專利名稱：新型溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶。
背景技術(shù)：
高不飽和脂肪酸的牛物合成脂肪酸是構(gòu)成磷脂質(zhì)、三酰基甘油等脂質(zhì)的重要成分，含有2個以上不飽和鍵的脂肪酸總稱為高不飽和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已報道了各種生理活性(非專利文獻1)。雖然期待該高不飽和脂肪酸在各種領(lǐng)域中的應(yīng)用，其中也包括了在動物體內(nèi)不能合成的物質(zhì)。因此，開發(fā)出了通過培養(yǎng)各種微生物來獲得高不飽和脂肪酸的方法。并且，也進行了用植物生產(chǎn)高不飽和脂肪酸的嘗試。在這種情況下，已知高不飽和脂肪酸例如作為三酰基甘油等儲存脂質(zhì)的構(gòu)成成分，可在微生物的菌體內(nèi)或植物種子中積累?；ㄉ南┧崾歉卟伙柡椭舅嶂械囊环N，其作為形成前列腺素、白三烯等的中間代謝物受到關(guān)注，已進行了大量將其應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥品的原料的嘗試。進而因為花生四烯酸在母乳中含有，對嬰兒的發(fā)育，特別是胎兒的身高、腦的發(fā)育很重要，所以作為嬰兒發(fā)育的必要成分，從營養(yǎng)學的觀點來看與DHA(二十二碳六烯酸)共同受到關(guān)注?；ㄉ南┧嵊脠D1所示的路徑進行生物合成。具體來說，由通過新型脂肪酸合成而生成的棕櫚酸經(jīng)過數(shù)次鏈延長反應(yīng)和去飽和反應(yīng)而生成花生四烯酸。已知在該路徑中， 鏈延長酶及Δ 9去飽和酶對?；o酶A進行作用。此外，Δ 12去飽和酶、Δ 6去飽和酶、 Δ5去飽和酶對卵磷脂等磷脂質(zhì)的酰基進行作用(非專利文獻幻。因此，在花生四烯酸等的PUFA的生物合成中，?；仨毧稍邗；o酶A與磷脂質(zhì)之間轉(zhuǎn)移。并不限于PUFA的生物合成，將在生物合成磷脂質(zhì)后僅改變脂肪酸稱為磷脂質(zhì)的“改制(remodeling) ”，已知溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(以下記為“LPLAT”)參與了該反應(yīng)(非專利文獻3)。三?；视偷呐Ｎ锖铣勺鳛閮Υ嬷|(zhì)的三?；视驮谏矬w內(nèi)如下述方式合成。即甘油-3-磷酸在甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(以下有時記為“GPAT”)的作用下，1位(α位)的羥基發(fā)生酰化從而生成溶血磷脂酸(以下有時記為“LPA”)。LPA是僅具有1個?；娜苎字|(zhì)，其被溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(以下有時記為“LPAAT”)?；瘡亩闪字?以下有時記為 “ΡΑ”)。該PA被磷脂酸磷酸酯酶脫磷酸化生成二?；视?，該二?；视捅欢；视王；D(zhuǎn)移酶(以下有時記為“DGAT”)?；扇；视?。此外，已知?；o酶A 膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(以下有時記為“ACAT”)、溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶(以下有時記為“LPCAT”)等間接參與三?；视偷纳锖铣?。磷脂質(zhì)的牛物合成如上所述在LPAAT的作用下由LPA生成的PA成為各種磷脂質(zhì)生物合成的前體。 例如由PA可以生物合成磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酰甘油(PG)等重要的磷脂質(zhì)。PA不僅是這樣生物合成脂質(zhì)的中間體，而且是具有細胞增殖、血小板凝聚效果、平滑肌收縮效果、促進癌浸潤效果等非常多的生物學、藥理學的作用的脂質(zhì)性細胞內(nèi)及細胞間的介質(zhì)。溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶如上所述，認為LPLAT參與PUFA的生物合成。該LPLAT是具有將?；鶎肴苎字|(zhì)上的活性的酶的總稱，根據(jù)對于底物的特異性的不同，也就是說根據(jù)作為底物的溶血磷脂質(zhì)的分子種類的不同，存在各種稱呼的LPLAT。其中1個是以LPA為底物的參與三?；视汀⒘字|(zhì)的合成的LPAAT。LPLAT所作用的溶血磷脂質(zhì)中此外還包括溶血卵磷脂(LPC)、 溶血磷脂酰絲氨酸(LPQ、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)等。因此，從各種酶所作用的磷脂質(zhì)的分子種類的不同來看，稱為LPAAT、LPCAT、溶血磷脂酰絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶(LPSAT)、溶血磷脂酰肌醇?；D(zhuǎn)移酶(LPIAT)等。有時各種酶對1種溶血磷脂質(zhì)進行特異性作用，但有時也對多種特異性溶血磷脂質(zhì)進行作用。例如在被稱為LPAAT的LPLAT 中，不僅對LPA，也包括對LPC、LPE等進行作用的酶。歹丨臘觀溶血LPLAT被分類為甘油磷脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶。從氨基酸序列的比對來看，認為該甘油磷脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶分類為LPAAT家族、MBOAT (膜結(jié)合0-?；D(zhuǎn)移酶)家族及DGAT2家族這3 個組(非專利文獻5)。屬于LPAAT家族的酶的特征在于，共同具有膜結(jié)合區(qū)域，序列上有保守基序(LPAAT基序)。屬于LPAAT家族的酶中包括LPAAT、GPAT等。MBOAT家族中所包含的酶的特征在于，共同具有膜結(jié)合區(qū)域。已知在MBOAT家族中，除LPLAT之外還包括DGAT、 ACAT等。認為在動物等體內(nèi)屬于MBOAT家族的幾種酶是負責對膜磷脂質(zhì)生物合成來說非常重要的改制反應(yīng)的酶。關(guān)于LPLAT，已在細菌、酵母等單細胞生物至哺乳動物等高等生物的種類廣泛的生物中進行了報道。在菌類的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作為膜結(jié)合型的 LPLAT 基因，已知有 SLCl (YDL052C)和 SLC4 (Y0R175C)(有時稱為“ALE1 ” 或“LPT1 ”)(非專利文獻5)。在動物體內(nèi)存在有多種LPLAT同源物，已知有在一次(de novo)合成甘油三酯體系中負責對LPA作用從而生成PA的反應(yīng)的酶、對磷脂質(zhì)的改制發(fā)揮作用的酶(非專利文獻6) ο在作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下有時記為 "M. alpina")中得到了 4種LPLAT，這些均屬于LPAAT家族(專利文獻1 3)。但是尚未報道從M. alpina中得到了屬于MBOAT家族的LPLAT。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1國際公報W02004/087902號專利文獻2美國專利申請公開公報US2006/0094090號專利文獻3國際公報W02008/146745號非專利文獻非專利文獻1 Lipids, 39,1147(2004)非專利文獻2 J. B. C. ,278(37) ,35115-35126, (2003)非專利文獻3 J. B. C.，276 (29)，26745-26752, (2001)非專利文獻4 Proc. Nath, Aca，Sci.，105 (8)，2830-2835, (2008)
非專利文獻5J. B. C.，282 (42)，30845-30855，(2007)非專利文獻6J. B. C.，284 (1)，1-5, (2009)非專利文獻7Trends Biochem. Sci. 25，111-112，(2000)非專利文獻8Journal of lipid reserach 2009 R80035 JLR200vl

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，在花生四烯酸等PUFA的生物合成中磷脂質(zhì)的改制是必需的，認為 LPLAT參與該反應(yīng)。但是存在對于目前為止所知的LPAAT同源物，即使導入宿主并進行表達，也不能使總脂肪酸中的PUFA的比率充分提高的課題。因此，需要鑒定出導入宿主內(nèi)進行表達時能夠使宿主的總脂肪酸中的PUFA的比率充分提高的新型核酸及蛋白質(zhì)。此外，需要鑒定出可生產(chǎn)出利用價值高、脂肪酸的含量高的油脂的核酸及蛋白質(zhì)，利用這些核酸及蛋白質(zhì)來開發(fā)可生產(chǎn)出有用脂肪酸或者可提高有用脂肪酸的含量的方法。本發(fā)明的目的是提供以下蛋白質(zhì)及核酸，S卩通過在宿主細胞內(nèi)表達，或?qū)λ拗鞯闹|(zhì)代謝產(chǎn)生影響，或使目標脂肪酸的含量增加，從而可生產(chǎn)出有用的油脂的蛋白質(zhì)及核酸在花生四烯酸等PUFA的生物合成中，磷脂質(zhì)的改制是必需的。脂質(zhì)生產(chǎn)菌 M. alpina雖然可大量蓄積花生四烯酸等有用的PUFA，但如在動物等體內(nèi)報道的參與脂質(zhì)改制的屬于MBOAT家族的?；D(zhuǎn)移酶仍未從Ealpina中得到。本發(fā)明者對這一點進行關(guān)注，為了解決上述課題進行了精心研究，從M. alpina中獲得了編碼屬于MBOAT家族的酶的 cDNA，進而將得到的cDNA導入酵母等具有高增殖能力的宿主細胞內(nèi)以試驗產(chǎn)生脂肪酸組合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可生成與將含有編碼從M. alpina中得到的已知LPAAT的核酸的載體導入的宿主所產(chǎn)生的脂肪酸組合物相比不同的脂肪酸組合物、特別是花生四烯酸比率高的脂肪酸組合物。由此本發(fā)明者成功地進行了與已知LPAAT不同的新型LPLAT相關(guān)的基因的克隆， 于是完成了本發(fā)明。即本發(fā)明如下所述。(1) 一種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。(2)根據(jù)⑴所述的核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中的任一項，(a)核酸，
8其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在 2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。(3) 一種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列， 即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。(4)根據(jù)(3)所述的核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中的任一項，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列， 即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。(5)根據(jù)⑴ (4)中任一項所述的核酸，其特征在于，編碼的蛋白質(zhì)屬于膜結(jié)合性0-?；D(zhuǎn)移酶家族。(6) 一種核酸，其特征在于，為以下(a) (d)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有序列號1或6所示的堿基序列或其部分序列，(b)核酸，其含有編碼由序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列或其部分序列，(c)核酸，其含有序列號4或9所示的堿基序列或其部分序列，(d)核酸，其含有序列號5或10所示的堿基序列或其部分序列。(7) 一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性。(8)根據(jù)(7)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中的任一項，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性。(9) 一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。(10)根據(jù)(9)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中的任一項，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。(11)根據(jù)(7) (10)中任一項所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，屬于膜結(jié)合性0-?；D(zhuǎn)移酶家族。(12) 一種蛋白質(zhì)，其特征在于，由序列號2或7所示的氨基酸序列組成。(13) 一種重組載體，其特征在于，含有(1) (6)中任一項所述的核酸。(14) 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，被(1 所述的重組載體轉(zhuǎn)化。(15)脂肪酸組合物，其為培養(yǎng)(14)所述的轉(zhuǎn)化體而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，該脂肪酸組合物中的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比培養(yǎng)作為非轉(zhuǎn)化體的宿主而得到的脂肪酸組合物中的花生四烯酸的比率高。(16)脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從培養(yǎng)(14)所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取(1 所述的脂肪酸組合物。(17) 一種食品，其特征在于，含有(1 所述的脂肪酸組合物。(18) 一種方法，其特征在于，使用(1 所述的重組載體，使導入了該載體的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未導入該載體的宿主的脂肪酸組成中的比率提高。(19) 一種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且參與由18:3(n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n-6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA 向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n-6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL 轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成、且參與由18:3 (n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向 DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼參與由18:3(n-6)-PL向 18:3(n-6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列。(20) 一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且參與由18:3(n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向 DGLA-PL 轉(zhuǎn)化，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n_6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的LPLAT，因為能夠使花生四烯酸等有用的脂肪酸、儲存脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高，所以優(yōu)選作為可提高微生物、植物中的高不飽和脂肪酸的生產(chǎn)率的酶。因此，因為能夠提供具有所期望特性、效果的脂質(zhì)，所以作為可應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品、肥皂等的酶而有用。


圖1為表示花生四烯酸的生物合成路徑的模式圖。此外，圖1中PL表示磷脂質(zhì)、 CoA表示輔酶A (coenzyme A)、DS表示去飽和酶(脂肪酸去飽和酶)、GLELO表示脂肪酸鏈延長酶、18:0-表示硬脂酰基、18:1-表示油?；?、18:2-表示亞油酰基、18:3(n-6)-表示 Y -亞麻?；?、DGLA-表示二高-Y -亞麻?；RA-表示花生四烯?；D2表示來自M. alpinalS-4株的LPLAT5的cDNA全長序列(序列號4)及由其導出的氨基酸序列(序列號2)。圖3表示來自M. alpinalS-4株的LPLAT6的cDNA全長序列(序列號9)及由其導出的氨基酸序列(序列號7)。圖4A為來自M. alpinalS-4株的LPLAT5的基因組序列(序列號5)與ORF的序列 (序列號1)的序列比對圖。圖4B為來自M. alpinalS-4株的LPLAT5的基因組序列(序列號5)與ORF的序列 (序列號1)的序列比對圖。圖4C為來自M. alpinalS-4株的LPLAT5的基因組序列(序列號5)與ORF的序列 (序列號1)的序列比對圖。圖5A為來自M. alpinalS-4株的LPLAT6的基因組序列(序列號10)與ORF的序列(序列號6)的序列比對圖。圖5B為來自M. alpinalS-4株的LPLAT6的基因組序列(序列號10)與ORF的序列(序列號6)的序列比對圖。圖5C為來自M. alpinalS-4株的LPLAT6的基因組序列(序列號10)與ORF的序列(序列號6)的序列比對圖。圖6為表示在M. alpina中抑制LPLAT6或Δ 5脂肪酸去飽和酶表達時菌體內(nèi)高不飽和脂肪酸組成比的坐標圖。圖6中GLA表示Y-亞麻酸，DGLA表示二高γ-亞麻酸，ARA 表示花生四烯酸。圖7為表示在Μ. alpina中抑制LPLAT6或Δ 5脂肪酸去飽和酶表達時三?；视徒M分中的高不飽和脂肪酸組成比的坐標圖。圖7中GLA表示γ -亞麻酸，DGLA表示二高 Y -亞麻酸，ARA表示花生四烯酸。圖8為表示在M. alpina中抑制LPLAT6或Δ 5脂肪酸去飽和酶表達時磷脂質(zhì)組分中的高不飽和脂肪酸組成比的坐標圖。圖8中GLA表示γ -亞麻酸，DGLA表示二高Y -亞麻酸，ARA表示花生四烯酸。
具體實施例方式本發(fā)明涉及來自森田屬(Mortierella)的新型溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(“LPLAT”)， 其特征在于，在花生四烯酸的生物合成過程中，使?；邗；o酶A與磷脂質(zhì)之間轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可對溶血磷脂質(zhì)產(chǎn)生作用。?；w通常為?；o酶Α，但并不限于此。以下對本發(fā)明的實施方式進行具體說明。^mmmmMmmmummm被本發(fā)明的核酸編碼的溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(LPLAT)，作為其典型例子，包括 LPLAT5及6。LPLAT5及6如以下實施例中的說明，可在宿主中產(chǎn)生具有如下特征的組成的脂肪酸組合物，即與使公知的來自Μ. alpina的LPAAT表達的宿主所產(chǎn)生的脂肪酸組合物不同、花生四烯酸的比率高的特征。因此，本發(fā)明的LPLAT，優(yōu)選與公知的來自Malpina的 LPAAT相比花生四烯酸產(chǎn)生效率極高。本發(fā)明的編碼LPLAT5及LPLAT6的核酸的cDNA、CDS、ORF及氨基酸序列的對應(yīng)關(guān)系已整理并記載于以下表1中。
權(quán)利要求
1.一種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中的任一項，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在 2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。
3.—種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中的任一項，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在 2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，S卩能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性；(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且含有編碼具有以下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，即能夠使被含有所述核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的核酸，其特征在于，編碼的蛋白質(zhì)屬于膜結(jié)合性 0-?；D(zhuǎn)移酶家族。
6.一種核酸，其特征在于，為以下(a) (d)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有序列號1或6所示的堿基序列或其部分序列，(b)核酸，其含有編碼由序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列或其部分序列，(c)核酸，其含有序列號4或9所示的堿基序列或其部分序列，(d)核酸，其含有序列號5或10所示的堿基序列或其部分序列。
7.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中的任一項，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶活性。
9.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中的任一項，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1 50個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有能夠使被含有編碼所述氨基酸序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主的脂肪酸組成中的比率提高的活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求7 10中任一項所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，屬于膜結(jié)合性0-?；D(zhuǎn)移酶家族。
12.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，由序列號2或7所示的氨基酸序列組成。
13.—種重組載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1 6中任一項所述的核酸。
14.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，被權(quán)利要求13所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
15.脂肪酸組合物，其為培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化體而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，該脂肪酸組合物中的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比培養(yǎng)作為非轉(zhuǎn)化體的宿主而得到的脂肪酸組合物中的花生四烯酸的比率高。
16.脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取權(quán)利要求15所述的脂肪酸組合物。
17.一種食品，其特征在于，含有權(quán)利要求15所述的脂肪酸組合物。
18.一種方法，其特征在于，使用權(quán)利要求13所述的重組載體，使導入了該載體的宿主的脂肪酸組成中的花生四烯酸的比率比未導入該載體的宿主的脂肪酸組成中的比率提高。
19.一種核酸，其特征在于，為以下(a) (e)中任一項所述的核酸，(a)核酸，其含有編碼由在序列號2或7所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成、且參與由18:3(n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及 /或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(b)核酸，其與由序列號1或6所組成的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼參與由18:3(n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向 DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(c)核酸，其含有與序列號1或6所組成的堿基序列有80%以上同一性的堿基序列，且含有編碼參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n_6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(d)核酸，其含有編碼由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成、且參與由18:3 (n-6)-PL向18 3 (n_6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向 DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列，(e)核酸，其與由編碼序列號2或7所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補堿基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且含有編碼參與由18:3(n-6)-PL向 18:3 (n-6)-CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的堿基序列。
20.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，為以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(zhì)，(a)蛋白質(zhì)，其由在序列號2或7中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加后的氨基酸序列組成，且參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n-6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL 轉(zhuǎn)化，(b)蛋白質(zhì)，其由與序列號2或7所組成的氨基酸序列有80%以上同一性的氨基酸序列組成，且參與由18 3 (n-6) -PL向18 3 (n-6) -CoA轉(zhuǎn)化及/或由DGLA-CoA向DGLA-PL轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明提供新型溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的上述課題通過本發(fā)明的序列號1及6的堿基序列以及序列號2及7的氨基酸序列來解決。
文檔編號C12N1/21GK102388137SQ20108001594
公開日2012年3月21日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者落合美佐 申請人:三得利控股株式會社