專利名稱：核酸的檢測方法以及試劑盒、裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠?qū)νㄟ^核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測的核酸檢測方法和試劑盒、裝置。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域、基因檢查等臨床應(yīng)用領(lǐng)域中，特異性擴(kuò)增靶標(biāo)核酸片段的方法成為非常重要的技術(shù)。在這樣的基因擴(kuò)增方法中，除了最通用的PCR法 (Polymerase Chain Reaction)以外，還開發(fā)出了無需PCR法中不可缺少的復(fù)雜溫度控制的LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等溫?cái)U(kuò)增方法。作為通過PCR法、LAMP法、ICAN法等擴(kuò)增出的特定核酸區(qū)域的檢測方法，大致可以分為對作為擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA進(jìn)行檢測的方法、和對作為副產(chǎn)物的焦磷酸(二磷酸)進(jìn)行檢測的方法這兩類。檢測雙鏈核酸的最一般方法已知有對擴(kuò)增反應(yīng)后的溶液實(shí)施瓊脂糖電泳，使之結(jié)合Khidium Bromide、SYBR Green等熒光性嵌入劑，并觀察特異性的熒光的方法(非專利文獻(xiàn)1)。但是，電泳后用Khidium Bromide等熒光性嵌入劑進(jìn)行染色的方法需要30分 1小時(shí)左右的泳動(dòng)時(shí)間，而且需要用于檢測熒光的紫外線照射裝置、熒光檢測器等昂貴的機(jī)械。此外，作為無需進(jìn)行電泳、而對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測和定量的方法，已知有通過預(yù)先在PCR開始前的反應(yīng)液中添加熒光性嵌入劑，并使用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，來測定擴(kuò)增DNA量的方法(專利文獻(xiàn)1)。但是，熒光性嵌入劑與引物等單鏈核酸結(jié)合，因而導(dǎo)致不依賴于雙鏈核酸量的背景信號增強(qiáng)、檢測靈敏度降低的問題。與此相對，已知有通過用優(yōu)先與結(jié)合了單鏈核酸的嵌入劑反應(yīng)的化合物進(jìn)行處理，來降低背景信號的方法(專利文獻(xiàn) 2)。但是，在采用這些方法的情況下，需要用于檢測熒光的裝置、設(shè)備。作為上述以外的方法，例如已知有使用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)、并通過熒光偏光來檢測該核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(專利文獻(xiàn)幻。但是，這需要對未進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記引物的分離操作，不僅煩雜，而且由于引物的分離操作，存在所得核酸擴(kuò)增片段的收獲量減少、結(jié)果導(dǎo)致檢測靈敏度降低的隱患。此外，一般而言，標(biāo)記核苷酸、標(biāo)記引物非常昂貴，在成本方面也存在問題。此外，還已知使偏振光通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的反應(yīng)液，并通過測定該偏振光的旋光度或圓偏光二色性來檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(專利文獻(xiàn)4)。但是，旋光度、圓偏光二色性的測定需要特殊裝置?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 特開平5-237000號公報(bào)專利文獻(xiàn)2 國際公開第2002/103053號
專利文獻(xiàn)3 特開平9-187275號公報(bào)專利文獻(xiàn)4 特開2002-186481號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 =Molecular Cloning second edition, vol. 1,6. 15(1989)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的課題是提供無需特殊裝置、簡便且高精度地目測檢測采用核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸的核酸檢測方法、和核酸檢測裝置或試劑盒。解決問題的方法本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的前或后添加因與核酸結(jié)合而色調(diào)發(fā)生變化的染料，通過在可見光下進(jìn)行觀察，能夠檢測核酸擴(kuò)增的有無。而且獨(dú)立發(fā)現(xiàn)通過添加與結(jié)合雙鏈核酸的染料相比、優(yōu)先和與單鏈核酸結(jié)合了的染料、未與核酸結(jié)合的染料反應(yīng)的化合物，改變或者消除來源于除了與雙鏈核酸結(jié)合了的染料以外的色調(diào)，能夠簡便且高精度地目測檢測上述核酸擴(kuò)增片段。而且，還制作了利用本方法的目測核酸檢測試劑盒、裝置，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測方法，其包括(1)使被檢物與染料接觸并反應(yīng)的步驟；(2)在可見光下觀察該反應(yīng)生成的物質(zhì)，目測判定核酸的存在的步驟。優(yōu)選在所述步驟(1)的前或后包括使與染料反應(yīng)的物質(zhì)與被檢物接觸的步驟 ⑶。所述染料優(yōu)選是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、堿或pH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。此外，本發(fā)明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測裝置或試劑盒，其包含(a)保持了能夠與核酸結(jié)合的染料的載體；(c)被檢物通過載體(a)的路徑；和(d)在可見光下觀察由被檢物與染料的反應(yīng)而生成的物質(zhì)、并目測判定核酸的存在的判定部位。優(yōu)選在所述載體(a)與判定部位(d)之間具有(b)保持與染料反應(yīng)的物質(zhì)的載體。所述染料優(yōu)選是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、堿、或pH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。所述染料優(yōu)選是選自三苯基甲烷類染料、噻嗪類染料、嶸嗪類染料、吖嗪類染料、 夾氧雜蒽類染料、和菲啶饋鹽類染料中的1種以上的染料。此外，所述染料優(yōu)選是選自結(jié)晶紫、龍膽紫B、維多利亞藍(lán)B、甲基紫、夜光藍(lán)、甲基綠、甲苯胺藍(lán)0、天青B、亞甲基藍(lán)、亮甲酚藍(lán)、甲基橙、派洛寧Y、溴化乙錠和中性紅中的1種以上的染料。所述與染料反應(yīng)的物質(zhì)優(yōu)選是選自氧化劑、還原劑、酸、堿、或pH緩沖劑中的1種以上的化合物。
所述酸優(yōu)選是選自鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和乳酸中的1種以上的酸。所述堿優(yōu)選是選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氨和三乙基胺中的1 種以上的堿。所述氧化劑優(yōu)選是選自過氧化氫、高錳酸鉀、氯酸鉀、重鉻酸鉀、溴酸鈉、溴酸鉀、 鹵素、濃硫酸、硝酸、次氯酸鈉、二氧化氯、氯胺、四氧化鋨、二甲基亞砜和間氯過苯甲酸中的 1種以上的氧化劑。所述還原劑優(yōu)選是選自硼氫化鈉、氰化硼氫化鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、次硫酸鈉、焦亞硫酸鉀、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、抗壞血酸、2-巰基乙醇、DL-二硫蘇糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1種以上的還原劑。所述pH緩沖劑優(yōu)選是選自戈氏緩沖液(Good’ s Buffers)、甘氨酸、磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1種以上的PH緩沖劑。此外，本發(fā)明涉及核酸的檢測裝置或試劑盒，其包含(e)保持能夠與核酸結(jié)合的染料、并具備能夠因外力而形成開口從而釋放出染料的開口部的載體；(f)將釋放出的染料引導(dǎo)向判定部位的路徑；和(d)保持導(dǎo)入的被檢物、在可見光下觀察因從載體(e)經(jīng)由路徑(f)導(dǎo)入的染料與保持的被檢物之間的反應(yīng)而生成的物質(zhì)、并目測判定核酸的存在的判定部位。優(yōu)選存在于所述判定部位的被檢物還包含與染料反應(yīng)的物質(zhì)。所述染料優(yōu)選是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、堿、或pH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法，無需使用特殊的檢測儀器，即可在核酸擴(kuò)增后通過染料的色調(diào)變化目測檢測核酸擴(kuò)增的有無。而且，通過氧化劑、還原劑、酸、堿、PH緩沖劑引起的染料的色調(diào)變化，能夠目測檢測核酸擴(kuò)增的有無。此外，由于能夠用可見光進(jìn)行檢測，能夠提供使用可見區(qū)域分光光度計(jì)(其是一種通用性高的裝置)等的簡便的核酸檢測方法。


[圖1]顯示本發(fā)明的色譜型核酸檢測裝置的一個(gè)例子的示意圖。[圖2]顯示本發(fā)明的濾器型核酸檢測裝置的一個(gè)例子的示意圖。[圖3]顯示本發(fā)明的吸引型核酸檢測裝置的一個(gè)例子的示意圖。[圖4]顯示本發(fā)明的流路型核酸檢測裝置的一個(gè)例子的示意圖。[圖5]顯示本發(fā)明的管型核酸檢測裝置的一個(gè)例子的示意圖。[圖6]在實(shí)施例5中，向LAMP反應(yīng)液中添加了甲基綠時(shí)的吸收光譜圖。[圖7]在實(shí)施例5中，向LAMP反應(yīng)液中添加甲基綠后、再添加了KOH時(shí)的吸收光譜圖。[圖8]在實(shí)施例6中，向LAMP反應(yīng)液中添加了甲苯胺藍(lán)0時(shí)的吸收光譜圖。[圖9]在實(shí)施例6中，向LAMP反應(yīng)液中添加甲苯胺藍(lán)0后，再添加了亞硫酸鈉時(shí)的吸收光譜圖。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。1.核酸的檢測方法本發(fā)明的包含在被檢物中的核酸的檢測方法包括(1)使被檢物與染料接觸并反應(yīng)的步驟、(2)在可見光下觀察該反應(yīng)生成的物質(zhì)，目測判定核酸的存在的步驟。在使被檢物與染料接觸并反應(yīng)的步驟(1)中，只要被檢物與染料接觸、兩者之間發(fā)生反應(yīng)即可，可以以任何形式接觸。在本發(fā)明中，檢測對象是核酸，雙鏈核酸包括雙鏈DNA、雙鏈RNA、DNA與RNA的雜合鏈、以及PNA等人工核酸的雙鏈。而且，即使是單鏈核酸，當(dāng)其多個(gè)混合存在、且能被染料染色時(shí)，也能夠采用本發(fā)明的檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。對被檢物沒有特殊限制，只要包含核酸即可。不但可以是核酸擴(kuò)增方法的反應(yīng)液， 也可以是來自微生物、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞的抽提液，還可以是來自食品的抽提液。核酸擴(kuò)增方法只要是以PCR法為代表的擴(kuò)增核酸序列的方法即可，可以是任何核酸擴(kuò)增方法。例如，除了 PCR法以外，可以示例出LCR(Ligase Chain Reaction)法、 SDA(Strand Displacement Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification) 法、CPT(Cycling Probe Technology) Q-Beta ReplicaseAmplification Technology 法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic Acids) LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA) NASBA (Nucleic acid Sequence-based Amplification method) ^去、以及 TMA(Transcription mediated amplification method)法等公知的方法，但不限于此。Q-Beta Replicase Amplification Technology法、RCA法、NASBA法、SDA法、TMA法、LAMP法、ICAN法等是在一定溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法，其他的PCR法、LCR法等是在溫度循環(huán)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的方法。此外，利用逆轉(zhuǎn)錄酶等將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA、以該DNA作為模板采用上述的核酸擴(kuò)增方法可以間接地對RNA進(jìn)行檢測。在本發(fā)明中，作為染料，可以列舉出三苯基甲烷類染料、噻嗪類染料、噁嗪類染料、吖嗪類染料、吩嗪類染料、夾氧雜蒽類染料、菲啶鎮(zhèn)(phenanthridium)類染料、 偶氮類染料、內(nèi)酯類染料、磺內(nèi)酯(sultone)類染料、靛青類染料、花青類染料、羊雜菁 (oxonol)類染料、苯乙烯型(styryl)類染料、嚇啉類染料、硫代夾氧雜蒽類染料、方酸鎮(zhèn)鹽 (squarainium)類染料、克酮酸(croconium)類染料、azulenium類染料、二硫醇金屬鹽類染料、萘醌類染料、蒽醌類染料、靛酚(indophenol)類染料、香豆素類染料、香豆素酮類染料、 吡喃備t鹽類染料、硫代吡喃錯(cuò)鹽系、噻唑類染料、喹啉類染料、二苯甲酮類染料、硫代二苯甲酮類染料和它們的混合物。優(yōu)選為三苯基甲烷類染料、噻嗪類染料、囔嗪類染料、吖嗪類染料、吩嗪類染料、夾氧雜蒽類染料、菲啶鎮(zhèn)類染料、偶氮類染料、靛青類染料、內(nèi)酯類染料、 磺內(nèi)酯類染料和它們的混合物。而且，在本發(fā)明中，三苯基甲烷類染料是指具有下述式(1)或式O)[化1]
權(quán)利要求
1.包含在被檢物中的核酸的檢測方法，該檢測方法包括(1)使被檢物與染料接觸并反應(yīng)的步驟；(2)在可見光下觀察該反應(yīng)生成的物質(zhì)，目測判定核酸的存在的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其還包括C3)在步驟(1)之前或之后，使與染料反應(yīng)的物質(zhì)與被檢物接觸的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述染料是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、 堿、或PH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。
4.包含在被檢物中的核酸的檢測裝置或試劑盒，其具有(a)保持有能夠與核酸結(jié)合的染料的載體；(c)被檢物通過載體(a)的路徑；和(d)在可見光下觀察被檢物與染料的反應(yīng)生成的物質(zhì)、并目測判定核酸的存在的判定部位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測裝置或試劑盒，其中，在載體(a)與判定部位(d)之間還具有(b)保持與染料反應(yīng)的物質(zhì)的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述染料是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、堿或PH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述染料是選自三苯基甲烷類染料、噻嗪類染料^惡嗪類染料、吖嗪類染料、夾氧雜蒽類染料、和菲啶備t鹽類染料中的1種以上的染料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述染料是選自結(jié)晶紫、龍膽紫B、 維多利亞藍(lán)B、甲基紫、夜光藍(lán)、甲基綠、甲苯胺藍(lán)0、天青B、亞甲基藍(lán)、亮甲酚藍(lán)、甲基橙、派洛寧Y、溴化乙錠和中性紅中的1種以上的染料。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述與染料反應(yīng)的物質(zhì)是選自氧化劑、還原劑、酸、堿、或PH緩沖劑中的1種以上的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述酸是選自鹽酸、硫酸、硝酸、 乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和乳酸中的1種以上的酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述堿是選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氨和三乙胺中的1種以上的堿。
12.權(quán)利要求9所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述氧化劑是選自過氧化氫、高錳酸鉀、氯酸鉀、重鉻酸鉀、溴酸鈉、溴酸鉀、商素、濃硫酸、硝酸、次氯酸鈉、二氧化氯、氯胺、四氧化鋨、二甲基亞砜和間氯過苯甲酸中的1種以上的氧化劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述還原劑是選自硼氫化鈉、氰化硼氫化鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、次硫酸鈉、焦亞硫酸鉀、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、抗壞血酸、2-巰基乙醇、DL- 二硫蘇糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1種以上的還原劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述pH緩沖劑是選自戈氏緩沖液(Good’ s Buffers)、甘氨酸、磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1種以上的PH緩沖劑。
15.一種核酸的檢測裝置或試劑盒，其具有(e)保持能夠與核酸結(jié)合的染料、并具備能夠因外力而形成開口從而釋放出染料的開口部的載體；(f)將釋放出的染料引導(dǎo)向判定部位的路徑；和(d)保持導(dǎo)入的被檢物，在可見光下觀察因從載體(e)經(jīng)由路徑(f)導(dǎo)入的染料與保持的被檢物之間的反應(yīng)而生成的物質(zhì)，并目測判定核酸的存在的判定部位。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測裝置或試劑盒，其中，存在于判定部位的被檢物還包含與染料反應(yīng)的物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的檢測裝置或試劑盒，其中，所述染料是色調(diào)通過氧化劑、還原劑、酸、堿、或PH緩沖劑的處理而發(fā)生變化的染料。
全文摘要
簡便且高精度地目測檢測采用核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸，而無需特殊裝置。本發(fā)明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測方法，該檢測方法包括(1)使被檢物與染料接觸并反應(yīng)的步驟；(2)在可見光下觀察該反應(yīng)生成的物質(zhì)，目測判定核酸的存在的步驟。此外，本發(fā)明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測裝置或試劑盒，其具有(a)保持了能夠與核酸結(jié)合的染料的載體；(c)被檢物通過載體(a)的路徑；和(d)在可見光下觀察由被檢物與染料的反應(yīng)而生成的物質(zhì)、并目測判定核酸的存在的判定部位。
文檔編號C12N15/09GK102356161SQ20108001236
公開日2012年2月15日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日
發(fā)明者加藤智久, 友野潤, 宮本重彥, 高橋孝治 申請人:株式會(huì)社鐘化