專利名稱：培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法及生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌的方法、以及生產(chǎn)含有產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌的發(fā)酵乳的方法。
背景技術(shù)：
通過下述方法制備酸乳(yogurt)等發(fā)酵乳向混合有生乳(rawmilk)、脫脂乳、乳清蛋白等的原料乳(raw material milk)(酸乳混合物)中添加起子，使酸乳混合物發(fā)酵。作為起子使用的是保加利亞乳桿菌(LactcAacillus bulgaricus)及嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等乳酸細(xì)菌。在酸乳混合物制備后，將其冷卻至0-10°C的溫度，并以冷藏的狀態(tài)運(yùn)送。由于乳酸細(xì)菌在冷藏的酸乳中是存活的，因此酸乳在分送過程和在家庭的保藏期中等逐漸地發(fā)酵，且其酸度增加。結(jié)果，即使在保質(zhì)期內(nèi)，酸乳的味道也會(huì)發(fā)生變化。另外，眾所周知的是，一些種類的乳酸細(xì)菌產(chǎn)生稱為細(xì)菌素的抗菌蛋白或者肽。如下述專利文獻(xiàn)1-3所示，可以使用產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌來改善食品的保存質(zhì)量。在專利文獻(xiàn)1的發(fā)明中，將產(chǎn)生細(xì)菌素的乳球菌(Lactococcus)用作酸乳的起子。伴隨著酸乳混合物的發(fā)酵，乳球菌產(chǎn)生細(xì)菌素。由于由乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素抑制酸乳的酸度的增加，因此可以改善酸乳的保存質(zhì)量。在專利文獻(xiàn)2的發(fā)明中，使用液體培養(yǎng)基來共培養(yǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳球菌，所述液體培養(yǎng)基的主要成分是乳和乳成分。通過將共培養(yǎng)之后的培養(yǎng)液作為食品防腐劑而添加到食品(面包、烏冬等)中，可以改善食品的保存質(zhì)量，并給食品帶來優(yōu)良味道。專利文獻(xiàn)3公開了使用添加有酵母提取物等的乳清培養(yǎng)基來培養(yǎng)乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)并從培養(yǎng)后的乳清培養(yǎng)基中去除乳酸乳球菌而獲得的風(fēng)味改良劑。通過使用該風(fēng)味改良劑，可以消除魚類和海鮮的腥味，還可以給食品帶來優(yōu)良味道。專利文獻(xiàn)1 日本國(guó)專利申請(qǐng)公開公報(bào)“特開平4-211360號(hào)”專利文獻(xiàn)2 日本國(guó)專利申請(qǐng)公開公報(bào)“特開平8-187071號(hào)”專利文獻(xiàn)3 日本國(guó)專利申請(qǐng)公開公報(bào)“特開2004-283109號(hào)”如上所述，專利文獻(xiàn)1的發(fā)明中將產(chǎn)生細(xì)菌素的乳球菌用作為起子。因此，難以抑制未將乳球菌用作起子的酸乳酸度的增加。另外，為了以抑制分發(fā)過程及保藏期中酸乳酸度的增加，提出了將專利文獻(xiàn)2所用的食品防腐劑或者專利文獻(xiàn)3所用的風(fēng)味改良劑作為添加劑而添加到酸乳混合物中的方法。但是，當(dāng)以一定的比例將添加劑添加到酸乳混合物中時(shí)，作為添加劑的原料的酵母提取物等，會(huì)發(fā)生破壞酸乳原來的味道。從而，優(yōu)選地，當(dāng)將產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)物添加到酸乳混合物中時(shí)，希望盡量減少培養(yǎng)物的添加量
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)方法包括培養(yǎng)液制備工序，制備含有根據(jù)蛋白水解酶所降解的乳清的培養(yǎng)液；以及培養(yǎng)工序，將產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌接種到所述培養(yǎng)液中，并將接種有所述乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5但不高于6的同時(shí)培養(yǎng)所述乳酸細(xì)菌。本發(fā)明的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法可以得到與根據(jù)現(xiàn)有的培養(yǎng)方法所得到的培養(yǎng)液相比抗菌活性高約數(shù)十倍的培養(yǎng)液。即，本發(fā)明的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法可以高效地產(chǎn)生細(xì)菌素。本發(fā)明的制備發(fā)酵乳的方法包括原料乳生成工序，生成酸乳混合物；濃縮菌液生成工序，培養(yǎng)作為細(xì)菌素產(chǎn)生者的產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌，據(jù)此生成濃縮有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液；添加工序，向所述酸乳混合物中添加以所述酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)的不少于0.01wt%但不多于0. Iwt %的所述濃縮菌液；以及發(fā)酵工序，發(fā)酵添加有所述濃縮菌液的酸乳混合物；所述濃縮菌液生成工序包括培養(yǎng)液制備工序，制備含有根據(jù)蛋白水解酶所降解的乳清的培養(yǎng)液；培養(yǎng)工序，將所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌接種到所述培養(yǎng)液中，并將接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5但不高于6的同時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌；以及分離工序，從接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)液中分離所述濃縮菌液。本發(fā)明的制備發(fā)酵乳的方法可以減少作為添加劑而添加到酸乳混合物中的濃縮菌液的添加量。因此，在未破壞酸乳原來的味道的情況下可以防止酸乳酸度增加。除此之外，本發(fā)明的目的在于提供培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法，通過所述方法，能夠高效地產(chǎn)生細(xì)菌素，并提供生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，通過所述方法，能夠抑制發(fā)酵乳酸度的增加。本發(fā)明的目的、特征、形式以及優(yōu)點(diǎn)根據(jù)下面的發(fā)明內(nèi)容和附圖而得以明確。


圖1為圖示在實(shí)施例1中使用的乳清降解培養(yǎng)基的組成的示意圖；圖2為圖示在實(shí)施例1中的戈式乳桿菌(LactcAacillus gasseri)的培養(yǎng)結(jié)果的示意圖；圖3為圖示在實(shí)施例2中使用的乳清降解培養(yǎng)基的組成的示意圖；圖4為圖示在實(shí)施例2中的戈式乳桿菌的培養(yǎng)結(jié)果的示意圖；圖5為圖示離心分離時(shí)的重力加速度和濃縮菌液的抗菌活性之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系的圖表；圖6為圖示在實(shí)施例4中使用的酸乳混合物的各自組成的示意圖；圖7為將實(shí)施例4的酸乳在5°C下保藏時(shí)酸度隨時(shí)間變化的圖表；圖8為將實(shí)施例4的酸乳在10°C下保藏時(shí)酸度隨時(shí)間變化的圖表；圖9為圖示在實(shí)施例5中使用的酸乳混合物的各自組成的示意圖；以及圖10為將實(shí)施例5的酸乳在5°C下保藏時(shí)酸度隨時(shí)間變化的圖表。
具體實(shí)施例方式下面說明本發(fā)明的實(shí)施方式。本實(shí)施方式中的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法是，向培養(yǎng)基中加入堿性溶液，以便使培養(yǎng)基的PH值保持在一定范圍(pH值為不低于5但不高于6)內(nèi)的同時(shí)，培養(yǎng)乳酸細(xì)菌。由此，可以得到每活細(xì)菌計(jì)數(shù)的抗菌活性非常高的乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)
5物。在本實(shí)施方式的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法中，待培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌為可以產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌(下面，簡(jiǎn)稱“細(xì)菌素生產(chǎn)菌”)。通過使用本實(shí)施方式的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法能夠培養(yǎng)下述細(xì)菌戈式乳桿菌等屬于乳桿菌屬的乳酸細(xì)菌；以及乳酸乳球菌等屬于乳球菌屬的乳酸細(xì)菌等。具體而言，乳酸細(xì)菌包括例如戈式乳桿菌0LL2959(NITEBP-2M，專利微生物保藏中心)、乳酸乳球菌乳酸亞種0LS3311 (Lactococcus lactis subsp. Iactis0LS3311，F(xiàn)ERM BP-10966，專利生物保藏中心)、乳酸乳球菌乳脂亞種0LS3312 (Lactococcuslactis subsp. cremoris 0LS3312, FERM BP-10967，專利生物保藏中心)等。對(duì)本實(shí)施方式的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法進(jìn)行了具體說明。首先，向含有乳清的乳清水溶液添加蛋白酶等蛋白水解酶，以降解乳清水溶液中的乳清蛋白。在添加蛋白水解酶之前，還可以將濃縮乳清蛋白(WPC)、分離乳清蛋白(WPI)等乳清蛋白添加到乳清水溶液中。然后，向乳清水溶液添加如啤酒酵母提取物等酵母提取物，以制備用于培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌的乳清降解培養(yǎng)基。除了乳清蛋白外，還可以向乳清降解培養(yǎng)基添加肉提取物、魚肉提取物等，作為氮源。另外，還可以向乳清降解培養(yǎng)基添加硫酸鐵、硫酸鎂等無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，以及添加德卡甘油單油酸酯、山梨醇單油酸酯等乳化劑。還可以向乳清降解培養(yǎng)基中添加抗壞血酸鈉等。向乳清降解培養(yǎng)基接種細(xì)菌素生產(chǎn)菌，并培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌。優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌，直到乳清降解培養(yǎng)基的PH值變成不高于6，然后將培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌的乳清降解培養(yǎng)基的PH值調(diào)整為在不低于5但不高于6的范圍中的同時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌。更優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌，直到乳清降解培養(yǎng)基的PH值變成不高于5. 8為止，然后將乳清降解培養(yǎng)基的PH值調(diào)整為在不低于5. 2但不高于5. 8的范圍中的同時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌。再優(yōu)選地，將乳清降解培養(yǎng)基的PH值調(diào)整為在不低于5. 5但不高于5. 8的范圍中的同時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌。可以通過向乳清降解培養(yǎng)基中添加堿性溶液來調(diào)整PH值。作為堿性溶液，可以使用碳酸鉀水溶液、碳酸氫鈉水溶液等。培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌之后，從培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中分離含有濃縮的細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液。濃縮菌液可以使用離心分離或者膜分離而分離。利用離心分離來分離濃縮菌液時(shí)，重力加速度優(yōu)選不低于6000 (G)。與在培養(yǎng)過程中未調(diào)整乳清降解培養(yǎng)基的PH值而培養(yǎng)的細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液相比，這樣得到的細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液的抗菌活性高數(shù)十倍或更高。即，通過將乳清降解培養(yǎng)基的PH值保持在5-6的范圍中的同時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌素生產(chǎn)菌，在控制濃縮菌液的抗菌活性的同時(shí)，可以高效地得到抗菌活性高的濃縮菌液。另外，當(dāng)將本實(shí)施方式的濃縮菌液作為食品防腐劑而添加到食品中時(shí)，與通常所需的現(xiàn)有食品防腐劑的量相比，待向食品中所添加的本實(shí)施方式的濃縮菌液的量較小。艮口，作為食品防腐劑而添加到食品中的本實(shí)施方式的濃縮菌液，能夠抑制食品原來的味道發(fā)生變化，也能夠改善食品的保存質(zhì)量。然后，對(duì)生產(chǎn)本實(shí)施方式的發(fā)酵乳(酸乳)的方法進(jìn)行具體說明。首先，制備作為原料乳的酸乳混合物。通過向生乳中混合脫脂奶粉、乳清蛋白、以及水等而制備酸乳混合物。另外，向酸乳混合物還可以添加砂糖、果肉、果汁等。以與常規(guī)進(jìn)行相同的方式，對(duì)酸乳混合物進(jìn)行均質(zhì)化以及滅菌之后，向酸乳混合物接種起子、由上述培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法得到的細(xì)菌素生產(chǎn)菌或者其濃縮菌液。以酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)，細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液的接種量?jī)?yōu)選為不少于0.01wt%但不多于0. lwt%。細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液的接種量更優(yōu)選為不少于0.01wt%但不多于0. 05wt%o而且，用作起子的乳酸細(xì)菌可以為與細(xì)菌素生產(chǎn)菌相同的乳酸細(xì)菌，還可以為不同的乳酸細(xì)菌。另外，在均質(zhì)化酸乳混合物的工序或者在滅菌工序之前，還可以向酸乳混合物添加濃縮菌液。通過使接種有細(xì)菌素生產(chǎn)菌或者其濃縮是細(xì)胞懸浮液的酸乳混合物發(fā)酵來生產(chǎn)酸乳。發(fā)酵條件可以與常規(guī)條件相同。與未添加濃縮菌液的酸乳相比，在根據(jù)本實(shí)施方式所討論的方法所生產(chǎn)的酸乳中，在剛制備后的酸度的增加得以抑制。這是由于濃縮菌液所含有的高濃度的細(xì)菌素抑制了酸乳中的保加利亞乳桿菌的活性。因此，根據(jù)本實(shí)施方式所討論的方法所生產(chǎn)的酸乳與現(xiàn)有的酸乳相比，在剛制備后的優(yōu)美的味道可以在整個(gè)保質(zhì)期O周左右)內(nèi)得以穩(wěn)定地保持。另外，在本實(shí)施方式的生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法中，可以將用作食品防腐劑的濃縮菌液的使用量，減少至通常所用的食品防腐劑的量的1/10左右。從而，可以防止酸乳原來的味道因添加濃縮菌液而遭到破壞。實(shí)施例下面，參考附圖，對(duì)本發(fā)明培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法的實(shí)施例進(jìn)行說明。實(shí)施例1圖1為圖示在實(shí)施例1中使用的乳清降解培養(yǎng)基的組成的示意圖。首先，制備在實(shí)施例1中使用的乳清降解培養(yǎng)基。具體而言，以乳清降解培養(yǎng)基的總重量為基準(zhǔn)，通過混合8. 70wt%的乳清粉末(明治乳業(yè)公司制造)、1. 50wt%的濃縮乳清蛋白(WPC80，NZMP公司制造)以及88. 80wt%的水，制備乳清水溶液。然后，通過將0. 10wt%的蛋白水解酶(蛋白酶A "AMANO"G,AMAN0 ENZYME公司制造)添加到乳清水溶液中，降解乳清水溶液中的乳清蛋白。之后，向乳清蛋白被分解的乳清水溶液添加0. 20wt%的啤酒酵母提取物(朝日啤酒公司制造)、0. 50wt%的魚肉提取物(MARUHANICHIRO食品公司制造)、0. 10襯％的抗壞血酸鈉以及0. 05襯％的硫酸鐵(FeS04)、0. 05襯％的乳化劑(SUN SOFT Q_17S(德卡甘油單油酸酯)，太陽化學(xué)公司制造)，以制備乳清降解培養(yǎng)基。然后，將戈式乳桿菌0LL2959(NITE BP-224，專利微生物保藏中心)接種到乳清降解培養(yǎng)基中，以便活細(xì)胞計(jì)數(shù)為2-4X 107CfU/ml。直到乳清降解培養(yǎng)基的PH值變?yōu)?. 5為止培養(yǎng)戈式乳桿菌0LU959之后，中和培養(yǎng)戈式乳桿菌0LL2959。具體而言，將碳酸鉀水溶液(40wt% )添加到乳清降解培養(yǎng)基中并攪拌，以便乳清降解培養(yǎng)基的PH時(shí)常不低于5. 5的同時(shí)，在34°C條件下將戈式乳桿菌0LL2959培養(yǎng)22個(gè)小時(shí)(中和培養(yǎng))。其中，中和培養(yǎng)是在吹入二氧化碳的缺氧條件下進(jìn)行的。中和培養(yǎng)之后，根據(jù)使用BCP培養(yǎng)基的注入培養(yǎng)法來測(cè)量乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌數(shù)量。戈式乳桿菌0LL2959 的活細(xì)菌計(jì)數(shù)為 1. 81 X 101Qcfu/ml。通過離心(重力加速度6000G)中和培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，得到了實(shí)施例1的戈式乳桿菌0LL2959的濃縮菌液。通過使用將在后面敘述的方法來測(cè)量實(shí)施例1的濃縮菌液的抗菌活性。測(cè)量結(jié)果為，實(shí)施例1的濃縮菌液每Iml的抗菌活性為72400AU(任意單位(Arbitrary Unit))。此外，實(shí)施例1的濃縮菌液每1 X IO9Cfu的抗菌活性為約4000AU。另外，使用實(shí)施例1的乳清降解培養(yǎng)基，在改變?nèi)榍褰到馀囵B(yǎng)基PH條件的同時(shí)，中和培養(yǎng)戈式乳桿菌0LL2959。結(jié)果，在pH值5. 2-5. 8的條件下通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液的抗菌活性值與實(shí)施例1的濃縮菌液的抗菌活性值相同。另外通過在PH值5-6的條件下通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液的抗菌活性值，稍微低于實(shí)施例1的濃縮菌液的抗菌活性值。為了確認(rèn)中和培養(yǎng)的效果，將以與實(shí)施例1相同的方法接種戈式乳桿菌0LU959的乳清降解培養(yǎng)基在37°C條件下靜置20個(gè)小時(shí)，以靜態(tài)培養(yǎng)戈式乳桿菌0LU959 (比較實(shí)施例1)。離心(重力加速度6000G)靜態(tài)培養(yǎng)的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，從而得到了比較實(shí)施例1的濃縮菌液。在靜態(tài)培養(yǎng)后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中，戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)為2. 63 X 109Cfu/ml。另外，比較實(shí)施例1的濃縮菌液每Iml的抗菌活性小于100AU。比較實(shí)施例1的濃縮菌液每IX IO9Cfu的抗菌活性小于約40AU。圖2圖示了在實(shí)施例1和比較實(shí)施例1中的培養(yǎng)后的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)和濃縮菌液的抗菌活性的各自測(cè)量結(jié)果。如上所述，實(shí)施例1的濃縮菌液每1 X IO9Cfu的抗菌活性，為4000AU，而比較實(shí)施例1的濃縮菌液每1 X IO9Cfu的抗菌活性，為小于約40AU。即，通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液(實(shí)施例1)的每活細(xì)菌計(jì)數(shù)的抗菌活性，為通過靜態(tài)培養(yǎng)所得到的濃縮菌液(比較實(shí)施例1)的每活細(xì)菌計(jì)數(shù)的抗菌活性的100倍左右。另外，中和培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)比靜態(tài)培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中的活細(xì)菌計(jì)數(shù)大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。由此推定出如下的結(jié)論因?yàn)橥ㄟ^在中和培養(yǎng)時(shí)將乳清降解培養(yǎng)基的PH值保持在不低于5. 5，使得戈式乳桿菌0LU959有活性，因而高效地產(chǎn)生細(xì)菌素。如此，通過在培養(yǎng)過程中將乳清降解培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為在5-6的范圍中的同時(shí)，進(jìn)行細(xì)菌素生產(chǎn)菌的中和培養(yǎng)，可以將濃縮菌液的抗菌活性控制在非常高的水平。實(shí)施例2圖3為圖示在實(shí)施例2中使用的乳清降解培養(yǎng)基的組成的示意圖。為了制備在實(shí)施例2中使用的乳清降解培養(yǎng)基，以與實(shí)施例1相同的方法制備乳清蛋白被分解的乳清水溶液。向乳清蛋白被分解的乳清水溶液添加0. 20wt%的啤酒酵母提取物(朝日啤酒公司制造)、0. 50wt%的魚肉提取物(MARUHA NICHIRO食品公司制造)、0. 10wt%的抗壞血酸鈉、0. 05襯％的硫酸鐵(FeS04)以及0. 05wt%的乳化劑(SUN SOFT 81S(山梨醇單油酸酯)、太陽化學(xué)公司制造)，制備乳清降解培養(yǎng)。在實(shí)施例2中使用的乳化劑與在實(shí)施例1所使用的不同。然后，向乳清降解培養(yǎng)基接種戈式乳桿菌0LL2959，以便活細(xì)菌計(jì)數(shù)為2-4 X 107CfU/ml。與實(shí)施例1相同，直到乳清降解培養(yǎng)基的pH值變?yōu)?.5為止培養(yǎng)戈式乳桿菌0LU959之后，中和培養(yǎng)戈式乳桿菌0LL2959。具體而言，在向乳清降解培養(yǎng)基添加碳酸鉀水溶液(40wt% )，以便乳清降解培養(yǎng)基的pH值時(shí)常不低于5. 5，同時(shí)，在34°C條件下將戈式乳桿菌0LL2959中和培養(yǎng)22個(gè)小時(shí)。中和培養(yǎng)后，使用與實(shí)施例1相同的方法來測(cè)量乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌數(shù)量。戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)為1. 84X1010cfu/mL·通過離心(重力加速度6000G)中和培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)來分離實(shí)施例2的濃縮菌液。實(shí)施例2的濃縮菌液每Iml的抗菌活性為51200AU。實(shí)施例2的濃縮細(xì)胞懸浮液每IX IO9Cfu的抗菌活性為約^OOAU?？咕钚缘臏y(cè)量則使用了與實(shí)施例1相同的方法(將在后面敘述)。另外，使用實(shí)施例2的乳清降解培養(yǎng)基，同時(shí)改變?nèi)榍褰到馀囵B(yǎng)基PH條件，中和培養(yǎng)戈式乳桿菌0LL2959。結(jié)果，在pH值為5. 2-5. 8的條件下通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液的抗菌活性值與實(shí)施例2的濃縮菌液的抗菌活性值相同。另外，在pH值為5-6的條件下通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液的抗菌活性值稍低于實(shí)施例2的濃縮菌液的抗菌活性值。為了確認(rèn)中和培養(yǎng)的效果，將以與實(shí)施例2相同的方法接種戈式乳桿菌0LL2959的乳清降解培養(yǎng)基在37°C條件下靜態(tài)培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)(比較實(shí)施例2、。離心(重力加速度6000G)靜態(tài)培養(yǎng)的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，以分離比較實(shí)施例2的濃縮菌液。在靜態(tài)培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中，戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)為2. 63X 109Cfu/ml。另外，比較實(shí)施例2的濃縮菌液每Iml的抗菌活性小于100AU,比較實(shí)施例2的濃縮菌液每IX IO9Cfu的抗菌活性小于約40AU。圖4圖示在實(shí)施例2和比較實(shí)施例2中的培養(yǎng)后的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)和濃縮菌液的抗菌活性的各自測(cè)量結(jié)果。如上所述，實(shí)施例2的濃縮菌液每1 X IO9Cfu的抗菌活性為^OOAU。比較實(shí)施例2的濃縮菌液每1 X IO9Cfu的抗菌活性為小于約40AU。即，通過中和培養(yǎng)所得到的濃縮菌液(實(shí)施例幻的每活細(xì)菌計(jì)數(shù)的抗菌活性為通過靜態(tài)培養(yǎng)所得到的濃縮菌液(比較實(shí)施例2、的每活細(xì)菌計(jì)數(shù)的抗菌活性的70倍或以上。另外，中和培養(yǎng)之后的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)比靜態(tài)培養(yǎng)之后的戈式乳桿菌0LL2959的活細(xì)菌計(jì)數(shù)大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。從實(shí)施例2中也可以推出如下結(jié)論因?yàn)槭沟酶晔饺闂U菌0LU959有活性，因而高效地產(chǎn)生細(xì)菌素。如此，通過在實(shí)施例2的條件下中和培養(yǎng)戈式乳桿菌0LL2959，可以將濃縮菌液的抗菌活性控制在非常高的水平。另外，因?yàn)閷?shí)施例1、實(shí)施例2的濃縮菌液的抗菌活性，是比較實(shí)施例1、比較實(shí)施例2的濃縮菌液的抗菌活性的數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以看出，對(duì)能夠用于乳清降解培養(yǎng)基中的乳化劑沒有特別的限定。測(cè)量抗菌活性的方法然后，以涉及實(shí)施例1的濃縮菌液為例，討論測(cè)量戈式乳桿菌0LL2959的濃縮菌液抗菌活性的方法。實(shí)施例2、比較實(shí)施例1以及比較實(shí)施例2的濃縮菌液的抗菌活性，也通過相同的方法進(jìn)行測(cè)量。使用在市場(chǎng)上銷售的MRS培養(yǎng)基(BECTON，DICKINSON公司制造)?；贛RS培養(yǎng)基，通過添加0.1% (ν/ν)的指示菌，制備測(cè)試培養(yǎng)基。使用德氏乳桿菌保加利亞變種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) ATCCl 1842 (模式菌株)作為指示菌。將冷凍保藏的實(shí)施例1的濃縮菌液在熱水浴中保持5分鐘，隨后制備實(shí)施例1的濃縮菌液的(v/v)水溶液。以每次2倍的比例漸進(jìn)性地稀釋濃縮菌液的水溶液，從而得到了濃縮菌液的多個(gè)稀釋溶液，其稀釋率水平不同。稀釋率水平范圍為8-12。由此制備了濃縮菌液的稀釋28-212倍的溶液。將稀釋的溶液分別添加到測(cè)試培養(yǎng)基中，使用ANAER0PACK.ANAERO (三菱氣體化學(xué)公司制造)，將添加有稀釋28-212倍溶液的測(cè)試培養(yǎng)基在37°C條件下缺氧培養(yǎng)對(duì)個(gè)小時(shí)。缺氧培養(yǎng)之后，確認(rèn)了指示菌不生長(zhǎng)的稀釋率的最高水平(N)。然后，基于稀釋率的最高水平(N)和濃縮菌液的水溶液的濃度(0.01 1%)，獲得實(shí)施例1的濃縮菌液的抗菌活性(AU)。可以基于下述計(jì)算式獲得抗菌活性。抗菌活性(AU)=稀釋率的最高水平(N)/濃縮菌液的水溶液的濃度(0. 01)。實(shí)施例3在實(shí)施例3中，討論中和培養(yǎng)的戈式乳桿菌的濃縮菌液的離心分離條件。以多種值設(shè)定重力加速度來對(duì)實(shí)施例1的中和培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)進(jìn)行離心。然后，獲得在不同的離心分離條件各個(gè)濃縮菌液的抗菌活性。圖5為圖示重力加速度和濃縮菌液的抗菌活性之間的關(guān)系的圖表。如圖5所示，在進(jìn)行離心分離時(shí)，隨著重力加速度的增加，濃縮菌液的抗菌活性也增加。并且，在離心分離時(shí)，當(dāng)重力加速度不低于6000G時(shí)，抗菌活性變?yōu)楹愣?大致72400AU)。由此可以明確，通過以不低于6000G的重力加速度對(duì)濃縮菌液進(jìn)行離心分離，可以高效地得到抗菌活性高的濃縮菌液。下面，作為制備本發(fā)明發(fā)酵乳的方法的實(shí)施例，說明通過使用實(shí)施例1的濃縮菌液制備酸乳的方法。實(shí)施例4圖6為圖示在實(shí)施例3中使用的三種酸乳混合物的組成的示意圖。首先，以酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)，通過混合83. 90wt%的牛乳、1. 5Iwt%的脫脂乳(都為明治乳業(yè)公司制造)、0. 80wt%的濃縮乳清蛋白(WPC34、D0M0公司制造)以及水，制備混合物A-C的酸乳混合物。如圖6所示，水的混合比在混合物A-C中是不同的。以與常規(guī)進(jìn)行相同的方式，對(duì)混合物A-C的酸乳混合物進(jìn)行均質(zhì)化以及滅菌，然后將混合物A-C的酸乳混合物冷卻至約40°C左右。冷卻之后，用2. 00wt%的乳酸細(xì)菌起子接種混合物A-C的酸乳混合物。使用從明治BULGARIA酸乳(明治乳業(yè)公司制造)中分離出的乳酸細(xì)菌作為乳酸細(xì)菌起子。混合物B的酸乳混合物接種0. 05wt %的實(shí)施例1的濃縮菌液。混合物C的酸乳混合物接種0. 10wt%的實(shí)施例1的濃縮菌液?；旌衔顰的酸乳混合物則未接種實(shí)施例1的濃縮菌液。直到乳酸濃度變?yōu)榧s0. 75%為止，在40°C溫度下發(fā)酵各混合物A-C的酸乳混合物，以制備酸乳。然后，在5°C和10°C的溫度下分別冷藏混合物A-C的酸乳，并在酸乳的通常保質(zhì)期(從制備日開始2周左右)內(nèi)測(cè)量混合物A-C的酸乳中的乳酸濃度。圖7為圖示將混合物A-C的酸乳在5°C下保藏時(shí)乳酸濃度隨時(shí)間變化的圖表。圖8為圖示將混合物A-C的酸乳在10°C下保藏時(shí)乳酸濃度隨時(shí)間變化的圖表。如圖7和圖8所示，與保藏溫度無關(guān)，混合物B、混合物C的酸乳的乳酸濃度低于混合物A的乳酸濃度。即，可以看出，接種有實(shí)施例1的濃縮菌液的混合物B、混合物C的酸乳，在冷藏狀態(tài)下其發(fā)酵受到抑制，從而可以保持其原來的味道和質(zhì)量。
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由混合物C的酸乳的乳酸濃度比混合物B的酸乳的乳酸濃度稍微低的現(xiàn)象可以看出，隨著濃縮菌液的接種量增多，存在乳酸濃度的增加受到更多抑制的傾向。但是，隨著濃縮菌液的接種量的增加，存在酸乳原來的味道遭破壞的憂慮。由于混合物B、混合物C的酸乳的乳酸濃度的差異較小，因此，如果僅意圖抑制酸乳乳酸濃度的增加，則濃縮菌液的接種量可以在0. Olwt% -0. 05wt%的范圍內(nèi)。另外，在混合物B、混合物C的酸乳混合物中，在上述情況和對(duì)酸乳混合物進(jìn)行均質(zhì)化和滅菌之前接種實(shí)施例1的濃縮菌液的情況之間，在抑制酸乳乳酸濃度增加的效果方面，未出現(xiàn)差異。由此可以明顯地看出，與濃縮菌液一同接種的細(xì)菌素生產(chǎn)菌可以是死的或活的，且無論細(xì)菌素生產(chǎn)菌是死還是活，都不會(huì)對(duì)濃縮菌液的抗菌活性產(chǎn)生影響。實(shí)施例5圖9為圖示在實(shí)施例5中使用的兩種酸乳混合物的組成的示意圖。向?qū)嵤├?的酸乳混合物中添加了分離乳清蛋白(WPI)，以代替濃縮乳清蛋白(WPC)，并且還添加了砂糖。首先，以酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)，通過混合84. 20wt%的牛乳、1. 76wt %的脫脂乳(都為明治乳業(yè)公司制造)、0.20wt%的分離乳清蛋白(WPI, NEW ZEALAND MILKPRODUCTS公司制造)、4. 50wt%的砂糖以及水，制備混合物D、混合物E各自的酸乳混合物。如圖9所示，水的混合比在混合物D、混合物E中是不同的。以與常規(guī)進(jìn)行相同的方式，對(duì)混合D、混合E的酸乳混合物進(jìn)行均質(zhì)化以及滅菌，并將混合物D、混合物E的酸乳混合物冷卻至約40°C。冷卻之后，用3. 00wt%的乳酸細(xì)菌起子接種混合物D、混合物E的酸乳混合物。使用從明治十勝酸乳(明治乳業(yè)公司制造)中分離出的乳酸細(xì)菌作為乳酸細(xì)菌起子。并且，混合物E的酸乳混合物接種了 0. 05wt%的實(shí)施例1的濃縮菌液。混合D的酸乳混合物未接種實(shí)施例1的濃縮菌液。另外，在實(shí)施例5中未使用接種有0. 10wt%的濃縮菌液的酸乳混合物。這是由于，在所述實(shí)施例4中明顯看出了下述的現(xiàn)象，即，即使?jié)饪s菌液的接種量為0. 05wt%，也可以充分地得到酸度抑制效果。直到乳酸濃度變?yōu)榧s0. 75%為止，在40°C溫度下發(fā)酵混合物D、混合物E的各自酸乳混合物，以制備酸乳。在5°C溫度下冷藏混合物D、混合物E的酸乳，且在酸乳的通常保質(zhì)期(從制備日開始大致2周左右)內(nèi)測(cè)量了混合物D、混合物E的酸乳中的乳酸濃度。圖10為圖示混合物D、混合物E的酸乳乳酸濃度隨時(shí)間變化的圖表。如圖10所示，混合物E的酸乳的乳酸濃度低于混合物D的酸乳的乳酸濃度。由此可以明顯地看出，即使將實(shí)施例1的濃縮菌液用于制備加糖酸乳，也可以抑制加糖酸乳乳酸濃度的增加。另外，在混合物E的酸乳混合物中，在上述情況和對(duì)酸乳混合物進(jìn)行均質(zhì)化和滅菌之前接種實(shí)施例1的濃縮菌液的情況之間，在抑制酸乳的乳酸濃度增加的效果方面，未出現(xiàn)差異。在實(shí)施例4、實(shí)施例5中，作為食品防腐劑，實(shí)施例1的濃縮菌液的接種量為常規(guī)使用的食品防腐劑的量的1/10或更少。即，通過實(shí)施例4、實(shí)施例5所討論的制備發(fā)酵乳的方法，可以抑制由于實(shí)施例1的濃縮菌液的接種而導(dǎo)致的酸乳原來味道的變化，同時(shí)可以在通常的保質(zhì)期內(nèi)保持酸乳原來的味道。另外，通過使用實(shí)施例2的濃縮菌液來進(jìn)行與實(shí)施例4、實(shí)施例5相同的測(cè)試。結(jié)果，與使用實(shí)施例1的濃縮菌液相同，使用實(shí)施例2的濃縮菌液所生產(chǎn)的酸乳，也能夠抑制酸乳酸度的變化。 參考附圖所示的實(shí)施方式說明了本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限于所記載的形式，應(yīng)理解為，本發(fā)明所要保護(hù)的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書所記載的范圍決定。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法，包括培養(yǎng)液制備工序，制備含有蛋白水解酶所降解的乳清的培養(yǎng)液；以及培養(yǎng)工序，將產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌接種到所述培養(yǎng)液中，并將接種有所述乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5但不高于6的同時(shí)培養(yǎng)所述乳酸細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法，其中，還包括分離工序，從培養(yǎng)有所述乳酸細(xì)菌的所述培養(yǎng)液中分離含有濃縮的所述乳酸細(xì)菌的濃縮菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法，其中，在所述培養(yǎng)工序中，將接種有所述乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5. 2但不高于 5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)乳酸細(xì)菌的方法，其中，在所述培養(yǎng)工序中，通過向接種有所述乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)液中添加堿性溶液來調(diào)節(jié)接種有所述乳酸細(xì)菌的所述培養(yǎng)液的PH值。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳酸細(xì)菌的培養(yǎng)方法，其中，在所述分離工序中，以不低于6000G的重力加速度從培養(yǎng)所述乳酸細(xì)菌的所述培養(yǎng)液中離心所述濃縮菌液。
6.生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，包括原料乳生成工序，產(chǎn)生酸乳混合物；濃縮菌液生成工序，培養(yǎng)作為產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌的細(xì)菌素生產(chǎn)菌，產(chǎn)生含有濃縮的所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的濃縮菌液；添加工序，以所述酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)，向所述酸乳混合物中添加不少于0.01Wt%但不多余0. Iwt %的所述濃縮菌液；以及發(fā)酵工序，發(fā)酵添加有所述濃縮菌液的酸乳混合物；其中，所述濃縮菌液生成工序包括培養(yǎng)液制備工序，制備含有根據(jù)蛋白水解酶所分解的乳清的培養(yǎng)液；培養(yǎng)工序，將所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌接種到所述培養(yǎng)液中，在將接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5但不高于6的同時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌；以及分離工序，從培養(yǎng)有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)液中分離所述濃縮菌液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，其中，向所述酸乳混合物中添加的所述濃縮菌液的量，以所述酸乳混合物的總重量為基準(zhǔn)，不少于0. Olwt%但不多于0. 05wt%o
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，其中，在所述培養(yǎng)工序中，將接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的所述培養(yǎng)液的PH值保持在不低于5. 2但不高于5.8以下。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，其中，在所述培養(yǎng)工序中，通過向接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的所述培養(yǎng)液中添加堿性溶液，來調(diào)節(jié)接種有所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的所述培養(yǎng)液的PH值。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)發(fā)酵乳的方法，其中，在所述分離工序中，以6000G以上的重力加速度從培養(yǎng)所述細(xì)菌素生產(chǎn)菌的所述培養(yǎng)液中離心所述濃縮菌液。
全文摘要
向乳清水溶液添加蛋白酶，以降解乳清水溶液中的蛋白質(zhì)。然后，向乳清水溶液添加酵母提取物等，以制備乳清降解培養(yǎng)基。向乳清降解培養(yǎng)基接種產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸細(xì)菌，并且將乳清降解培養(yǎng)基的pH值保持在5-6范圍中的同時(shí)培養(yǎng)乳酸細(xì)菌。離心培養(yǎng)之后的乳清降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，以分離含有濃縮的乳酸細(xì)菌的濃縮菌液。濃縮菌液顯示出非常高的抗菌活性(數(shù)萬AU)，從而可以用作食品防腐劑。另外，使添加有0.01wt％-0.1wt％的濃縮菌液的酸乳混合物發(fā)酵，以生產(chǎn)酸乳。用此方法，可以抑制酸乳酸度的增加。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102369273SQ20108001472
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
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