專利名稱：預(yù)測和監(jiān)控對于Aurora激酶B抑制劑療法的應(yīng)答的標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在關(guān)于選擇用一種或多種Aurora激酶B抑制劑的癌癥療法的患者分類中有用的診斷測定。具體地，本發(fā)明涉及鑒定ABCBl基因、ABCB4基因或其組合中一種或多種拷貝數(shù)增益(gain)的存在或不存在，鑒定對于接受作為單一療法或作為組合療法的部分的Aurora激酶抑制劑療法合格的患者，并且監(jiān)控對于此種療法的患者應(yīng)答。背景
Aurora激酶家族是一組高度相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其充當(dāng)有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。3種Aurora激酶在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。這些Aurora激酶是Aurora A、Aurora B和 Aurora C。這些Aurora激酶各自顯示不同的亞細(xì)胞定位且發(fā)揮獨特作用(參見，Carmena Μ. E. W.，Nat. Rev. Mol. Cell Biol.，4:842-854 (2003)和(Ducat，D. Ζ. Y.，Exp. Cell Tfes. , 301:60-67 (2004))。具體地，Aurora A定位于紡錘極且在兩極紡錘體形成中具有關(guān)鍵作用(參見 Marumoto，T. Z. D.，等人，Rev.542-50 (2005))。Aurora B，染
色體過客蛋白質(zhì)，定位于早期有絲分裂中的著絲粒，并且隨后定位于后期中的紡錘體中間區(qū)。Aurora B是有絲分裂組蛋白H3磷酸化、染色體雙向定向(biorientation)、紡錘體裝配限制點和胞質(zhì)分裂所需的(Andrews，P. D.，等人，Curr. Opin. Cell BioL，15:672-683
(2003))。AuroraC也是染色體過客蛋白質(zhì)，并且在正常細(xì)胞中，其表達(dá)局限于睪丸，在其中它主要在雄性配子發(fā)生中起作用。因為Aurora激酶在有絲分裂中發(fā)揮基本功能，所以相當(dāng)大的注意力已給予靶向這個激酶家族用于癌癥療法。幾種小分子抑制劑已得到開發(fā)，包括 Hesperadin、ZM447439、VX-680/MK0457、AZD1152 和 MLN8054 (參見，Ditchfield，C，J. V.，等人，7； Cell Biol. , 161:267-280 (2003)，Harrington，Ε. Α.，等人，Med. , 10:262-267
(2004)，Hauf，S.，等人，7；Cell Biol.，161:281-294 (2003)，Manfredi，Μ. G.，等人， Natl. Acad. Sci. , USA, 104:4106-4111 (2007))。AZDl 152是新乙酰苯胺取代的吡唑-氨基喹唑啉前體藥物，其在人血漿中快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚运幬?AZD1152 HQPA(參見，Mortlock，A. A.，等人，7； Med. Chem. , 50:2213-2224 (2007))。與 Aurora A 相比較(Ki 1369 nM)，AZD1152 HQPA 是 Aurora B 的高度有效和有選擇性的抑制劑(Ki 0.36 nM)，并且針對50種其他激酶的實驗對象組是無活性的。AZD1152 有效抑制人結(jié)腸、肺和血液學(xué)腫瘤異種移植物在免疫缺陷小鼠中的生長。用ASH152靜脈內(nèi)處理的荷有SW620結(jié)腸直腸腫瘤的無胸腺大鼠中的詳細(xì)藥物動力學(xué)分析揭示腫瘤中的表型事件的時間順序組蛋白H3磷酸化的瞬時抑制，具有如DNA的細(xì)胞積累，隨后為多倍體(Mn DNA)細(xì)胞比例中的增加。組織學(xué)分析已顯示與AZD1152處理的腫瘤中細(xì)胞凋亡中的增加同時的異常細(xì)胞分裂，即，觀察到骨髓的增殖抑制所繼發(fā)的瞬時的骨髓抑制，盡管這種作用在AZD1152處理停止后是完全可逆的(參見，Wilkinson, R. W.，等人，Clin. Cancer Res. , 13:3683-3688 (2007))。在癌癥化學(xué)療法中面對的主要障礙是腫瘤對于細(xì)胞毒劑，甚至對于腫瘤細(xì)胞從未暴露于其的藥物的交叉抗性的發(fā)展。這種表型稱為多藥耐性(MDR)，在用抗癌藥物治療后頻繁觀察到。雖然關(guān)于MDR的分子基礎(chǔ)經(jīng)常是復(fù)雜的，但ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員的上調(diào)已作為由腫瘤細(xì)胞利用的核心、細(xì)胞自主性機制出現(xiàn)，以逃避在第一線和第二線治療標(biāo)準(zhǔn)中普遍的化學(xué)治療藥物的活性。因為先前化學(xué)療法已失敗的個體是最可能接受更新的實驗醫(yī)學(xué)的那些，所以MDR易感性代表腫瘤學(xué)中的藥物開發(fā)中的重大障礙。原型ABC轉(zhuǎn)運蛋白，多藥耐性1 (MDR1 ；也稱為P-糖蛋白或P-gp ；由基因ABCBl編碼)由2個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其通過ATP的水解轉(zhuǎn)運溶質(zhì)逆著濃度梯度進入細(xì)胞外間隙內(nèi)。其他ABC轉(zhuǎn)運蛋白例如乳腺癌抗性蛋白質(zhì)(BRCP，其由基因ABCG2編碼)作為半轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，并且二聚化以產(chǎn)生成熟的功能單位。盡管BRCP對于針對化學(xué)療法的抗性的貢獻(xiàn)仍不明了，但MDRl的上調(diào)已是具有急性髓細(xì)胞性白血病(AML)或骨髓異常增生綜合征的個體中化學(xué)療法失敗和低存活的一致地預(yù)兆(Pallis，M. R. N. ,Leukemia, 18:1927-1930 (2004) 和 van der Holt，B. L. B.，等人，擬oot/，106 2646-2654 (2005))。此外，MDRl 已與 31 個乳腺癌試驗的元分析(meta-analysis)中對于化學(xué)療法的應(yīng)答減少相關(guān)(參見，Trock, B. J.， 等)k，J. Natl. Cancer Inst. ,89:917-931 (1997))。因此，在抑制或調(diào)節(jié)一種或多種 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的物質(zhì)開發(fā)中已投入相當(dāng)大的努力。事實上，這類第二代和第三代抑制劑待作為化學(xué)致敏劑(chemosensitizer)在臨床試驗中評價(Bates，S. F.，等k，Nomrtis Found. Symp. , 83-96 (2002))。盡管AZD1152已顯示希望的臨床前功效且在AML和實體瘤中的I/II期臨床試驗中評價，但關(guān)于發(fā)展對于AZD1152的抗性的潛力仍未探究。因此，本領(lǐng)域需要鑒定對于用Aurora激酶B抑制劑治療的受試者賦予腫瘤細(xì)胞抗性的基因，并且使用得自這些基因的信息，例如由這些基因圍繞的蛋白質(zhì)的上調(diào)或下調(diào)，以開發(fā)用于測定或分類患者對于用 Aurora激酶B抑制劑的治療是否合格的診斷方法，和用于就藥物抗性的發(fā)展監(jiān)控患有癌癥且用一種或多種Aurora激酶B抑制劑治療的患者的方法。概述
在第一個方面，本發(fā)明涉及對于用Aurora激酶B抑制劑的治療的合格性分類患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患者的測試樣品；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
c)基于關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在，將患者分類為對于接受用Aurora激酶B抑制劑的治療是合格的。在第二個方面，本發(fā)明涉及對于用Aurora激酶B抑制劑的治療的合格性分類患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患者的測試樣品；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和c)基于關(guān)于在染色體基因座7q21. 1的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在，將患者分類為對于接受用Aurora激酶B抑制劑的治療是合格的。 在上述2個方面各自中，Aurora激酶B抑制劑可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/ MK0457 或 Hersperadin0 在上述2個方面各自中，測試樣品可以包括組織樣品。具體地，組織樣品包括外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、淋巴結(jié)樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品、石蠟包埋的組織樣品，或由外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品或石蠟包埋的組織樣品中的任何一種產(chǎn)生的提取物或加工的樣品。在上述2個方面各自中，測定步驟(b )可以通過原位雜交執(zhí)行。具體地，原位雜交可以用熒光標(biāo)記的核酸探針執(zhí)行。更具體而言，原位雜交可以用至少2種核酸探針執(zhí)行。可替代地，原位雜交用肽核酸探針執(zhí)行?？商娲兀谏鲜?個方面各自中，測定步驟(b)可以通過聚合酶鏈反應(yīng)執(zhí)行。再進一步可替代地，測定步驟(b)可以通過核酸微陣列測定執(zhí)行。在上述2個方面各自中，癌癥可以是結(jié)腸直腸癌或胰癌。在第一個方面，在ABCBl基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDRl多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在第二個方面，在ABCB4基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDR3多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在上述2個方面各自中，患者用反義試劑治療，所述反義試劑設(shè)計為與ABCBl基因、ABCB4基因或ABCBl基因和ABCB4基因的組合中的至少一種結(jié)合。在上述2個方面各自中，患者還可以任選用化學(xué)療法、放射或其組合進行治療。在第三個方面，本發(fā)明涉及監(jiān)控患有癌癥且用Aurora激酶B抑制劑治療的患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患有癌癥且目前用至少一種Aurora激酶B抑制劑治療的患者的測試樣
P
m ；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；
c)針對基線水平或預(yù)定水平比較測試樣品中ABCBl基因的拷貝數(shù)；和
d)基于步驟c)中的比較，決定患者是否應(yīng)繼續(xù)用Aurora激酶B抑制劑治療。在第四個方面，本發(fā)明涉及監(jiān)控患有癌癥且用Aurora激酶B抑制劑治療的患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患有癌癥且目前用至少一種Aurora激酶B抑制劑治療的患者的測試樣
P
m ；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；
c)針對基線水平或預(yù)定水平比較測試樣品中關(guān)于ABCB4基因的拷貝數(shù)增益或不存在；
和
d)基于步驟c)中的比較，決定患者是否應(yīng)繼續(xù)用Aurora激酶B抑制劑治療。在上述2個方面各自中，Aurora激酶B抑制劑可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457 或 Hersperadin0在上述2個方面各自中，測試樣品可以包括組織樣品。具體地，組織樣品包括外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、淋巴結(jié)樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品、石蠟包埋的組織樣品，或由外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品或石蠟包埋的組織樣品中的任何一種產(chǎn)生的提取物或加工的樣品。在上述2個方面各自中，測定步驟(b )可以通過原位雜交執(zhí)行。具體地，原位雜交可以用熒光標(biāo)記的核酸探針執(zhí)行。更具體而言，原位雜交可以用至少2種核酸探針執(zhí)行?？商娲兀浑s交用肽核酸探針執(zhí)行。可替代地，在上述2個方面各自中，測定步驟(b)可以通過聚合酶鏈反應(yīng)執(zhí)行。再進一步可替代地，測定步驟(b)可以通過核酸微陣列測定執(zhí)行。在上述2個方面各自中，癌癥可以是結(jié)腸直腸癌或胰癌。在第三個方面，在ABCBl基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDRl多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在第四個方面，在ABCB4基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDR3多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在上述2個方面各自中，患者用反義試劑治療，所述反義試劑設(shè)計為與ABCBl基因、ABCB4基因或ABCBl基因和ABCB4基因的組合中的至少一種結(jié)合。在上述2個方面各自中，患者還可以任選用化學(xué)療法、放射或其組合進行治療。在第五個方面，本發(fā)明涉及分類具有對于用Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥的患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患者的測試樣品；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；
c)針對基線水平或預(yù)定水平比較測試樣品中關(guān)于ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
d)基于(i)在染色體基因座7q21. 1上ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在；和(ii )測試樣品中拷貝數(shù)增益是否高于基線水平或預(yù)定水平，將患者分類為具有對于Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥。 在第六個方面，本發(fā)明涉及分類具有對于用Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥的患者的方法。該方法包括步驟
a)提供來自患者的測試樣品；
b)測定關(guān)于在染色體基因座7q21.1的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；
c)針對基線水平或預(yù)定水平比較測試樣品中關(guān)于ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
d)基于(i)在染色體基因座7q21.1上ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在；和(ii)測試樣品中拷貝數(shù)增益是否高于基線水平或預(yù)定水平，將患者分類為具有對于Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥。 在上述2個方面各自中，Aurora激酶B抑制劑可以是AZD1152、ZM447439、VX-680/MK0457 或 Hersperadin0在上述2個方面各自中，測試樣品可以包括組織樣品。具體地，組織樣品包括外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、淋巴結(jié)樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品、石蠟包埋的組織樣品，或由外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品或石蠟包埋的組織樣品中的任何一種產(chǎn)生的提取物或加工的樣品。在上述2個方面各自中，測定步驟(b )可以通過原位雜交執(zhí)行。具體地，原位雜交可以用熒光標(biāo)記的核酸探針執(zhí)行。更具體而言，原位雜交可以用至少2種核酸探針執(zhí)行?？商娲兀浑s交用肽核酸探針執(zhí)行?？商娲兀谏鲜?個方面各自中，測定步驟(b)可以通過聚合酶鏈反應(yīng)執(zhí)行。再進一步可替代地，測定步驟(b)可以通過核酸微陣列測定執(zhí)行。在上述2個方面各自中，癌癥可以是結(jié)腸直腸癌或胰癌。在第五個方面，在ABCBl基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDRl多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在第六個方面，在ABCB4基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDR3多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在上述2個方面各自中，患者用反義試劑治療，所述反義試劑設(shè)計為與ABCBl基因、ABCB4基因或ABCBl基因和ABCB4基因的組合中的至少一種結(jié)合。在上述2個方面各自中，患者還可以任選用化學(xué)療法、放射或其組合進行治療。在第七個方面，本發(fā)明涉及包括下述的試劑盒
(a)用于測定關(guān)于ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑；
(b)用于執(zhí)行測試的說明書。在上述試劑盒中，測定拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑包括與ABCBl基因的至少部分雜交的可檢測標(biāo)記的多核苷酸。在第八個實施方案中，本發(fā)明涉及包括下述的試劑盒
(a)用于測定關(guān)于ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑；
(b)用于執(zhí)行測試的說明書。在上述試劑盒中，測定拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑包括與ABCB4基因的至少部分雜交的可檢測標(biāo)記的多核苷酸。附圖簡述


圖1顯示如實施例中所述，ABCBl和ABCB4鑒定為SW620衍生物中擴增且超表達(dá)的基因，所述SW620衍生物對于針對AZDl 152 HQPA的抗性進行選擇。具體地，圖IA顯示在親本 SW620細(xì)胞、SW620ABra"3細(xì)胞和在無藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月后的SWeZO·"3細(xì)胞中，使用 Affymetrix 100K SNP芯片通過CGH測定的ABCBl和ABCB4拷貝數(shù)。垂直線指示ABCBl基因座的位置，并且水平線指示正常DNA拷貝數(shù)(2個拷貝)。圖IB顯示與其他溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白相比較，關(guān)于ABCBl和ABCB4的mRNA表達(dá)值。STOZO 173中ABCBl (編碼MDRl)和ABCB4 (編碼MDR3)的表達(dá)水平由箭標(biāo)指示。圖IC顯示使用Affymetrix HG-U133A GeneChips測定的，關(guān)于超過14，000種基因加上ESTs廣22，000探針組)的mRNA表達(dá)值。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為與其表達(dá)增加10倍或更大的所有基因相比較，與親本SW620細(xì)胞相比較，關(guān)于SW620ABGB1/3 細(xì)胞的基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。圖ID顯示通過免疫印跡分析測定的MDRl蛋白質(zhì)的相對表達(dá)。肌動蛋白用作裝載對照。圖2顯示ABCBl的抑制逆轉(zhuǎn)SW620abgbV3衍生物中對于AZDl 152 HQPA的抗性。圖 2A顯示在劑量應(yīng)答中用AZDl 152 HQPA處理90分鐘的SW620、31620 〃和在無藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月后的SW620abgbV3細(xì)胞。通過免疫印跡分析測定組蛋白H3在^rltl上的磷酸化。 圖2B顯示用1 μΜ AZDl 152 HQPA處理4小時的SW620或31620 〃細(xì)胞。使細(xì)胞分級分離，并且在分別的樣品級分中通過LC-MS分析測定AZD1152 HQPA濃度。圖2C顯示在劑量應(yīng)答中AZDl 152 HQPA 90分鐘前，用DMSO或1 μ M PSC-833處理2小時的細(xì)胞。 隨后通過免疫印跡測定組蛋白H3的磷酸化。圖2D顯示通過轉(zhuǎn)染螢光素酶(siLuciferase) 或 ABCBK siABCBl )siRNAs，隨后用 AS)1152 HQPA 處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 90 分鐘，評估 SW620ABCB1/3 衍生物中ABCBl擊倒的作用。ABCBl的免疫印跡分析指示與siLuciferase相比較，蛋白質(zhì)水平由siABCBl減少約75%。圖3顯示在SW620與SW620abgbV3異種移植物比較中，AZDl 152 HQPA的藥物代謝動力學(xué)、藥物動力學(xué)和功效的關(guān)系。圖3A (上圖)顯示通過計算在組蛋白H3磷酸化的測定中AZD1152 HQPA的固有效力和當(dāng)在50% (vv4)小鼠血漿的存在下測定時AZD1152 HQPA 的效力中的倍數(shù)減少的積估計的抑制異種移植物組蛋白H3磷酸化所需的計劃閾值瘤內(nèi)濃度。下圖顯示在100 mg kg—1的單次腹膜內(nèi)(i. p.)注射后，在給藥后0、2、8和M小時時測定的AZD1152 HQPA瘤內(nèi)藥物代謝動力學(xué)。圖顯示給予單劑AZDl 152 HQPA的荷有確立的SW620和SWeZO—腫瘤異種移植物的小鼠(100 mg kg—Si.p.)，并且每個時間點收獲3 個腫瘤。取出腫瘤，并且在用AZD1152處理后通過SW620腫瘤(淺藍(lán)色)和SWeZO·"3腫瘤 (深藍(lán)色)中的免疫印跡測定磷酸-組蛋白H3水平。定量免疫印跡，并且數(shù)據(jù)表示為曲線下面積。呈現(xiàn)來自個別時間點的平均值士 s. e.m。圖3C和圖3D顯示如實施例1中所述，皮下注射到Mifbg小鼠內(nèi)的SW620和SW620—細(xì)胞。腫瘤在約500 mm3進行大小匹配，并且用AZD1152的處理在接種后第7天起始。AZD1152以q2d時間表以50或100 mg/kg/天的劑量通過i. P.注射施用2周。每個點代表10個腫瘤的平均值士 s. d.。圖4顯示超表達(dá)ABCBl的細(xì)胞系在體外對于AS)1152 HQPA和VX-680/MK0457是抗性的。圖4A呈現(xiàn)在顯示ABCBl的相對表達(dá)的異種移植物研究中使用的細(xì)胞系的免疫印跡。圖4B顯示在7天集落形成(貼壁系SW620、SW620abgbV3、HCT-15、AsPC1)或生存力(非貼壁系RS ；411 和 DoHH-2)中對于針對 AZD1152 HQPA、VX-680/MK0457、MLN8054 和紫杉醇的相對敏感性評價的細(xì)胞系實驗對象組。細(xì)胞在劑量應(yīng)答中處理，以測定IC5(ls。圖4C顯示在添加所示濃度的AZDl 152 HQPA另外1小時前，用DMSO或1 μ M PSC-833處理1小時的 HCT-15細(xì)胞。通過免疫印跡測定總和磷酸-(Serltl)-組蛋白H3。圖4D顯示如圖4C中所述，用DMSO或10 μ M煙曲霉毒素C處理1小時隨后為AZD1152 HQPA的AsPCl細(xì)胞。碰
本發(fā)明提供了關(guān)于對于Aurora激酶B抑制劑療法的抗性監(jiān)控癌癥和腫瘤細(xì)胞的方法和組合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)關(guān)于(i)在染色體基因座7q21. 1的ABCBl基因；(ii)在染色體基因座7q21. 1的ABCB4基因；或(iii)在染色體基因座7q21. 1上的ABCBl基因和ABCB4基因各自的拷貝數(shù)增益的存在與對于用Aurora激酶B抑制劑的療法的抗性相關(guān)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用基于微陣列的比較基因組雜交技術(shù)的上述拷貝數(shù)增益，以檢測在全基因組規(guī)模上的基因拷貝數(shù)異常(例如拷貝數(shù)增益和拷貝數(shù)喪失)，從而提供了伴隨 DNA拷貝數(shù)中的變化的染色體畸變的全基因組視圖。這種方法在METHODS FOR ASSEMBLING PANELS OF CANCER CELL LINES FOR USE IN TESTING THE EFFICACY OF ONE OR MORE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS中完全公開，其于2008年10月31日提交，并且指定美國系列號61/110，281，其內(nèi)容整體引入本文。本發(fā)明提供了用于鑒定、分類且監(jiān)控癌癥患者的診斷測定，這包括就關(guān)于(i) ABCB1基因；(i i ) ABCB4基因；或(i i i ) ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷貝數(shù)增益的存在或不存在評估測試樣品。本發(fā)明的測定包括用于鑒定對于接受Aurora激酶B療法(作為單一療法或作為組合療法(例如連同化學(xué)療法、放射或其組合)的部分)合格的患者和用于監(jiān)控對于此種療法的患者應(yīng)答的測定方法。本發(fā)明包括例如通過熒光原位雜交測定關(guān)于 (i ) ABCB1基因；(i i ) ABCB4基因；或(i i i ) ABCB1基因和ABCB4基因各自的拷貝數(shù)增益的存在或不存在。分類為具有關(guān)于(i) ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和 ABCB4基因各自的拷貝數(shù)增益中的增加的患者對于接受至少作為單一療法的Aurora激酶 B療法是不合格的，因為他們不太可能響應(yīng)這種療法。此外，具有這種擴增的患者可以對其他癌癥療法是抗性的。因此，關(guān)于癌癥和腫瘤細(xì)胞中(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或 (iii) ABCBl基因和ABCB4基因各自的拷貝數(shù)增益的存在的測定作為一般療法分層標(biāo)記是有用的。在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于將患者鑒定或分類為對于用Aurora激酶B抑制劑的治療(作為單一療法或組合療法的部分)合格的方法，該方法包括步驟
(a)提供來自患者的組織樣品；
(b)測定關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
(c)基于關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii)ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的不存在，將患者分類為對于用Aurora激酶B抑制劑的治療是合格的。在上述方法中，基于關(guān)于(i) ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在，患者對于用Aurora激酶B抑制劑的治療(至少作為單一療法)將是不合格的。由其獲得測試樣品的患者可以是懷疑或診斷有癌癥的患者。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) ABCBl基因中的拷貝數(shù)增益與MDRl多肽表達(dá)中的增加相關(guān)，并且ABCB4基因中的拷貝數(shù)增益與MDR3多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。在這個實施方案中，癌癥可以是任何類型的癌癥，例如結(jié)腸直腸癌或胰癌。此外， 在這個實施方案中，基因擴增可以通過多彩色熒光原位雜交(FISH)測定進行測定，例如對肺癌腫瘤活組織檢查樣品執(zhí)行。在其他實施方案中，使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)方法。在另外一個實施方案中，本發(fā)明包括用于鑒定或分類具有對于用Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥的患者的方法，該方法包括步驟
(a)提供來自患者的測試樣品(例如組織樣品)；
(b)測定關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
(c)基于關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii)ABCBl基因和ABCB4基因的
10拷貝數(shù)增益的存在，將患者分類為具有對于Aurora激酶B抑制劑是抗性的癌癥。在這個實施方案中，癌癥可以是任何類型的癌癥，例如結(jié)腸直腸癌或胰癌。此外， 在這個實施方案中，基因擴增可以通過多彩色熒光原位雜交(FISH)測定進行測定，例如對肺癌腫瘤活組織檢查樣品執(zhí)行。在其他實施方案中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于監(jiān)控用Aurora激酶B抑制劑治療的患者的方法，該方法包括步驟
(a)提供來自用至少一種Aurora激酶抑制劑治療的癌癥患者的測試樣品(任選地，可以鑒定或提取得自組織樣品的腫瘤或癌細(xì)胞)；
(b)測定測試樣品中(例如腫瘤或癌細(xì)胞中)關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或 (iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和
(c)針對基線水平或預(yù)定水平比較來自測試樣品(例如腫瘤或癌細(xì)胞)的關(guān)于(i)ABCBl 基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益；和
(d)基于步驟(c)中的比較，決定患者是否應(yīng)繼續(xù)用Aurora激酶B抑制劑治療。具體地，如果具有關(guān)于(i ) ABCB1基因；(i i ) ABCB4基因；或(i i i ) ABCB1基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的測試樣品(例如腫瘤或癌細(xì)胞)與基線水平或預(yù)定水平相同或高于基線水平或預(yù)定水平，那么用Aurora激酶B抑制劑的治療可以中斷、停止或終止(如果它作為單一療法單獨使用的話)?？商娲?，治療醫(yī)生可以決定組合Aurora激酶B抑制劑與至少第二種療法(例如用第二種小分子的治療)作為組合療法。然而，如果得自測試樣品(例如腫瘤或癌細(xì)胞)的關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii)ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益小于基線水平或預(yù)定水平，或如果未檢測到關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或 (iii)ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益，那么用Aurora激酶B抑制劑的治療可繼續(xù)。 再次，取決于用所述治療獲得的結(jié)果，治療醫(yī)生可以決定組合Aurora激酶B抑制劑與至少第二種療法(例如用第二種小分子的治療)作為組合療法。再次，F(xiàn)ISH和PCR方法可以用于檢測得自患者的測試樣品中關(guān)于(i)ABCBl基因； (ii) ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在。本發(fā)明還涉及包裝例如工程改造為作為PCR引物、FISH探針等使用的寡核苷酸或多核苷酸的試劑盒。本發(fā)明具有提供用于癌癥療法且具體用于Aurora激酶B抑制劑療法的改善的患者分層的顯著能力。這些生物標(biāo)記由本發(fā)明的評估還允許跟蹤對于療法的個別患者應(yīng)答。A.定義
如本文這個章節(jié)和整個公開內(nèi)容中使用的章節(jié)標(biāo)題不預(yù)期是限制性的。如本文使用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明確說明。對于本文數(shù)字范圍的敘述，明確預(yù)期了具有相同精確度的兩者之間的每個間插數(shù)字。 例如，對于范圍6-9，除6和9外，還預(yù)期了數(shù)字7和8，并且對于范圍6. 0-7. 0，明確預(yù)期了數(shù)字 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. 0。a) Aurora激酶B抑制劑
"Aurora激酶B抑制劑”指任何類型(例如非選擇性或選擇性)的治療化合物，包括基于小分子、抗體、反義、小干擾RNA或微小RNA的化合物，其與Aurora激酶B或Aurora B中的至少一種結(jié)合，并且拮抗Aurora激酶B或Aurora B相關(guān)核酸或蛋白質(zhì)的活性。例如，已知許多Aurora激酶B抑制劑抑制組蛋白H3磷酸化或細(xì)胞分裂中的至少一種。此外，已知許多Aurora激酶B抑制劑在至少一種細(xì)胞系統(tǒng)(例如急性髓性白血病細(xì)胞系、原代急性髓性白血病培養(yǎng)物等)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的方法對于任何已知或?qū)黹_發(fā)的Aurora激酶 B抑制劑都是有用的。Aurora激酶B抑制劑的例子是AZDl 152、ZM447439、VX-680/MK0457 禾口 Hesperadin0AZDl 152 也稱為 2_[[3_ ( {4_[ (5-{2-[ (3_ 氟苯基)氨基]_2_ 氧代乙基吡唑-3-基)氨基]-喹唑啉-7-基}氧)丙基](乙基)氨基]乙基二氫磷酸酯是吡唑并喹唑啉Aurora激酶抑制劑(AZD1152-#-羥基喹唑啉吡唑酰苯胺(HQPA))的藥物前體，并且在血漿中快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚?AZD1152-HQPA(參見，Mortlock，AA，等人，7； Med. Chem. , 50:2213-24 (2007))。AZD1152-HQPA是Aurora B的高度有效和有選擇性的抑制劑。ZM447439也稱為4_ (4- OV-苯甲酰氨基)苯胺基)_6_甲氧基_7_ (3- (1_嗎啉代)丙氧基)喹唑啉，是喹唑啉衍生物，抑制Aurora A和Aurora B。ZM447439的化學(xué)結(jié)構(gòu)在 Ditchfield，C.，等人，7； Cell Bio. , 161 (2) :267-280 (2003)和 Montembault，Ε.，等 k, Drugs of the Future，3Q (1) :1-9 (2005)中提供。VX-680/MK0457 是{4-[4- (4_ 甲基-哌嗪基)_6_ (5-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)_嘧啶-2-基硫烷基]-苯基}-酰胺的環(huán)丙烷羧酸，并且抑制Aurora A.Aurora B和 Aurora C。VX-680/MK0457 的化學(xué)結(jié)構(gòu)在Montembault，Ε.，等k，Drugs of the Future，3Q (1) :1-9 (2005)中提供。Hesperadin，吲哚滿酮，抑制 Aurora B。Hesperadin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)在 Hauf，S.，等人， J. Cell Bio.，161 (2):281-294 (2003)禾口 Montembault，E.，等k，Drugs of the Future, 30 (1) :1-9 (2005)中提供。b)基本上由具有％序列同一性的多核苷酸組成
“基本上由具有％序列同一性的多核苷酸組成”意指多核苷酸在長度中沒有相當(dāng)大不同，但在序列中可能相當(dāng)大地不同。因此，基本上由與100個核苷酸的已知序列“B”具有至少80%序列同一性的多核苷酸組成的多核苷酸“A”意指多核苷酸“A”約100個核苷酸 (nts)長，但最高達(dá)20個nts可以與“B”序列不同。正被討論的多核苷酸序列可以更長或更短，這是由于末端的修飾，例如1-15個核苷酸的添加，以產(chǎn)生特定類型的探針、引物和其他分子工具等，例如當(dāng)添加基本上非等同的序列以產(chǎn)生預(yù)期二級結(jié)構(gòu)時的情況。當(dāng)序列通過“基本上由……組成”修飾時，此種非等同核苷酸在序列同一性計算中不予以考慮。C)表達(dá)、反義抑制和共抑制
“表達(dá)”指功能終產(chǎn)物的產(chǎn)生。基因的表達(dá)涉及基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！胺戳x抑制”指能夠抑制靶蛋白質(zhì)表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生?！肮惨种啤敝改軌蛞种频韧蚧旧舷嗨频耐鈦砘騼?nèi)源基因表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國專利號 5，231，020)。d)分離的
如本文使用的，在核酸分子或多核苷酸的背景中的術(shù)語“分離的”指這樣的核酸分子或多核苷酸，其與核酸分子或多核苷酸的天然來源中存在的其他核酸分子或多核苷酸分離。 此外，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時，“分離的”核酸分子或多核苷酸例如cDNA分子可以基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。在一個方面，核酸分子或多核苷酸是分離的。e)基因
“基因”指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在編碼序列前(5’非編碼序列)和后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。f )天然基因和嵌合構(gòu)建體
“天然基因”指如在自然界中與其自身調(diào)節(jié)序列一起發(fā)現(xiàn)的基因。相比之下，“嵌合構(gòu)建體”指在自然界中正常未一起發(fā)現(xiàn)的核酸片段的組合。因此，嵌合構(gòu)建體可以包括衍生自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或衍生自相同來源但以與自然界中正常發(fā)現(xiàn)的那種不同的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。g)百分比(％ )核酸序列同一性
就核酸序列而言的“百分比(％)核酸序列同一性”定義為，在比對序列和若需要則引入缺口，以達(dá)到最大限度的百分比序列同一性后候選序列中與目的序列中的核苷酸等同的核苷酸百分比。為了測定％核酸序列同一性目的的比對可以以在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方式達(dá)到，例如使用可公開獲得的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR) 軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括達(dá)到在被比較的序列全長上的最大限度比對所需的任何算法。當(dāng)比對核苷酸序列時，對于、關(guān)于或針對給定核酸序列D的給定核酸序列C的％核酸序列同一性(其可以可替代地用短語表示為具有或包括對于、關(guān)于或針對給定核酸序列D 的特定％核酸序列同一性的給定核酸序列C)可以如下計算
%核酸序列同一性=W/Z*100 其中
W是通過序列比對程序或算法的C和D比對評分為等同匹配的核苷酸數(shù)目禾口
Z是D中的核苷酸總數(shù)目。當(dāng)核酸序列C的長度不等同于核酸序列D的長度時，C與D的％核酸序列同一性將不等同于D與C的％核酸序列同一性。h )聚合酶鏈反應(yīng)或PCR
“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”是用于合成大量特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列重復(fù)的循環(huán)組成(Perkin Elmer Cetus hstruments，Norwalk，CT)。一般地，使雙鏈 DNA 熱變性，與靶區(qū)段的3’邊界互補的2個引物在低溫退火，并且隨后在中間溫度延伸。一組這3個連續(xù)步驟被稱為循環(huán)。PCR是通過模板的反復(fù)復(fù)制，在短時間段內(nèi)用于將DNA擴增數(shù)百萬倍的強大技術(shù)。 ((Mullis, K.，等人，Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1:263-73 (1986))；歐洲專利申請?zhí)?0，424 ；歐洲專利申請?zhí)?4，796 ；歐洲專利申請?zhí)枺?，017，歐洲專利申請?zhí)?237，362 ；歐洲專利申請?zhí)?01，184，美國專利號4，683，202 ；美國專利號4，582，788 ；和美國專利號4，683，194)。該方法使用特定體外合成的寡核苷酸組以引發(fā)DNA合成。引物的設(shè)計取決于待分析的DNA序列。該技術(shù)通過在高溫使模板解鏈、允許引物與模板內(nèi)的互補序列退火，并且隨后用DNA聚合酶復(fù)制模板的許多循環(huán)(通常20-50個)執(zhí)行。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物可以通過在瓊脂糖凝膠中分離隨后為溴化乙錠染色和用UV透照顯現(xiàn)進行分析?？商娲兀派湫詃NIPs可以添加到PCR中，以將標(biāo)記摻入產(chǎn)物內(nèi)。在這種情況下，PCR的產(chǎn)物通過使凝膠暴露于χ射線片進行顯現(xiàn)。放射性標(biāo)記PCR產(chǎn)物的添加的優(yōu)點是可以定量個別擴增產(chǎn)物的水平。i)多核苷酸
“多核苷酸”是核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、修飾的RNA或DNA、或RNA或DNA 模擬物(例如PNAs)及其衍生物和其同源物的核酸聚合物。因此，多核苷酸包括由天然存在的核堿基、糖和共價核苷間(主鏈)鍵組成的聚合物，以及相似作用的具有非天然存在部分的聚合物。此種修飾或取代的核酸聚合物是本領(lǐng)域眾所周知的，并且被稱為“類似物”。寡核苷酸一般是約10到最高達(dá)約160或200個核苷酸的短多核苷酸。多核苷酸還包括與靶序列特異性雜交的引物，包括核酸序列的類似物和/或衍生物及其同源物。多核苷酸可以通過常規(guī)技術(shù)進行制備，例如使用商購可得設(shè)備的固相合成，例如 Bj/AApplied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA ；USA)> DuPont (Wilmington, DE ； USA)或Milligen (Bedford, MA ;USA)獲得的那種。修飾的多核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物還可以通過本領(lǐng)域已知的相似方法容易地制備(參見美國專利號4，948，882、 5，464，746 和 5，424，414)。j)多核苷酸類似物
如本文使用的，術(shù)語“多核苷酸類似物”指具有修飾的主鏈或非天然核苷間鍵的聚合物。修飾的主鏈包括保留主鏈中的磷原子的那些，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，以及不再具有磷原子的那些，例如通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的主鏈。修飾的核酸聚合物(類似物)可以包含一種或多種修飾的糖部分。其中核苷酸單位的糖和核苷間鍵由新基團替換的作為RNA或DNA模擬物的類似物也是有用的。在這些模擬物中，維持堿基單位用于與靶序列雜交。已顯示具有極佳雜交性質(zhì)的此種模擬物的例子是肽核酸(PNA)(參見Buchardt，0.，P. Nielsen，和R. Berg. 1992. Peptide Nucleic Acids) k)預(yù)定水平
如本文使用的，術(shù)語“預(yù)定水平” 一般指測定截止值，其用于通過針對預(yù)定水平比較測定結(jié)果來評估診斷結(jié)果，并且其中預(yù)定水平已經(jīng)與各種臨床參數(shù)關(guān)聯(lián)或相關(guān)(例如評估危險、疾病嚴(yán)重性、進展/非進展/改善，測定測試樣品的時期(age)，測定測試樣品(例如血清或血漿)是否發(fā)生溶血等)。本發(fā)明提供了示例性預(yù)定水平，并且描述了此種水平與關(guān)于如本文描述的示例性測定的臨床參數(shù)的初始關(guān)聯(lián)或聯(lián)系。然而，眾所周知截止值可以依賴于測定的性質(zhì)而改變。進一步完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員普通技術(shù)內(nèi)的是使本文的本發(fā)明適合于其他測定，以基于這個說明書獲得關(guān)于那些其他測定的測定特異性截止值。1)引物或探針
如本文使用的，“探針”或“引物”是長度至少8個核苷酸且與靶序列形成雜交體結(jié)構(gòu)的多核苷酸，這是由于探針或引物中的至少一個序列與靶區(qū)域中的序列的互補性。探針的多核苷酸區(qū)可以由DNA和/或RNA和/或合成核苷酸類似物組成。優(yōu)選地，探針不包含與在
14聚合酶鏈反應(yīng)過程中用于引發(fā)靶序列的一個或多個序列互補的序列。m)重組體
“重組體”指2個否則分離的序列區(qū)段的人工組合，例如通過化學(xué)合成或通過經(jīng)由基因工程技術(shù)操作核酸的分離的區(qū)段。η)特異性雜交
“特異性雜交”指核酸與第二種核酸可檢測且特異性結(jié)合的能力。在使通過非特異性核
酸的可檢測結(jié)合的可估計量降到最低的雜交和洗滌條件下，多核苷酸與靶核酸鏈特異性雜 、-父。O)嚴(yán)格性或嚴(yán)格條件
單鏈DNA與互補片段雜交的特異性由反應(yīng)條件的嚴(yán)格性決定。雜交嚴(yán)格性隨著形成 DNA雙鏈體的傾向降低而增加。在核酸雜交反應(yīng)中，可以選擇嚴(yán)格性以支持特異性雜交(高嚴(yán)格性)。較不特異的雜交(低嚴(yán)格性)可以用于鑒定相關(guān)但并非確切的DNA分子(同源但并非等同)或區(qū)段。DNA雙鏈體通過下述得到穩(wěn)定(1)互補堿基對數(shù)目，(2)堿基對類型，(3)反應(yīng)混合物的鹽濃度(離子強度)，(4)反應(yīng)溫度，和(5)降低DNA雙鏈體穩(wěn)定性的特定有機溶劑例如甲酰胺的存在。通常方法是改變溫度更高的相對穩(wěn)定導(dǎo)致更嚴(yán)格的反應(yīng)條件(參見 Ausubel, F. Μ. ，R. Brent, R. Ε. Kingston，等人 1987. Current Pro toco Is in Molecular Biology. John Wiley & Sons，New ^rk)，提供雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性的極佳解釋。在“嚴(yán)格條件”下的雜交意指其中彼此至少60%同源的核苷酸序列保持雜交的雜交規(guī)程。多核苷酸可以包括其他附加基團，例如肽(例如用于在體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)， 或促進跨越細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運的試劑。此外，寡核苷酸可以用雜交觸發(fā)的切割試劑(參見van der Krol ^K^Biotechniques. 6958-76 (1988)或嵌入齊[J(intercalculating agents) (Zon, G. , Pharm Res. 5:539-49 (1988))進行修飾。寡核苷酸可以與另一種分子綴合，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交觸發(fā)的切割試劑等。ρ)受試者或患者
如本文使用的，術(shù)語“受試者”和“患者”互換使用，不管受試者是否具有或目前經(jīng)歷任何形式的治療。如本文使用的，術(shù)語“受試者”指任何脊椎動物，包括但不限于哺乳動物(例如牛、豬、駱駝、美洲駝、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、犬、大鼠和小鼠、非人靈長類動物 (例如猴，例如食蟹猴、黑猩猩等)和人)。優(yōu)選地，受試者是人。受試者或患者可以是活的或死亡的。q)靶序列或靶核酸序列
“靶序列”或“靶核酸序列”意指包含例如基因或其互補體或片段的核酸序列，其使用多核苷酸引物或探針擴增、檢測或兩者。另外，雖然術(shù)語靶序列有時指雙鏈核酸序列；但靶序列還可以是單鏈的。在其中靶是雙鏈的情況下，多核苷酸引物序列優(yōu)選擴增靶序列的2條鏈?？梢赃x擇對于特定生物或多或少特異的靶序列。例如，靶序列可以對于生物的整個屬、 超過一個屬、物種或亞種、血清群(serogroup)、營養(yǎng)型、血清型、品系、分離物或其他亞型是特異的。r)測試樣品“測試樣品”意指得自受試者的樣品或生物學(xué)流體，其中樣品可以包含靶序列。測試樣品可以得自任何來源，例如組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道拭子、子宮頸拭子、泌尿生殖或肛門拭子、結(jié)膜拭子、眼睛晶狀體流體、腦脊髓液等。測試樣品可以(i)如得自來源那樣直接使用；或(ii)在預(yù)處理后使用，以修飾樣品的特征。因此，測試樣品可以在使用前進行預(yù)處理，通過例如由血液制備血漿或血清，破裂細(xì)胞或病毒顆粒，由固體材料制備液體，稀釋粘性流體，過濾液體，添加試劑，純化核酸等。S)治療
如本文使用的，術(shù)語“治療”指在(i)防止病理學(xué)狀況發(fā)生(例如預(yù)防)；(ii)抑制病理學(xué)狀況或阻止其發(fā)展；(iii)減輕病理學(xué)狀況和/或防止或減少與此種病理學(xué)狀況相關(guān)的一種或多種癥狀的嚴(yán)重性的努力中，給受試者施用一種或多種活性劑或化合物，不管項目 (i)到(iii)中的任何一項在受試者中是否是成功的。t)變體多核苷酸或變體核酸序列
“變體多核苷酸”或“變體核酸序列”意指與給定核酸序列具有至少約60%核酸序列同一性，更優(yōu)選至少約 61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、 73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%, 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 核酸序列同一性，且更加優(yōu)選至少約99%核酸序列同一性的多核苷酸。變體不包含天然核苷酸序列。一般地，變體多核苷酸長度至少約8個核苷酸，經(jīng)常長度至少約9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、35、40、45、50、55、60 個核苷酸， 或甚至長度約75-200個核苷酸或更多。核苷酸的范疇包括其中核酸分子已通過取代、化學(xué)、酶促或其他合適方法用除天然存在的核苷酸外的部分共價修飾的衍生物。B.多核苷酸測定
在本發(fā)明中有用的核酸測定法包括通過下述檢測拷貝數(shù)增益的存在或不存在(i )對于完整組織或細(xì)胞樣品的原位雜交測定，(ii)對于從組織樣品中提取的染色體DNA的微陣列雜交測定，和(iii)對于從組織樣品中提取的染色體DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其他擴增測定。還可以使用在這些形式中的任何一種中使用核酸的合成類似物例如肽核酸的測定。本發(fā)明的測定用于鑒定關(guān)于(i)ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii ) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益用于在預(yù)測治療應(yīng)答和用于監(jiān)控對于Aurora激酶B抑制劑療法的患者應(yīng)答中使用。對于應(yīng)答預(yù)測的測定可以在療法開始前運行，并且未顯示或展示顯示關(guān)于(i) ABCBl基因；(ii)ABCB4基因；或(iii) ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的患者對于接受Aurora激酶B抑制劑療法是合格的。關(guān)于(i) ABCBl基因；(ii) ABCB4 基因；或(iii)ABCBl基因和ABCB4基因的拷貝數(shù)增益還可以指示對于其他癌癥療法的抗性，例如化學(xué)療法或放射療法。對于監(jiān)控患者應(yīng)答，測定可以在療法起始時運行，以確立組織樣品中的生物標(biāo)記的基線水平，例如顯示樣品中的拷貝數(shù)增益的總細(xì)胞百分比或細(xì)胞數(shù)目。隨后取樣且測定相同組織，并且使生物標(biāo)記的水平與基線比較。當(dāng)水平保持相同或降低時，療法可能是有效的且可以繼續(xù)。當(dāng)發(fā)生超過基線水平的顯著增加時，患者可能不響應(yīng)或可能已發(fā)展對于繼續(xù)的Aurora激酶B抑制劑療法的抗性。
本發(fā)明的測定可以與靶向的癌癥療法一起使用，例如對于實體瘤(例如肉瘤或癌) 或血液學(xué)惡性腫瘤(例如影響血液、骨髓和淋巴結(jié)的癌癥)的靶向療法。本發(fā)明的測定可以對于實體瘤使用，所述實體瘤例如結(jié)腸直腸癌、胰癌、甲狀腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、 膽管癌、口癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌或乳腺癌。本發(fā)明的測定可以對于血液學(xué)惡性腫瘤使用，所述血液學(xué)惡性腫瘤例如急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病 (AML)、慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、費城染色體陽性的急性成淋巴細(xì)胞性白血病(Wi+ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。測定可以關(guān)于其中涉及 Aurora激酶B擴增或超表達(dá)的任何癌癥類型進行。本發(fā)明的測定對任何類型的測試樣品執(zhí)行，例如任何類型的患者組織樣品或其衍生物，包括外周血，腫瘤或可疑腫瘤組織(包括新鮮冷凍和固定的石蠟包埋的組織)，細(xì)胞分離物例如在血液樣品、淋巴結(jié)組織、骨髓和細(xì)針抽吸物中分離或鑒定的循環(huán)上皮細(xì)胞。本發(fā)明包括通過雜交測定檢測基因組生物標(biāo)記，其中使用基于可檢測標(biāo)記的核酸的探針，例如脫氧核糖核酸(DNA)探針或蛋白質(zhì)核酸(PNA)探針，或設(shè)計/選擇為與特定染色體靶雜交的未標(biāo)記的引物。未標(biāo)記的引物在擴增測定中使用，例如通過聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)，其中在引物結(jié)合后，聚合酶擴增靶核酸序列用于后續(xù)檢測。在PCR或其他擴增測定中使用的檢測探針優(yōu)選是熒光的，并且更加優(yōu)選地，在“實時PCR”中有用的檢測探針。熒光標(biāo)記對于在原位雜交中的使用也是優(yōu)選的，但還可以使用在雜交技術(shù)中常用的其他可檢測標(biāo)記，例如酶促、生色和同位素標(biāo)記。有用的探針標(biāo)記技術(shù)在文獻(xiàn)中描述(Fan，Y. -S. 2002. Molecular cytogenetics :protocols and applications. Humana Press，Totowa, N. J. xiv，第411頁，其內(nèi)容引入本文作為參考)。在通過微陣列分析檢測基因組生物標(biāo)記中，應(yīng)用這些探針標(biāo)記技術(shù)，以標(biāo)記從患者樣品中提取的染色體DNA，其隨后與微陣列雜交。關(guān)于人ABCBl基因的多核苷酸序列(SEQ ID N0:1 ；GenBank登記號NM_000927)顯示于表1中。
權(quán)利要求
1.一種對于用Aurora激酶B抑制劑的治療的合格性分類患者的方法，所述方法包括步驟a)提供來自患者的測試樣品；b)測定關(guān)于(1)在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因或(2)在染色體基因座7q21. 1 的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和c)基于關(guān)于(1)在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因或(2)在染色體基因座7q21. 1 的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在，將所述患者分類為對于接受用Aurora激酶B 抑制劑的治療是合格的。
2.一種監(jiān)控患有癌癥且用Aurora激酶B抑制劑治療的患者的方法，所述方法包括步驟a)提供來自患有癌癥且目前用至少一種Aurora激酶B抑制劑治療的患者的測試樣PBFI ；b)測定關(guān)于(1)在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因或(2)在染色體基因座7q21. 1 的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；c)針對基線水平或預(yù)定水平比較所述測試樣品中所述ABCBl基因或ABCB4基因的拷貝數(shù)；和d)基于步驟c)中的比較，決定所述患者是否應(yīng)繼續(xù)用Aurora激酶B抑制劑治療。
3.一種分類具有對于用Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥的患者的方法，所述方法包括步驟a)提供來自患者的測試樣品；b)測定關(guān)于(1)在染色體基因座7q21.1的ABCBl基因或(2)在染色體基因座7q21. 1 的ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；c)針對基線水平或預(yù)定水平比較所述測試樣品中關(guān)于所述ABCBl基因或ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在；和d)基于(i)在染色體基因座7q21. 1上所述ABCBl基因或ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在；和(ii)所述測試樣品中拷貝數(shù)增益是否高于基線水平或預(yù)定水平，將所述患者分類為具有對于Aurora激酶B抑制劑治療是抗性的癌癥。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述Aurora激酶B抑制劑是AZD1152、ZM447439、 VX-680/MK0457 或 Hersperadin。
5.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述測試樣品包括組織樣品。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述組織樣品包括外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、 薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、淋巴結(jié)樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品、石蠟包埋的組織樣品，或由外周血樣品、腫瘤組織或可疑腫瘤組織、薄層細(xì)胞學(xué)樣品、細(xì)針抽吸物樣品、骨髓樣品、尿樣品、腹水樣品、灌洗樣品、 食管刷洗樣品、膀胱或肺洗滌樣品、脊髓液樣品、腦液體樣品、導(dǎo)管抽吸物樣品、乳頭排出物樣品、胸膜積液樣品、新鮮冷凍組織樣品或石蠟包埋的組織樣品中的任何一種產(chǎn)生的提取物或加工的樣品。
7.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述測定步驟(b)通過原位雜交執(zhí)行。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述原位雜交用(a)熒光標(biāo)記的核酸探針、(b)至少2種核酸探針或(c )肽核酸探針執(zhí)行。
9.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述測定步驟(b)通過聚合酶鏈反應(yīng)或核酸微陣列測定執(zhí)行。
10.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸直腸癌或胰癌。
11.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述(a)ABCBl基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDRl多肽表達(dá)中的增加相關(guān)，或所述(b)ABCB4基因中拷貝數(shù)增益的存在與MDR3多肽表達(dá)中的增加相關(guān)。
12.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述患者還用化學(xué)療法、放射或其組合進行治療。
13.—種試劑盒，其包括(a)用于測定關(guān)于ABCBl基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑；(b)用于執(zhí)行所述測試的說明書。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中測定拷貝數(shù)增益的存在或不存在的所述試劑包括與 ABCBl基因的至少部分雜交的可檢測標(biāo)記的多核苷酸。
15.一種試劑盒，其包括(a)用于測定關(guān)于ABCB4基因的拷貝數(shù)增益的存在或不存在的試劑；(b)用于執(zhí)行所述測試的說明書。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中測定拷貝數(shù)增益的存在或不存在的所述試劑包括與 ABCB4基因的至少部分雜交的可檢測標(biāo)記的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定ABCB1基因、ABCB4基因或其組合中一種或多種拷貝數(shù)增益的存在或不存在，鑒定對于接受作為單一療法或作為組合療法的部分的Aurora激酶抑制劑療法合格的患者，并且監(jiān)控患者對于此種療法的應(yīng)答。
文檔編號C12Q1/68GK102365372SQ201080014811
公開日2012年2月29日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月31日
發(fā)明者塞米扎洛夫 D., 沙 J., 郭 J., 安德森 M. 申請人:雅培制藥有限公司