專利名稱：Mir-208和mir-499在治療心臟病癥中的雙重靶向的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)施用調(diào)控微小RNA(miRNA)活性或表達(dá)的藥劑來(lái)治療心臟和肌肉骨骼病癥。具體而言，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防心臟病癥的方法，其通過(guò)抑制 miR-208a/miR-208b和miR-499兩者在受試者(包括人)的心臟細(xì)胞中的表達(dá)或活性來(lái)進(jìn)行。另外，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，其通過(guò)提高miR-208b 和miR-499兩者在受試者的骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)或活性來(lái)進(jìn)行。
背景技術(shù)：
心臟病及其表現(xiàn)，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，清楚地呈現(xiàn)了美國(guó)當(dāng)今的一項(xiàng)重大健康風(fēng)險(xiǎn)。診斷、治療和支持罹患這些疾病的患者的花費(fèi)完全達(dá)到數(shù)十億美元。心臟病的兩項(xiàng)特別嚴(yán)重的表現(xiàn)是心肌梗死和心臟肥大。心肌梗死(通常稱為心臟病發(fā)作)是由于突然且持續(xù)缺乏向心臟組織的血流(其通常是冠狀動(dòng)脈變窄或阻塞的結(jié)果)引起的。沒(méi)有足夠的供血，組織變得缺血，這導(dǎo)致心肌細(xì)胞(例如心臟肌肉細(xì)胞)和血管結(jié)構(gòu)的死亡。源自心肌細(xì)胞死亡的壞死組織一般被瘢痕組織替換，所述瘢痕組織沒(méi)有收縮性，無(wú)助于心臟功能，而且常常通過(guò)在心臟收縮期間擴(kuò)張或通過(guò)增加心室的大小和有效半徑而在心臟功能中發(fā)揮有害作用，例如變成肥大。心臟肥大是心臟對(duì)實(shí)際上所有形式心臟病(包括那些源自高血壓、機(jī)械負(fù)荷、心肌梗死、心臟心率失常、內(nèi)分泌病癥、和心臟收縮蛋白質(zhì)基因中遺傳突變)的適應(yīng)性應(yīng)答。 雖然肥大性應(yīng)答最初是提高心排血量的代償機(jī)制，但是持久的肥大能導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病 (DCM)、心力衰竭、和猝死。在美國(guó)，每年有大約50萬(wàn)人診斷出心力衰竭，死亡率大約50%。眾多信號(hào)傳導(dǎo)途徑，尤其是那些牽涉異常鈣信號(hào)傳導(dǎo)的，推動(dòng)心臟肥大和病理性重塑(Heineke和Molkentin，2006)。響應(yīng)壓力而發(fā)生的肥大性生長(zhǎng)涉及與響應(yīng)鍛煉而發(fā)生的生理性肥大不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和基因表達(dá)樣式。壓力介導(dǎo)的心肌肥大是與眾多不良后果有關(guān)的復(fù)雜現(xiàn)象，其中獨(dú)特的分子和組織學(xué)特征引起心臟發(fā)生纖維組織形成、擴(kuò)張和代償失調(diào)，這經(jīng)由心肌細(xì)胞變性和死亡而常常以心力衰竭達(dá)到極點(diǎn)。因此，對(duì)于解釋根本的分子機(jī)制和為遏制不良心臟生長(zhǎng)及最終衰竭發(fā)現(xiàn)新的治療靶物很感興趣。了解這些機(jī)制對(duì)于設(shè)計(jì)治療心臟肥大和心力衰竭的新療法是至關(guān)重要的。最近提出微小RNA涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括對(duì)發(fā)育時(shí)機(jī)、凋亡、脂肪代謝、和造血細(xì)胞分化等的調(diào)節(jié)。微小RNA(miRNA)指自常常編碼多種密切相關(guān)miRNA的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄物、自蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子、或自各miRNA基因衍生的，長(zhǎng)度為約18個(gè)至約25個(gè)核苷酸的小型、非蛋白質(zhì)編碼RNA。參見(jiàn)Carrington等的綜述(kience，第301卷(5631) 336-338,2003)。miRNA起靶mRNA的阻抑物的作用，這通過(guò)促進(jìn)它們的降解(當(dāng)它們的序列完美互補(bǔ)時(shí))或通過(guò)抑制翻譯(當(dāng)它們的序列含有錯(cuò)配時(shí))來(lái)實(shí)現(xiàn)。miRNA 由 RNA 聚合酶 II (pol II)或 RNA 聚合酶 III (pol III ；參見(jiàn) Qi 等 Q006) Cellular & Molecular Immunology 第 3 卷411-419)轉(zhuǎn)錄，而且源自稱作初級(jí) miRNA 轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)的初始轉(zhuǎn)錄物，它們一般長(zhǎng)數(shù)千堿基。pri_miRNA在細(xì)胞核中被RNA酶 Drosha加工成約70個(gè)至約100個(gè)核苷酸的發(fā)夾形前體(pre-miRNA)。轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，發(fā)夾pre-miRNA被Dicer進(jìn)一步加工以生成雙鏈miRNA。然后將成熟miRNA鏈并入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，在那里它通過(guò)堿基對(duì)互補(bǔ)性與它的靶mRNA結(jié)合。在相對(duì)罕見(jiàn)的、miRNA 與mRNA靶物完美堿基配對(duì)的情況中，它促進(jìn)mRNA降解。更常見(jiàn)的是，miRNA與靶mRNA形成不完美的異源雙鏈體，從而影響mRNA穩(wěn)定性或抑制mRNA翻譯。最近，發(fā)明人報(bào)告了一種心臟特異性微小RNA，即miR-208a，它是由α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的內(nèi)含子編碼的，而且是響應(yīng)心臟壓力而上調(diào)β-MHC表達(dá)和遏制心臟中的快速骨骼肌基因所需要的(van Rooij等，Q007) kience，第316卷575-579)。本發(fā)明擴(kuò)展了此發(fā)現(xiàn)，而且提供了一種用于治療心臟和肌肉骨骼病癥的新的治療方法。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，即miR_208a和miR-499兩者在心臟細(xì)胞中的系統(tǒng)性下調(diào)對(duì)響應(yīng)壓力的心臟肥大形成、收縮性增強(qiáng)、和病理性心臟重塑產(chǎn)生協(xié)同影響。發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了，通過(guò)同時(shí)或順序施用miR-208a和miR-499抑制劑來(lái)下調(diào)miR_208a 和miR-499兩者，從而顯著縮短用于調(diào)節(jié)壓力相關(guān)基因諸如β-MHC表達(dá)的時(shí)段。與僅下調(diào) miR-208a情況中觀察到相似的效果所需要的幾個(gè)月延遲相比，此類雙重靶向?qū)毫ο嚓P(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生立即的影響。因而，本發(fā)明提供了一種用于在有需要的受試者(包括人)中治療病理性心臟肥大、心力衰竭、和心肌梗死的新的治療方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者施用miR-208a或miR_208b的抑制劑和miR-499的抑制劑，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用后的所述受試者的心臟細(xì)胞中降低。在一些實(shí)施方案中，miR-208a或miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用所述抑制劑后的受試者的心臟細(xì)胞中降低大于60%。所述miR-208和miR-499 抑制劑包括antagomir或反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miRNA抑制劑在表達(dá)載體上編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，心臟壓力響應(yīng)在施用miR_208a或miR_208b的抑制劑和 miR-499的抑制劑后的受試者中降低。心臟壓力響應(yīng)包括心肌細(xì)胞的肥大、心臟的纖維化、 所述受試者的心臟細(xì)胞中α-MHC表達(dá)降低、和/或β-MHC表達(dá)升高。在某些實(shí)施方案中， 在施用miR-208a/miR-208b和miR-499抑制劑后小于2個(gè)月發(fā)生心臟壓力響應(yīng)的降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用抑制劑后小于1周發(fā)生心臟壓力響應(yīng)的降低。在一些實(shí)施方案中，順序施用miR-208a/miR-20m3抑制劑和miR-499抑制劑。兩種抑制劑的施用可以以可為大約幾分鐘至幾周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相隔至少M(fèi)小時(shí)施用miR-208a/miR-208b抑制劑和miR-499抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，共施用miR-208a/miR-208b抑制劑和miR-499抑制劑?？梢愿饕约slmg/kg至約200mg/kg的劑量施用兩種抑制劑。本發(fā)明還提供了一種在有需要的受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-208的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑，其中miR-208和miR-499的表達(dá)或活性在施用后的受試者的骨骼肌細(xì)胞中升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者施用miR-20m3的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑。miRNA激動(dòng)劑可以是編碼成熟miR-208a、 miR-208b、或miR-499序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，此類多核苷酸與啟動(dòng)子序列可操作連接，并在表達(dá)載體中提供給受試者的細(xì)胞?？梢怨彩┯没蛞蕴囟〞r(shí)間間隔分開(kāi)順序施用miRNA激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中， 一種或多種快速骨骼肌基因在受試者的骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)在對(duì)受試者施用miR-499和 miR-208a或miR-208b激動(dòng)劑后降低。一種或多種快速骨骼肌基因可包括肌鈣蛋白12、肌鈣蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白輕鏈、和α骨骼肌動(dòng)蛋白。附圖簡(jiǎn)述

圖1. MiR-208敲除動(dòng)物展現(xiàn)出響應(yīng)胸主動(dòng)脈縮窄而發(fā)生的心臟肥大和纖維化較小。A.示意性顯示了胸主動(dòng)脈縮窄(TAB)規(guī)程(左側(cè))。在TAB規(guī)程或假規(guī)程(右側(cè))后用于Masson三色染色的野生型和miR-208-/-小鼠的心臟的組織學(xué)切片。miR-208的缺乏減少進(jìn)行TAB達(dá)21天的野生型小鼠中看到的肥大和纖維化。B.在假規(guī)程或TAB規(guī)程后的野生型和miR-208-/-動(dòng)物的心臟中的β -肌球蛋白重鏈(β -MHC)、心房利鈉因子(ANF)、 和腦利鈉肽(BNP)的相對(duì)表達(dá)水平。C.在假規(guī)程或TAB規(guī)程后對(duì)野生型和miR-208-/-動(dòng)物的心臟中的α-MHC和β-MHC蛋白水平的Wfestern分析。檢測(cè)GAPDH作為加載對(duì)照。圖2. miR-208的長(zhǎng)期敲低表型模擬miR-208敲除動(dòng)物中對(duì)壓力響應(yīng)的抑制。 A.合成的寡核苷酸的序列靶向成熟的miR-208序列(SEQ ID N0:16)。錯(cuò)配對(duì)照序列與反-miR-208序列(SEQ ID NO :17)相比含有四個(gè)堿基錯(cuò)配。B.實(shí)時(shí)PCR分析顯示了用反-miR-208寡核苷酸處理的動(dòng)物的心臟中miR-208的有效敲低。C.在假規(guī)程或胸主動(dòng)脈縮窄(TAB)規(guī)程后在接受反-miR-208寡核苷酸(反208)或錯(cuò)配對(duì)照(mm)的動(dòng)物的心臟中的β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、心房利鈉因子(ANF)、和腦利鈉肽(BNP)的相對(duì)表達(dá)水平。 雖然響應(yīng)TAB而誘導(dǎo)壓力標(biāo)志物ANF和BNP，但是接受反-miR-208的動(dòng)物顯示β MHC表達(dá)的誘導(dǎo)降低。圖 3. Myh7b 和 miR-499 受miR-208 調(diào)節(jié)。Northern 印跡顯示野生型(+/+) ,miR-208 雜合子(+/_)和miR-208敲除(-/-)小鼠的心臟中的miR-499的表達(dá)。在野生型和突變體小鼠中miR-208與miR-499，及Myh7b的表達(dá)之間有正相關(guān)。測(cè)量GAPDH的表達(dá)作為對(duì)照。圖4. Myh7b和miR-499在心臟和慢速骨骼肌肉中表達(dá)。A. Northern分析指示 miR-499在心臟和慢速骨骼肌肉(例如比目魚(yú)肌)中表達(dá)。針對(duì)Myh7b的RT-PCR顯示 miR-499與其宿主基因共表達(dá)。B.在心臟和四種骨骼肌肉類型(腓腸肌/跖肌(GP)、脛骨前肌(TA)、趾長(zhǎng)伸肌(EDL)、和比目魚(yú)肌)上對(duì)miR-499的實(shí)時(shí)PCR分析確認(rèn)miR-499主要在心臟和比目魚(yú)肌中表達(dá)。僅可在TA和EDL中檢測(cè)出微少水平的miR-499表達(dá)。C.原位雜交指示在胚胎發(fā)生期間，Myh7b在心臟和體節(jié)中特異性表達(dá)。
圖5. MiR-499不影響肌球蛋白表達(dá)。A.對(duì)Myh7b的RT-PCR分析顯示miR-499的遺傳刪除不影響其宿主基因Myh7b的表達(dá)。GP-腓腸肌/跖??；TA-脛骨前?。籈DL-趾長(zhǎng)伸肌。測(cè)量GAPDH的表達(dá)作為對(duì)照。B.對(duì)來(lái)自野生型(WT)、雜合子(+/-)、和miR-499敲除 (KO)動(dòng)物的心臟的α -和β -MHC兩者的Western印跡分析顯示miR-499的刪除不影響任一種基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。C.丙基硫尿嘧啶(PTU)(其阻斷甲狀腺激素生物發(fā)生，而且是β -MHC的強(qiáng)誘導(dǎo)物)在野生型(WT)和miR-499敲除(KO)動(dòng)物兩者中都產(chǎn)生α -MHC的降低和β -MHC的升高。圖6.通過(guò)體內(nèi)敲低miR-208來(lái)調(diào)節(jié)miR-499。Α.在指定量的反-miR-208寡核苷酸或鹽水(Sal)的尾靜脈注射后三天對(duì)miR-208和miR-499表達(dá)的Northern分析。B.處理后2個(gè)月對(duì)注射單劑80mg/kg反-miR-208、在連續(xù)兩天注射兩劑80mg/kg反-miR-208、 或注射錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸(mm)的動(dòng)物的心臟組織的miR-208和miR-499表達(dá)的Northern 分析。C.在用單劑反-miR-208、在連續(xù)兩天用兩劑反-miR-208、或在連續(xù)兩天用兩劑錯(cuò)配寡核苷酸處理后2個(gè)月對(duì)心臟組織中的miR-208、miR-499、miR_208b、α -MHC, Myh7b、和 β-MHC表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。D.在反-miR-208 (單劑80mg/kg或連續(xù)兩劑80mg/kg)或錯(cuò)配(mm)對(duì)照處理后2個(gè)月對(duì)心臟組織中的β -MHC表達(dá)的Wfestern印跡分析。圖7. miR-208和miR-499的雙重靶向。A.對(duì)野生型和miR-499敲除動(dòng)物的心臟組織中的miR-208、miR-208b和miR-499的Northern分析顯示響應(yīng)PTU的miR_208b的強(qiáng)誘導(dǎo)。MiR-2(M3與β-MHC共表達(dá)，而且指示其表達(dá)。在miR-499敲除動(dòng)物中，miR-2(M3的誘導(dǎo)與野生型相當(dāng)。然而，miR-499敲除動(dòng)物中的miR-208敲低遏制PTU對(duì)miR_208b表達(dá)的誘導(dǎo)。B.在存在和沒(méi)有PTU的情況中對(duì)野生型動(dòng)物、miR-208敲除動(dòng)物、miR-499敲除動(dòng)物、和用反-miR-208處理的miR-499敲除動(dòng)物的心臟組織中的miR-208、α -MHC、和β -MHC 的實(shí)時(shí)PCR分析。發(fā)明詳述心臟和骨骼肌肉通過(guò)調(diào)控調(diào)節(jié)收縮效率的肌球蛋白各同等型的表達(dá)來(lái)響應(yīng)多種病理生理刺激，諸如工作負(fù)荷、甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)和損傷。在成人心臟中的α -與β -MHC同等型的比率是心臟收縮性的一項(xiàng)主要決定因素。 β-MHC(即成人心臟中主要的肌球蛋白同等型)展現(xiàn)出相對(duì)較低的ATP酶活性，而a-MHC 具有較高的ATP酶活性。在對(duì)多種病理學(xué)刺激諸如心肌梗死、高血壓、和其它病癥的響應(yīng)中，β-MHC表達(dá)升高，而α-MHC表達(dá)降低，因此肌原纖維ATP酶活性降低，而且降低心臟肌原纖維的縮短速度，這導(dǎo)致最終的收縮功能障礙。顯著的是，心臟的α-MHC含量的微小變化對(duì)心臟性能可具有深刻的影響。最近，本發(fā)明人報(bào)告了一種心臟特異性miRNA，即miR-208a，它是由α-肌球蛋白重鏈基因的內(nèi)含子編碼的，而且是在心臟中響應(yīng)心臟壓力而上調(diào)β-MHC表達(dá)和遏制快速骨骼肌基因所需要的(參見(jiàn)共同未決申請(qǐng)W02008/016924，通過(guò)提述而完整并入本文)。最近，本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，miR-208a也是密切相關(guān)的miRNA(即miR-499，其由Myh7b基因的內(nèi)含子編碼)的心臟表達(dá)所需要的(參見(jiàn)共同未決申請(qǐng)PCT/US08/71837， 通過(guò)提述而完整并入本文)。Myh7b和miR-499在心臟中的以及在慢速骨骼肌中的表達(dá)受到MEF2轉(zhuǎn)錄因子(條紋肌肉基因表達(dá)的一種信號(hào)依賴性調(diào)節(jié)物)的控制。miR-499或 miR-208的受迫表達(dá)足以在體內(nèi)介導(dǎo)快速向慢速肌纖維的轉(zhuǎn)換。miR-208和miR-499能負(fù)調(diào)節(jié)Thrapl ( 一種甲狀腺激素受體輔調(diào)節(jié)物)和轉(zhuǎn)錄因子PUR家族各成員的表達(dá)，它們繼而負(fù)調(diào)節(jié)β-MHC在心肌和骨骼肌中的表達(dá)。Sox6發(fā)揮慢速纖維類型特異性基因的阻抑物的功能。Sox6表達(dá)在野生型肌管中的敲低導(dǎo)致β-MHC表達(dá)的顯著升高。對(duì)β-MHC啟動(dòng)子的分析揭示了一種Sox共有序列，這提示Sox6在心臟中的胎骨骼肌纖維類型分化和β-MHC 調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)揭示了 Myh基因通過(guò)編碼控制收縮性和信號(hào)響應(yīng)性的調(diào)節(jié)性miRNA而調(diào)節(jié)條紋肌肉的基因表達(dá)樣式的一種共同調(diào)節(jié)性機(jī)制(van Rooij等(2009) Developmental Cell, Vol. 17 :662_673)。本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，即在心臟細(xì)胞中下調(diào)miR-208和miR-499兩者在遏制心臟壓力響應(yīng)方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在心臟細(xì)胞中抑制miR-208a表達(dá)導(dǎo)致β-MHC的壓力誘導(dǎo)的表達(dá)降低。然而，此效果直到施用miR-208抑制劑后2個(gè)月才被觀察到。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了對(duì)miR-208a和miR-499兩者的抑制導(dǎo)致在施用后幾乎立即遏制壓力誘導(dǎo)的β-MHC表達(dá)，如此加速對(duì)心臟壓力響應(yīng)的影響。因而，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)描述了通過(guò)同時(shí)或順序調(diào)控miR-208和miR-499表達(dá)來(lái)操作骨骼和心臟肌肉基因表達(dá)的策略，以治療和預(yù)防心臟病。
1^1 -208￡1位于(1-|^(基因的內(nèi)含子內(nèi)。精確的內(nèi)含子位置取決于具體的物種和具體的轉(zhuǎn)錄物。例如，在人類中，miR-208a是在α-MHC基因的第28內(nèi)含子內(nèi)編碼的，而在小鼠中，它是在第29內(nèi)含子內(nèi)編碼的。下文分別以SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、和SEQ ID NO :4顯示了人、小鼠、大鼠、和犬的miR-208a的pre-miRNA編碼序列。SEQ ID NO 5中提供了成熟miR-208a序列。與α -MHC 一樣，miR-208a僅僅在心臟中表達(dá)。人pre-miR_208a(SEQ ID NO 1)ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGAGCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A小鼠pre-miR_208a(SEQ ID NO 2)ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGAGCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A大鼠pre-miR_208a(SEQ ID NO 3)ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGAGCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A犬pre-miR_208a(SEQ ID NO 4)ACGCATGAGC TTTTGGCTCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGAGCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A成熟的miR_208a(SEQ ID NO 5)AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU對(duì)miR-499基因的基因組位置的分析顯示它包含在Myh7b基因(即α -MHC基因的一種同源物)的第20內(nèi)含子內(nèi)。分別在SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10、SEQ ID N0:11 和 SEQID NO :12 中提供了小鼠、大鼠、人、犬、負(fù)鼠、 雞和熱帶爪蟾(X. tropicalis)的miR-499的pre-miRNA編碼序列。SEQ ID N0:13是小鼠前體序列的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，而SEQ ID NO: 14是成熟的miR-499序列。Myh7b基因在脊椎動(dòng)物中是保守的，而且僅在心臟和慢速骨骼肌肉(例如比目魚(yú)肌)中表達(dá)。
小鼠pre-miR_499(SEQ ID NO 6)TCCCTGTGTC TTGGGTGGGC AGCTGTTAAGCCTCTGCATG TGAACATCAC AGCAAG大鼠pre-miR_499(SEQ ID NO 7)TCCCTGTCTT GGGTGGGCAG CTGTTAAGACTCTCCATGTG AACATCACAG CAAG人pre-miR-499(SEQID NO 8)CCCCTGTGCC TTGGGCGGGC GGCTGTTAAGCCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAGit pre-miR-499(SEQ ID NO 9)CCCTTGCACC CTGGGCGGGC GGCCGTTAAGCCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG負(fù)鼠pre-miR-499 (SEQ ID NO 10)CCCCTGCCTC CCCGGCGGGC AGCTGTTAAGCTTCTCTATG TGAACATCAC AACAAG雞pre-miR-499(SEQ ID NO 11)GGAGCGGCAG TTAAGACTTG TAGTGATGTTCATCACTTTA AG熱帶爪蟾pre-miR-499 (SEQ ID NO 12)GTCTTAGCGA GGCAGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGTT AAAATCTTTTCATGAACATC ACTTTAAG小鼠pre-miR-499 序列的蓮-環(huán)(SEQ ID NO 13)GGGUGGGCAG CU⑶UAAGAC UUGCA⑶GAU GUUUAGCUCC UCUGCAUiiUGAACAUCACAG CAA⑶CU⑶G CUGCUGCCU成熟的miR_499(SEQ ID NO 14)UUAAGACUUG CA⑶GAU⑶U U本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了基因組含有第二種型式的miR208a(稱作miR_208b)，其在 β-MHC基因內(nèi)位于內(nèi)含子31，而且與β-MHC—樣，miRNA208b僅在心臟和慢速骨骼肌肉 (例如比目魚(yú)肌)中表達(dá)。受miR-208b調(diào)節(jié)的基因包括例如Sp3、肌肉抑制素(Myostatin)、 PUR^、THRAP1、和快速骨骼肌蛋白基因。此miRNA的序列與在“種子區(qū)”(即限定某些miRNA 的mRNA靶物的區(qū)域)中具有100%同源性的miR-208a在很大程度上重疊。如此，miR_208b 可對(duì)人的心臟和骨骼肌肉收縮性具有深刻的影響。pre-miR-208b序列在數(shù)個(gè)哺乳動(dòng)物物種(例如人、小鼠、大鼠、和犬)間是保守的。下文顯示了 pre-miR-208b序列及成熟的 miR-208b 序列pre-miR-208b (SEQ ID NO: 18)TTTCTGATCC GAATATAAGA CGAACAAAAG GTTTGTCTGA GGG
成熟的miR_208b(SEQ ID NO 19)AUAAGACGAA CAAAAGGUUU GU應(yīng)當(dāng)理解，在需要脫氧核糖核苷酸的實(shí)施方案中使用本文中所公開(kāi)的RNA序列
ACTTGCAGTG ATGTTTAGCT
TTGCAGTGAT GTTTAGCTCC
ACTTGCAGTG ATGTTTAACT
ACTTGCAGTG ATGTTTAACT
ACTTGCAGTG ATGTTTAATT
TAGATAATGT ATTACATGGA時(shí)，用胸苷殘基替換尿苷殘基。類似地，在需要核糖核苷酸的實(shí)施方案中，用尿苷殘基替換本文中所公開(kāi)的DNA序列中的胸苷殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在有需要的受試者(包括人)中治療病理性心臟肥大、心肌梗死、或心力衰竭的方法，其通過(guò)在受試者的心臟細(xì)胞中靶向 miR-208(例如 miR_208a 和 / 或 miR_208b，或者換言之 miR208a/miR208b)和 miR-499 中的任一種或兩種的表達(dá)和/或活性來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用miR-208a/ miR-208b的抑制劑和miR-499的抑制劑以降低miR-208a/miR_208b和miR-499在受試者的心臟細(xì)胞中的表達(dá)或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有需要的受試者可有風(fēng)險(xiǎn)形成病理性心臟肥大、心力衰竭、 或心肌梗死。此類受試者可展現(xiàn)出一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子，包括但不限于長(zhǎng)期存在的不受控制的高血壓、未矯正的瓣膜病、慢性咽峽炎、近期的心肌梗死、對(duì)心臟病的先天性素因或病理性肥大。所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者可以診斷為具有心臟肥大的遺傳素因或者可具有心臟肥大的家族史。優(yōu)選的是，miR-208a/miR-208b的抑制劑和miR-499的抑制劑兩者對(duì)受試者的施用導(dǎo)致受試者中心臟肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一種或多種癥狀的改善，或者導(dǎo)致自心臟肥大向心力衰竭的轉(zhuǎn)變的延遲。所述一種或多種得到改善的癥狀可以是例如升高的運(yùn)動(dòng)能力、升高的心臟射血體積、降低的左心室舒張末期壓、降低的肺毛細(xì)血管楔壓、升高的心排血量、升高的心排血指數(shù)、降低的肺動(dòng)脈壓、降低的左心室收縮和舒張末期內(nèi)徑、降低的心臟纖維化、心臟肌肉中降低的膠原沉積、降低的左和右心室壁壓、降低的壁張力、升高的生命質(zhì)量、和降低的疾病相關(guān)發(fā)病率或死亡率。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，心臟壓力響應(yīng)在施用miR_208(例如miR_208a和/ 或miR-208b)和miR-499抑制劑后的受試者中降低。心臟壓力響應(yīng)包括心肌細(xì)胞肥大、心臟的纖維化、心臟細(xì)胞中降低的α-MHC表達(dá)、和/或心臟細(xì)胞中升高的β-MHC表達(dá)等。與單獨(dú)施用任一種抑制劑相比，對(duì)受試者施用miR-208a/miR-208b的抑制劑和miR-499的抑制劑兩者導(dǎo)致對(duì)心臟壓力響應(yīng)的更快速影響。例如，在施用抑制劑后小于8周、小于6周、 小于4周、小于3周、小于2周、小于1周、小于5天、小于3天、或小于1天發(fā)生心臟壓力響應(yīng)的降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用抑制劑后小于12小時(shí)發(fā)生心臟壓力響應(yīng)的降低。在一些實(shí)施方案中，miR-208(例如miR-208a和/或miR-208b)和miR-499抑制劑可以是靶向成熟的miR-499和/或miR-208a或miR_208b序列的反義寡核苷酸。所述反義寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選的是，所述反義寡核苷酸具有至少一處化學(xué)修飾。例如，合適的反義寡核苷酸可以由一個(gè)或多個(gè)“構(gòu)象約束性”或二環(huán)糖核苷修飾，例如“鎖定核酸”構(gòu)成?！版i定核酸”(LNA)指經(jīng)修飾的核糖核苷酸，它在核糖糖模塊的2’和4’碳之間含有額外橋接，導(dǎo)致賦予含有LNA的寡核苷酸以增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的“鎖定”構(gòu)型。靶向miR-208a/miR-208b和miR-499的反義寡核苷酸可以含有LNA或其它經(jīng)修飾的核苷酸與核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的組合。或者，所述反義寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主鏈，而非糖-磷酸酯主鏈。反義寡核苷酸可含有的其它化學(xué)修飾包括但不限于糖修飾，諸如2’ -0-烴基或2’ -0-烷基(例如2’ -0-甲基、2’ -0-甲氧乙基)、2’ -氟、和4’ -硫修飾，及主鏈修飾，諸如一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯、嗎啉代、或膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)連接(參見(jiàn)例如美國(guó)專利 No. 6，693，187 和 7，067, 641，通過(guò)提述而完整并入本文)。例如，反義寡核苷酸，特別是那些具有較短長(zhǎng)度(例如小于15 個(gè)核苷酸)的反義寡核苷酸可以包含一處或多處親和力增強(qiáng)性修飾，諸如但不限于LNA、二環(huán)核苷、磷?；姿狨?、2’ 0烴基或2’ 0烷基等。在一些實(shí)施方案中，合適的反義寡核苷酸是2’ -0-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5’和3’端都含有2’ -0-甲氧乙基修飾的核糖核苷酸，且中央有至少十個(gè)脫氧核糖核苷酸。這些“缺口聚物”能夠觸發(fā)RNA酶H依賴性的對(duì)RNA靶物的降解機(jī)制。增強(qiáng)穩(wěn)定性和提高功效的對(duì)反義寡核苷酸的其它修飾(諸如美國(guó)專利No. 6，838，283中記載的那些，通過(guò)提述而完整并入本文)是本領(lǐng)域已知的，而且適合于在本發(fā)明的方法中使用?？捎糜谝种苖iRNA活性的優(yōu)選的反義寡核苷酸長(zhǎng)約5至約 50個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約10至約30個(gè)核苷酸、或長(zhǎng)約20至約25個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中， 靶向miR-208a/miR-208b和miR-499的反義寡核苷酸長(zhǎng)約8至約18個(gè)核苷酸，且在其它實(shí)施方案中，長(zhǎng)約12至16個(gè)核苷酸。特別地，可以使用與miR208a或miR208b互補(bǔ)的任何8 聚體或更長(zhǎng)，即從miR的5，端開(kāi)始到成熟序列的3，端的與miR208a或miR208b中的任何保守序列互補(bǔ)的任何antimir序列。反義寡核苷酸在一些情況中可以包含至少部分與成熟 miRNA序列互補(bǔ)的序列，例如與成熟miRNA序列至少約75%、80 %、85%、90%、95 %、96%、 97 %、98 %、或99 %互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸可以與成熟miRNA序列基本上互補(bǔ)，也就是與靶多核苷酸序列至少約95 %、96 %、97 %、98 %、或99 %互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸包含與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)的序列。
在其它實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是antagomir?！癆ntagomir”指單鏈的、經(jīng)化學(xué)修飾的、至少部分與miRNA序列互補(bǔ)的核糖核苷酸。Antagomir可以包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，諸如2’-0_甲基-糖修飾。在一些實(shí)施方案中，antagomir僅包含經(jīng)修飾的核苷酸。antagomir也可包含一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯連接，導(dǎo)致部分或完全是硫代磷酸酯的主鏈。為了促進(jìn)體內(nèi)遞送和穩(wěn)定性，可將antagomir在其3’端連接至類固醇諸如膽固醇、脂肪酸、維生素、碳水化合物、肽或其它小分子配體。適合于抑制miRNA的antagomir可以長(zhǎng)約 15個(gè)至約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)約18個(gè)至約30個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選長(zhǎng)約20個(gè)至約25個(gè)核苷酸。“部分互補(bǔ)”指某序列與靶多核苷酸序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、或 99%互補(bǔ)。antagomir 可以與成熟 miRNA 序列至少約 75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，antagomir可以與成熟miRNA序列基本上互補(bǔ)，也就是與靶多核苷酸序列至少約95 %、96 %、97 %、98 %、或99 %互補(bǔ)。在其它實(shí)施方案中，antagomir與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)。 在一些實(shí)施方案中，miR-499和miR-208a/miR_208b的抑制劑是包含與成熟 miR-499和成熟miR-208a或成熟miR_208b序列完美互補(bǔ)的序列的antagomir。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499 的抑制劑是具有與 5，-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3，(SEQ ID NO 14)部分或完美互補(bǔ)的序列的antagomir。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208a的抑制劑是具有與5’ -AUAAGACGAGCAAAAAGCUU⑶-3，(SEQ ID NO 5)部分或完美互補(bǔ)的序列的 antagomir。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a的抑制劑是具有序列5，-ACAAGCUUUUUGCUC⑶CUUAU-3，(SEQ ID NO 15)的antagomir。在又一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208a的抑制劑是具有序列SEQ ID N0: 16的antagomir。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208b的抑制劑是具有與5，-AUAAGACGAACAAA AGGUUUGU-3，(SEQ ID NO 19)部分或完美互補(bǔ)的序列的antagomir。
在一些實(shí)施方案中，miR-499和miR_208a或miR_208b的抑制劑是經(jīng)化學(xué)修飾的
11反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499的抑制劑是經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸，其包含與5，-UUAAGACUUGCA⑶GAUGUUU-3，(SEQ ID NO 14)基本上互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a的抑制劑是經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸，其包含與5’ -AUAAGACGAGCAAAA AGCUUGU-3，(SEQID NO 5)基本上互補(bǔ)的序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208b的抑制劑是經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸，其包含與5’ -AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3，(SEQ ID NO: 19) 基本上互補(bǔ)的序列。如本文中所使用的，“基本上互補(bǔ)”指某序列與靶多核苷酸序列(例如成熟或前體miRNA序列)至少約95%、96%、97%、98%、99%、或100%互補(bǔ)。反義寡核苷酸可包含與miR-499或miR-208a/miR_208b的前體miRNA序列 (pre-miRNA)基本上互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸包含與位于 pre-miR-499或pre-miR-208a/miR_208b序列莖環(huán)區(qū)以外的序列基本上互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499功能的抑制劑是反義寡核苷酸，其具有與選自下組的pre-miR-499 序列基本上互補(bǔ)的序列SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208a功能的抑制劑是反義寡核苷酸，其具有與選自下組的pre-miR-208a序列基本上互補(bǔ)的序列SEQID NO :1、 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、和SEQ ID NO :4。在又一個(gè)實(shí)施方案中，miR_208b功能的抑制劑是反義寡核苷酸，其具有與SEQ ID N0:18的pre-miR-208b序列基本上互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用單一核酸分子來(lái)同時(shí)抑制miR-208和 miR-499兩者。例如，單一核酸可以含有與成熟miR-208a序列(例如SEQ ID NO 5)至少部分互補(bǔ)的序列和與成熟miR-499序列(例如SEQ ID NO :14)至少部分互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單一核酸可以含有與成熟miR-208b序列(例如SEQ ID NO 19)至少部分互補(bǔ)的序列和與成熟miR-499序列(例如SEQ ID NO 14)至少部分互補(bǔ)的序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，單一核酸分子可以含有與pre-miR-208a序列(例如SEQ ID NO=USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、禾Π SEQ ID NO 4)至少部分互補(bǔ)的序列和與pre-miR-499序列(例如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12)至少部分互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單一核酸分子可以含有與pre-miR-208b序列(例如SEQ ID NO 18)至少部分互補(bǔ)的序列和與pre-miR-499序列(例如 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12)至少部分互補(bǔ)的序列。單一核酸分子可以進(jìn)一步在miR-208 (例如miR-208a或miR-208b)與miR-499靶向序列之間包含一個(gè)或多個(gè)的間隔核苷酸。例如， 單一核酸分子可在miR-208a/miR-208b與miR-499靶向序列之間含有約1至約200個(gè)間隔核苷酸，更優(yōu)選地約5至約100個(gè)間隔核苷酸，最優(yōu)選地約10至約50個(gè)間隔核苷酸?？梢酝ㄟ^(guò)向細(xì)胞遞送編碼miR-208a/miR-208b和miR-499抑制劑的表達(dá)載體來(lái)將本文中所描述的任何miR-208a/miR-208b和miR-499的抑制劑遞送到靶細(xì)胞(例如心臟細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞)。miR-208a/miR-208b的抑制劑和miR-499的抑制劑可以由同一表達(dá)載體編碼?；蛘?，miR-208 (例如miR-208a或miR-208b)的抑制劑和miR-499的抑制劑在不同表達(dá)載體上編碼。“載體”指可用于將感興趣核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組成。本領(lǐng)域已知眾多載體，包括但不限于線性多核苷酸、與離子化合物或兩親性化合物結(jié)合的多核苷酸、質(zhì)粒、和病毒。如此，術(shù)語(yǔ)“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、等等。表達(dá)構(gòu)建體能在活細(xì)胞中復(fù)制，或者它能合成制備。為了本申請(qǐng)，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”、和“載體”可互換使用，從而以一般性的、例示性的意義說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用，而且并非意圖限制本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR-208a/miR-208b和/或miR-499抑制劑的表達(dá)載體包含與編碼反義寡核苷酸的多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子，其中所表達(dá)的反義寡核苷酸的序列與miR-208 (例如miR-208a或miR_208b)和/或miR-499的成熟序列部分或完美互補(bǔ)。如本文中所使用的，短語(yǔ)“可操作連接”或“在轉(zhuǎn)錄控制下”意味著啟動(dòng)子相對(duì)于多核苷酸處于正確的定位和取向以控制RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文中所描述的，表達(dá)載體可以編碼靶向miR-208 (例如miR-208a 或miR-208b)和miR-499兩者的單一核酸，其中單一核酸與啟動(dòng)子可操作連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單一表達(dá)載體可以編碼miR-208a/miR-208b抑制劑和miR-499抑制劑，其中 miR-208a/miR-208b抑制劑由與miR-499抑制劑不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。如本文中所使用的，“啟動(dòng)子”指受到細(xì)胞的合成機(jī)構(gòu)、或?qū)氲暮铣蓹C(jī)構(gòu)識(shí)別，啟動(dòng)基因的特異性轉(zhuǎn)錄所需的DNA序列。合適的啟動(dòng)子包括但不限于RNApol I、pol II、pol III、和病毒啟動(dòng)子(例如人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù))。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。特別感興趣的是肌肉特異性啟動(dòng)子，更特別的是心臟特異性啟動(dòng)子。這些包括肌球蛋白輕鏈_2啟動(dòng)子(Franz 等(1994)Cardioscience,第 5 卷(4) :235_43 ；Kelly 等(1995) J. Cell Biol.， 第 129 卷(2) 383-396)、α 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Moss 等(1996)Biol. Chem.，第 271 卷(49) 31688-31694)、肌鈣蛋白 1 啟動(dòng)子(Bhavsar 等(1996)Genomics，第 35 卷(1) 11-23) ,Na+/ Ca2+交換器啟動(dòng)子(Barnes 等(1997) J. Biol. Chem.，第 272卷(17) :11510_11517)、抗肌萎縮蛋白啟動(dòng)子(Kimura 等(1997) Dev. Growth Differ·，第 39 卷(3) :257_265)、α 7 整聯(lián)蛋白啟動(dòng)子(Ziober 和 Kramer (1996) J. Bio. Chem.，第 271 卷(37) :22915_22)、腦鈉尿肽啟動(dòng)子(LaPointe 等(1996) Hypertension，第 27 卷(3 Pt 2) :715_22)和 α B-晶體蛋白 / 小熱休克蛋白啟動(dòng)子(Gopal-Srivastava(1995) J. Mol. Cell. Biol.，第 15卷(12) :7081_7090)、 α 肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子(Yamauchi-Takihara 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第 86 卷(10) 3504-3508)和 ANF 啟動(dòng)子(LaPointe 等(1988) J. Biol. Chem.，第 263 卷(19) 9075-9078)。在某些實(shí)施方案中，與編碼miR-499和/或miR-208a/miR_208b抑制劑的多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于四環(huán)素啟動(dòng)子、金屬硫蛋白IIA啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、類固醇/甲狀腺激素/視黃酸響應(yīng)元件、腺病毒后期啟動(dòng)子、和誘導(dǎo)型小鼠乳房腫瘤病毒LTR。如本文中所描述的， 表達(dá)載體可以編碼靶向miR-208(例如miR-208a或miR-208b)和miR-499兩者的單一核酸，其中單一核酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作連接?；蛘撸瑔我槐磉_(dá)載體可以編碼miR-208a/ miR-208b抑制劑和miR-499抑制劑，其中miR-208a/miR_208b抑制劑由第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，而miR-499抑制劑由第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一表達(dá)載體可以編碼miR-208a/miR-208b抑制劑，其中miR-208a/miR_208b抑制劑與第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作連接，而第二表達(dá)載體可以編碼miR-499抑制劑，其中miR-499抑制劑與第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作連接。也涵蓋用于控制miR-208 (例如miR-208a或miR_208b)和miR-499抑制劑表達(dá)的誘導(dǎo)型和組成性啟動(dòng)子的其它組合。例如，可以使用組成性啟動(dòng)子從載體表達(dá)miR-208a/miR-208b抑制劑，而可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子從載體表達(dá)miR-499抑制劑。本發(fā)明還包括用于在治療后清除或消除miR-499和miR-208a/miR-208b抑制劑的方法。該方法可包括在心臟組織中過(guò)表達(dá)miR-499和miR-208a/miR-208b抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在治療后清除或消除miR-499和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在骨骼肌中使用骨骼和心臟肌肉特異性啟動(dòng)子(肌肉肌酸激酶(MCK))過(guò)表達(dá)miR-499和miR-208a/miR-208b的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)。所述結(jié)合位點(diǎn)區(qū)優(yōu)選含有miR-499和miR-208a或miR-208b的種子區(qū)的序列。 種子區(qū)是miRNA中跨越堿基2-8的5’部分，其對(duì)于靶物識(shí)別是重要的。在一些實(shí)施方案中， 所述結(jié)合位點(diǎn)可含有來(lái)自miR-499或miR-208的一種或多種靶物(諸如THRAPl或PUR β ) 的3，UTR的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在miR-499和miR-208之后施用miR-499和 miR-208抑制劑以削弱或終止miRNA的功能。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，共施用miR-208(例如miR-208a或miR-208b)的抑制劑和miR-499的抑制劑。可以在單一配制劑中施用miR-208抑制劑和miR-208。例如， 可以使用包含miR-208抑制劑和miR-499抑制劑的藥物組合物以共施用兩種抑制劑。或者， 如本文中所描述的，miR-208和miR-499抑制劑可以由單一核酸，如表達(dá)載體編碼?？梢栽诔掷m(xù)的一段時(shí)間，例如1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、 1年、2年、3年、4年、或5年里給予兩種抑制劑的多次共施用。在一些實(shí)施方案中，順序施用miR-208 (例如miR_208a或miR_208b)的抑制劑和 miR-499的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在miR-499的抑制劑前施用miR-208的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在miR-208的抑制劑前施用miR-499的抑制劑。分開(kāi)miR-208和miR-499 抑制劑施用的時(shí)間間隔范圍可以為幾分鐘至幾天。例如，時(shí)間間隔可以是約1小時(shí)至約72 小時(shí)、6小時(shí)至約48小時(shí)、或約12小時(shí)至約24小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miR-208 抑制劑與miR-499抑制劑的施用之間的時(shí)間間隔是至少24小時(shí)。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到在 miR-208抑制劑前至少約24小時(shí)施用miR-499抑制劑導(dǎo)致在施用miR-208抑制劑后約3天時(shí)壓力誘導(dǎo)的β-MHC表達(dá)降低至少約50%。在沒(méi)有miR-499抑制劑的情況中，對(duì)壓力誘導(dǎo)的β -MHC表達(dá)的相當(dāng)?shù)男Ч钡绞┯胢iR-208抑制劑后至少約2個(gè)月才觀察到。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以采用miR-208和miR-499抑制劑的超過(guò)一次順序施用以產(chǎn)生持續(xù)的效果。在這點(diǎn)上，可以使用各種組合。舉例而言，在miR-499的抑制劑是“A”，而miR-208 (例如miR-208a或miR-208b)的抑制劑是“B”的情況中，基于總共3和 4次施用的下列排列是例示性的A/'KB；Ikl/BB/B,'KΑ/Α/ΒΒ/Α/ΑΑ/Β/ΒB/,Β/Β/Α B/,Β/Α/Β
A/7A/7B/xBA/%/A/BA/,Β/Β/ΑΒ/Β/Α/ΑΒ/Α/Β//AΒ/Α/Α/ΒΒ/Β/Β/ΑA/%%xBB/%'k/kA/,Β/Α/ΑΑ/Α/Β/ΑΑ/Β/Β//BΒ/Α/Β/ΒΒ/Β/Α/Β同樣涵蓋其它組合。優(yōu)選地，miR-208 (例如miR_208a或miR_208b)和miR-499的表達(dá)或活性在對(duì)受試者施用miR-208抑制劑和miR-499抑制劑后的受試者的心臟細(xì)胞中降低。在某些實(shí)施方案中，miR-208a/miR-208b和/或miR-499的表達(dá)或活性在施用miR-208和miR-499抑制劑后降低大于50%、大于60%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、或大于95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a/miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用抑制劑后的受試者的心臟細(xì)胞中降低大于60%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a/miR-208b和 miR-499的表達(dá)或活性在施用抑制劑后的受試者的心臟細(xì)胞中降低大于80%。在又一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a/miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用抑制劑后的受試者的心臟細(xì)胞中降低大于90%。本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)心臟和/或骨骼肌肉收縮性的方法。根據(jù)專門(mén)化的收縮和代謝特性，成人骨骼肌纖維可分成快速和慢速顫動(dòng)亞型。這些特性反映了肌球蛋白重和輕鏈、 原肌球蛋白、和肌鈣蛋白，及肌紅蛋白的快速和慢速收縮蛋白質(zhì)同等型的特定子集的表達(dá) (Naya等(2000) J Biol Chem，第275卷(7) =4545-4548) 0慢速顫動(dòng)肌肉主要用于長(zhǎng)期活動(dòng)，諸如保持姿勢(shì)和持久的運(yùn)動(dòng)活性?？焖兕潉?dòng)纖維主要用于大力爆發(fā)活動(dòng)。成人骨骼肌表型不是靜態(tài)的，而是保留響應(yīng)于承重(load bearing)和收縮使用樣式的變異來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的能力，導(dǎo)致形態(tài)、表型、和收縮特性的適應(yīng)。在缺乏這兩個(gè)miR-208a等位基因的小鼠的心臟中觀察到數(shù)種快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的上調(diào)。miR-208a敲除小鼠的心臟中快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的這種上調(diào)指示 miR-208在正常情況中發(fā)揮遏制快速骨骼肌基因程序的功能。在miR-208a突變體小鼠中觀察到伴隨的miR-499表達(dá)降低(參見(jiàn)實(shí)施例3)，提示miR-499可能還負(fù)面地調(diào)節(jié)快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的表達(dá)。如上文所討論的，miR-208b也主要在慢速骨骼肌(例如比目魚(yú)肌)中表達(dá)。如此，miR-208b對(duì)人的心臟和骨骼肌肉收縮性可以具有深刻的影響，而且還可以調(diào)節(jié)快速骨骼肌基因程序并確定纖維身份。本發(fā)明人最近已經(jīng)顯示了，miR-208b和 miR-499通過(guò)激活慢速肌纖維基因程序并遏制快速肌纖維基因程序而在肌肉纖維身份的規(guī)格上起重要作用。這些miRNA的作用部分是通過(guò)收集慢速肌纖維基因的轉(zhuǎn)錄阻遏物，如 Sox6、PUR0、Sp3和HPl β來(lái)介導(dǎo)的。使用骨骼肌特異性MCK-啟動(dòng)子miR-499轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還揭示了向更慢速的肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。甚至更顯著的是，在小鼠進(jìn)行被迫踏車奔跑方案時(shí)，miR-499轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比野生型同窩出生者奔跑得長(zhǎng)超過(guò)50 %，指示源自快速肌纖維向更慢速的纖維類型的重編程的耐力增強(qiáng)。參見(jiàn)van Rooij等(2009)Developmental Cell, 第 17 卷662-673)。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)心臟和/或骨骼肌肉收縮性的方法包括對(duì)心臟和/或骨骼肌肉細(xì)胞施用miR-499和miR-208 (例如miR_208a或miR_208b)表達(dá)或活性的調(diào)控劑。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括施用miR-499和miR-208b的調(diào)控劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)心臟收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括對(duì)心臟細(xì)胞施用miR-499 和miR-208(例如miR-208a或miR-208b)表達(dá)或活性的調(diào)控劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 提供了一種調(diào)節(jié)骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和 miR-208 (例如miR-208a或miR-208b)表達(dá)或活性的調(diào)控劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和miR-208b 表達(dá)或活性的調(diào)控劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞的纖維類型轉(zhuǎn)換的方法，包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和miR-208表達(dá)或活性的調(diào)控劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞的纖維類型轉(zhuǎn)換的方法包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和 miR-208b表達(dá)或活性的調(diào)控劑。所述調(diào)控物可以是miR-499、miR-208、和/或miR_208b表達(dá)或活性的激動(dòng)劑或抑制劑。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使細(xì)胞與miR-499和miR-208a (或 miR-208b)抑制劑接觸來(lái)在細(xì)胞中提高THRAPl、PURβ、肌肉抑制素、Sp3、HPl β、和Sox 6的表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)使細(xì)胞與miR-499和miR-208a (或miR-208b)的激動(dòng)劑接觸來(lái)在細(xì)胞中降低THRAPU PURβ、肌肉抑制素、Sp3、HP13、和Sox 6的表達(dá)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了降低心臟細(xì)胞中的β -MHC表達(dá)的方法，包括對(duì)心臟細(xì)胞施用miR-499和miR-208 (例如miR_208a或miR_208b)表達(dá)或活性的抑制劑。 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了降低骨骼肌細(xì)胞中的β -MHC表達(dá)的方法，包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和miR-208b表達(dá)或活性的抑制劑。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，提供了提高心臟細(xì)胞和/或骨骼肌細(xì)胞中的β -MHC表達(dá)的方法，包括提高內(nèi)源miR-499和miR-208a (或 miR-208b)表達(dá)或活性或?qū)π呐K細(xì)胞和/或骨骼肌細(xì)胞施用外源miR-499和miR-208a (或 miR-208b)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了提高心臟細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括對(duì)心臟細(xì)胞施用miR-499和miR-208 (例如miR_208a或miR_208b)表達(dá)或活性的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了提高骨骼肌細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括對(duì)骨骼肌細(xì)胞施用miR-499和miR-208b表達(dá)或活性的抑制劑。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了降低心臟細(xì)胞和/或骨骼肌細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括提高內(nèi)源miR-499和miR-208a (或miR_208b)表達(dá)或活性或?qū)π呐K細(xì)胞和/或骨骼肌細(xì)胞施用外源miR-499和miR-208a (或miR_208b)。可依照本發(fā)明的方法升高或降低的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的例子包括但不限于肌鈣蛋白12、肌鈣蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白輕鏈、或α骨骼肌動(dòng)蛋白。在骨骼肌中，對(duì)慢速纖維基因的遏制和對(duì)快速纖維基因的激活與多種肌肉骨骼病癥(包括但不限于失用性萎縮、響應(yīng)反重力而發(fā)生的肌肉萎縮、和去神經(jīng))有關(guān)。如此，在骨骼肌細(xì)胞中miR-499與miR-208a或miR-208b組合的表達(dá)可以用于遏制快速纖維基因，由此激活慢速纖維基因的交互表達(dá)。因而，本發(fā)明還涵蓋一種用于在有需要的受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者施用miR-208 (例如miR-208a或miR_208b)的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑，其中miR-208a/miR_208b和 miR-499的表達(dá)或活性在施用后的受試者的骨骼肌細(xì)胞中升高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者施用miR-208b的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑，其中miR_208b和miR-499 的表達(dá)或活性在施用后的受試者的骨骼肌細(xì)胞中升高。優(yōu)選地，受試者的骨骼肌細(xì)胞中的一種或多種快速骨骼肌基因的表達(dá)在施用miR-499和miR-208a (或miR-208b)激動(dòng)劑后降低。一種或多種快速骨骼肌基因可以包括但不限于肌鈣蛋白12、肌鈣蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白輕鏈、或α骨骼肌動(dòng)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)骨骼肌施用miR-499和miR-208 (例如 miR-208a或miR-208b)的激動(dòng)劑來(lái)治療或預(yù)防響應(yīng)降低的重力環(huán)境而發(fā)生的肌肉萎縮的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療或預(yù)防響應(yīng)降低的重力環(huán)境而發(fā)生的肌肉萎縮的方法包括對(duì)骨骼肌施用miR-499和miR-208b的激動(dòng)劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)骨骼肌施用miR-499的激動(dòng)劑和miR-208 (例如miR-208a或miR_208b)的激動(dòng)劑來(lái)治療或預(yù)防肌肉萎縮的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療或預(yù)防肌肉萎縮的方法包括對(duì)骨骼肌施用miR-499的激動(dòng)劑和miR-208b的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，miR-208 (miR208a或miR-208b)的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑是編碼成熟miR-208(miR208a或miR-208b)和/或miR-499序列的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含成熟miR-208a序列(SEQ ID NO :5)和成熟miR-499序列(SEQ ID N0:14)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含成熟miR_208b序列(SEQ ID NO 19)和成熟miR-499序列(SEQ ID NO 14)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499的激動(dòng)劑和 miR-208 (miR208a 或 miR-208b)的激動(dòng)劑可以是包含 miR-499 和 miR-208 (miR208a 或 miR-208b)的 pri_miRNA 或 pre_miRNA 序列的多核苷酸?；蛘?，miR-208 (miR208a 或 miR-208b)的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑可以是不同多核苷酸，其各包含miRNA的成熟序列或pre-miRNA序列。包含成熟miR-499和/或miR-208 (miR208a或miR_208b)序列的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。所述多核苷酸可含有一處或多處化學(xué)修飾，諸如鎖定核酸、 肽核酸、糖修飾(諸如2’ -0-烴基或2’ -0-烷基(例如2’ -0-甲基、2’ -0-甲氧乙基)、 2’ -氟、和4’ -硫修飾)、和主鏈修飾(諸如一個(gè)或多個(gè)硫代硫酸酯、嗎啉代、或膦?；人狨ミB接)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含miR-499、miR-208、和/或miR_208b序列的多核苷酸偶聯(lián)于膽固醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499和miR-208 (miR208a或miR-208b)的激動(dòng)劑可以在表達(dá)載體上表達(dá)。用于表達(dá)miR-499和miR-208 (miR208a或miR-208b)的表達(dá)載體包含與編碼miR-499和/或miR-208(miR208a或miR-208b)的多核苷酸可操作連接的至少一個(gè)啟動(dòng)子。編碼miR-499的多核苷酸可以編碼初級(jí)-miRNA-499序列(pri-miR-499)、 前體-miRNA-499 序列(pre-miR-499)或成熟 miR-499 序列。編碼 miR-208a/miR_208b 的多核苷酸可以編碼初級(jí) _miRNA-208a/208b 序列(pri-miR-208/pri_miR-208b)、前體-miRNA-208/208b 序列(pre-miR-208a/pre_miR-208b)或成熟 miR_208a/208b 序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:14。在其它實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID N0:19和SEQ IDNO 14。此類多核苷酸可以長(zhǎng)約18至約2000個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約70至約200個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約20至約50個(gè)核苷酸，或長(zhǎng)約18至約25個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以從不同啟動(dòng)子表達(dá)miR-499 激動(dòng)劑(例如包含miR-499序列的多核苷酸)和miR-208激動(dòng)劑(例如包含miR-208a或 miR-208b序列的多核苷酸)。編碼miR-499、miR_208a、和/或miR_208b的多核苷酸可以位于編碼內(nèi)含子的核酸中或編碼mRNA的非翻譯區(qū)的核酸中或者非編碼RNA中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建物可含有來(lái)自Myh7b基因第20內(nèi)含子的序列或來(lái)自Myh7 ( β -MHC) 基因第31內(nèi)含子的序列。可以對(duì)受試者共施用miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑與miR-499的激動(dòng)劑。可以在單一配制劑(例如包含miR-208a或miR_208b激動(dòng)劑和miR-499激動(dòng)劑的藥物組合物) 中施用兩種激動(dòng)劑。或者，兩種激動(dòng)劑(例如miR-208a和miR-499或miR_208b和miR-499) 可以是編碼兩種miRNA的成熟或pre-miRNA序列的單一多核苷酸?？梢栽诔掷m(xù)的一段時(shí)間， 例如1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年、2年、3年、4 年、或5年里給予兩種激動(dòng)劑的多次共施用。在某些實(shí)施方案中，順序施用miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑在miR-499的激動(dòng)劑前施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499的激動(dòng)劑在miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑前施用。分開(kāi)激動(dòng)劑施用的時(shí)間間隔范圍可以為幾分鐘至幾周，例如約1小時(shí)至約72小時(shí)、6小時(shí)至約48小時(shí)、或約12小時(shí)至約24小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miR-208a或miR-208b激動(dòng)劑與miR-499激動(dòng)劑的施用之間的時(shí)間間隔是至少24小時(shí)。本發(fā)明還包括包含miR-499、miR_208a、和/或miR_208b的抑制劑或激動(dòng)劑的藥物組合物。在涵蓋臨床應(yīng)用的情況中，會(huì)以適合于意圖應(yīng)用的形式制備藥物組合物。一般地，這會(huì)需要制備基本上沒(méi)有熱原，及其它對(duì)人或動(dòng)物可有害的雜質(zhì)的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含有效劑量的miR-499抑制劑和/或有效劑量的miR-208a或miR-208b抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含有效劑量的 miR-499激動(dòng)劑和/或有效劑量的miR-208a或miR_208b激動(dòng)劑?！坝行┝俊敝缸阋詫?shí)現(xiàn)有益的或期望的臨床結(jié)果的量。本發(fā)明的miRNA抑制劑或miRNA激動(dòng)劑的有效劑量可以是約 lmg/kg 至約 200mg/kg、約 20mg/kg 至約 160mg/kg、或約 40mg/kg 至約 100mg/kg。在一個(gè)實(shí)施方案中，各以約20mg/kg至約200mg/kg的劑量施用miR-208或miR_208b的抑制劑和 miR-499的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，各以約80mg/kg的劑量施用miR-208或miR-208b 的抑制劑和miR-499的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，各以約20mg/kg至約200mg/kg的劑量施用miR-208或miR-208b的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，各以約 80mg/kg的劑量施用miR-208或miR-208b的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑。認(rèn)為什么是有效劑量的精確確定可以基于每名患者的個(gè)體因素，包括其體型、年齡、病癥的類型(例如心肌梗死、心力衰竭、心臟肥大、或肌肉骨骼的)、和抑制劑或激動(dòng)劑(例如antagomir、表達(dá)構(gòu)建體、反義寡核苷酸等)的性質(zhì)。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)此公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域的知識(shí)可以容易地確定劑量?？梢允褂媚z狀分散系統(tǒng)(諸如高分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠、和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束(micelle)、混合膠束、和脂質(zhì)體)作為miRNA功能的寡核苷酸抑制劑、編碼miRNA激動(dòng)劑的多核苷酸、或表達(dá)特定miRNA抑制劑或激動(dòng)劑的構(gòu)建體的遞送運(yùn)載體。適于將本發(fā)明的核酸遞送至心肌和骨骼肌組織的商業(yè)上可得到的脂肪乳劑包括Intralipid 、Liposyn 、Liposyn 11、Liposyn π I、Nutril ipid、和其它類似的脂質(zhì)乳劑。一種作為體內(nèi)遞送運(yùn)載體使用的優(yōu)選的膠狀系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜囊泡)。 此類系統(tǒng)的制備和使用是本領(lǐng)域公知的。例示性的配制劑還披露于US 5,981,505 ；US 6, 217, 900 ；US 6, 383, 512 ；US 5, 783, 565 ；US 7, 202, 227 ；US 6, 379, 965 ；US 6，127，170 ； US5, 837，533 ；US 6，747，014 ；和 W003/093449，通過(guò)提述完整并入本文。一般會(huì)希望采用適宜的鹽和緩沖劑來(lái)使得遞送運(yùn)載體穩(wěn)定且容許被靶細(xì)胞攝取。 本發(fā)明的水性組合物包含有效量的遞送運(yùn)載體，其包含溶解或分散在藥學(xué)可接受載體或水性介質(zhì)中的抑制劑多核苷酸或miRNA多核苷酸序列(例如脂質(zhì)體或其它復(fù)合物或表達(dá)載體)。短語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”指在對(duì)動(dòng)物或人類施用時(shí)不產(chǎn)生不利的、 變應(yīng)性的、或其它不想要的反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文中所使用的，“藥學(xué)可接受載體”包括可接受用于配制藥物(諸如對(duì)于人類施用合適的藥物)的溶劑、緩沖劑、溶液、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。此類介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的使用是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與本發(fā)明的活性成分不相容，涵蓋它在治療性組合物中的用途。還可以將補(bǔ)充性活性成分摻入組合物中，只要它們不滅活所述組合物的載體或多核苷酸。本發(fā)明的活性組合物可包括經(jīng)典的藥學(xué)制備物。依照本發(fā)明的這些組合物的施用
18可以經(jīng)由任何常用路徑，只要靶組織經(jīng)由該路徑可及。這包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是經(jīng)過(guò)皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或者通過(guò)直接注射入心臟組織。包含 miRNA抑制劑的藥物組合物、編碼miRNA序列的多核苷酸或包含miRNA序列的表達(dá)構(gòu)建體也可以通過(guò)導(dǎo)管系統(tǒng)或?yàn)閷⒅委焺┻f送至心臟而分離冠狀循環(huán)的系統(tǒng)來(lái)施用。本領(lǐng)域知道用于將治療劑遞送至心臟和冠狀脈管系統(tǒng)的多種導(dǎo)管系統(tǒng)。美國(guó)專利No. 6，416，510 ；美國(guó)專利 No. 6，716，196 ；美國(guó)專利 No. 6，953，466 ；WO 2005/082440 ；WO 2006/089340 ；美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 2007/0203445 ；美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 2006/0148742 ；和美國(guó)專利公開(kāi)文本 No. 2007/0060907 (通過(guò)提述完整并入本文)中披露了適用于本發(fā)明的基于導(dǎo)管的遞送方法或冠狀動(dòng)脈分離方法的一些非限制性例子。此類組合物通常會(huì)作為如本文中所述的藥學(xué)可接受組合物來(lái)施用。活性化合物也可以胃腸外或腹膜內(nèi)施用。舉例而言，可以在與表面活性劑(諸如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水中制備游離堿或藥理學(xué)可接受鹽形式的活性化合物的溶液。 也可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中及在油中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，這些制備物一般含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。適于注射使用或?qū)Ч苓f送的藥物形式包括例如無(wú)菌水溶液或分散體及用于臨場(chǎng)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉劑。一般而言，這些制備物是無(wú)菌的，而且存在易于注射的流動(dòng)性程度。制備物在制造和貯存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，而且應(yīng)當(dāng)針對(duì)微生物(諸如細(xì)菌和真菌)的污染作用進(jìn)行防腐。適宜的溶劑或分散介質(zhì)可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇、等等)、它們的合適混合物、及植物油。可以通過(guò)例如使用涂層(諸如卵磷脂)、通過(guò)維持所需粒度(在分散體的情況中)和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的預(yù)防，例如對(duì)羥苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在許多情況中，會(huì)優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在組合物中使用延遲吸收的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的吸收的延長(zhǎng)，例如單硬脂酸鋁和明膠?？扇缦轮苽錈o(wú)菌注射液，即以適宜的量將活性化合物根據(jù)需要與任何其它成分 (例如上文所列)一起并入溶劑中，接著過(guò)濾除菌。一般而言，如下制備分散體，即，將各種經(jīng)滅菌的活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和期望的其它成分(例如上文所列)的無(wú)菌運(yùn)載體中。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況中，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，它們自先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何附加的所需成分的粉末。本發(fā)明的組合物一般可配制成中性或鹽形式。藥學(xué)可接受鹽包括例如自無(wú)機(jī)酸 (例如鹽酸或磷酸)或自有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的)。也可以自無(wú)機(jī)堿(例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵)或自有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)衍生與蛋白質(zhì)的游離羧基形成的鹽。配制后，優(yōu)選以與劑型相容的方式和以治療上有效的量施用溶液。所述配制劑可以容易地以多種劑量形式來(lái)施用，諸如注射液、藥物釋放膠囊等等。例如，為了以水溶液形式胃腸外施用，一般將溶液適當(dāng)緩沖，并且首先例如用足夠的鹽或葡萄糖使得液體稀釋劑等滲。此類水溶液可用于例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選的是，采用無(wú)菌水介質(zhì)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，特別是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容來(lái)進(jìn)行。舉例而言，可以將單劑溶解在Iml等滲NaCl溶液中，并且或是添加至IOOOml皮下輸液或是在建議的輸注部位注射(參見(jiàn)例如《Remington，s Pharmaceutical Sciences))第 15 版，第 1035-1038 頁(yè)和第 1570-1580頁(yè))。根據(jù)所治療的受試者的狀況，劑量必然會(huì)發(fā)生一些變化。在任何情況中， 負(fù)責(zé)施用的人會(huì)為各受試者確定適宜的劑量。此外，對(duì)于人類施用，制備物應(yīng)當(dāng)達(dá)到FDA生物制劑標(biāo)準(zhǔn)辦公室要求的無(wú)菌度、熱原度、一般安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。本文所述任何成分可以包含在試劑盒中。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有包含 miR-208a或miR-208b抑制劑的第一藥物組合物和包含miR-499抑制劑的第二藥物組合物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有包含miR-208a或miR-208b抑制劑和miR-499抑制劑的單一藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有包含miR-208a或miR-208b激動(dòng)劑的第一藥物組合物和包含miR-499激動(dòng)劑的第二藥物組合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有包含miR-208a或miR_208b激動(dòng)劑和miR-499激動(dòng)劑的單一藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可包括一種或多種轉(zhuǎn)染試劑以便于將miRNA激動(dòng)劑或抑制劑遞送至細(xì)胞。試劑盒的成分可以在水介質(zhì)中或以凍干形式包裝。試劑盒的容器裝置一般會(huì)包括至少一個(gè)管形瓶(vial)、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中裝有(優(yōu)選合適地分配的)成分。在試劑盒中有超過(guò)一種成分的情況中，試劑盒一般還會(huì)包含第二、第三或其它附加的容器，其中可以分開(kāi)裝納別的成分(例如無(wú)菌的、藥學(xué)可接受緩沖液和/或其它稀釋劑)。然而，可以在管形瓶中裝納各種成分組合。通常，本發(fā)明的試劑盒一般還包括為了商業(yè)銷售而牢固地安置核酸，和任何其它試劑容器的手段。此類容器可包括用于保留期望的管形瓶的注射或吹塑成形的塑料容器。當(dāng)所述試劑盒的成分在一種和/或多種液體溶液中提供時(shí)，所述液體溶液是水溶液，特別優(yōu)選無(wú)菌的水溶液。然而，試劑盒的成分可以以干粉形式提供。當(dāng)試劑和/或成分以干粉形式提供時(shí)， 可以通過(guò)添加合適的溶劑來(lái)將所述粉劑重構(gòu)?？深A(yù)見(jiàn)的是所述溶劑也可以在另一容器手段中提供。此類試劑盒還可包括保存或維持miRNA激動(dòng)劑或miRNA抑制劑或者保護(hù)它們免于降解的成分。此類成分可以不含DNA酶、不含RNA酶或針對(duì)核酸酶(RNA酶和DNA酶)提供保護(hù)。此類試劑盒一般會(huì)以合適的手段為每種單獨(dú)的試劑或溶液包含獨(dú)特的容器。試劑盒還會(huì)包括關(guān)于采用試劑盒成分以及使用試劑盒中沒(méi)有包括的任何其它試劑的指示。指示可包括能執(zhí)行的變化形式。試劑盒還可包括通過(guò)多種施用路徑(諸如胃腸外或?qū)Ч苁┯?施用miRNA激動(dòng)劑或抑制劑的器具或裝置。涵蓋的是此類試劑是本發(fā)明試劑盒的實(shí)施方案。然而，此類試劑盒不限于上文鑒定的具體項(xiàng)，而且可包括任何用于miRNA操作或表征的試劑。僅為了說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面而包括下列實(shí)施例。在實(shí)施例和圖中提及miR208 指小鼠中的miR208a。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明同樣適用于任何人或其它動(dòng)物，而且涵蓋調(diào)控miR208a和/或miR208b。
實(shí)施例實(shí)施例1 :MiR_208敲除小鼠展現(xiàn)出響應(yīng)壓力超載而發(fā)生的心臟肥大和纖維化降低miR-208在α-MHC基因的內(nèi)含子內(nèi)編碼。與α-MHC—樣，miR-208在心臟中特異性表達(dá)，在肺中有痕量表達(dá)。miR-208是自α-MHC pre-mRNA加工出的，而不是作為分開(kāi)的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄得到的。然而，有趣的是，miR-208展現(xiàn)出長(zhǎng)得引人注目的、至少14天的半衰期， 而且由此甚至能在α-MHC mRNA表達(dá)已經(jīng)下調(diào)時(shí)發(fā)揮功能。通過(guò)生成miR-208靶向載體來(lái)創(chuàng)建MiR-208敲除小鼠，所述miR-208靶向載體通過(guò)將在miR-208編碼區(qū)上游延伸的0. 4kb片段(5，臂)用SacII和NotI消化，并將片段連接入pGKne0F2L2dta靶向質(zhì)粒，在IoxP位點(diǎn)和側(cè)翼為Fit的新霉素盒的上游來(lái)得到。將 3. 3kb片段(3’臂)用SalI和HindIII消化并連接入載體，在新霉素抗性與Dta負(fù)選擇盒之間。用5’和3’探針通過(guò)Southern印跡分析來(lái)鑒定攜帶被破壞的等位基因的靶定ES細(xì)胞。鑒定出三個(gè)miR-208靶定ES克隆并用于胚泡注射。將所得嵌合小鼠與C57BL/6交配以獲得突變等位基因的種系傳遞。雖然小鼠中的miR-208遺傳刪除未能誘發(fā)明顯表型，但是對(duì)來(lái)自2月齡野生型和 miR-208-/-動(dòng)物的心臟進(jìn)行的微陣列分析揭示了 miR-208消除導(dǎo)致眾多快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的顯著表達(dá)，它們?cè)谡Ｇ闆r中在心臟中不表達(dá)。如此，這些結(jié)果提示在正常條件下，miR-208與唯一的心臟特異性MHC基因共表達(dá)，通過(guò)遏制骨骼肌基因在心臟中的表達(dá)來(lái)維持心肌細(xì)胞身份。miR-208無(wú)效(null)小鼠對(duì)心臟壓力的異常響應(yīng)揭示了 miR-208的最顯著功能 (van Rooij 等，(2007) Science，Vol. 316 :575_579)。響應(yīng)于通過(guò)胸主動(dòng)脈縮窄(TAB)(其驅(qū)動(dòng)心臟的病理性重塑)的壓力超載，與來(lái)自野生型小鼠的切片相比，來(lái)自miR-208敲除小鼠的心臟的組織學(xué)切片實(shí)際上顯示無(wú)心肌細(xì)胞肥大或纖維化(圖1A)。另外，miR-208敲除動(dòng)物不能響應(yīng)壓力超載而上調(diào)β -MHC表達(dá)(圖IB和C)。相反，其它壓力響應(yīng)性基因(諸如那些編碼ANF和BNP的)在miR-208突變動(dòng)物中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)(圖1B)，證明了 miR-208明確專門(mén)致力于控制β-MHC表達(dá)，它能與心臟壓力應(yīng)答的其它方面脫離(uncouple)。實(shí)施例2 敲低miR-208表型模擬響應(yīng)壓力的miR-208敲除動(dòng)物為了檢查miR-208的缺乏對(duì)心臟壓力響應(yīng)的影響的特異性，每天給動(dòng)物靜脈內(nèi)注射antagomir，其具有與成熟miR-208序列互補(bǔ)的序列(反208;SEQ IDNO 16)或錯(cuò)配序列 (mm ；SEQ ID NO 17)。所有核苷是經(jīng)2’ -OMe修飾的，而且5’端的兩個(gè)和3’端的四個(gè)堿基含有核苷間硫代磷酸酯。經(jīng)由羥基脯氨醇接頭將膽固醇附接于信使鏈的3’端(圖2A)。治療后2個(gè)月對(duì)注射miR-208antagomir的動(dòng)物的心臟的實(shí)時(shí)PCR分析顯示miR-208的有效敲低(圖2B)。為了測(cè)試體內(nèi)miR-208下調(diào)對(duì)心臟壓力響應(yīng)的影響，接受反-miR_208antagomir 或錯(cuò)配對(duì)照的動(dòng)物進(jìn)行假規(guī)程或胸主動(dòng)脈縮窄規(guī)程以誘導(dǎo)壓力超載。用錯(cuò)配對(duì)照處理的動(dòng)物展現(xiàn)出典型的壓力響應(yīng)，其中上調(diào)β-MHC及其它壓力基因(ANF和BNP)。相反，用反-miR-208 antagomir處理的動(dòng)物未能顯示響應(yīng)壓力刺激的β -MHC上調(diào)。然而，觀察到其它壓力基因(ANF和BNP)的表達(dá)升高(圖2C)。用反-miR-208 antagomir處理的動(dòng)物的壓力響應(yīng)與miR-208敲除動(dòng)物的壓力響應(yīng)顯著相似，提示miR-208在調(diào)節(jié)響應(yīng)壓力的β -MHC 表達(dá)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵的作用。實(shí)施例3 :MiR-208是miR-499表達(dá)所需要的為了進(jìn)一步探索miR-208在心臟中的作用機(jī)制，發(fā)明人通過(guò)微陣列分析來(lái)限定來(lái)自野生型和miR-208敲除小鼠的心臟的miRNA表達(dá)樣式。在miR-208敲除心臟中上調(diào)和下調(diào)的數(shù)種miRNA中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-499在正常心臟中高度豐富，但是在miR-208敲除動(dòng)物中不超過(guò)背景水平表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)得到了 Northern印跡的證實(shí)(圖3)。對(duì)miR-499基因的基因組定位的分析顯示了它包含在Myh7b基因(a-MHC基因的一種同源物)的第20內(nèi)含子內(nèi)。miR-208表現(xiàn)出在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Myh7b和由此miR-499表達(dá)，因?yàn)獒槍?duì)Myh7b的 RT-PCR指示宿主基因的mRNA在不存在miR-208的情況中被劑量依賴性地消除(圖3)。Myh7b基因在脊椎動(dòng)物中是保守的，而且僅僅在心臟和慢速骨骼肌(例如比目魚(yú)肌)中表達(dá)(圖4A)。相似地，miR-499與其宿主基因具有相同的表達(dá)樣式，如通過(guò)實(shí)時(shí) PCR分析所確認(rèn)的(圖4A和B)。使用針對(duì)Myh7b基因3’端的探針進(jìn)行的原位雜交指示此肌球蛋白(和miR-499)在心臟中與E 10. 5 一樣早地表達(dá)(圖4C)。后來(lái)在胚胎發(fā)生期間，Myh7b/miR-499也在體節(jié)中表達(dá)。這些數(shù)據(jù)指示miR-208是驅(qū)動(dòng)另一種肌球蛋白(即 Myh7b，它產(chǎn)生相關(guān)的miR-499)所需要的。另外，miR-499在心臟肥大期間下調(diào)。為了進(jìn)一步探索miR-499在病理學(xué)心臟肥大和肌肉收縮性調(diào)節(jié)中的作用，產(chǎn)生 miR-499敲除動(dòng)物。miR-499的遺傳刪除對(duì)其宿主基因Myh7b的表達(dá)沒(méi)有影響(圖5A)。對(duì)來(lái)自miR-499突變體和野生型動(dòng)物的心臟的α -和β -MHC兩者的Western印跡分析顯示 miR-499的刪除不影響任一種基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)(圖5B)。為了檢查miR-499是否對(duì) β -MHC調(diào)節(jié)具有影響，野生型和miR-499敲除動(dòng)物接受丙基硫尿嘧啶(PTU)，其誘導(dǎo)甲狀腺功能減退癥并上調(diào)β-MHC。野生型和miR-499敲除動(dòng)物兩者都展現(xiàn)出響應(yīng)PTU的α-MHC 降低和β -MHC升高(圖5C)。令人驚訝的是，與miR-208不同，miR-499不是調(diào)節(jié)α -或 β -MHC的表達(dá)所需要的。實(shí)施例4 :miR-208和miR-499的雙重靴定MiR-208調(diào)節(jié)miR-499的表達(dá)，如通過(guò)miR-208雜合子和miR-208敲除動(dòng)物中的 miR-499表達(dá)的劑量依賴性降低所顯示的(圖3和實(shí)施例3)。為了進(jìn)一步闡明miR-208 與miR-499之間的相互作用，給野生型動(dòng)物靜脈內(nèi)注射鹽水或四劑量之一(20mg/kg、40mg/ kg、80mg/kg和160mg/kg)的合成寡核苷酸(例如antagomir)，其具有與成熟miR-208序列互補(bǔ)的序列(反-miR-208 ；SEQ ID NO 16)。尾靜脈注射后3天對(duì)心臟組織的Northern分析揭示成熟miR-208表達(dá)的劑量依賴性降低，而使pre-miR-208表達(dá)保持原樣(圖6A)。然而，與在遺傳刪除模型中不同，miR-499的表達(dá)保持不變。另外，β-MHC的表達(dá)水平在注射反-miR-208antagomir后3天也不受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，給野生型動(dòng)物靜脈內(nèi)注射單劑反-miR-208 (80mg/kg)、在連續(xù)兩天注射連續(xù)兩劑(80mg/kg)反-miR-208、或在連續(xù)兩天注射連續(xù)兩劑(80mg/kg)錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸(SEQ ID NO 17)。處理后2個(gè)月對(duì)心臟組織的Northern分析顯示miR-208 和miR-499表達(dá)在用反-miR-208處理的動(dòng)物中均降低(圖6B)。實(shí)時(shí)PCR分析確認(rèn)這些結(jié)果(圖6C)。另外，還觀察到miR-208b (其在β-MHC的內(nèi)含子內(nèi)編碼，并與β-MHC共表達(dá))的表達(dá)降低。對(duì)相應(yīng)的宿主肌球蛋白基因的實(shí)時(shí)PCR分析揭示miR-208的敲低不影響 α -MHC的表達(dá)，但是誘導(dǎo)β -MHC和Myh7b的表達(dá)降低(圖6C)。在用反-miR-208治療后2 個(gè)月還觀察到β-MHC蛋白的降低(圖6D)。這些結(jié)果指示延遲后發(fā)生miR-208對(duì)miR-499 和β -MHC表達(dá)的調(diào)節(jié)，提示miR-208在miR-499的上游，其又在β -MHC的上游。如此， miR-208和miR-499兩者都需要下調(diào)以獲得β-MHC表達(dá)的加速降低。單獨(dú)的MiR-208下調(diào)導(dǎo)致最終的miR-499表達(dá)降低，這繼而誘導(dǎo)β -MHC表達(dá)的降低。為了獲得對(duì)β -MHC表達(dá)的更即刻的影響，可以靶定miR-499和miR-208兩者來(lái)進(jìn)行下調(diào)。為了檢查下調(diào)miR-208和miR-499兩者的組合效果，對(duì)miR-499敲除動(dòng)物施用反-miR-208寡核苷酸，之后接受丙基硫尿嘧啶(PTU)JP β-MHC表達(dá)的一種誘導(dǎo)物。與先前的結(jié)果相似，PTU在沒(méi)有用反-miR-208寡核苷酸處理的野生型和miR-499敲除動(dòng)物兩者中都誘導(dǎo)α -MHC表達(dá)降低和β -MHC/miR-208b表達(dá)(miR_208b與β -MHC共表達(dá))升高 (圖7Α，B)。此類效應(yīng)是心臟壓力響應(yīng)特征性的。相反，處理后2周來(lái)自用反-miR-208寡核苷酸處理的miR-499敲除動(dòng)物的心臟組織的Northern和實(shí)時(shí)PCR分析顯示，沒(méi)有觀察到響應(yīng)PTU的β -MHC/miR-208b表達(dá)升高(圖7A，B)。用反-miR-208處理的miR-499敲除動(dòng)物的響應(yīng)與miR-208敲除動(dòng)物的響應(yīng)相似(圖7B)。這些結(jié)果提示可以通過(guò)靶定miR-208 和miR-499兩者來(lái)實(shí)現(xiàn)β-MHC的有效且快速下調(diào)。對(duì)動(dòng)物施用的反-miR-208寡核苷酸的劑量產(chǎn)生降低60%的miR-208表達(dá)。此百分比降低足以在沒(méi)有miR-499的情況中遏制PTU 對(duì)β -MHC的誘導(dǎo)(圖7Β)。這些發(fā)現(xiàn)指示miR-499和miR-208兩者的降低可為用于治療心臟病癥諸如病理學(xué)心臟肥大和心力衰竭的有效治療策略。實(shí)施例5 敲低miR-208和miR-499抑制心臟壓力響應(yīng)為了進(jìn)一步評(píng)估靶定miR-208和miR-499對(duì)于治療心臟病癥的治療價(jià)值，給小鼠靜脈內(nèi)注射具有與成熟miR-208a序列互補(bǔ)的序列的反義寡核苷酸(反-208)、具有與成熟 miR-499序列互補(bǔ)的序列的反義寡核苷酸(反-499)、或反-208和反-499寡核苷酸序列兩者。反-208和反-499兩者都含有由核苷間硫代磷酸酯鍵連接的鎖定核酸(LNA)和脫氧核糖核酸(DNA)的組合。使用處理后3周直至2個(gè)月的注射反義寡核苷酸的動(dòng)物心臟的實(shí)時(shí) PCR分析來(lái)評(píng)估對(duì)miR-208和miR-499的敲低。為了測(cè)試體內(nèi)miR-208和miR-499下調(diào)對(duì)心臟壓力響應(yīng)的影響，接受反-208、 反-499、或反-208和反-499寡聚物兩者的動(dòng)物進(jìn)行假規(guī)程或胸主動(dòng)脈縮窄規(guī)程以誘導(dǎo)壓力超載。未處理的動(dòng)物展現(xiàn)出典型的壓力響應(yīng)，其中上調(diào)β-MHC及其它壓力基因(ANF和 BNP)。相反，用反-208和反-499兩者處理的動(dòng)物展現(xiàn)出響應(yīng)壓力刺激的β-MHC上調(diào)的降低，其比僅接受任一種反義寡聚物的動(dòng)物更顯著。通過(guò)提述將本文中所討論和引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)完整并入本文。 應(yīng)當(dāng)理解，所公開(kāi)的發(fā)明不限于所描述的具體的方法、方案和材料，因?yàn)檫@些可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)是僅為了描述具體的實(shí)施方案，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍，它們僅會(huì)由所附權(quán)利要求書(shū)來(lái)限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，或者僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)便能夠確定本文中所描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同方案。此類等同方案意欲被所附權(quán)利要求書(shū)所涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種在有需要的受試者中治療病理性心臟肥大、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-208a或miR_208b的抑制劑和miR-499的抑制劑，其中miR_208a或 miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用后的所述受試者的心臟細(xì)胞中降低。
2.權(quán)利要求2的方法，其中所述miR-208a或miR_208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑是反義寡核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑是共施用的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述miR-208a或miR_208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑由表達(dá)載體編碼。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述miR-208a或miR_208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑由同一表達(dá)載體編碼。
6.權(quán)利要求1的方法，其中順序施用所述miR-208a或miR-208b的抑制劑和所述 miR-499的抑制劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在所述miR-499的抑制劑前施用所述miR-208a或miR_208b 的抑制劑。
8.權(quán)利要求6的方法，其中在所述miR-208a或miR-208b的抑制劑前施用所述miR-499 的抑制劑。
9.權(quán)利要求6的方法，其中相隔至少M(fèi)小時(shí)施用所述miR-208a或miR-208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑。
10.權(quán)利要求1的方法，其中以約lmg/kg至約200mg/kg的劑量施用所述miR_208a或 miR-208b的抑制劑和所述miR-499的抑制劑。
11.權(quán)利要求1的方法，其中miR-208a或miR-208b和miR-499的表達(dá)或活性在施用所述抑制劑后的所述受試者的心臟細(xì)胞中降低大于60%。
12.權(quán)利要求1的方法，其中心臟壓力響應(yīng)在施用所述抑制劑后的所述受試者中降低。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述心臟壓力響應(yīng)包括所述受試者的心臟細(xì)胞中降低的 α -MHC表達(dá)和/或升高的β -MHC表達(dá)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中在施用所述抑制劑后小于8周發(fā)生所述心臟壓力響應(yīng)的降低。
15.權(quán)利要求12的方法，其中在施用所述抑制劑后小于4周發(fā)生所述心臟壓力響應(yīng)的降低。
16.權(quán)利要求12的方法，其中在施用所述抑制劑后小于1周發(fā)生所述心臟壓力響應(yīng)的降低。
17.一種在有需要的受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，包括對(duì)所述受試者施用miR-208a或miR_208b的激動(dòng)劑和miR-499的激動(dòng)劑，其中miR_208a或miR_208b和 miR-499的表達(dá)或活性在施用后的所述受試者的骨骼肌細(xì)胞中升高。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑和所述miR-499的激動(dòng)劑是編碼成熟miR-208a或miR_208b和/或miR-499序列的多核苷酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑和所述miR-499的激動(dòng)劑在表達(dá)載體上編碼。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑和所述miR-499的激動(dòng)劑是共施用的。
21.權(quán)利要求17的方法，其中順序施用所述miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑和所述 miR-499的激動(dòng)劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中在所述miR-499的激動(dòng)劑前施用所述miR-208a或 miR-208b的激動(dòng)劑。
23.權(quán)利要求21的方法，其中在所述miR-208a或miR-208b的激動(dòng)劑前施用所述 miR-499的激動(dòng)劑。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述骨骼肌細(xì)胞中的一種或多種快速骨骼肌基因的表達(dá)在施用所述miR-499和miR-208激動(dòng)劑后降低。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中一種或多種快速骨骼肌基因選自下組肌鈣蛋白12、肌鈣蛋白T3、快速骨骼肌球蛋白輕鏈、和α骨骼肌動(dòng)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在有需要的受試者中治療或預(yù)防心臟病癥的方法，其通過(guò)抑制miR-499和miR-208兩者在該受試者的心臟細(xì)胞中的表達(dá)或功能來(lái)進(jìn)行。具體地，公開(kāi)了用于施用所述兩種miRNA的抑制劑的特定方案，所述抑制劑實(shí)現(xiàn)有效的、長(zhǎng)期的遏制。另外，本發(fā)明提供了一種用于在有需要的受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，其通過(guò)提高miR-499和miR-208兩者在該受試者的骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)或活性來(lái)進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102356162SQ201080012373
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者E.V.魯伊杰, E.奧爾森 申請(qǐng)人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會(huì)