專(zhuān)利名稱(chēng)：新型除草劑抗性基因的制作方法
新型除草劑抗性基因
背景技術(shù)：
目前有許多類(lèi)型用于控制雜草的除草劑。一種非常流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了抗草甘膦的農(nóng)作物，例如玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、小麥、草皮(turf)和稻。所以，例如，可以對(duì)活躍生長(zhǎng)有草甘膦抗性大豆的田地進(jìn)行噴灑來(lái)控制雜草，而不會(huì)顯著破壞大豆植株。90年代中期，利用引入遺傳工程化的草甘膦耐受的農(nóng)作物(GTC)，農(nóng)業(yè)上種植者能夠利用簡(jiǎn)單、便利、靈活、廉價(jià)的工具來(lái)前所未有地控制廣譜的闊葉雜草和草本雜草。隨后，生產(chǎn)者很快采用了 GTC，并在許多情況下放棄了許多已經(jīng)接受的最好的農(nóng)藝學(xué)實(shí)踐， 例如輪作、輪作操作的除草劑模式(herbicide mode of action rotation)、罐混(tank mixing)、機(jī)械控制雜草與化學(xué)和培養(yǎng)控制雜草的結(jié)合。目前在美國(guó)和其他地區(qū)可商購(gòu)草甘膦耐受的大豆、棉花、玉米和油菜。紫花苜蓿是引入的第一個(gè)多年生GTC，增加了在數(shù)年時(shí)間內(nèi)對(duì)同樣的作物和土地重復(fù)使用草甘膦的機(jī)會(huì)。更多的GTC(例如小麥、稻、甜菜、草皮等)已準(zhǔn)備好介入未決的全球市場(chǎng)占有率。許多其他的草甘膦抗性物種在實(shí)驗(yàn)至開(kāi)發(fā)的階段(例如甘蔗、向日葵、 甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、西紅柿和煙草；像楊樹(shù)和楓香樹(shù)(sweetgum)這樣的林業(yè)物種；和像金盞花、矮牽牛和秋海棠這樣的園藝物種；參見(jiàn)“isb. vt. edu/cfdocs/ fieldtestsl.Cfm，2005”網(wǎng)站)。另外，最近這些年草甘膦的費(fèi)用急劇降低，以至于常規(guī)的除草程序很少能有效地與草甘膦GTC系統(tǒng)在價(jià)格和性能上面競(jìng)爭(zhēng)了。在栽培者面對(duì)草甘膦抗性的雜草或變化為更加難控制的雜草物種時(shí)，可以通過(guò)罐混或與可控制遺漏雜草的其他除草劑交替使用來(lái)彌補(bǔ)草甘膦的缺點(diǎn)。在許多情況下控制闊葉的其他雜草的一個(gè)慣用罐混物(tankmix)參與者是2，4-二氯苯氧基乙酸Q，4_D)。2， 4-D已經(jīng)在農(nóng)藝上應(yīng)用并在非作物情況下用于廣譜的闊葉雜草控制達(dá)60年。雖然已經(jīng)報(bào)道了許多的耐受物種的個(gè)別例子，但是2，4-D仍然是最廣泛使用的除草劑之一。2，4-D的進(jìn)一步應(yīng)用的一個(gè)限制是其對(duì)于雙子葉作物例如大豆或棉花的選擇性非常差，所以2，4-D通常不用于(而且一般不靠近)敏感的雙子葉作物。此外，由于可能發(fā)生的對(duì)禾本科作物造成傷害的這種性質(zhì)，從某種程度上限制了 2，4-D的應(yīng)用。2，4-D聯(lián)合草甘膦已經(jīng)用于在種植免耕法大豆和棉花之前提供更加穩(wěn)健的除草處理；但是，由于這些雙子葉物種對(duì)2，4-D的敏感性，這些除草處理必須在種植之前至少14-30天進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供對(duì)諸如2，4_D等植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑有抵抗力的新型植物。在本發(fā)明一些發(fā)明中，此處公開(kāi)的植物還對(duì)其他除草劑有抵抗力。在本發(fā)明的這些方面，也可向植物引入異源的草甘膦_、ALS-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基鏈烷酸酯_、HPPD-、PPO-和/或草銨膦抗性基因，以提供對(duì)多種除草劑的耐受性。本發(fā)明的多個(gè)其他方面提供編碼能夠用于失活植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑的甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸和多肽序列。序列簡(jiǎn)要說(shuō)明
SEQ ID NO 1是編碼甲基轉(zhuǎn)移酶Pt JBMT3的核酸序列。SEQ ID NO :2是SEQ ID NO 1編碼的翻譯蛋白質(zhì)序列。表格簡(jiǎn)要說(shuō)明表1 示例性可商購(gòu)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑。表2 用植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑進(jìn)行的PtJBMT和PtJBMTm3相對(duì)活性檢測(cè)。表3:氨基酸取代表。


圖1 :PtJBMTm3對(duì)底物的示例性甲基化。圖2 示例性植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑和PtJBMTm3對(duì)除草劑底物的相對(duì)活性(相對(duì)于對(duì)底物2，4-D的ptJBMTm3活性)。圖3 :PtJBMTm3的序列(SEQ ID NO :1)?；钚晕稽c(diǎn)殘基用黑體并雙下劃線表示。圖4 :PtJBMTm3的其他可能除草劑底物。圖5 :W0/2009/046090中公開(kāi)的示例性植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑。該結(jié)構(gòu)包括的多種取代基和化合物如下A)A代表N或C ;R1代表C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C4烷硫烷基、C2-C4烯基、 C2-C4鹵代烯基、C2-C4烷氧基烯基、C2-C4烷硫基烯基(thioalkylalkenyl)、C2-C4炔基或C2-C4 鹵代炔基、甲?；2-C4烷基羰基、C2-C4鹵代烷基羰基；R2代表C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C6烯基、C2-C6鹵代烯基或其中
Z1 W1代表H或鹵素；
Y
W1
X1
X1代表H、鹵素、硝基、氰基、甲?；1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C4烷氧基烷基、C2-C6烷基羰基、C1-C6烷基硫、C1-C6烷基亞磺?；?、C1-C6烷基磺?；2-C4烯氧基、C2-C4炔氧基、C2-C4烯硫基、C2-C4炔硫基、C1-C6商代烷基、C2-C6商代烯基、 C2-C6鹵代炔基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C4鹵代烷氧基烷基、C2-C6鹵代烷基羰基、C1-C6鹵代烷硫基、C1-C6鹵代烷基亞磺酰基、C1-C6鹵代烷基磺酰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、C2-C4鹵代烯氧基、C2-C4鹵代炔氧基、C2-C4鹵代烯硫基、C2-C4鹵代炔硫基、-C (O)OR7、-C (O)M6R7、-C&N0 R7、-NR6R7、-NR6OR7、-NR6SO2R7, -NR6C (0) R7、-NR6C (0) OR7、-NR6C (0) NR6R7 或-NCIi6M6R7 ；
Y1代表H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6 烯基或C2-C6鹵代烯基，或者，當(dāng)&和Y1 —起時(shí)代表-O(CH2)nCH2-或-O(CH2)nO-其中η = 1 或2 ；且
6
乙代表H或鹵素；R3和R4獨(dú)立地表示Hj1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、羥基、C1-C6烷氧基、氨基-C1-C6?；1-C6烷氧羰基(carboalkoxy)、C1-C6烷基氨甲?；?、C1-C6烷基磺?；1-C6三烷基甲硅烷基或C1-C6 二烷基膦?；?，或者民和R4與N —起表示5-或6-元飽和環(huán)；且&代表H或鹵素； 胺；D)如A或B或C所述的化合物，其中隊(duì)為C1-C2烷基、C1-C2鹵代烷基、C2-C3烯基或C2-C3鹵代烯基；
E)如D所述的化合物，其中R1為乙烯基；
F)如A、B、C、D或E中任一個(gè)所述的化合物，其中&為環(huán)丙基；
G)如A、B、C、D或E中任一個(gè)所述的化合物，其中&為
R6表示H、C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；且 R7表示C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基； 和羧酸基團(tuán)的可農(nóng)用衍生物；
B)如A)所述的化合物，其中民和R4獨(dú)立地代表H或C1-C6烷基；
C)如A或B所述的化合物，其中所述羧酸基團(tuán)的可農(nóng)用衍生物為可農(nóng)用鹽、酯和酰
其中
W1代表H或鹵素
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述蛋白質(zhì)，而且所述多核苷酸在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1或其完全互補(bǔ)物雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸的表達(dá)誘導(dǎo)所述細(xì)胞對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑抵抗或耐受。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO :2。
4.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞進(jìn)一步包括第二個(gè)異源基因， 以使得所述植物細(xì)胞對(duì)第二種除草劑耐受。
5.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為雙子葉細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為單子葉細(xì)胞。
7.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括多個(gè)如權(quán)利要求1、2、3或4所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸的表達(dá)賦予所述植物對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑的耐受性。
8.—種控制雜草的方法，所述方法包括向包含植物和雜草的區(qū)域過(guò)度噴灑/施用包括植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑的組合物，所述植物包括多個(gè)如權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述植物為大豆、玉米、擬南芥、煙草、棉花、油菜、 稻、小麥、草皮、紫花苜蓿、三葉草、牧場(chǎng)草、水果植物、蔬菜或觀賞性植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述植物進(jìn)一步包括草甘膦抗性基因，而且所述方法進(jìn)一步包括向所述植物和所述雜草施用草甘膦。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，所述植物進(jìn)一步包括第三種除草劑抗性基因，而且所述方法進(jìn)一步包括向所述植物和所述雜草施用第三種除草劑。
12.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括編碼包括SEQ ID NO :2的甲基轉(zhuǎn)移酶的異源多核苷酸，所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑有抵抗力。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包括至少一種另外的除草劑抗性基因。
14.如權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物進(jìn)一步包括昆蟲(chóng)抗性基因，所述昆蟲(chóng)抗性基因來(lái)自選自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、光桿狀菌屬 (Photorhabdus)禾口致病桿菌屬(Xenorhabdus)的有機(jī)體。
15.如權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物進(jìn)一步包括農(nóng)藝學(xué)特征基因，所述農(nóng)藝學(xué)特征選自真菌抗性、脅迫耐受性、提高的產(chǎn)量、改善的油屬性、改善的纖維質(zhì)量、病毒抗性、延遲成熟、耐寒性和耐鹽性。
16.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物包括源自選自下組來(lái)源的生物殺蟲(chóng)劑日本甲蟲(chóng)芽孢桿菌(Bacillus popilliae)、球形芽孢桿菌(B. sphaericus)、 蘇云金芽孢桿菌aizawai亞禾中(B. thuringiensis subsp. Aizawai)、蘇云金芽孢桿菌 Kurstaki 亞禾中(B. thuringiensis subsp. Kurstaki)、蘇云金芽抱桿菌 Tenebrionis 亞禾中 (B. thuringiensis subsp. Tenebrionis)、 求 包白iBlif (Beauveria bassiana)、蘋(píng)果産娥顆粒體病毒(Cydia pomonella granulosis virus)、道格拉斯冷杉草叢蛾 NPV(Douglas fir tussock moth NPV)、舞毒蛾 NPV(gypsy moth NPV)、谷實(shí)夜蛾 NPV(Helicoverpa zea NPV)立(Indian meal moth granulosis virus) M^SM (Metarhizium anisopliae)、幢蟲(chóng)微抱子蟲(chóng)(Nosema locustae)、擬青霉(Paecilomyces. fumosoroseus) >淡紫擬青霉菌(p. Iilacinus)、發(fā)光桿菌(Photorhabdus luminescens)、甜菜夜蛾 NPV(Spodoptera exigua NPV)、胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑制因子(trypsin modulating oostatic factor)、嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)禾口伯氏致病桿菌(X. bovienii)。
17.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物包含整合有選自CrylAb、CrylAc、 CrylF、Cry ΙΑ. 105、Cry2Ab2、Cry3A、mir Cry3A、Cry3BbU Cry34, Cry35 和 VIP3A 的保護(hù)性殺蟲(chóng)劑的植物。
18.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
19.包括權(quán)利要求1-6所述的植物細(xì)胞的種子。
20.從權(quán)利要求19的種子生長(zhǎng)的植物。
21.如權(quán)利要求12所述的植物的可再生部分、后代或無(wú)性繁殖體。
22.一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，包括將多個(gè)植物細(xì)胞用編碼包含SEQ ID NO 2 的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化，將所述細(xì)胞在包含一定濃度的植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑的組合物中生長(zhǎng)，所述濃度的植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑允許表達(dá)所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)，而殺死或抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法用于選擇轉(zhuǎn)化的植物。
24.一種控制場(chǎng)地中雜草的方法，包括在場(chǎng)地中種植至少一種轉(zhuǎn)基因植物的種子，所述種子包含編碼包含SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸，并向所述場(chǎng)地的至少部分施加包含植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑的組合物。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物對(duì)第二除草劑具有抵抗力，所述第二除草劑選自草甘膦、草銨膦、咪草煙、氯磺隆、麥草畏、甲基磺草酮、異噁氟草和氟丙嘧草酯。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、 暖季和冷季型草坪草、燕麥、高粱和牧場(chǎng)草。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述第一除草劑為植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑，而且所述植物為雙子葉植物。
29.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物為選自棉花、煙草、油菜和大豆的雙子葉植物。
30.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述方法包括施加第二除草劑，而且所述植物對(duì)所述第二除草劑具有抵抗力。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑和第二除草劑被依次施用。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑和第二除草劑被同時(shí)施用。
33.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述植物對(duì)草甘膦具有抵抗力。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述草甘膦抗性是由編碼EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)或GAT的多核苷酸所賦予的。
35.一種物質(zhì)組合物，包括a)編碼包含SEQ ID NO 2的多肽或編碼SEQ ID NO 2的多肽片段的多核苷酸序列，所述多肽或片段具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑抗性；b)與SEQID NO 1有至少70%同一性而且編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑抗性的多肽的多核苷酸序列；c)多核苷酸序列，包括(a)或(b)中所述的多核苷酸序列的至少8個(gè)連續(xù)核苷酸；d)與(a)、(b)或(c)中所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；e)在低、中或高嚴(yán)緊條件下與(a)、(b)、(c)或(d)中所述的多核苷酸序列雜交的多核苷酸；f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所述的多核苷酸序列的基因構(gòu)建體；g)包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中所述的多核苷酸或基因構(gòu)建體的載體；h)包括如(g)中所述的載體、(f)中所述的基因構(gòu)建體或(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一個(gè)所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞；i)分離的多肽，所述多肽包括SEQID NO :2或具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和/或能夠賦予植物對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑抗性的SEQ ID NO 2的片段。
36.一種分離的載體，包括有效連接到編碼SEQ ID NO :2或具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SEQ ID NO :2片段的多核苷酸的啟動(dòng)子。
37.如權(quán)利要求36所述的載體，其中所述啟動(dòng)子為植物啟動(dòng)子。
38.如權(quán)利要求36所述的載體，包括選自木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、玄參花葉病毒啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、菜豆球蛋白啟動(dòng)子、擬南芥泛素10啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子、擬南芥Act2啟動(dòng)子、擬南芥泛素11啟動(dòng)子和擬南芥泛素3啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
39.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、植物、可再生植物部分、后代、無(wú)性繁殖體、植物細(xì)胞或多肽，其中所述植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑如表1或表2或圖2或圖4或圖5或圖6中所述。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的新型多核苷酸和多肽。本發(fā)明提供了表達(dá)此處公開(kāi)的甲基轉(zhuǎn)移酶并對(duì)植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑有抵抗力的新型植物。本發(fā)明還提供了已經(jīng)轉(zhuǎn)化了一種或多種其他除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物，從而使得該植物能夠耐受植物生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑和一種或多種其他除草劑的施用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102365016SQ201080015508
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者G·R·阿梅爾, 趙楠, 陳 峰 申請(qǐng)人:田納西大學(xué)研究基金會(huì)