開日2012年2月8日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者姆里甘卡·蘇爾, 達(dá)蒙·西倫·佩奇 申請人:麻省理工學(xué)院