專利名稱：用于冷凍干燥乳酸菌的冷凍保護劑的制作方法
技術領域：
該項發(fā)明所涉及的領域是生產凍干細菌，特別是乳酸菌。更具體地，本發(fā)明涉及冷凍保護劑的新型組合的用途，其用于增加經冷凍干燥后的細菌的存活力、改善凍干的塊的質感以易于研磨，以及改善冷凍干燥的細菌在不同溫度條件下的長期穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及此類冷凍干燥的細菌，其用于食品工業(yè)或用于人類或動物的健康應用。更具體地，本發(fā)明涉及重組細菌的提高的存活力和長期貯存能力，所述重組細菌能表達異源蛋白或肽，并以治療或疫苗接種的目的向人類或動物施用。
背景技術：
乳酸菌(LAB)是一組在分類學上多樣的革蘭氏陽性細菌，它們能夠將可發(fā)酵的碳水化合物主要轉換成乳酸，從而在該過程中酸化生長培養(yǎng)基。通常，乳酸菌(LAB)種類在食品工業(yè)中的用途最為知名，其主要是用于制備發(fā)酵食物諸如乳制品和某些肉類。乳制品發(fā)酵工業(yè)的商業(yè)重要性涵蓋了例如奶酪、酸乳酪和酸奶油的生產，這些都是世界公認的。在過去的幾十年里，人們對乳酸菌(LAB)的興趣已顯著提高。特定乳酸菌(LAB) 菌株能影響腸道生理的這一事實已廣泛受到認同。人們對于乳酸菌用作異源蛋白的生產宿主，并最終用作生物活性分子的就地生產和遞送系統(tǒng)的興趣日益增加(見下文)。目前，研究人員傾注了大量的精力來研究基因改造的(GM)乳酸菌物種用作局部、 粘膜給藥的生物藥物(包括細胞因子、抗體片段、生長因子、激素和神經肽)的生產和遞送工具的用途。(例如W-12])。更具體地，經改造的食品級細菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis (L. Iactis))被選為用于治療性遞送生物活性多肽的優(yōu)選微生物。顯然，經改造的乳酸乳球菌菌株用于遞送口服治療性蛋白質的這一概念創(chuàng)造了激動人心的可能性。然而，任何醫(yī)藥產品的一個必要屬性是長期穩(wěn)定性(保質期)，在預定的貯存條件下通常為至少M 個月。為此，需要為基于經改造的乳酸乳球菌的藥物物質(DS)和藥物產品(DP)制劑開發(fā)一個高效且具伸縮性和可靠性的制造平臺。在制造和后續(xù)的貯存期間，產品穩(wěn)定性的關鍵參數(shù)是經改造的細菌的長期存活力 (通常表示為菌落形成單位(CFU)/克，作為貯存時間的函數(shù))。乳酸乳球菌菌株的生產、貯存和最終的治療使用會對細菌帶來顯著的壓力W]。在工業(yè)環(huán)境中，乳酸菌(LAB)可以以液體、噴霧干燥、冷凍或凍干(冷凍干燥)的形式被保存和分配。雖然上述所有制備物都適合用作食品工業(yè)中的起始培養(yǎng)物(starter culture)，但現(xiàn)在已越來越重視促進高細胞活力和代謝活性的長期保存方法，這是因為這些參數(shù)被認為是(生物)藥物應用的先決條件。 為了最大限度地提高存活能力，向生物質添加所選定的冷凍保護劑以及后續(xù)的凍干是關鍵步驟，特別是考慮到存活的且具有代謝活性的細菌是誘導期望的原位治療效果的絕對要求這一事實。
冷凍干燥被廣泛視為是最適合的細菌脫水過程之一，其目的旨在獲得固體的和穩(wěn)定的最終制劑W]。其是用于貯存微生物細胞培養(yǎng)物的最常見方法之一，即使冷凍干燥后及貯存過程中的存活率可能因不同菌株而有所不同[5]。冷凍干燥后的存活率反映了細胞抵抗快速冷凍和干燥的影響(例如在數(shù)個靶位點處的膜脂質氧化和細胞損傷)的能力[5]。 眾所周知，大多數(shù)無保護的細菌在冷凍干燥后都會被殺死，而存活的那些在進行貯存時迅速死亡。因此，已進行了多種嘗試來增加凍干和貯存后存活的細菌的數(shù)量，但僅取得有限的成功(見下文)。冷凍干燥是迄今為止最頻繁(如果不是唯一的話)用于實現(xiàn)長期保質期的方法 [16]。選擇適當?shù)母稍锝橘|/冷凍保護劑混合物是增加乳酸菌(LAB)在凍干和后續(xù)貯存過程中的存活率的關鍵因素W]。已報告了試圖增加乳酸菌(LAB)在凍干和/或后續(xù)貯存過程中的存活率的幾項研究(關于綜述，參見W])。然而，這些出版物都未證明凍干細菌具有足夠的長期穩(wěn)定性(即一年后能達到>80%的存活率)，特別是在室溫(25°C)或2-8°C 下，如制藥應用所需要的。對于大多數(shù)對乳品行業(yè)具商業(yè)利益的乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物而言，脫脂奶粉被選為干燥介質，因為它能夠穩(wěn)定細胞膜的成分、有利于再水化并且形成一層細胞保護膜W]。補充了額外的冷凍保護劑的脫脂乳可提高其內在的保護作用。Font de Valdez等描述了在10%脫脂乳中的核糖醇對12株經歷冷凍干燥的乳酸菌(LAB)的保護作用[17]。盡管報告顯示在凍干過程中獲得了高存活率(從42-100%不等，因菌株不同而有所不同)，但卻沒有提供關于長期穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。Castro等人評估了脫脂乳(11% )或海藻糖(5% )對保加利亞乳桿菌(LactcAacillus bulgaricus)在冷凍干燥后的存活率的有益效果，相比起在單獨的水中的約1 %的留存率，它們顯示25 %的留存率(活細胞計數(shù))[18]。同樣地，其沒有報導關于后續(xù)貯存期間的穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。Carvalho等人Q003)證明了山梨糖醇或谷氨酸(單)鈉(MSG)(它們分別被添加至懸浮在脫脂乳中的LAB)對凍干和3-6個月的后續(xù)貯存期間的存活的穩(wěn)定作用[19]。然而，盡管與單獨的脫脂乳相比，山梨糖醇或MSG增加了穩(wěn)定性，但所報導的存活率在山梨糖醇或MSG存在下仍然很低(< 0. )。此外，在20°C下在空氣中貯存于密閉容器中并保存在黑暗之中達8個月的凍干細胞的長期存活率隨著時間的流逝而表現(xiàn)出了一個或多個對數(shù)的顯著下降。Carcoba和Rodriguez研究了單獨添加至重構脫脂乳(RSM)的各種化合物對冷凍干燥后的乳酸乳球菌的細胞存活和代謝活性的影響[16]。他們發(fā)現(xiàn)，與單獨的RSM相比，糖類的海藻糖和蔗糖、多元醇的山梨醇和核糖醇、以及氨基酸的β -丙氨酸和谷氨酸都能夠把細胞活力增強44. 3%以上。然而，未提供補充了培養(yǎng)基的實際存活率，并且沒有披露長期貯存數(shù)據(jù)。作為最后一個示例，Huang等人所進行的研究開發(fā)和優(yōu)化了德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrueckii)的保護介質，其在冷凍干燥后導致86 %的細胞存活力 [20]。該介質的組成是66. 40克/升的蔗糖、101. 20克/升的甘油、113. 00克/升的山梨醇以及130. 00克/升的脫脂乳。同樣地，該研究并沒有報道有關長期穩(wěn)定性的結果。Huyghebaert等人旨在開發(fā)一種含有具可接受保質期的存活的GM乳酸乳球菌的凍干粉劑制劑[21]。為了調查冷凍干燥基質的影響，他們使用了兩種不同的介質補充有0.5%葡萄糖的M17肉湯(以獲得GM17)，或補充有0.5%葡萄糖和0.5%酪蛋白水解物的 10% (w/v)脫脂乳(以獲得GC-乳)。在冷凍干燥之后，他們評估了凍干參數(shù)、冷凍干燥基質和不同貯存條件對短期和長期存活力的影響。當在常規(guī)GM17肉湯中進行凍干時，絕對存活力低于10%，而在GC-乳基質內進行的凍干則導致顯著較高的存活力(60.0士 18.0%)。然而，盡管多次嘗試標準化冷凍干燥過程，但仍無法避免批次間的顯著的變異性。短期穩(wěn)定性研究的結果顯示，存活力在冷凍干燥和1周的貯存后(GC-乳基質)已下降士20%。在長期穩(wěn)定性研究中，相對存活力在1個月的貯存后高度下降，并且在隨后幾個月的貯存期間對數(shù)遞減(GC-乳基質，各種貯存條件)，這表明無法獲得長期穩(wěn)定性。整體地考慮現(xiàn)有技術，很明顯的是，脫脂乳是乳酸菌(LAB)冷凍干燥介質的反復出現(xiàn)的組成部分，因此它對細菌的存活力似乎是必不可少的。然而，乳衍生物在新型藥物組合物的使用是嚴格被禁止的，特別是考慮到與其使用相關的傳染性海綿狀腦病(TSE)風險。除了生產后的高存活力，凍干的乳酸菌(LAB)在制藥應用領域方面還應具有可接受的長期保質期。例如，US 2005/0100559、US 3897307和W02004/065584描述了穩(wěn)定的干燥的細菌組合物。US 2005/0100559中的干燥細菌組合物的特點是它們含有很大比例的穩(wěn)定劑。參見例如US 2005/0100559中的實施例
，其中穩(wěn)定劑占了至少40% (w/v) 0 在TO2004/065584中，蔗糖或蔗糖和麥芽糖糊精顯示能提高細菌細胞培養(yǎng)物的穩(wěn)定性，但前提是必須在_20°C下。在該文獻中沒有教導如何改善含有凍干細菌的組合物的長期保質期(在室溫下)。在US3897307中，所有實驗都從在脫脂乳中的不同乳酸菌物種的培養(yǎng)物開始，其隨后進行凍干，任選地在穩(wěn)定增強劑存在下，所述穩(wěn)定增強劑選自L-抗壞血酸(包括其可食用的鹽)，和谷氨酸或天門冬氨酸(包括其鹽)。因此，乳成分是穩(wěn)定的干燥細菌組合物的一個重要組成部分。換句話說，現(xiàn)有技術均未指出，更換乳成分能在長期貯存下獲得足夠的存活和穩(wěn)定性。事實上，大多數(shù)此類研究都缺乏關于初始存活力、穩(wěn)定性和細菌密度的精確數(shù)據(jù)。最后，這些研究都沒有報告GM細菌的冷凍干燥和/或其性質的維持。附圖簡述

圖1 乳酸乳球菌菌株SAGX0037在使用不同冷凍保護劑混合物的情況下的活細胞計數(shù)(以菌落形成單位[CFU]/g表示)緊在冷凍干燥后及在暴露于25°C /35% RH對小時后的數(shù)據(jù)。表1描述了冷凍保護劑混合物的詳細組成。圖2 乳酸乳球菌菌株SAGX0037在使用不同冷凍保護劑混合物的情況下的活細胞計數(shù)(以菌落形成單位[CFU]/g表示)緊在冷凍干燥后及在暴露于25°C /35% RH 24小時后的數(shù)據(jù)。表3描述了冷凍保護劑混合物的詳細組成。圖3 乳酸乳球菌菌株SAGX0037在使用冷凍保護劑混合物Z4(20%谷氨酸鈉，10% 山梨醇和10%葡聚糖500)進行冷凍干燥并且最終貯存溫度為25°C和35°C的情況下的活細胞計數(shù)(以菌落形成單位[CFU]/g表示)緊在冷凍干燥后及在暴露于25°C /35% RH 4和 24小時后的數(shù)據(jù)。表4描述了細菌和冷凍保護劑混合物組合物的詳細組成。圖4:谷氨酸鈉、糊精(來自玉米淀粉)和山梨醇在冷凍干燥和長期貯存(在 3種不同的貯存條件下)期間對乳酸乳球菌菌株SAGX0037的穩(wěn)定作用-20°C ；5°C及250C /60% RH，在PET/ALU袋中。表5描述了細菌和冷凍保護劑混合物組合物的詳細組成。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種有效的冷凍保護劑組合物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，其不包含脫脂乳或任何其他的動物源性化合物，實現(xiàn)了冷凍干燥的乳酸菌(LAB)在不同溫度下的長期穩(wěn)定性，由此冷凍干燥的乳酸菌(LAB)在貯存6個月、優(yōu)選貯存9個月及更優(yōu)選貯存12個月后保留的存活力超過50 %、優(yōu)選超過60 %，更優(yōu)選超過70 %，更優(yōu)選超過80 %。冷凍保護劑組合物制劑的主要優(yōu)點是在冷凍干燥期間、在短期暴露于正常生產操作條件期間及在包裝后的長期貯存期間，為高度敏感的細菌提供保護。本發(fā)明提供了穩(wěn)定劑(冷凍保護劑)的組合，其在冷凍干燥、研磨和篩分凍干的塊以及后續(xù)的貯存時獲得乳酸菌(LAB)的高存活。為了最大限度地提高存活率，在冷凍干燥前將不同的穩(wěn)定化合物(冷凍保護劑)的組合添加到細菌生物質。該穩(wěn)定化合物組合包括淀粉水解物和谷氨酸鹽和/或多元醇，導致凍干乳酸菌(LAB)的改善的存活率和穩(wěn)定性。具體地，本發(fā)明涉及冷凍保護劑的新型組合的用途，其用于增加經冷凍干燥后的細菌的存活力、改善凍干的塊的質感以易于研磨，以及改善冷凍干燥細菌在不同溫度條件下的長期穩(wěn)定性。如下文實施例詳細解釋的，在所選的冷凍保護劑混合物的存在下在冷凍干燥后獲得高存活細胞產率(>6x 10E+11菌落形成單位[CFU]/g)。令人驚訝的是，這些凍干細胞的存活力并沒有因接觸環(huán)境條件(模擬下游藥物配制和生產過程[例如膠囊灌裝])長達 M小時(25°C/35%RH)而受到影響，并且在不同的貯存條件下也觀察到了細胞存活力的長期保存。冷凍保護劑組合包含谷氨酸鈉或山梨醇和葡聚糖，同時結合了諸如海藻糖和蔗糖等的公知冷凍保護劑，其在冷凍干燥后得到與優(yōu)選的冷凍保護劑制劑(代碼D)相當?shù)幕罴毎a率。短期暴露研究清楚地顯示，包含淀粉水解物和谷氨酸鹽和/或多元醇的此類組合的冷凍保護劑制劑在未受保護的貯存下在25°C和35% RH下保護凍干乳酸乳球菌長達M 小時。在本發(fā)明中，谷氨酸鹽優(yōu)選是谷氨酸鈉。本發(fā)明的多元醇優(yōu)選是山梨醇或甘露醇，而本發(fā)明的淀粉水解物則優(yōu)選是葡聚糖。乳酸乳球菌(L. Iactis)菌株sAGX0037的存活分析的結果通過凍干樣品及暴露于空氣中的樣品的存活細胞計數(shù)來確定，其表明，淀粉水解物(如葡聚糖500)、谷氨酸鈉和多元醇(如甘露醇)的優(yōu)選組合(代碼D)(如實施例1、2和3所示)，在未受保護的貯存下在 25°C和35% RH下保護凍干乳酸乳球菌長達M小時。相較于蔗糖制劑(其也稱為用于穩(wěn)定凍干乳酸菌(LAB)的“金標準”)，上述3 種冷凍保護劑的組合在貯存方面顯然有更優(yōu)越的表現(xiàn)，而且也是唯一能在短期暴露于 250C /35% RH下導致> 6xlOE+llCFU/g的活細胞計數(shù)的穩(wěn)定劑組合。當谷氨酸鈉被單獨添加至細菌時，在短期暴露后，沒有觀察到細菌的存活。淀粉水解物(如來自玉米淀粉的糊精)、谷氨酸鈉和多元醇(如山梨醇)的冷凍保護劑組合能產生穩(wěn)定的凍干乳酸菌(LAB)粉末，從而保證了活細菌的長期穩(wěn)定性和存活率(在研磨和篩分貯存于_20°C及5°C的凍干的塊時，沒有觀察到任何顯著的活細胞計數(shù)下降，并且在1年的貯存后也有> 90%的最初活細胞計數(shù)得以保留，導致非常高的CFU濃度， 高達> 切10E+llCFU/g)。在25°C及60% RH下，只觀察到輕微的活細胞計數(shù)下降，仍然得到非常高的CFU濃度，在25°C及60% RH下貯存1年后仍高達> 3x 10E+llCFU/g。因此，本發(fā)明的目的是提供冷凍干燥的細菌組合物，其包含淀粉水解物、谷氨酸鹽和多元醇的組合。從下文的實施例中可知，所述組合物中所用的淀粉水解物的量為約2.0% 到約10% (w/v)；特別是約2. 5%至約5% (w/v) 0所述組合物中所用的谷氨酸鹽的量為約 2. 0^^1^410% (w/v)；特別是約5.0%至約7. 5% (w/v) 0所述組合物中所用的多元醇的量為約5. 0%到約30% (w/v)；特別是約10%至約20% (w/v)，更具體來說為約7. 5%至約 15% (w/v) ο本文中所使用的“多元醇”通常是指數(shù)種糖醇的混合物，如山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇等等。它是由玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或小麥淀粉(其被淀粉酶分解成小單位，如葡萄糖、 糊精、麥芽糊精和葡聚糖等等)水解而成。在隨后的氫化步驟里，所述的小單位會被轉換成糖醇，如山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇和較長鏈的氫化糖類(如maltitriitol)。在本發(fā)明的具體實施方案中，多元醇是甘露醇、山梨醇或山梨醇和甘露醇的組合。在所述實施方案中，每個所述多元醇，即山梨醇或甘露醇，各自獨立地以約5. 0%至約15% (w/v)，特別是約7. 0% 至約15% (w/v)的量存在。在進一步的實施方案中，每個所述多元醇成分以相同的量存在， 即約 7m 10%、11%、12%、13%、14%或 15% (w/v)。本文中所使用的“谷氨酸鹽”通常是指谷氨酸和其可食用的水溶性鹽。這類“可食用的”鹽是被批準用于人類食品中且是食品級的那些，如谷氨酸的鈉和/或鉀鹽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，谷氨酸鹽是谷氨酸單鈉，也被稱為谷氨酸鈉及MSG。在進一步的實施方案中，所述谷氨酸鈉以約2.0%到約10% (w/v)；特別是約5.0%至約7. 5% (w/v)的量存在。本文中所使用的“淀粉水解物”通常是指包含大量葡萄糖單位的支鏈多糖如淀粉或葡聚糖等的水解產物。淀粉的構建單位包括線性和螺旋的直鏈淀粉及分枝的支鏈淀粉。 葡聚糖的直鏈包含葡萄糖分子之間的α-1，6糖苷鍵，而支鏈則開始自α_1，4鍵(在某些情況下，α_1，2及α_1，3鍵)。在具體實施方案中，本文中所使用的淀粉水解物包含下列任何一種葡聚糖1、葡聚糖5、葡聚糖10、葡聚糖20、葡聚糖40、葡聚糖60、葡聚糖70、葡聚糖110或葡聚糖500，其中數(shù)字是指以kDa表示的規(guī)范性分子量；在更具體的實施方案中， 淀粉水解物為葡聚糖500。在進一步的實施方案中，所述葡聚糖以約2.0%至約10% (w/v), 特別是約2. 5%至約5% (w/v)的量存在。如在本發(fā)明的說明書和實施例中使用的，單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該”包括單數(shù)和復數(shù)所指物，除非上下文另外明確說明。舉例來說，“細胞”是指一個或超過一個的細胞。本文中所使用的術語“含有”、“包含”和“包括”是同義詞，其是包容性或開放式的， 不排除額外的、未被引述的成員、元素或方法步驟。用端點表示的數(shù)值范圍包括該范圍內所包含的所有數(shù)值及分數(shù)，以及所引述的端
點ο當描述一個可測量的值，例如參數(shù)，量，時間期限等時，本文中所使用的術語“約” 意欲涵蓋與指定值相差+/-20%或更少、優(yōu)選+/-10%或更少、更優(yōu)選+/-5%或更少、更優(yōu)選+/-1 %或更少，更優(yōu)選+/-ο. 1 %或更少的變化，此類變化適宜在所披露的發(fā)明中使用。本說明書中列舉的所有文件以其全文通過引用并入本文。具體來說，本文中特別提到的所有文件的教導通過引用并入本文。除非另有說明，用于披露本發(fā)明的所有術語(包括技術和科學術語)的意義與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同。通過進一步的指導，隨后的定義用于更好地理解本發(fā)明的教導。術語“重組核酸”通常是指，包含利用重組DNA技術連接在一起的區(qū)段的核酸。當重組核酸在宿主生物體內復制時，其后代核酸也包含在術語“重組核酸”內。陳述重組DNA技術的一般原則的標準參考著作包括Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , vol.1-3, ed. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989 ；Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al. , Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York, 1992(定期更新)("Ausubel et al. 1992〃 ) ；Innis et al.，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press :San Diego, 1990o itLf 白勺—MHC貝U 陳述于例如 Davis, B. D. et al. , Microbiology, 3rd edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980)中。當提及給定的ORF與啟動子之間的關系時，術語“異源的”表示，所述啟動子通常不與所述ORF天然結合，也即，通常不天然控制所述ORF的轉錄。換句話說，這些結合是通過重組DNA技術在本發(fā)明的重組核酸中形成的?！叭樗峋?lactic acid bacterium) ”這一術語通常是指，選自乳球菌屬 (Lactococcus)物種、乳桿菌屬(Lactobacillus)物種、鏈球菌屬(Streptococcus)物種、片球菌屬(Pediococcus)物種、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)物種和明串珠菌屬 (Leuconostoc)物種的細菌，并且包括本領域內歸類為上述的任何類群(如物種、亞種、株系)?！叭榍蚓边@一術語通常是指乳球菌屬細菌，并且包括本領域內歸類為該屬的任何類群(如物種、亞種、株系)。作為例子，乳球菌包括格氏乳球菌(Laxtococcus garvieae), 乳酸乳球菌(Laxtococcus lactis)、魚乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌 (Lactococcus ρlantarum)禾口棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis),以及其亞禾中禾口株系。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，乳球菌是乳酸乳球菌。乳酸乳球菌包括但不限于，乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis ssp. cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亞種 (Lactococcus lactis ssp. hordniae)、乳酸乳球菌乳亞禾中(Lactococcus lactis ssp. lactis)及乳酸乳球菌酸雙乙酰乳變種(Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis)。在本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方案中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亞種或乳酸乳球菌乳亞種，更優(yōu)選為乳酸乳球菌乳亞種，并且包括其任何株系，如乳酸乳球菌乳脂亞種 SKll或乳酸乳球菌乳亞種MG1363。因此，在一個實施方案中，凍干細菌包含一個或多個編碼表達產物(優(yōu)選多肽)的重組核酸開放閱讀框，所述表達產物能夠在受試者優(yōu)選人或動物受試者中引起治療應答。在特別有用的示例性且非限制性的實施方案中，本發(fā)明所述的一個或多個重組核酸開放閱讀框可編碼抗原和/或非疫苗原性的(non-vaccinogenic)治療活性多肽。本文中所使用術語“抗原”通常是指能激發(fā)免疫應答(包括體液免疫和/或細胞免疫應答)且能夠結合免疫應答的產物(如抗體或T細胞)的對于生物體(尤其是對于被給予抗原的人類或動物受試者而言)是外源的物質。因此，在一個優(yōu)選的例子中，抗原需要被給予所述抗原的受試者具有功能性免疫系統(tǒng)，以引起生理應答。根據(jù)本發(fā)明的抗原可來源于人或動物受試者對其的免疫應答在治療上有用的任何多肽，如來自病原體，如來自病毒、原核生物(如細菌)或真核病原體，來自非生理性蛋白 (如源自癌組織的蛋白質)，來自變應原(如用來激發(fā)免疫耐受性)等。術語“非疫苗原性的治療活性多肽”通常是指在施用其的人或動物受試者中不引起抗其自身的免疫應答且能實現(xiàn)治療作用的多肽。因此，預期此類多肽的治療效果與其自身的天然生物學功能直接相關，由此其可以在受試者體內達到特定的效果，而不是作為受試者體內的免疫原性和/或免疫保護性抗原而產生治療效果。因此，非疫苗原性的治療活性多肽在其表達形式上應具有生物學活性，或至少在從表達宿主細胞中釋放時轉換成生物學活性形式。所述多肽的生物學活性形式優(yōu)選能展示二級構型，或更優(yōu)選地三級構型，所述構型與其天然構型相同或非常類似。非疫苗原性的治療活性多肽優(yōu)選是無毒和非病原性的。在優(yōu)選實施方案中，非疫苗原性的治療活性多肽可來源于人類或動物，且優(yōu)選對應于與待施用其的人類或動物受試者相同的類群。合適的非疫苗原性的治療活性多肽的非限制性例子包括，能夠局部或全身性起作用的多肽，例如能夠施加內分泌活性來影響局部或全身代謝的多肽，和/或生物學活性多肽是能夠調節(jié)免疫造血系統(tǒng)的細胞活性的多肽，和/或一個或多個生物學活性多肽是能夠影響體內各種正?；蚰[瘤細胞的存活力、生長和分化或影響對損傷和感染的急性期炎性應答的免疫調節(jié)或誘導的多肽，和/或一個或多個生物學活性多肽是能夠增強或誘導對細胞和組織的感染的抗性(通過作用于其靶細胞受體的趨化因子介導)或上皮細胞的增殖或促進傷口愈合的多肽，和/或一個或多個生物學活性多肽能夠調節(jié)體內細胞的物質表達或生產。此類多肽的具體例子包括但不限于，胰島素，生長激素，促乳素，降鈣素，促黃體激素，甲狀旁腺激素，生長抑素，促甲狀腺激素，血管活性腸肽，細胞因子如IL-2，IL-3，IL-4， IL-5, IL-6, IL-7, IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14 至 IL-32 的任一個，GM-CSF， M-CSF, SCF, IFNs, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL,細胞因子的 TNF 家族，如 TNFa，TNFb, ⑶40，⑶27或FAS配體，細胞因子的IL-I家族，成纖維細胞生長因子家族，血小板源性生長因子，轉化生長因子和神經生長因子，細胞因子的表皮生長因子家族及胰島素相關細胞因子等。另外，治療活性多肽可以是上述定義的治療活性多肽的受體或拮抗劑。此類合適多肽的進一步具體例子列舉于例如，以引用方式并入本文中的WO 96/11277第14頁第1_30 行；以引用方式并入本文中的WO 97/14806第12頁第1行到第13頁第27行；或以引用方式并入本文中的US 5，559，007第8欄第31行到第9欄第9行。因此，在一個實施方案中，重組核酸編碼抗原和/或非疫苗原性的治療活性多肽， 其中所述的抗原能夠引發(fā)人體或動物受試者的免疫應答，優(yōu)選保護性免疫應答，和/或所述的非疫苗原性的治療活性多肽能夠在人或動物受試者體內產生治療作用。WO 97/14806進一步具體地披露了抗原與免疫應答刺激分子(例如白細胞介素， 諸如IL-2或IL-6)的細菌共表達。因此，還預期本發(fā)明的凍干細菌用于此類共表達。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的開放閱讀框進一步包含編碼分泌信號的序列，該序列與ORF所編碼的多肽同相。這有利地允許表達的多肽從宿主細胞分泌，從而可促進例如分離或遞送。在通常情況下，分泌信號序列代表約16到約35個氨基酸的區(qū)段，其通常包含嵌入到脂質雙層膜中的疏水氨基酸，從而允許所伴隨的蛋白質或肽序列從宿主細胞分泌，并且其通常從該蛋白質或肽切除。優(yōu)選，分泌信號序列在意欲用于包含所述信號序列的核酸的宿主細胞(例如細菌宿主細胞，優(yōu)選乳酸菌，更優(yōu)選乳球菌，而更優(yōu)選乳酸乳球菌)內是有活性的。在合適的宿主細胞中有活性的分泌信號序列是本領域已知的；示例性乳球菌信號序列包括，usp45的信號序列(請參閱US 5，559，007)和其他信號序列，請參閱，例如， Perez-Martinez et al.1992(Mol Gen Genet 234 :401-11) ；Sibakov et al.1991(Appl Environ Microbiol 57(2) :341-8)。優(yōu)選，信號序列位于啟動子序列及ORF之間，S卩，信號序列位于啟動子序列的3'端和目的多肽的ORF之前。在優(yōu)選的實施方式中，信號序列編碼如下氨基酸序列MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA(usp45)。另一方面，本發(fā)明的凍干細菌含有包含重組核酸的載體。本文所使用的“載體”是指一種核酸分子，其通常為DNA，并且其中可插入和克隆 (即增殖)核酸片段。因此，載體通常包含一個或多個獨特的限制性酶切位點，并能夠在確定的宿主或媒介生物體內自主復制，從而克隆的序列是可復制的。載體可包括但不限于質粒、噬菌粒、噬菌體、噬菌體衍生載體、PAC、BAC、線性核酸、如線性DNA等等(請參閱例如 Sambrook et al. , 1989 ；Ausubel 1992)。本發(fā)明的重組核酸或載體可以以染色體外的形式存在于宿主細胞內，優(yōu)選其使用自身的復制起點進行自主復制，或其可整合入細菌基因組DNA，如細菌染色體，例如乳球菌染色體。對于后一種情況，可整合所述核酸的一個或多個拷貝，優(yōu)選單個拷貝；整合可發(fā)生在染色體的隨機位點，或如上文所述，發(fā)生在預定的位點，優(yōu)選在預定的位點，例如在優(yōu)選的非限制性例子中，在乳球菌例如乳酸乳球菌的thyA基因座。在相關方面，本明提供了一種生產凍干細菌的方法，所述凍干細菌內的重組核酸含有一個或多個開放閱讀框，用于給有此需要的人或動物施用，包括給所述人或動物施用治療有效量的用所述核酸轉化的所述細菌。動物優(yōu)選是哺乳動物，如馴養(yǎng)動物、農場動物、動物園動物、體育動物、寵物和實驗動物，如狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬、牛、母牛；靈長類動物如猿、猴子、猩猩和黑猩猩； 犬科動物如狗和狼；貓科動物如貓、獅和虎；馬科動物如馬，驢和斑馬；食用動物如牛、豬及羊；蹄類動物如鹿和長頸鹿；嚙齒類動物如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等。本文中所使用的術語“治療”或“療法”是指治療性治療和預防性或防止性措施， 其中目標是為了防止或減慢(減少)不想要的生理變化或障礙?！靶枰委煹娜祟惢騽游铩?包括將受益于給定治療條件的那些。術語“治療有效量”是指，有效治療諸如人類或動物等受試者的疾病或障礙的治療性物質或組合物的量，即獲得期望的局部或全身效果和性能的量。例如，治療有效量的細菌可能包含至少1個細菌、或至少10個細菌、或至少有IO2個細菌、至少IO3個細菌、或至少有IO4個細菌、或至少IO5個細菌、或在至少IO6個細菌、或至少有IO7個細菌、或至少有IO8個細菌、或至少109、或至少101(1、或至少1011、或至少1012、或至少1013、或至少1014、或至少IO15 或更多的宿主細胞，如細菌，例如在單個或重復的劑量中。本發(fā)明的凍干細胞可單獨施用，或者與一個或多個活性化合物組合施用。后者可以在施用所述凍干細胞之前、之后或同時施用。許多現(xiàn)有技術公開了抗原和/或治療活性多肽的遞送，因此應理解，這些公開內容可進一步有利地使用本發(fā)明的強啟動子進行改善。例如但不限于，三葉肽的細菌遞送可用于治療消化道疾病(請參閱例如WO 01/02570)、白細胞介素特別是IL-10的遞送可用于治療結腸炎(請參閱例如WO 00/23471)、抗原的遞送可作為疫苗(請參閱例如WO 97/14806)、GLP-2和相關類似物的遞送可用于治療短腸疾病、克羅恩病、骨質疏松癥及作為癌癥化療期間的輔助治療，等等?？稍O想使用本發(fā)明的凍干細胞的其他治療應用?？赏ㄟ^本發(fā)明的治療性多肽的遞送治療的人類或動物疾病類型的其他非限制性例子包括但并不限于，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎在內的炎性腸道疾病(可用例如 IL-Ira或IL-10或三葉肽治療)；自身免疫疾病，包括但不限于銀屑病，類風濕性關節(jié)炎， 紅斑狼瘡(可用IL-Ira或IL-10治療)；神經病癥，包括但不限于阿爾茨海默病，帕金森病和肌萎縮性側索硬化(可用例如腦源性神經營養(yǎng)因子和睫狀神經營養(yǎng)因子治療)；癌癥 (可用例如IL-1、集落刺激因子或干擾素-W治療)；骨質疏松癥(可用例如轉化生長因子 f3治療)；糖尿病(可用例如胰島素治療)；心血管疾病(可用例如組織型纖溶酶原激活劑治療)；動脈粥樣硬化(可用例如細胞因子和細胞因子拮抗劑治療)；血友病(可用例如凝血因子治療)；退化性肝臟疾病(可用例如肝細胞生長因子或干擾素a治療)；例如囊腫性纖維化的肺部疾病(可用例如α抗胰蛋白酶治療)；肥胖；病原體感染，如病毒或細菌感染 (可用任何上述組合物或抗原治療)；等等。另一方面，本發(fā)明因此還提供了包含本發(fā)明所制造的凍干細菌的藥物組合物，無論該凍干細菌是否用上文所述的核酸和/或載體進行了轉化。所述制劑優(yōu)選包含治療有效量的本發(fā)明所制造的凍干細菌及藥學上可接受的載體，即一個或多個藥學上可接受的載體物質和/或添加劑，例如緩沖劑、載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等等。本文中所使用的術語“藥學上可接受的”在本領域內的含義是一致的，意思是指與藥物組合物的其他成分相容，且對受者無害。本發(fā)明的凍干細菌可以制成膠囊劑、片劑、顆粒劑和粉劑形式，而所有的這些形式都可通過口服途徑給藥。此外，本發(fā)明的凍干細菌也可制成在合適介質內的水性懸浮液，或者可緊在使用前將凍干細菌懸浮在合適的介質中。對于口服施用，可配制腸溶制劑的口服劑型，該劑型還可包括提供宿主細胞的控制釋放的化合物，從而能提供其中編碼的所需蛋白質的控制釋放。例如，口服劑型(包括片劑、彈丸劑、顆粒劑、粉劑)可以涂上賦形劑薄層(通常是聚合物、纖維素衍生物和/或親脂性材料)，其能抵抗在胃內而非在腸道內的溶解或破壞，從而允許通過胃部到達腸道進行崩解、溶解和吸收?？诜┬涂杀辉O計成允許宿主細胞或其重組蛋白質的緩慢釋放，例如控制釋放、 緩釋、延長釋放、長效片劑或膠囊。這些劑型通常包含常規(guī)和廣為人知的賦形劑，如親脂性賦形劑、聚合物賦形劑、纖維素賦形劑、不溶性賦形劑、膨脹賦形劑。控釋制劑也可用于任何其他遞送位點，包括腸、結腸、生物粘附或舌下遞送(即口腔粘膜遞送)和支氣管遞送。當本發(fā)明的組合物將通過直腸或陰道進行給藥時，藥物制劑可包括栓劑和藥膏劑。在此實例中， 將宿主細胞懸浮在常見賦形劑的混合物(其還包括脂質)中。上述所提到的各種制劑在本領域中是眾所周知的，并且描述在例如下列文獻中Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,5th edition, William and ffilkins) ；Chien 1992, Novel drug delivery system,2nd edition, M. Dekker) ；Prescott et al. (1989, Novel drug delivery,J. Wiley & Sons) ；Cazzaniga et al.，(1994,Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int.J.Pharm. i08 7')。灌腸劑制劑優(yōu)選可用于直腸給藥?！肮嗄c劑”這一術語用來涵蓋意欲用于直腸的液體制劑。灌腸劑通?？梢蕴峁┯趩蝿┝咳萜髦校环N或多種溶解或分散于水、甘油或聚乙二醇(macrogol)或其他合適溶劑中的活性物質。因此，根據(jù)本發(fā)明，在優(yōu)選實施方式中，編碼所需基因的重組宿主細胞可通過粘膜例如口、鼻、直腸、陰道或支氣管途徑，通過可用于所述途徑的任何現(xiàn)有技術制劑，向動物或人類施用。施用的宿主細胞的劑量會因各種因素而有所不同，所述因素包括細菌及其所編碼的基因的類型、待治療的疾病的類型和嚴重程度以及所使用的給藥途徑。因此，對于本發(fā)明的每一個和所有實施方案，無法界定精確的劑量，但對于本領域技術人員來說，在閱讀本發(fā)明后，其將是顯而易見的?？傊瑒┝繉凑諅€案方式而具體確定使用廣為人知的方法(如ELISA或Biacore，請參閱實施例)來測量在施用預定數(shù)目的細胞后重組蛋白的血清濃度。所遞送的重組蛋白的動力學特點及半衰期的分析將提供足夠的信息來確定經轉化的宿主細胞的有效劑量范圍。在一個實施方案中，當按照本發(fā)明制造的凍干細菌表達抗原時，本發(fā)明也可提供疫苗?！耙呙纭边@一術語是指藥學上可接受的組合物，其當以有效量施用給動物或人類受試者時，能在受試者中誘導針對疫苗內包含的免疫原的抗體和/或激發(fā)保護性免疫。本發(fā)明的疫苗包含用本發(fā)明的核酸或載體轉化的宿主細胞，及任選地賦形劑。此類疫苗還可包括佐劑，即增強對抗原的免疫應答的化合物或組合物。佐劑包括但不限于， 完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂甙、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質例如溶血卵磷脂、嵌段多元醇、聚陰離子、肽、油或烴類乳劑和潛在有用的藥學上可接受的人佐劑，如 BCG (卡介苗)禾口短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。本發(fā)明的凍干乳酸菌可用于一般食品工業(yè)，用作食品添加劑或特別是用作起始培養(yǎng)物，例如酸乳酪起始培養(yǎng)物或奶酪起始培養(yǎng)物。通常情況下，這些組合物包含濃縮形式的細菌，包括冷凍的、干燥的或冷凍干燥的濃縮物，其活細胞濃度通常為至少10<5>CFU/ 克組合物，如至少10<6>CFU/克，包括至少10<7>CFU/克，如至少10<8>CFU/克，如至少 10<10>CFU/克，如至少10<11>CFU/克，如至少10<12>。組合物可包含常規(guī)添加劑(包括營養(yǎng)物質，例如酵母提取物、糖和維生素)作為進一步的成分。本發(fā)明提供了一種制造凍干的乳酸菌的方法，所述乳酸菌可用于各種食用產品的組分或成分，例如乳包括非巴氏殺菌的乳(生乳)、肉、面團、酒和植物材料，例如蔬菜、水果或飼料作物等。本文中所使用的術語“乳”是指任何類型的乳或乳成分，例如牛乳、人乳、水牛乳、山羊乳、綿羊乳、由此類乳制成的乳制品、或乳清。本發(fā)明的凍干乳酸菌的特別的優(yōu)勢是，具有高存活力和長期貯存能力。起始培養(yǎng)物以這樣的量添加，所述量導致下列活細胞數(shù)至少10<3>菌落形成單位(CFU)/克食用產品起始材料，如至少10<4>CFU/克，包括至少10<5>CFU/克，如至少10<6>CFU/克，如至少10<7>CFU/克，如至少10<8>CFU/克，如至少 10<9>CFU/克，如至少10<10>CFU/克，如至少10<11>CFU/克，如至少10<12>/克食用產品起始材料。本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的穩(wěn)定化合物的組合的凍干乳酸菌，其為用于生產食品或動物飼料的起始培養(yǎng)物組合物的形式，或用于產生香氣的培養(yǎng)物的形式。本發(fā)明通過不被認為是限制性的實施例作進一步的說明。
實施例通過參考下列實驗細節(jié)，將更好地理解本發(fā)明，但本領域技術人員易于理解，這些都只是本發(fā)明的示例，本發(fā)明由之后的權利要求更充分地描述?；谶@些實施例，其他實施方案對于本領域技術人員來說是顯然的，特別是包括其他乳酸菌的實施方案，所述乳酸菌例如乳球菌屬物種，例如乳桿菌屬物種、鏈球菌屬物種、片球菌屬物種、雙歧桿菌屬物種、明串珠菌屬物種以及本領域內歸類為上述的任何類群(如物種、亞種、株系)。實施例1 葡聚糖、谷氨酸鈉和多元醇的組合在冷凍干燥期間和短期(M小時)暴露于25°C /35% RH期間所發(fā)揮的穩(wěn)定作用將乳酸乳球菌菌株SAGX0037培養(yǎng)在5升的發(fā)酵罐內，并用含有800 μ M胸苷的經純化的水清洗2次，然后濃縮十倍。濃縮的細菌以1 1的體積比與冷凍保護劑混合物(1 毫升樣品+1毫升冷凍保護劑)混合。所產生的制劑以2毫升的體積被分裝進35個小瓶內。 從生物反應器到小瓶的整個過程花費約8個小時，且平均溫度為10°C。具有最終濃度的各種制劑(即包括細菌在內)如表1所示。將小瓶冷凍于固體二氧化碳顆粒中，直到將它們置于冷凍干燥機中為止。表1 加入細胞懸浮液后的冷凍保護劑制劑的組成。配制的細胞懸浮液中細胞的干重含量為33克/升或3.3%。
權利要求
1.用于改善冷凍干燥的乳酸菌的存活率和穩(wěn)定性的穩(wěn)定化合物的組合，其包含淀粉水解物和谷氨酸鹽和/或多元醇。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合，其中-所述淀粉水解物的量為約2.0%到約10% (w/v)； -所述谷氨酸鹽的量為約2.0%到約10% (w/v)；并且 -所述多元醇的量為約5. 0%到約30% (w/v)。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的穩(wěn)定化合物的組合，其中所述谷氨酸鹽是谷氨酸鈉。
4.根據(jù)權利要求1至3任一項所述的穩(wěn)定化合物的組合，其中所述多元醇是甘露醇或山梨醇。
5.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的穩(wěn)定化合物的組合，其中所述淀粉水解物是葡聚糖。
6.冷凍干燥乳酸菌的方法，其中使用根據(jù)權利要求1至5任一項的穩(wěn)定化合物的組合。
7.冷凍干燥的乳酸菌，其還包括權利要求1至5任一項的穩(wěn)定化合物的組合。
8.根據(jù)權利要求7的冷凍干燥的乳酸菌，其中所述乳酸菌還包含一種或多種重組核酸，所述重組核酸對所述細菌是異源的。
9.根據(jù)權利要求7或8的冷凍干燥的乳酸菌，其用作藥物或食品成分。
10.根據(jù)權利要求7或8的冷凍干燥的乳酸菌，其用于食品應用或食品加工。
11.根據(jù)權利要求10的冷凍干燥的乳酸菌，其為用于生產食品或動物飼料的起始培養(yǎng)物組合物的形式，或為用于生產香氣的培養(yǎng)物的形式。
12.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的穩(wěn)定化合物的組合或根據(jù)權利要求6的冷凍干燥乳酸菌的方法或根據(jù)權利要求7至10任一項的冷凍干燥的細菌，其中所述乳酸菌選自乳球菌屬(Lactococcus)物種、乳桿菌屬(Lactobacillus)物種、鏈球菌屬(Streptococcus) 物種、片球菌屬(Pediococcus)物種、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)物種和明串珠菌屬 (Leuconostoc)物種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有效的冷凍保護劑組合物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，其不包含脫脂乳或任何其他的動物源性化合物，實現(xiàn)了冷凍干燥的乳酸菌(LAB)在不同溫度下的長期穩(wěn)定性，由此冷凍干燥的乳酸菌(LAB)在貯存6個月、優(yōu)選貯存9個月及更優(yōu)選貯存12個月后保留的存活力超過50％。本發(fā)明所涉及的領域是生產凍干細菌，特別是乳酸菌。更具體地，本發(fā)明涉及冷凍保護劑的新型組合的用途，其用于增加經冷凍干燥后的細菌的存活力、改善凍干的塊的質感以易于研磨，以及改善冷凍干燥的細菌在不同溫度條件下的長期穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及此類冷凍干燥的細菌，其用于食品工業(yè)或用于人類或動物的健康應用。更具體地，本發(fā)明涉及重組細菌的提高的存活力和長期貯存能力，所述重組細菌能表達異源蛋白或肽，并以治療或疫苗接種的目的向人類或動物施用。
文檔編號C12N1/04GK102414310SQ201080018717
公開日2012年4月11日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權日2009年4月30日
發(fā)明者L·斯泰德勒, P·德哈瑟, S·奈恩克, S·科維雷恩 申請人:阿克圖杰尼斯公司