專利名稱：冷-活躍的β-半乳糖苷酶、其生產(chǎn)方法、以及所述酶的用途的制作方法
冷-活躍的β -半乳糖苷酶、其生產(chǎn)方法、以及所述酶的用
途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異于乳糖的新的冷-活躍的β-半乳糖苷酶。酶由此在例如用于在低溫催化乳糖二糖水解成其成分單糖，葡萄糖和半乳糖的食品工業(yè)中有用。本發(fā)明還提供通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生冷-活躍的β -半乳糖苷酶的方法。
背景技術(shù)：
β -半乳糖苷酶(β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3. 2. 1. 23)是能將二糖乳糖水解成其單糖成分，D-葡萄糖和D-半乳糖的酶。β -半乳糖苷酶見于廣泛的生物，如哺乳動物，植物，真菌，酵母和細(xì)菌。本質(zhì)上，半乳糖苷酶水解乳糖和其他含D-半乳糖的碳水化合物。在工業(yè)上，半乳糖苷酶主要在食品工業(yè)中使用。乳糖和含乳糖的乳產(chǎn)品的 β -半乳糖苷酶水解在整個乳制品工業(yè)中，在無乳糖或低-乳糖產(chǎn)品(其可被患有乳糖不耐性的人消費)的制備中使用。通過半乳糖苷酶的乳糖水解也可用于需要去除乳糖的應(yīng)用中，即防止食品中的乳糖結(jié)晶化和去除糖基化的蛋白中的D-半乳糖部分。β-半乳糖苷酶的其他應(yīng)用包括將乳糖水解成D-半乳糖和D-葡萄糖，隨后將單糖修飾成高價值產(chǎn)品，如甜味劑 D-塔格糖(Jergensen et al. 2004)。β -半乳糖苷酶的應(yīng)用可用于產(chǎn)生用于不耐受乳糖的人的無乳糖和低-乳糖乳產(chǎn)
P
ΡΠ O乳糖水解的主要應(yīng)用如以下所列。(a)液體乳。液體乳中的乳糖水解改善乳糖不耐受消費者的可消化性。在香味乳中，乳糖水解增加甜度及增強香味。(b)乳粉。乳糖水解的乳粉用于飲食使用，尤其用于具有臨時的β -半乳糖苷酶缺乏的嬰兒。(C)發(fā)酵的乳產(chǎn)品。在一些情況中，用于生產(chǎn)干酪及酸乳的乳中乳糖水解可增加酸發(fā)展速度和由此減少處理時間。(d)濃縮的乳產(chǎn)品。濃縮的乳產(chǎn)品(例如甜煉乳，冰淇淋)中的乳糖水解阻止乳糖
結(jié)晶化。(e)用于動物飼喂的乳清。乳清中的乳糖水解致使給豬和牛飼喂更多的乳清固體， 且也阻止乳清濃縮物中的結(jié)晶化。(f)乳清。將乳糖水解的乳清濃縮，以產(chǎn)生含70-75%固體的糖漿。此糖漿提供有功能的乳清蛋白及甜碳水化合物的來源，并且用作冰淇淋，面包及糖果產(chǎn)品中的食品成分。食品處理中的常規(guī)方法是為了于40°C進行乳糖水解約4小時。但是，作為原材料的乳或乳糖溶液是細(xì)菌的優(yōu)選的營養(yǎng)來源。結(jié)果，處理期間由腐生生物污染的腐敗是食品生產(chǎn)中的嚴(yán)重的問題。由此，實際情況是常規(guī)半乳糖苷酶的使用受限。實際應(yīng)用中的多數(shù)β-半乳糖苷酶僅在20 30°C以上溫度活躍，這是腐敗食品的細(xì)菌最旺盛的溫度。已使用利用嗜熱β -半乳糖苷酶的嘗試，但產(chǎn)品由于熱處理而香味減少及外觀變差，且處理需要高能成本。已描述了來自節(jié)桿菌屬(Arthrobacter) (Coker，et al. 2003 ； Karasova-Lipovova, et al. 2003 ；Nakagawa et al. 2003 ；Nakagawa et al. 2006),來自的棲魚肉桿菌(Carnobacterium piscicola) (Coombs and Brenchley, 1999)禾口來自的fi 交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas) (Cieslinski, et al. 2005 ；Fernandes, et al. 2002 ； Hoyoux, et al. 2001 ；Turkiewicz, et al. 2003)的數(shù)種冷-活躍的 β _ 半乳糖苷酶。此外，Nakagawa等人0006)描述了來自酵母普蘭久浩酵母(Guehomyces pullulans)的冷-活躍的半乳糖苷酶。但是，迄今描述的冷-活躍的半乳糖苷酶的活性在乳品工業(yè)需要的低溫下低。來自酵母普蘭久浩酵母(Guehomyces pullulans)的β -半乳糖苷酶于0°C具有約17%的活性(Nakagawa et al. 2005)，來自棲魚肉桿菌(Carnobacterium piscicola) BA 的 β -半乳糖苷酶于 10°C顯示約 24%活性(Coombs 和 Brenchley, 1999)，而來自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)分離物的酶于10°C顯示39%活性(Fernandes et al. 2002)，22%活性(Cieslinski et al. 2005)，及 12%活性(Hoyoux et al. 2001)。至今，在低溫具有最高活性的半乳糖苷酶分離自南極節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)分離物。 Karasovci-Lipovovci,等人 QOO3)顯示，耐冷節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)C2_2 分離物產(chǎn)生半乳糖苷酶，其于10°C顯示其最大活性的19%，Coker等人Q003)描述了來自南極節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)分離物的酶，其于0°C具有約50%的活性，而Nakagawa等人 (2003，2006)描述了來自A.psychrolactophilus F2的β-半乳糖苷酶，其于10°C具有最佳溫度。但是，來自南極節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的冷-活躍的β _半乳糖苷酶在天然的細(xì)胞中以低量產(chǎn)生，且在大腸埃希氏菌(E.coli)中重組產(chǎn)生酶的嘗試不成功，由于約90% 的酶位于不溶性包含體(Coker et al. 2003)。來自A. psychrolactophilus F2的冷-活躍的β-半乳糖苷酶可異源性地產(chǎn)生，但相比其他節(jié)桿菌屬(Arthrobacter) β -半乳糖苷酶具有更低活性(Nakagawa et al. 2006)。因此，為了開發(fā)乳糖的低-溫度水解方法，需要新冷-活躍的β -半乳糖苷酶和產(chǎn)生所述酶的方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過使用重組DNA技術(shù)首次使以對于生產(chǎn)食品和藥物工業(yè)上適當(dāng)?shù)牧刻峁┚哂懈咛禺愋曰钚缘睦?活躍的β-半乳糖苷酶成為可能。因此，本發(fā)明提供純化的冷-活躍的β -半乳糖苷酶，其特異于乳糖，在低于8°C及特別在4°C的溫度具有穩(wěn)定的酶促活性，其對應(yīng)于乳產(chǎn)品的冷凍保存溫度。結(jié)果，本發(fā)明的酶可水解乳產(chǎn)品中的乳糖，并在所述阻止腐生生物增殖的低溫乳處理。乳糖的水解可在這些冷凍條件下，無需對相關(guān)乳產(chǎn)品的特定處理而進行。特別是，本發(fā)明提供冷活躍的β -半乳糖苷酶，其具有SEQ ID NO 1所示的序列， 或與SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，所述氨基酸序列選擇為酶在低于8°C的溫度具有穩(wěn)定的酶促活性。優(yōu)選所述氨基酸序列與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90 %，及更優(yōu)選95 %同源性。冷-活躍的半乳糖苷酶，還提供了 DNA序列，其(a)編碼具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白，或者(b)在嚴(yán)格或非常嚴(yán)格條件下與(a)的序列雜交，或者(c)是(a)或(b)的序列的簡并體。優(yōu)選DNA 序列源于 Alkalilactibacillus 屬，例如物種 Alkalilactibacillus ikkense，及具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。在進一步實施方式中，本發(fā)明提供重組載體，其包括編碼具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白的DNA序列，所述氨基酸序列選擇為酶在低于8°C的溫度具有穩(wěn)定的酶促活性。優(yōu)選氨基酸序列與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90%，及更優(yōu)選95%同源性。本發(fā)明的另一目的是分離的AlkalilactibacilIus屬細(xì)菌株，其能產(chǎn)生本發(fā)明的冷-活躍的半乳糖苷酶。優(yōu)選的株是在2009年3月3日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號 LMG Ρ-24866保藏在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)的 Alkalilactibacillus ikkense 及源于其的變體禾口突變體。為了純化本發(fā)明的冷-活躍的半乳糖苷酶，將在格陵蘭區(qū)中生活的細(xì)菌分離， 并表征，以便研究該酶如何，及尤其是，β -半乳糖苷酶如何適應(yīng)寒冷。這些研究導(dǎo)致β -半乳糖苷酶的純化，意為使用本領(lǐng)域已知的蛋白純化步驟得到從其他蛋白基本上游離的此蛋白。由此，本發(fā)明的另一目的是分離的Alkalilactikicillus屬細(xì)菌株，其能產(chǎn)生本發(fā)明的冷-活躍的β-半乳糖苷酶。優(yōu)選的株是alkalilactibacillus ikkense。本發(fā)明的另一目的是重組質(zhì)?；蜉d體適合于宿主轉(zhuǎn)化，能引導(dǎo)本發(fā)明的DNA序列以宿主以可恢復(fù)的形式表達(dá)本發(fā)明的冷-活躍的β-半乳糖苷酶的方式表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，另一目的是如此轉(zhuǎn)化的宿主。各種宿主-表達(dá)系統(tǒng)可接受以表達(dá)冷-活躍的β -半乳糖苷酶編碼序列，例如細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞， 等。尤其是，在酵母及細(xì)菌中，可使用含組成型或誘導(dǎo)型啟動子的許多載體。本發(fā)明還旨在提供從細(xì)菌純化本發(fā)明的冷-活躍的β -半乳糖苷酶的方法，以及提供在轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生本發(fā)明的冷-活躍的β-半乳糖苷酶的方法。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有冷-活躍的半乳糖苷酶活性的多肽的方法，包括 分離編碼多肽的DNA片段，將所述DNA片段插入適當(dāng)?shù)乃拗魃铮趯?dǎo)致具有冷-活躍的 β -半乳糖苷酶活性的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主生物，以及從培養(yǎng)培養(yǎng)基或宿主生物回收所述多肽。適當(dāng)?shù)乃拗魃飪?yōu)選選自埃希氏菌屬(Escherichia)，芽孢桿菌屬(Bacillus)， 雙岐桿菌屬(Bifidobacterium),乳球菌屬(Lactococcus), ILff lifM (Iactobacillus), 鏈霉菌屬(Str印tomyces)，明串球菌屬(Ieuconostoc)，鏈霉菌屬(Str印tomyces)，酵母菌屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，念珠菌屬(Candida)，串酵母屬 (Torula)，球擬酵母屬(Torulopsis)和曲霉屬(Aspergillus)。再一方面，本發(fā)明涉及重組DNA分子，其包括編碼具有冷-活躍的β -半乳糖苷酶活性的多肽的DNA片段，且涉及包括所述重組DNA分子的微生物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及以上具有冷-活躍的β -半乳糖苷酶活性的多肽或表達(dá)所述多肽的微生物細(xì)胞在生產(chǎn)食品或藥物產(chǎn)品中的用途。在另一有用的方面，提供了減少食品的乳糖含量的方法，包括向食品添加一定量的如本文所述的多肽或微生物細(xì)胞，其足以去除存在于所述食品中的至少部分乳糖。在另一方面，本發(fā)明涉及通過適度增加溫度的多肽的半乳糖苷酶活性的滅活。在另一感興趣的方面，提供了本發(fā)明的具有冷-活躍的β -半乳糖苷酶活性的多肽或微生物細(xì)胞用于乳糖水解的方法，其中多肽和/或微生物細(xì)胞將應(yīng)用于含在低溫條件下水解的乳糖的反應(yīng)器。本發(fā)明的這些和其他目的將從以下公開內(nèi)容中顯而易見。本發(fā)明的其他特征將列于隨附的權(quán)利要求。

圖1顯示了來自Alkalilactibacillus ikkense株517和其在種系聚類中的rRNA 組1內(nèi)分類學(xué)上定義為芽孢桿菌屬(Bacillus)的最接近的相對物的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)樹。顯示了引導(dǎo)(η = 100)值。條，0.015置換/核苷酸位置。圖2顯示天然的Uka-β -半乳糖苷酶的溫度依賴性。Y軸是以最大活性的百分率的相對活性。X軸是溫育溫度。圖3顯示天然的Ilcka- β -半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。Y軸是溫育X軸上指定的時間后殘留的活性。 ， ，▲，■， ，〇分別表示0，10，20，30，40和50°C的溫育溫度。圖4顯示天然的^ka- β -半乳糖苷酶的ρΗ依賴性。Y軸是以最大活性的百分率的相對活性。X軸是半乳糖苷酶測定中的ΡΗ。圖5顯示來自用ImM IPTG誘導(dǎo)的天然的A. ikkense細(xì)胞的(泳道2和3)和來自未誘導(dǎo)的天然的A. ikkense的(泳道4和5)提取物的SDS-PAGE。泳道2和3的箭標(biāo)表示 120kDa β-半乳糖苷酶條帶。泳道1是分子量標(biāo)記物。120kDa處的標(biāo)記物是來自大腸埃希氏菌(E.coli)的β-半乳糖苷酶。圖6顯示來自表達(dá)Ikka-β-半乳糖苷酶的重組大腸埃希氏菌(E.coli)細(xì)胞的3種提取物稀釋液的SDS-PAGE (泳道4，5和6)。為了比較，將含來自乳克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)的β -半乳糖苷酶的酶提取物稀釋液(泳道7，8和9)和含天然的大腸埃希氏菌(E. coli) 半乳糖苷酶的分子量標(biāo)記物(120kDa的標(biāo)記物)重組 Ikka-β-半乳糖苷酶共-電泳。箭標(biāo)顯示120kDa β -半乳糖苷酶條帶的位置。圖7顯示大腸埃希氏菌(E. coli)中產(chǎn)生的重組Ikka-β -半乳糖苷酶的溫度依賴性。Y軸是以最大活性的百分率的相對活性。X軸是溫育溫度. ，表示重組半乳糖苷酶；〇，表示乳克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) β -半乳糖苷酶。圖8顯示大腸埃希氏菌(E. coli)中產(chǎn)生的重組Ilcka-β -半乳糖苷酶的特異性活性。Y軸是以nmol釋放的ONP/小時/mg酶的特異性活性。X軸是以。C的溫度。 是重組 Ilika-β-半乳糖苷酶，〇是乳克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) β -半乳糖苷酶。圖9顯示重組Uka-β -半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。在指定溫度溫育相等的量的酶， 并以不同的時間間隔取樣品。Y軸是波長415nm處的吸光度。X軸是以分鐘的時間。圖10也顯示重組Ilika-β -半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性，而X軸是以小時的時間。
圖11顯示重組Ilcka- β -半乳糖苷酶的ρΗ依賴性。Y軸是在波長415nm處測量的吸光度。X軸是β-半乳糖苷酶測定中的PH。圖12顯示由大腸埃希氏菌(E. coli)中產(chǎn)生的重組^ka-β-半乳糖苷酶的乳糖水解。反應(yīng)混合物以3種濃度含乳糖，1. 25mg/ml,2. 5mg/ml和5mg/ml。溫育15，150和1440 分鐘后采集樣品。將反應(yīng)于5°C (A)或20°C (B)溫育，并通過薄層層析(TLC)分析。將TCL 板用苔黑酚試劑噴射，及乳糖水解通過TLC板上乳糖斑點的消失和伴隨的葡萄糖和半乳糖斑點的出現(xiàn)來估計。圖13顯示表達(dá)A. ikkense β -半乳糖苷酶的大腸埃希氏菌(E. coli)細(xì)胞的粗提取物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，泳道1。粗提取物中的半乳糖苷酶還在離子交換層析上純化，泳道2，或在親和層析上純化，泳道3。箭標(biāo)表示大腸埃希氏菌(E.Coli)120kDa β-半乳糖苷酶條帶的位置。左側(cè)的數(shù)表示I^ageRuler Plus Prestained Protein Ladder(Fermentas)中蛋白條帶的位置。圖14顯示純化的，重組A. ikkense β -半乳糖苷酶及含重組酶的粗提取物的溫度依賴性(A)和ρΗ依賴性(B)。Y軸是以最大活性的百分率的相對活性。X軸是溫育溫度(A) 或ρΗ(Β)。通過黑矩形顯示用ONPG作為底物的純化的，重組酶的相對活性。以一式三份進行測定，及標(biāo)準(zhǔn)誤差在0. 05以下。圖15顯示純化的，重組A. ikkense β -半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。在指定溫度溫育相等的量的酶，并以不同的時間間隔采集樣品。Y軸是以最大活性的百分率的殘留的活性。 酶樣品在0°c 60°C的溫度溫育，及在指定的時間點(X軸)，采集樣品，及于20°C測定活躍的半乳糖苷酶。測定以一式三份進行，及標(biāo)準(zhǔn)誤差在0.05以下。圖16顯示將A. ikkense β-半乳糖苷酶(黑矩形)用商業(yè)上可用的來自乳克魯維酵母(K. Iactis)的Lactozyme 33000L(開環(huán))作為基準(zhǔn)。將相等的量的酶Omg/ml) 以O(shè)NPG作為底物，以0°C 20°C的溫度溫育。以不同的時間間隔采集樣品，并在A420nm處測量水解的0ΝΡ。水解效率計算為以A420nm/min/yg活性酶的增加。測定以一式三份進行，及標(biāo)準(zhǔn)誤差在0. 05以下。圖17顯示由A. ikkense β -半乳糖苷酶的乳糖水解的薄層層析(TLC)。泳道4 6 樣品經(jīng) 5°C溫育 21/2h(4 :1. 25mg/ml 乳糖，5 :2. 5mg/ml 乳糖，6 :5mg/ml 乳糖)。泳道 7 9 樣品經(jīng) 20°C溫育 21/2h(7 :1. 25mg/ml 乳糖，8 :2. 5mg/ml 乳糖，9 :5mg/ml 乳糖)。泳道 1 3 對照，0. 0125 μ g的各碳水化合物13乳糖(泳道1)，半乳糖(泳道2、和葡萄糖(泳道3)。發(fā)明詳述“β-半乳糖苷酶”(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2. 1.23)定義為能將乳糖水解成單糖D-葡萄糖和D-半乳糖的酶?！袄?活躍的”定義為于15°C及以下，優(yōu)選于10°C及以下和最優(yōu)選于5°C及以下溫
度具有活性?！八拗骷?xì)胞”選自一組微生物，包括真菌，酵母和原核生物。微生物更優(yōu)選為原核生物，且最優(yōu)選為細(xì)菌。溫育β-半乳糖苷酶與乳糖的條件被定義為在0°C和20°C之間，優(yōu)選在5°C和 15°C之間的溫度進行溫育。
術(shù)語〃嚴(yán)格條件"指在含6乂33((20乂33(代表3331111檸檬酸鈉，3331111 NaCl)， 0.5% SDS和50%甲酰胺的溶液中于42°C進行雜交，及然后在0. 1XSSC,0. 5% SDS的溶液中于 68°C洗滌雜交的產(chǎn)物的條件，或如 Nakayama, et al.，Bio-Jikken-Illustrated, vol. 2, “ Idenshi-Kaiseki-No-Kiso (A Basis for Gene Analysis)" ,pp. 148-151,Shujunsha, 1995中所述的條件。
實施例實施例1產(chǎn)生冷-活躍的β -半乳糖苷酶的細(xì)菌的分離1.1細(xì)菌采樣由潛水員在Ikka Fjord，西南格陵蘭(61° 11，N, 48° 01，W)從約6 IOm的深度收集Uaite物質(zhì)。柱長度在36 70cm之間和直徑在5和30cm之間。在運輸?shù)筋I(lǐng)域?qū)嶒炇移陂g柱保持冷。1.2篩選β -半乳糖苷酶產(chǎn)生的細(xì)菌鉆出來自ikaite柱頂部的15 18cm切片的約3cm3的ikaite物質(zhì)，并懸浮在如 Stoll 和 Blanchard(1990)所述用 0. 2M Na2C03/NaHC03 緩沖液緩沖到 pHIO 的 250ml R2 肉湯(Schmidt et al. 2006)中。于5°C溫育2個月后，將培養(yǎng)物接種到R2培養(yǎng)基，pHIO，無葡萄糖，但補充了乳糖(l^w/V)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal) (40 μ g/ml)，IOmM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和瓊脂(1.5%, w/v)。將板于 5°C溫育1 2周?？?7個藍(lán)集落表明檢測到β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。由于17個分離物的16S rRNA基因分析顯示僅分離物之一，株517相同的序列，將其選擇用于進一步表征。實施例2分離物517的分類學(xué)分析和新屬和物種，Alkalilactibacillus ikkense的描述2.116SrRNA基因序列的種系發(fā)生分析使用土壤用FastDNA SPIN試劑盒，如制造商(ΒΙ0 101，Irvine, CA)所述從分離物517的細(xì)胞提取用于種系發(fā)生分析的DNA。使用引物27F和1492R進行16S rRNA 基因擴增(泳道1991)，及以MWGBiotech AG^bersberg，德國)使用相同的2種引物加額外的引物519R，532F，907F和907R進行DNA測序(泳道1991)。將來自分離物517 的16S rRNA基因的接近全長DNA序列以登錄號No. EU281853提交到GenBank/EMBL/ DDBJ。在 NCBI 月艮務(wù)器(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/blast/)上使用 BLASTn 從公共數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)的序列。將最接近相關(guān)的16S rRNA基因序列使用Clustal W多重比對程序 MegAlign 5. 03 (DNASTAR, Inc. , Madison, WI)比對。Clustal W 分析顯示，最接近的相關(guān)體是 Natronobacillus azotifigens (登錄號 No. EU850815) (Sorokin et al. 2008) ,Paraliobacillus ryukyuensis (登錄號No. AB087828) (Ishikawa et al. 2002)， Halolactibacillus halophilus( g ^ No.AB196783)(Ishikawa et al. 2005), Halolactibacillus miurensis (登錄號 No. AB196784) (Ishikawa et al. 2005)，熱帶雙芽孢桿菌(Amphibacillus tropicus)(登錄號 No. AF418602) (Zhilina et al. 2001,2002)和 Gracilibacillus halotolerans (登錄號 No. AF036922) ( Waill0 et al. 1999)。分離物 517 以分另Ij 95,9%,94. 4%和 93. 9%序列相似性與 N. azotifigens,P. ryukyuensis 及熱帶雙芽孢桿菌(A. tropicus)最接近地相關(guān)。分離物517與H. halophilus, H. miurensis及G. halotolerans之間的序列相似性是93. 4%。由此，分離物517和最接近相關(guān)體之間的 16S rRNA基因序列相似性的距離在97%相似性以下，其常用作物種分離的初步指南。通過鄰接法分析(引導(dǎo)=100)使用 TREEC0N 1. 3b 軟件(Van de Peer 和 De Wachter，R. 1994) 創(chuàng)建系統(tǒng)樹(圖1)。2.2DNA-DNA雜交和基因組DNA的堿基組成分析在DSMZ (Braunschweig,德國)進行DNA-DNA雜交和DNA堿基組成(G+C含量)。 將DNA使用弗氏壓碎器(Thermo Spectronic)分離，及通過層析在羥基磷灰石上純化， 如Cashion等人(1977)所述。DNA-DNA雜交如De Ley等人(1970)所述，考慮Huss等人 (1983)描述的修飾，使用配備 Peltier-thermostatted 6X6multicell changer 的模型 Cary IOOBio UV/VIS-分光光度計及具有原位溫度探針的溫度控制器(Varian)進行?；?6S rRNA序列相似性P. ryukyuensis的分離物517和最接近相關(guān)物之間的DNA-DNA雜交是28. 8%，及分離物517和H. miurensis之間是24. 7%0為了確定GC含量，將DNA用Pl核酸酶水解，并將核苷酸用牛堿性磷酸酶去磷酸化(Mesbah et al. 1989)。得到的脫氧核糖核苷酸通過HPLC分析。分離物517的DNA G+C含量是38. 4mol %，其相當(dāng)類似于最接近相關(guān)的物種。N. azotifigen的G+C含量是 36. 1 38. 5mol% (Sorokin et al. 2008)，H. halophilus 及 H. miurensis 的 G+C 含量報道為 38. 5 40. 7mol % (Ishikawa et al. 2005)，P. ryukyuensis 的 G+C 含量是；35· 6mol % (Ishikawa et al. 2002)，及 G. h alotoleran 的 G+C 含量報道為 3& ο1 % ( Wain0 et al. 1999)?；贕C含量的種系發(fā)生結(jié)果和數(shù)據(jù)表明分離物517代表新屬中的新物種，由于 DNA-DNA雜交以分離2個物種的閾值是70% (Wayne等人，1987)。由此，我們建議分離物 517 MTfrM Alkalilactibacillus 屬 gen. nov. 禾中 Alkalilactibacillus ikkense sp. novο實施例3 來自Alkalilactobacillus ikkense的天然的Ikka-β-半乳糖苷酶的表征3.1 β-半乳糖苷酶測定β -半乳糖苷酶活性通過ο-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的水解和用分光光度計測量在415nm處的釋放的ο-硝基苯基(ONP)化合物的吸光度來測定。在測定中， 在415nm處于20°C及pH7. 0 (0. lMNaH2P04/Na2HP04)測量通過重組β -半乳糖苷酶活性的從 ImmONPG的ONP釋放。反應(yīng)通過添加300 μ 1 0. 6Μ Na2CO3來停止。測定于0，5，10，20，30， 40，50和60°C進行30分鐘。測定開始之前將磷酸鈉緩沖液預(yù)加熱至相應(yīng)溫度。通過于溫度0，10，20，30，40和50°C放置等份的酶，并在t = 0 t = M小時取樣品進行酶的熱穩(wěn)定性分析。取樣品后立即將它們冷卻，并于20°C測定，如上所述。使用用HCl或NaOH從pH4調(diào)整到pHIO的混合的pH緩沖液Q50mM Tris, 250mM MES, 250mM乙酸)研究pH活性特征。將樣品于20°C溫育1小時，并如上所述測定。3.2天然的Ikka-β -半乳糖苷酶的產(chǎn)生將AlkalilactibacilIus ikkense細(xì)胞在補充了乳糖和IPTG的液體R2培養(yǎng)基中于15°C在旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3天。將細(xì)胞通過用Sigma 3-18M離心機以4，700rpm離心來收獲，并將沉淀懸浮于2ml的0. lMNaH2P04/Na2HP04, pH7。將細(xì)胞通過珠敲打在i^astft·印FP120儀(BiolOl/Savant)中以速度5. 5裂解3次25s。然后從玻璃珠去除上清，并于4°C 以10，000 g離心15min。然后將無細(xì)胞上清用于測定。3.3天然的Uka-β -半乳糖苷酶的最佳溫度的表征天然的Uka-β -半乳糖苷酶于20°C顯示最大活性，于0°C得到40%的最大活性， 及于10°C觀察到多于最大活性的60% (圖2)。在30°C以上，酶僅中度活躍，并于60°C實際上觀察不到活性。研究Uka- β -半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。圖3顯示于0°C溫育M小時后觀察到幾乎100%的殘留的活性，于20°C溫育M小時后殘留多于80%活性。在20°C以上的溫度， 天然的Uka-β -半乳糖苷酶快速喪失活性(圖幻。在高溫的滅活顯示是不可逆的。研究了天然的Ilika- β -半乳糖苷酶的ρΗ依賴性。圖4顯示在ρΗ7觀察到天然的 Ikka- β -半乳糖苷酶的最大活性，及該酶在ρΗ6及在ρΗ8顯示最大活性的約70%。在ρΗ9， 觀察到約25%的最大活性。酶在ρΗ5和以下或在pHIO和以上顯示無活性(圖4)。3.4天然的Ikka-β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE在SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)中分析來自用ImM IPTG誘導(dǎo)的及未誘導(dǎo)的A. ilckense細(xì)胞的提取物(圖5)。通過如上3. 2所述使用珠-敲打裂解細(xì)胞來制備細(xì)胞內(nèi)提取物。將提取物(0.5 5μ 1)與12. 5μ 1 4 * LDS樣品緩沖液，5 μ 1 10* DTT和0. lMNaH2P04/Na2HP04混合至最終體積50 μ 1。將樣品加熱至70°C 10分鐘，并將30 μ 1 裝載到 4 12%505凝膠上。將凝膠在^^11 SureLockTMMini-Cell(Invitrogen，CA，美國) 中以150V于室溫運行1小時。電泳后，將凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R-250 (40% EtOH和10%乙酸中的0. 考馬斯亮藍(lán)R-250(krVa，Heidelberg，德國))染色。圖5顯示在含來自用 IPTG誘導(dǎo)的A. ilckense細(xì)胞的提取物的泳道中觀察到強120kDa條帶，及在含來自非-誘導(dǎo)的細(xì)胞的提取物的泳道中缺失此條帶。由此，120kDa條帶推定為天然的Uka-β -半乳糖苷酶。實施例4 來自Alkalilactobacillus ikkense的Ikka-β -半乳糖苷酶基因的分離和表征4.IIkka-β-半乳糖苷酶基因的分離從50ml的培養(yǎng)物分離來自A. ikkense的DNA。通過離心收獲細(xì)胞，并將染色體 DNA使用常規(guī)苯酚-氯仿提取方法(Maniatis等人，1982)分離。將DNA使用Sau3AI (New England Biolabs, MA，美國)部分消化，并如生產(chǎn)商所述將具有31Λ和101Λ之間的長度的片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒Oliagen，Hilden，德國)從瓊脂糖凝膠純化。用于克隆來自A. ikkense的染色體DNA的載體是修飾的pUC18質(zhì)粒(Stratagene， CA，美國)。通過NdeI和HindIII內(nèi)切核酸酶(New England Biolabs)限制質(zhì)粒pUC18。 使用DNA聚合酶的Klenow片段(New England Biolabs)彌補粘端，并將鈍端使用T4DNA 連接酶(New England Biolabs)連接。將修飾的pUC18質(zhì)粒，標(biāo)識為pUC18dlacZ，在GATC Biotech AG (Konstanz，德國)上DNA測序，并且用 CLC Workbench 4軟件(CLC Bio, Aarhus, 丹麥)的DNA序列分析確證，質(zhì)粒pUC18dlacZ中缺失了 pUC18的α-亞基序列。由此，質(zhì)粒pUC18dlacZ在導(dǎo)入到帶有β-半乳糖苷酶Δ Ζ15突變的大腸埃希氏菌(E. coli)細(xì)胞時不能介導(dǎo)α-互補。將Sau 3ΑΙΙ限制的和凝膠-純化的來自A. ikkense的染色體DNA連接到用限制性內(nèi)切酶BamHI和南極磷酸酶(New England Biolabs)處理的質(zhì)粒pUC18dlacZ。將連接混合物轉(zhuǎn)化進化學(xué)感受的大腸埃希氏菌(E. coli)TOP10細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平鋪于含20μ g/ml X-gal,0. ImM IPTG，及100 μ g/ml氨芐西林的LB瓊脂(10g/l細(xì)菌胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl)，并于37°C過夜溫育。16小時過夜溫育后，將板轉(zhuǎn)移到20°C，并再溫育另外的20小時。篩選出總580個集落，并且檢測到1個藍(lán)色集落。選擇于20°C溫育期間變藍(lán)色的集落，并轉(zhuǎn)移到IOml LB肉湯，并于37°C過夜生長。通過離心收獲來自過夜培養(yǎng)物的重組大腸埃希氏菌(E. coli)細(xì)胞，及將質(zhì)粒DNA使用QIApr印Spin Minipr印試劑盒Oliagen) 純化。通過用限制性內(nèi)切酶EcoRI和I3StI (New England Biolabs)消化來分析質(zhì)粒DNA 的插入子。將質(zhì)粒中的插入子，標(biāo)識為pUCIkka-bgal，在GATC Biotech AG (Konstanz，德國)中使用與引物M13反向并行的引物和自定義制造的特異于pUCHkka-bgal中的插入子 (SEQ ID NO 3 :5，CCGTCATCCATATCACC3，；SEQ ID NO 4 :5，CCTTTGCCCAAGAGCCAACC3，；SEQ ID NO 5 :5，GCTATTATCAGACTTGGCACC3，；SEQ ID NO 6 :5，GTAATTCAATGTTCCAACGTG3，；SEQ ID NO 7 :5，CGCTTATGGTGTGAAG3’ )和恰好在pUC18dlacZ中多克隆位點下游的序列(SEQ ID NO 8 :5，GGGCTGGCTTAACTATGCGG3，)的引物來測序。DNA 插入子帶有的 Ikka-β-半乳糖苷酶基因序列顯示為SEQ ID NO :2。4.2Ikka-^-半乳糖苷酶基因序列的表征使用CLC Workbench 4 軟件(CLC BIO, Aarhus，丹麥)的 DNA 序列，SEQ ID N0: 2的分析顯示開放閱讀框具有1，041個氨基酸，SEQID NO 1的編碼容量。使用NCBI檢索工具Blastp來檢索數(shù)據(jù)庫中相關(guān)的序列。最接近相關(guān)的序列是來自巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium)的β -半乳糖苷酶(登錄號ABW3675) 56. 7 %同一性，類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.) JDR-2 (登錄號 ZP_(^849115) 55. 3 % 同一性，及土芽孢桿菌屬 (Geobacillus sp.) Y412MC10 (登錄號ZP_03036811) 同一性，全部屬于糖基水解酶家族2。由此，得出Ilika-β-半乳糖苷酶屬于此家族。計算的Uka-β-半乳糖苷酶的亞基分子量和Pl分別是119kDa和pi 5. 0，(ExPASy ProtParam工具)。計算的亞基分子量通過SDS-PAGE確證，圖5和6。Ikka- β -半乳糖苷酶與結(jié)構(gòu)解析的酶的比對顯示，大腸埃希氏菌(E. coli)中保守的活性位點區(qū)(ILCEYAHAMGN)(陽性.534-544) (Gebler et al. 1992) 在Ilika-β -半乳糖苷酶中良好保守(ILCEFSHAMGN)(陽性.Μ7-557)，且活性位點親核體 Glu-537可能發(fā)現(xiàn)為Glu-550。實施例5大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中重組Ikka-β -半乳糖苷酶的產(chǎn)生天然的Alkalilactibacillus ikkense顯示產(chǎn)生僅中等量的Ikka-β -半乳糖苷酶。因此，為了產(chǎn)生更大量的半乳糖苷酶，進行將^ka-β-半乳糖苷酶基因亞克隆進表達(dá)質(zhì)粒。5.1用于在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中重組Ikka-β -半乳糖苷酶表達(dá)的載體的構(gòu)建將Uka-β -半乳糖苷酶基因進一步使用DNA來自A. ikkense的染色體作為模板和PCR引物bGal5，5，CTGAATTCGCATATGGCAAAAAAATTAAAAAAATTC3，(有下劃線的EcoRI 限制性位點)(SEQ ID NO 9) , Ji hGaUWCX AAGCTT ATCTGTTTA A ACTATTCA ACATGH (有雙下劃線的HindIII位點)(SEQ ID NO 10)亞克隆。使用的聚合酶是校正聚合酶Phusioil 高-保真度DNA聚合酶(New England BioLabs)。PCR反應(yīng)通過在0. 8%瓊脂糖凝膠Geakem GTG)上凝膠電泳來分析，并將3.91Λ片段連接到pJET1.2/鈍克隆載體(i^ermentas， Helsingborg，Sweden)，并轉(zhuǎn)化進大腸埃希氏菌(E. coli) T0P10細(xì)胞。在含氨芐西林的LB 瓊脂板上分離含PJET1. 2/鈍的大腸埃希氏菌(E. coli)轉(zhuǎn)化體，并如上所述制備質(zhì)粒DNA。 將質(zhì)粒DNA用酶EcoRI和HindIII限制，并如所述在0.8% (w/v)瓊脂糖凝膠上分析。從凝膠使用QIAquick凝膠提取試劑盒如生產(chǎn)商所述純化3. 9kb DNA片段。將純化的DNA片段連接到用酶EcoRI和HindIII類似限制的質(zhì)粒pUC18dlacZ，并且如上所述純化凝膠。將連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸埃希氏菌(E. coli) TOPlO細(xì)胞，并在含100 μ g/ml氨芐西林，ImM IPTG， 及40 μ g/ml X-gal的LA板上作為藍(lán)色集落選擇帶有含Ilika-β -半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒 i3UC18dlacZ的重組細(xì)胞。選擇轉(zhuǎn)化體，并且分析質(zhì)粒和插入子。從IOml培養(yǎng)物制備質(zhì)粒 DNA，并將DNA發(fā)送給GATCbiotech (Konstanz，德國)使用以上4. 1中描述的引物測序。測序兩條鏈的整個Ikka-β -半乳糖苷酶基因，以便確保PCR期間無突變導(dǎo)入。選擇含具有讓1 1-0-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒？肌18(11￡1(^(標(biāo)識為質(zhì)粒？肌11^￡1^^￡11_6即)的重組克隆之一用于進一步表達(dá)研究。5.2大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中重組Ikka-β -半乳糖苷酶的表達(dá)將帶有質(zhì)粒pUCIkka-bgal 和 pUCIkka_bgal_exp 的大腸埃希氏菌(E. coli) T0P10 細(xì)胞在含100 μ g/ml氨芐西林的30ml LB肉湯中于37°C培養(yǎng)過夜。過夜溫育后，給細(xì)胞補充0. ImM IPTG，并且于20°C溫育再20小時。通過以4，700rpm于10°C離心30min來收獲細(xì)胞，及懸浮于 Iml 0. IM NaH2P04/Na2HP04，pH7。將細(xì)胞通過在 i^ast ft·印儀(Fast Prep FP120, BiolOl/Savant Instruments Inc.，Holbrook, NY)中以速度 5· 5 珠敲打 3 次 25 秒鐘來裂解。敲打/搖動之間將樣品在冰上冷卻。將裂解物于4°C以10，00(^離心15!^11，及將含Ilcka-β -半乳糖苷酶的上清轉(zhuǎn)移到清潔的管。將此粗提取物用于隨后分析。5.3大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中產(chǎn)生的重組Ikka-β -半乳糖苷酶的性質(zhì)5.3. 1.重組Ikka-β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE和產(chǎn)率的確定如上3. 4所述在SDS-PAGE(SDS凝膠4 12%，PAGEgel, CA，美國)上分析來自帶有質(zhì)粒pUCIlcka-bgal的重組大腸埃希氏菌(E. coli)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)提取物。分析用ImM IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物和未誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)物。來自用及不用IPTG生長的培養(yǎng)物的提取物中的蛋白條帶與來自用IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中的約120kDa的條帶的彼此相同(圖6中的箭標(biāo))。由此，由于半乳糖苷酶的計算的分子質(zhì)量是119kDa，且由于僅在用IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中觀察到120kDa的強條帶，由此推定，120kDa條帶代表Ilika- β -半乳糖苷酶。如上所述制備來自帶有質(zhì)粒pUCIlcka-bgal的大腸埃希氏菌(E. coli)培養(yǎng)物的提取物，并在SDS-PAGE上電泳之前稀釋。將具有已知的分子質(zhì)量及指定的濃度的來自大腸 ±矣希氏菌(E. coli) (Sigma-Aldrich, M0，美國)和乳克魯維酵母(K. lactis) (Novozymes, Bagsvaerd，丹麥)的β _半乳糖苷酶在相同的凝膠上共電泳用于比較(圖6中的箭標(biāo))。 通過比較已知的β -半乳糖苷酶與Ilcka-β -半乳糖苷酶的遷移和考馬斯亮藍(lán)染色，得到估計的量的Ilcka-β -半乳糖苷酶。估計用于隨后分析的提取物具有ang/ml的Ilcka-β -半乳糖苷酶濃度。
5.3. 2重組Ikka-β -半乳糖苷酶的溫度依賴性如上對于使用ONPG作為底物的天然的酶所述測定重組Ilika-β -半乳糖苷酶的最佳溫度。對于重組讓！^-日-半乳糖苷酶，及作為對照，對于來自大腸埃希氏菌(E. coli)和乳克魯維酵母(K. Iactis)的β-半乳糖苷酶，于0，5，10，20，30，40，50和60°C測定溫度特征30，60和120分鐘。對于重組Uka- β -半乳糖苷酶活性的最佳溫度測定為20 30°C (圖 7)。但是，Ikka-β-半乳糖苷酶也在低溫顯示高活性，于0°C多于40%活性，于5°C約80% 活性及于10°C多于90%活性。相比乳克魯維酵母(K. Iactis) β-半乳糖苷酶，Ilcka-β-半乳糖苷酶的特異性活性在0°C和30°C之間的溫度幾乎兩倍高(圖8)。兩種酶于40°C及以上顯示接近于0的活性(圖8)。于0，10，20，30，40，50和60°C測定Ikka-β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。從t = 0小時 t = 123小時，以從第1小時期間的5分鐘到實驗?zāi)┑膸仔r的增加的間隔獲取樣品 (圖9)。圖9和10顯示，Ikka-β-半乳糖苷酶于QV及5 °C顯示高穩(wěn)定性，于10°C，酶穩(wěn)定約100小時，而在20°C以上溫度，Ikka-β -半乳糖苷酶更不穩(wěn)定。于40°C處理40分鐘導(dǎo)致完全滅活。Ilika-酶的滅活是不可逆的。[5. 3.3重組Ikka-β-半乳糖苷酶的ρΗ依賴性使用用HCl或NaOH調(diào)整到ρΗ4 pHIO的混合的ρΗ緩沖液Q50mM Tris, 250mM MES, 250mM乙酸)研究ρΗ活性特征。將樣品于20°C溫育2小時。Ilika- β -半乳糖苷酶的最佳PH值顯示為大致ρΗ7. 0。在ρΗ6. 0，酶顯示60%的最大活性，及在ρΗ8. 0，Ikka-酶顯示90%活性。在ρΗ9.0，觀察到15%活性，然而在ρΗ5.0或以下或在pHIO和以上檢測不到活性。[5. 3.3重組Ikka-β-半乳糖苷酶的ρΗ依賴性在于ΡΗ7.0和20°C使用9種不同的發(fā)色底物進行20分鐘的測定中測定 Ilcka-β-半乳糖苷酶的底物特異性0-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，P-硝基苯基-α -D-吡喃半乳糖苷，ο-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷，P"硝基苯基-β -D-吡喃阿拉伯糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃果糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃乳糖苷和ρ-硝基苯基-β -D-吡喃甘露糖苷。各底物以IOmM的濃度使用。測定顯示，Ilcka-β-半乳糖苷酶僅能水解ο-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和ρ-硝基苯基-β -D-吡喃果糖苷(相對ONPG水解，4% 的相對活性)。以下檢測其余底物的利用。在水中乳糖溶液中測定乳糖水解。測定3種不同的乳糖濃度1. 25mg/ml,2. 5mg/ ml和5mg/ml?？偡磻?yīng)體積是0. ^il，且各反應(yīng)含0. 2mg/ml的重組Ilika-β -半乳糖苷酶。酶反應(yīng)于5 °C及20 V溫育，及在15分鐘，21/2小時和M小時后收集樣品。溫育后，通過于95 °C 加熱20分鐘來停止反應(yīng)。通過薄層層析(TLC)在TLC氧化硅凝膠60 (Merck，Darmstadt，德國)上在含1-丁醇，2-丙醇和水的溶劑(3 12 4)中進行產(chǎn)物的可視化。在TLC上運行含0. 005mg乳糖的體積。對照是0. 5 μ 1乳糖(2. 5% )，0. 5 μ 1半乳糖O. 5% )和0. 5 μ 1 葡萄糖O. 5% )。干燥后，將糖通過用苔黑酚試劑噴射，然后是于100°C溫育5 IOmin來可視化。于5°C及于20°C觀察乳糖水解。于5°C，在15分鐘后，1.25mg/ml反應(yīng)中約75 85%乳糖水解，以及在21/2小時之內(nèi)100%水解，(圖12A)。在于20°C溫育的1. 25mg/ml反應(yīng)中觀察到類似水解效率(圖12B)。在2. 5mg/ml乳糖反應(yīng)中的水解有效性顯示在兩種溫度下21/2小時之內(nèi)約90 95%水解。M小時后，在兩種溫度從全部3種乳糖濃度觀察到100%水解(圖12)。5.3. 4重組Ikka-β -半乳糖苷酶的純化從粗提取物通過離子交換層析純化β-半乳糖苷酶。2ml的部分經(jīng)歷在生物學(xué)LP 系統(tǒng)上的Iml高Q盒(Bio-Rad)上層析。將柱用IOml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌，通過在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7) 中的NaCl的0 IM的梯度，以0. 5ml/min的流速洗脫。收集Iml的級分。粗提取物也在與 P-氨基芐基-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷偶聯(lián)的2ml瓊脂糖柱(PABTG-瓊脂糖，Sigma) 上經(jīng)歷親和層析。將柱用IOml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌，之后其通過50mM磷酸鹽緩沖液(PH7)中的IOOmM NaCl以0. 5ml/min的流速洗脫。收集Iml的級分。使用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)分析級分中蛋白的存在，及在如上所述的 ο-硝基苯基(ONP)-β-D-吡喃半乳糖苷測定中測量半乳糖苷酶。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳G 20%，PAGEgel, CA，美國)分析含β -半乳糖苷酶活性的級分。純化的 β-半乳糖苷酶用于隨后的穩(wěn)定性及活性實驗。圖13顯示來自大腸埃希氏菌(E. coli)的粗提取物含具有約115 120kDa的單體分子量的重組β -半乳糖苷酶。離子交換層析產(chǎn)生純β -半乳糖苷酶(圖13，泳道2)， 然而親和層析(圖13，泳道幻僅產(chǎn)生部分純化的重組酶。由此，為了隨后分析，使用來自離子交換的純半乳糖苷酶，除非別有指定。5.3. 5天然的和重組A. ikkense β -半乳糖苷酶的表征當(dāng)使用已知的來自大腸埃希氏菌(E.coli)和乳克魯維酵母(K. Iactis)的β-半乳糖苷酶作為參照在SDS-PAGE上分析時，A. ikkense β -半乳糖苷酶的分子量測定為約 115 120kDa。此結(jié)果與如由DNA測序確定的計算的分子量(119kDa) —致。來自大腸埃希氏菌(E. coli)的粗提取物估計含10mg/ml的A. ikkense β -半乳糖苷酶。以O(shè)NPG作為底物，基于由離子交換層析純化的β -半乳糖苷酶計算的特異性活性于 20°C是 8.4ymol/min/mg 蛋白(表 1)。表1
權(quán)利要求
1.純化的冷-活躍的β-半乳糖苷酶，其具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或與 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，所述氨基酸序列選擇為酶在低于 8V的溫度具有穩(wěn)定的酶促活性。
2.權(quán)利要求1的β-半乳糖苷酶，其中氨基酸序列與SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90 %，優(yōu)選95 %同源性。
3.權(quán)利要求1或2的β-半乳糖苷酶，其中其由Alkalilactikicillus屬的株產(chǎn)生。
4.權(quán)利要求1，2或3的β-半乳糖苷酶，其中其由Alkalilactibacillusi Iikense產(chǎn)生。
5.分離的DNA序列，其包括編碼權(quán)利要求1 4中任一項的β-半乳糖苷酶的基因。
6.分離的DNA序列，其(a)編碼具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，或者(b)在嚴(yán)格條件下與(a)的序列雜交，或者(c)是(a)或(b)的序列的簡并體。
7.權(quán)利要求6的DNA序列，其中序列如SEQID NO 2所示。
8.重組載體，其包括權(quán)利要求5 7中任一項的DNA序列。
9.權(quán)利要求8的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
10.宿主細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求8或9的載體轉(zhuǎn)化。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中細(xì)胞選自埃希氏菌屬(Escherichia)，芽孢桿菌屬(Bacillus),雙岐桿菌屬(Bifidobacterium),乳球菌屬(Lactococcus), ff lif M (Iactobacillus)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，明串球菌屬(Ieuconostoc)，鏈霉菌屬 (Streptomyces),酵母菌屬(Saccharomyces),克魯維酵母屬(Kluyveromyces),念珠菌屬 (Candida)，串酵母屬(Torula)，球擬酵母屬(Torulopsis)和曲霉屬(Aspergillus)。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中細(xì)胞選自短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)，長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)，嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)，兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，動物雙岐桿菌(Bifidobacterium animal is)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
13.權(quán)利要求10 12中任一項的細(xì)胞用于生產(chǎn)選自下列的產(chǎn)品的用途無乳糖的乳， 低-乳糖乳，酸乳，干酪，發(fā)酵的乳產(chǎn)品，飲食補充劑和益生菌食品。
14.權(quán)利要求13的用途，其用于生產(chǎn)具有或更低乳糖濃度的乳產(chǎn)品。
15.權(quán)利要求14的用途，其中乳糖濃度是0.或更低。
16.權(quán)利要求15的用途，其中乳糖濃度是0.01%或更低。
17.權(quán)利要求1 4中任一項的半乳糖苷酶用于生產(chǎn)選自下列的產(chǎn)品的用途無乳糖的乳，低-乳糖乳，酸乳，干酪，發(fā)酵的乳產(chǎn)品，飲食補充劑和益生菌食品。
18.權(quán)利要求17的用途，其用于生產(chǎn)具有或更低乳糖濃度的乳產(chǎn)品。
19.權(quán)利要求18的用途，其中乳糖濃度是0.或更低。
20.權(quán)利要求19的用途，其中乳糖濃度是0.01%或更低。
21.生產(chǎn)權(quán)利要求1 4中任一項的酶的方法，包括 在適宜培養(yǎng)基中、在允許表達(dá)所述酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10 12中任一項的細(xì)胞，及 從培養(yǎng)物中回收得到的酶。
22.權(quán)利要求21的方法，其中將得到的酶固定。
23.乳糖的水解方法，包括使權(quán)利要求1 4中任一項的酶或權(quán)利要求10 12中任一項的細(xì)胞與乳糖溶液接觸。
24.嗜冷細(xì)菌Alkalilactibacillus ikkense BCCM 保藏號 LMGP-24866 及源于其的變體和突變體，其能產(chǎn)生權(quán)利要求1或2定義的冷-活躍的β半乳糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異于乳糖的新冷-活躍的β-半乳糖苷酶。酶由此在例如用于在低溫催化將乳糖二糖水解成其成分單糖，葡萄糖和半乳糖的食品工業(yè)中有用。本發(fā)明還提供通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生冷-活躍的β-半乳糖苷酶的方法。
文檔編號C12N9/38GK102361974SQ201080012589
公開日2012年2月22日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者M·施米特, P·斯托加德 申請人:哥本哈根大學(xué)