專利名稱：多基因載體編碼的重組病毒樣顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含來(lái)自不同病毒毒株的重組病毒樣顆粒，以及編碼它們的載體。
背景技術(shù)：
小的天然生物分子在生物醫(yī)學(xué)、納米技術(shù)和材料科學(xué)的不同方面中的應(yīng)用越來(lái)越令人感興趣。由于它們的規(guī)則結(jié)構(gòu)、它們均勻的顆粒大小、它們的穩(wěn)定性、易于生產(chǎn)以及操作的可能性，病毒模擬物、病毒衣殼或病毒樣顆粒是非常吸引人的。病毒樣顆粒具有動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，它們的內(nèi)部是可接近的，此外包衣是可修飾的。取決于應(yīng)用，病毒樣顆?？梢跃哂邪せ虿痪哂邪?，可以被選擇作為病毒模擬物。這些實(shí)施方式可以用作新的生物學(xué)實(shí)體或靶點(diǎn)，用作疫苗，用作用于抗體生產(chǎn)的抗原，用作研究工具，用作診斷工具，用于藥物遞送和生物聯(lián)結(jié)物。這些病毒模擬物通過(guò)包膜或多種病毒的衣殼蛋白質(zhì)自組裝而形成。取決于特定病毒形態(tài)，大小在22-150 nm之間變動(dòng)。病毒模擬物是非傳染性，因?yàn)樗鼈儧](méi)有摻入遺傳材料進(jìn)行組裝。取決于應(yīng)用，外源的遺傳材料可以被包括在在此處描述的病毒模擬物中。這些病毒模擬物的有前景的應(yīng)用是針對(duì)各種疾病的的疫苗的生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈兊谋砦坏闹貜?fù)、高密度的展示常常引發(fā)強(qiáng)的免疫反應(yīng)。對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞的攝取，小的顆粒大小是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。嵌合的病毒模擬物提供了在選擇性的、多表位的、多蛋白質(zhì)的、多血清型的、多株系的或多物種的呈遞方面的巨大的可能性。存在著許多用于病毒模擬物的生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)，其包括桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)、各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，都可被病毒表達(dá)載體穩(wěn)定地或短暫地轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，還有包括釀酒酵母QSaccharomyces cererisiae)和巴斯德畢赤氏酵母QPichia pasioris)的各種酵母種類，以及大腸桿菌(fecAericAia CoIi)和其他細(xì)菌。疫苗接種取決于足夠的免疫性的產(chǎn)生，來(lái)保護(hù)對(duì)抗傳染性疾病。最多使用的減毒病毒疫苗依靠在免疫之后病毒在宿主中的有限的復(fù)制。但是這種疫苗接種可能在某些患者中引起嚴(yán)重的反應(yīng)。因而作為亞單位疫苗的病毒樣顆粒(VLP)的開(kāi)發(fā)具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鲱w粒一般缺少DNA或RNA基因組，但是具有天然病毒的真實(shí)的構(gòu)象。疫苗接種是針對(duì)例如季節(jié)性或流行性流感暴發(fā)威脅的最為有效和低成本的對(duì)策之一。易于作為氣溶膠傳播以及導(dǎo)致對(duì)于特別是敏感人群的嚴(yán)重疾病是流感稱為最具破壞性的病毒疾病的主要原因。當(dāng)前批準(zhǔn)的季節(jié)疫苗僅是部分保護(hù)性的，基于雞蛋的生產(chǎn)是非常耗時(shí)和高成本的。這種策略對(duì)于疫苗不良匹配或根本不匹配的流行株的未預(yù)期的出現(xiàn)是脆弱的。由于不斷出現(xiàn)的禽流感或其他來(lái)源的流感的毒株的危險(xiǎn)性，新的疫苗方案是必需的。另一個(gè)方面，幾種重要的病毒如HCV、HIV、mx)la等等的領(lǐng)域中的研究由于生物安全問(wèn)題是非常艱難的。直到現(xiàn)在，僅有少數(shù)的模型用于病毒進(jìn)入和病毒輸送的研究。由于缺乏合適的非傳染性病毒模型，診斷工具基于這些病毒的基因組。當(dāng)前商業(yè)的人類流感疫苗含有血凝素作為它們的僅有的或主要的病毒抗原。它們的生產(chǎn)起始于在含胚的雞蛋上生長(zhǎng)的病毒，或更近年來(lái)，起始于組織培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生長(zhǎng)的病毒。雞蛋中的生產(chǎn)需要選擇高產(chǎn)的、重排的病毒毒株，受限于容量，是耗時(shí)的(6-8個(gè)月)和昂貴的。除那以外，在對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)過(guò)敏的接種人群中它可能產(chǎn)生問(wèn)題。生產(chǎn)使用非致死性的禽類毒株才是可能的?；陔u蛋的生產(chǎn)的最重要缺點(diǎn)之一是有限的容量。 對(duì)于大流行來(lái)說(shuō)，必需停止季節(jié)性流感疫苗的生產(chǎn)，以幫助大流行性流感疫苗生產(chǎn)，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看這可能引起更多的致死事件。針對(duì)病毒疾病的疫苗通常依靠減毒病毒毒株或傳染性病毒的滅活。合適的環(huán)境是高度病原性或出血性病毒所必需的，由于生物安全水平(例如，BL3/BL4)這限制了生產(chǎn)可能性。對(duì)于某些病毒如人類乳頭狀瘤病毒，減毒將不是足夠的，因?yàn)椴《静荒茉隗w外增殖。產(chǎn)生基于人乳頭狀瘤病毒(HPV)樣顆粒的疫苗的能力(Gardasil，Cervarix)改變了預(yù)防婦女子宮頸癌癥的前景。由于不斷出現(xiàn)的禽流感或其他來(lái)源的毒株的危險(xiǎn)性，產(chǎn)生增強(qiáng)的保護(hù)的新的疫苗方案是必需的。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及重組病毒樣顆粒，其包含兩種或更多種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/ 或(b)同一病毒的不同血清型和/或(C)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。這些重組病毒樣顆粒作為疫苗是有用的，本發(fā)明還涉及這些疫苗。此外，本發(fā)明涉及包含編碼不同的表位或編碼不同的包含表位的蛋白質(zhì)的兩種或更多種多核苷酸的載體，所述不同的表位或編碼不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株，以及涉及包含這些載體的宿主細(xì)胞。附圖的簡(jiǎn)要描述
附

圖1:表達(dá)多表位病毒樣顆粒的載體構(gòu)建體的示意圖。(A) (SEQ ID NO: 1)含有來(lái)自Hmi病毒毒株以及H3N2 (HA，NA)病毒毒株的不同表位(M1，M2)的多價(jià)的A型流感病毒模擬物。(B) (SEQ ID NO:2)含有來(lái)自血清型HPV16和HPV18的表位(Li)的嵌合的人類乳頭狀瘤病毒樣顆粒
(C)(SEQ ID N0:3)具有來(lái)自B型流感/Florida分離物的包埋的表位(HA，NA，M1，M2) 的表達(dá)載體構(gòu)建體
(D)(SEQ ID N0:4)用于HPV16和HPV18血清型的表位(Li)的表達(dá)的載體構(gòu)建體，其中兩種基因都處于不同啟動(dòng)子的控制下。(E) (SEQ ID NO: 5)具有啟動(dòng)子plO的刪除的與(B)相同的載體構(gòu)建體載體含有兩個(gè)啟動(dòng)子Pl和P2 (<1 , 0)，選自polh、pl0和Pxiv極晚期桿狀病毒啟動(dòng)
子，vp39桿狀病毒晚期啟動(dòng)子，vp39polh桿狀病毒晚期/極晚期雜交啟動(dòng)子，pca/polh, perm, etl,p35, egt, da26 桿狀病毒早期啟動(dòng)子；CMV，SV40, UBc. EF-I，RSVLTR, MT, Pds47, Ac5，Pgal和Padh。終止子序列Tl和T2 (T)選自SV40、HSVtk或BGH (牛生長(zhǎng)激素)。此外， 載體含有轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)TnL和TnR (L, R)用于MultiBacAacmid的產(chǎn)生，IoxP位點(diǎn)(LP)用于位點(diǎn)特異性同源重組(質(zhì)粒融合)，復(fù)制起點(diǎn)(0)，氨芐西林(A)和慶大霉素(G)抗性基因和限定的限制性位點(diǎn)。附圖2:表達(dá)的嵌合流感病毒樣顆粒的分析。
(A)分泌的(A，泳道2)以及細(xì)胞內(nèi)的VLP (從SEQ ID NO 1制備的，A，泳道1)利用針對(duì)蛋白HA (H3)、NA (H3)和M2 (Hl)的特異性抗體通過(guò)免疫印跡來(lái)驗(yàn)證。泳道3=階梯，蛋白質(zhì)大小按kDa。表位是共同定位的，這意味著它們組裝到一個(gè)顆粒中。(B)利用醋酸鈾的負(fù)染色通過(guò)電子顯微鏡檢查，嵌合的流感病毒樣顆粒(從SEQ ID NO :3制備的)的可視化。呈遞表位HA的刺突是可見(jiàn)的。顆粒的大小在50-80 nm的范圍內(nèi)。附圖3:從SEQ ID NO :1制備的分泌的多表位流感病毒樣顆粒的層析純化和分析。(A)凝膠過(guò)濾純化的層析譜。第一峰(1)含有病毒樣顆粒(VLP)。其他峰(2-6)代表污染蛋白質(zhì)。(B)考馬斯染色的SDS-PAGE。病毒樣顆粒的多個(gè)表位通過(guò)分析來(lái)自第一峰(1)的不同級(jí)分來(lái)驗(yàn)證，分別代表含有VLP的峰的開(kāi)始的(泳道1 )、中間的(泳道2)和末尾的(泳道 3)部分。階梯[kDa]在第一泳道的左側(cè)呈現(xiàn)。表位的檢出用箭頭標(biāo)明。(C)根據(jù)考馬斯染色的凝膠使用抗HA抗體的Western印跡分析。附圖4:天然樣流感病毒樣顆粒(VLP)的功能性。純化的VLP (從SEQ ID NO 3制備的)的兩倍連續(xù)稀釋系列(1 2到1 2048)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的血細(xì)胞凝集分析來(lái)分析。50 μ L純化的顆粒溶液包被到用紅血細(xì)胞(紅血球)孵育的 96孔平板上。流感VLP (1，上部)能夠以劑量依賴性方式凝集紅血細(xì)胞。最高的稀釋度是 1:10Μ。相比之下，用作對(duì)照的PBS (C)僅導(dǎo)致紅血球的沉淀，在反應(yīng)孔的中央顯現(xiàn)為“圓
占，，
；^ ο附圖5:多表位流感病毒樣顆粒的體內(nèi)評(píng)估。小鼠用50 ng (小鼠1-5)或100 ng (小鼠6-10)從SEQ ID NO 3制備的純化的 VLP免疫，作為對(duì)照用PBS (小鼠11-12)免疫。在初次注射后的抗體滴度(注射后3周)以白色框表示，在強(qiáng)化注射后的滴度以黑色框表示(注射后6周)。滴度表示為小鼠血清的稀釋度(y-軸)。VLP有效地刺激抗體免疫反應(yīng)。當(dāng)用100 μ (小鼠6-10)免疫時(shí)獲得最好的結(jié)果，表明劑量依賴性免疫反應(yīng)。在強(qiáng)化之后觀察到抗VLP抗體的清楚的提高。如所預(yù)計(jì)的，對(duì)照動(dòng)物(小鼠11-12)沒(méi)有顯示免疫反應(yīng)。附圖6:通過(guò)血細(xì)胞凝集抑制分析對(duì)多表位流感VLP的特異性免疫反應(yīng)的確認(rèn)。用在注射后6周采集的血清進(jìn)行ELISA測(cè)試來(lái)分析特異性抗HA抗體的存在。從 SEQ ID NO 3制備的多表位病毒樣顆粒包被在96孔平板上，與血清混合，孵育30分鐘。血清在一系列兩倍的稀釋物(1:2到1:1024)中測(cè)試。在孵育后，添加紅血球，進(jìn)一步孵育30 分鐘。來(lái)自不同小鼠的特異性抗流感HA抗體結(jié)合多表位病毒樣顆粒，引起紅血球凝集的抑制作用達(dá)到稀釋度1:128 (1)和稀釋度1:256 (2)，在反應(yīng)孔中央作為紅血球沉淀(“圓點(diǎn)”)顯現(xiàn)。使用對(duì)照小鼠的血清樣品沒(méi)有觀察到血細(xì)胞凝集抑制(C)。附圖7:使用50 mL生物反應(yīng)器的最佳表達(dá)條件的篩選。通過(guò)斑點(diǎn)印跡分析確定了范圍1-2Χ IO6個(gè)細(xì)胞/mL (Τ0Ι，1或2)范圍內(nèi)的原始細(xì)胞量，病毒接種物(Μ0Ι，0. 01-2)和收獲時(shí)間(感染后天數(shù)，d2-d6)。(A)用作對(duì)照的帶有僅一個(gè)表位Ll的表達(dá)構(gòu)建體的最佳表達(dá)參數(shù)的確定。通過(guò)特異性抗HPV18抗體(Abeam)檢測(cè)。(B)攜帶來(lái)自不同血清型的兩個(gè)表位的多表位表達(dá)構(gòu)建體(SEQ ID NO :2)的最佳表達(dá)參數(shù)的確定。通過(guò)針對(duì)兩個(gè)表位HPV16 Ll和HPV18 Ll的特異性抗HPV16-抗體(Camvir, Santa Cruz)和抗 HPV18- (Abeam)抗體的檢測(cè)。附圖8:從SEQ ID NO :2制備的多表位人乳頭狀瘤病毒樣顆粒的層析純化和分析。(A)利用DEAE-瓊脂糖柱的陰離子交換層析的層析譜。流通(1)、洗滌(2)和洗脫峰(3-5)通過(guò)數(shù)字標(biāo)明(1-5)。洗脫緩沖液的提高的離子強(qiáng)度由線[%]顯示。3 =用300 mM NaCl 洗脫，4 =用 420 mM NaCl 洗脫，5 =用 680 mM NaCl 洗脫。(B)考馬斯染色的SDS-PAGE。病毒樣顆粒的多表位的存在通過(guò)分析層析譜的不同部分來(lái)驗(yàn)證。泳道1=階梯[kDa]，泳道2=純化前的VLP，泳道3=洗滌步驟，泳道4=用300 mM NaCl洗脫，泳道5=用420 mM NaCl洗脫，泳道6=用500 mM NaCl洗脫，泳道7=用680 mM NaCl洗脫。表位用箭頭標(biāo)明(Li)。(C)利用針對(duì)箭頭所標(biāo)明的兩個(gè)表位(Li)的特異性抗體，考馬斯染色的凝膠的 Western印跡分析。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
本發(fā)明目的在于根據(jù)用于生產(chǎn)的重組DNA和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)新的病毒樣顆粒用作疫苗、診斷工具和R&D工具。本發(fā)明的顆粒滿足了適合于對(duì)抗可能的流行性感冒暴發(fā)的疫苗的需求。本發(fā)明的重組病毒樣顆粒由多肽鏈組裝，其摻入了幾種，特別地兩種或更多種， 例如，兩種、三種、四種或五種，或三的倍數(shù)，例如，六種、九種、十二種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。這些表位然后被展示在顆粒表面上。來(lái)自不同的毒株、血清型和/或特異于不同宿主的病毒的表位選擇產(chǎn)生了多功能的病毒樣顆粒，其模擬了它們?cè)谧匀恢写嬖诘牟《镜奶烊桓淖儯?例如，在2009年4月豬流行性感冒暴發(fā)期間所觀察到的。病毒樣顆粒的技術(shù)現(xiàn)狀由單一蛋白質(zhì)組成，或包含來(lái)自同一病毒毒株的最高達(dá)三種不同表位。本發(fā)明的顆粒由基于病毒或質(zhì)粒的單個(gè)DNA載體編碼，其被用作在宿主細(xì)胞例如昆蟲(chóng)細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生產(chǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA載體是桿狀病毒載體，宿主細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。本發(fā)明的表位是由4到1000個(gè)氨基酸，優(yōu)選的6到100個(gè)氨基酸之間組成的免疫原性肽，優(yōu)選地是中和表位。中和表位是一些表位，其在作為免疫原性應(yīng)答的結(jié)果被抗體結(jié)合時(shí)引起帶有這樣的中和表位的病毒的中和。在此理解的表位可以是重復(fù)的，可以是更大的蛋白質(zhì)的部分，特別是抗原的部分，病毒表面蛋白質(zhì)的部分或病毒膜蛋白的部分。摻入在病毒表面蛋白質(zhì)或病毒膜蛋白中的這樣的表位是優(yōu)選的。如果根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒的預(yù)期用途是作為R&D工具、診斷工具或病毒模擬物，重要的是表位是提供完整病毒型表面的完整病毒蛋白質(zhì)的部分。本發(fā)明的不同的病毒毒株是，例如，流感病毒的不同毒株，例如，A性流感病毒毒株 H1NUH5NUH9NUH1N2, H2N2、H3N2或H9N2，或B型流感病毒或C型流感病毒。本發(fā)明的不同的血清型有，例如，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的不同的血清型，例如血清型 6、11、16、18、31、33、35、39、45、48、52、58、62、66、68、70、73 和 82，以及來(lái)自原癌型 HPV5、8、14、17、20 和 47，或來(lái)自乳頭瘤相關(guān)的型 HPV 6、11、13、26、28、32 和 60。特異于不同宿主的病毒毒株是指特別地適應(yīng)了相應(yīng)的宿主，例如，人類流感病毒毒株，豬流感病毒毒株以及禽流感病毒毒株。在本上下文中，特異于宿主是指，病毒易于從一個(gè)宿主傳播到相同類型的另一個(gè)宿主，而不易于傳播到不同類型的宿主。例如，禽類病毒毒株易于從鳥(niǎo)類傳播到其他鳥(niǎo)類，而不是其他動(dòng)物或人類。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含來(lái)自不同毒株、血清型和/或特異于不同宿主的病毒的表位的顆粒與B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表位組合以誘導(dǎo)更廣泛的免疫反應(yīng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒由形成完整的病毒樣表面的蛋白質(zhì)組成，任選地進(jìn)一步包含衣殼和核孔蛋白質(zhì)。本發(fā)明的病毒樣顆?？梢赃M(jìn)一步包含熒光蛋白質(zhì)，對(duì)于顆粒的純化目的或?qū)τ诟街鴺?biāo)簽有用的蛋白質(zhì)，以及運(yùn)輸過(guò)程和穩(wěn)定性所需的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。與實(shí)際的疫苗制造過(guò)程相比，由于特定的遺傳的和過(guò)程工程化工具的應(yīng)用，在此描述的多肽和病毒樣顆粒在更短的時(shí)間和以無(wú)限的量產(chǎn)生。通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法， 例如，MultiBac 技術(shù)(W0 2005/085456 ；I. Berger et al. , Nature Biotechnology 22， 1583，2004)，Polybac技術(shù)(WO 2007/0M250)或基因合成來(lái)組裝需要的病毒基因的能力， 例如，允許編碼DNA載體的快速組裝。這些技術(shù)的使用不需要原始的、潛在危險(xiǎn)的病毒在本發(fā)明的病毒樣顆粒和疫苗的開(kāi)發(fā)、制備或施用期間的任何物理的轉(zhuǎn)移。對(duì)于本發(fā)明的顆粒的構(gòu)建，足夠的是使用來(lái)自感染的個(gè)體的核苷酸序列。這與用于生產(chǎn)疫苗的經(jīng)典的基于蛋的方法形成很大的對(duì)比，其需要遺傳修飾的病毒作為種子株病毒。本發(fā)明的顆粒使用現(xiàn)代的一次性的組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)制造，這容許高生產(chǎn)能力。在桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的優(yōu)選的實(shí)施方式，制造過(guò)程可以被快速地建立，生產(chǎn)時(shí)間是短的，即，在數(shù)周的范圍內(nèi)，而不是與基于蛋的方法相比的數(shù)個(gè)月。另外，與建立基于蛋的設(shè)備相比，一次性的組織培養(yǎng)設(shè)備的構(gòu)建是更低耗時(shí)和低成本的。結(jié)果用于整個(gè)群體的大量疫苗可以在短的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)和重新生產(chǎn)，幾種不同類型的疫苗，例如，季節(jié)的流感疫苗和流行性感冒疫苗可以容易地并行生產(chǎn)。由于基于蛋的疫苗制造廠的能力限制的衛(wèi)生部門(mén)對(duì)該疫苗或其他種疫苗作出的困難的決定將不需要。本發(fā)明涉及重組病毒樣顆粒，其包含兩種或更多種，例如，兩種、三種、四種或五種，或三的倍數(shù)，例如，六種、九種或十二種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。優(yōu)選的是包含三種或更多種， 優(yōu)選的四種或更多種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)的重組病毒樣顆粒。同樣地優(yōu)選的是包含三的倍數(shù)，例如，六種、九種或十二種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)的重組病毒樣顆粒。所述表位選自兩種不同的毒株、血清型或?qū)Σ煌拗魈禺惖牟《径局?，或選自三種不同的毒株、血清型或?qū)Σ煌拗魈禺惖牟《径局辏蜻x自四種不同的毒株或血清型。優(yōu)選的是，包含來(lái)自三種不同毒株或血清型的幾種表位的病毒樣顆粒。同樣優(yōu)選的是包含來(lái)自特異于兩種或三種不同宿主的病毒毒株的幾種表位的病毒樣顆粒。此外本發(fā)明涉及載體，其包含兩種或更多種，例如，兩種、三種、四種或五種，或三的倍數(shù)，例如，六種、九種或十二種編碼表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)的不同多核苷酸， 所述表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。如在此使用的“多核苷酸”可以代表12到3，000個(gè)核苷酸的鏈，包括通常所指的寡核苷酸，可以是來(lái)自所提及的不同病毒來(lái)源的病毒基因或開(kāi)放閱讀框，特別是編碼病毒表面蛋白質(zhì)或病毒膜蛋白的基因或開(kāi)放閱讀框。優(yōu)選的是編碼以上提及的優(yōu)選的病毒樣顆粒的載體。最優(yōu)選的是包含選自SEQ ID NO 1到5的多核苷酸序列的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含
(1)來(lái)自同一病毒的兩種或三種不同毒株或血清型的相同類型的表面蛋白質(zhì)；
(2)來(lái)自不同的病毒毒株，例如，來(lái)自流感病毒毒株H5m和Hmi的超過(guò)兩種不同的表面蛋白質(zhì)的混合物；
(3)從對(duì)不同的宿主特異的病毒，例如，從對(duì)家豬、人類和/或禽類宿主特異的流感病毒組合的不同的表面蛋白質(zhì)的混合物。被認(rèn)為是包含在本發(fā)明的病毒樣顆粒中的表位的來(lái)源的病毒有，例如，流感病毒、 HPV、HIV、CMV、登革熱、HCV和新城疫病毒。表位可以衍生自其他病毒和細(xì)菌。特別優(yōu)選的是流感病毒。同樣地優(yōu)選的是人類乳頭狀瘤病毒(HPV)?？紤]的載體是DNA載體，可以是質(zhì)粒載體或者病毒載體。組裝這樣的載體的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。優(yōu)選的方法是MultiBac，例如在WO 2005/0邪456和在I. Berger et al. , Nature Biotechnology 22, 1583，2004 中描述的，或Polybac 方法，例如在WO 2007/054250中描述的，與CAP 技術(shù)和基因合成技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)組合。這件技術(shù)容許組裝多基因共表達(dá)DNA載體，其適合于在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選的 DNA載體是桿狀病毒載體。用于本發(fā)明的載體的表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是任何原核的(例如，大腸桿菌)或真核的表達(dá)細(xì)胞系。對(duì)于優(yōu)選的桿狀病毒載體的表達(dá)，昆蟲(chóng)細(xì)胞系是優(yōu)選的。昆蟲(chóng)細(xì)胞系的實(shí)例有，例如，SF9、SF21、Hi-5、Express Sf+和S2 Schneider細(xì)胞。對(duì)于在真核系統(tǒng)中的表達(dá)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是優(yōu)選的，特別是人類細(xì)胞，例如，HeLa, Huh7、HEK293、H印G2、BHK、CH0、 MT-2、骨髓成纖維細(xì)胞、原代神經(jīng)細(xì)胞或胚胎細(xì)胞。對(duì)于在酵母菌中表達(dá)，可以使用釀酒酵母W cerevisiae )、粟酒裂殖酵母(5 pombe)、白色念珠菌K albicans )或巴斯德畢氏酵母 0°. /^1Siori1S)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖可以在為特定宿主細(xì)胞提供合適的條件的任何容器、生物反應(yīng)器或一次性單元中進(jìn)行。本發(fā)明的病毒樣顆?？梢杂米饕呙?。此外，它們可以用作診斷工具中的抗原、用于抗體產(chǎn)生的抗原，以及作為用于研究和開(kāi)發(fā)工具的病毒模擬物，例如，病毒進(jìn)入研究和病毒-宿主相互作用研究。根據(jù)本發(fā)明的疫苗含有水性溶液中的重組病毒樣顆粒，任選地進(jìn)一步含有粘稠度調(diào)節(jié)化合物、穩(wěn)定化合物和/或提高免疫原性的佐劑，這是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。在具體的實(shí)施方式中，使用 Berger et al. , Nature Biotechnology, 2004、 W02005/085456和W02007/054250和CAP 技術(shù)的方法構(gòu)建H3N2流感病毒樣顆粒。Hmi 流感毒株A/Puerto Rico/834的Ml和M2基因的至少一個(gè)通過(guò)PCR擴(kuò)增與流感A/ Brisbanel0/2007的HA基因以及流感A/Brisbanel0/2007的NA基因一起克隆到轉(zhuǎn)移載體 pFL (W0 2007/054250,附圖1)中。構(gòu)建體通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，相同的克隆技術(shù)用于將血清型HPV16和HPV18兩者的至少一個(gè) Ll 基因，或來(lái)自組 2、4、6、11、31、33-35、39、40-45、51-53、55-59、62、66、68、70、73和77的其它的血清型的引入，克隆到轉(zhuǎn)移載體pFL中(附圖1)。實(shí)驗(yàn)部分
容許在大腸桿菌細(xì)胞中增殖的、稱為MultiBac或YFPMultiBac (W0 2005/085456)的桿狀病毒載體，和CAP 技術(shù)用于利用常規(guī)系統(tǒng)(Fitzgerald et al.，Nature Methods, 3， 1021，2006)的重組AcNPVs(Autographa californica核多角體病病毒，桿狀病毒)的產(chǎn)生。 10 ng的多基因載體轉(zhuǎn)化到DHlOMultiBac和/或DHlOYFPMultiBac感受態(tài)細(xì)胞中。陽(yáng)性克隆通過(guò)藍(lán)/白篩選和PCR來(lái)選擇。相應(yīng)的MultiBac bacmid DNA使用Birnboim & Doly方法分離。重組AcNPVs通過(guò)1 μ g多基因MultiBac bacmid使用轉(zhuǎn)染試劑Fugene (Roche) 根據(jù)廠家方案在OJxlO6個(gè)Sf21 (Invitrogen)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染來(lái)產(chǎn)生。病毒擴(kuò)增如早先描述的進(jìn)行(Fitzgerald et al.，Nature Methods, 3，1021, 2006)。所有重組 AcNPVs 的滴度通過(guò)Bac-to-Bac-Manual (Invitrogen)中描述的噬菌斑分析來(lái)測(cè)定。蛋白質(zhì)生產(chǎn)參數(shù)如感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι)、細(xì)胞數(shù)量(TOI)和收獲時(shí)間(TOH)使用小規(guī)模表達(dá)研究來(lái)分析。實(shí)施例1 表汰載體構(gòu)津體的產(chǎn)牛
為了制造各種構(gòu)建體，根據(jù)W02005/085456中描述的方法使用轉(zhuǎn)移載體pFL (W02005/085456和CAP 技術(shù))中的擴(kuò)增模塊M。表位的DNA通過(guò)從原始病毒分離病毒RNA和隨后的與PCR組合的逆轉(zhuǎn)錄(對(duì)于流感病毒表位)，或通過(guò)基因合成(Geneart公司提供)來(lái)獲得。逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)廠家方案使用RevertAid H Minus第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas) 來(lái)進(jìn)行。cDNA(2 μ L)用作PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)廠家的方案使用以下條件。對(duì)于50 μ L 總體積反應(yīng)，使用0.2 mM dNTP(NEB)U. 2% DMS0、0. 5 μ M反向和正向引物(Microsynth)、 10 μ 1 5x Phusion GC 反應(yīng)緩沖液和 2U Phusion Hot Mart 聚合酶(Finnzyme)。對(duì)于多基因裝配，合適的限制性位點(diǎn)(BstZ17I、SpeI, PmeI, AvrII)使用PCR引入。PCR片段用限制性內(nèi)切酶切割，隨后是連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程來(lái)將擴(kuò)增模塊整合到轉(zhuǎn)移載體中。連接在4°C使用500 ng直線化轉(zhuǎn)移載體(pFL)、4 μ L PCR產(chǎn)物和1 U T4-DNA裂解酶(Fermentas)過(guò)夜進(jìn)行。為了產(chǎn)生質(zhì)粒，4 μ L的連接溶液添加到50 μ 感受態(tài)DH5 α細(xì)胞，在冰上孵育30 分鐘。在42°C熱激30秒和在4°C冷激2分鐘之后，添加200 μ 1 LB培養(yǎng)基，然后在37°C 和220 rpm孵育1 h。此后，80 μ 1的細(xì)胞懸浮液平鋪在含有合適的抗生素的LB瓊脂平板上，在此種情況下，100 yg氨芐西林和100 yg慶大霉素。重復(fù)整個(gè)操作直到所有的表位導(dǎo)入到轉(zhuǎn)移載體中。流感表位選自基因HA和NA，兩者都選自H3N2/Brisbanel0/2007毒株， 而來(lái)自Ml和M2的表位選自HINl/Puerto Rico/834毒株。Ml表位由啟動(dòng)子plO控制，所有其他表位由多角體蛋白啟動(dòng)子polh控制。所有的表位在同一載體構(gòu)建體上存在(附圖1A， SEQ ID N0:1)。選擇流感B/Florida/2006分離物來(lái)產(chǎn)生構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有來(lái)自基因 HA、NA、M1*M2的基因(附圖1C，SEQ ID NO :3)。人類乳頭狀瘤病毒表位選自來(lái)自癌癥相關(guān)血清型HPV16和HPV18的基因Li，整合在一個(gè)載體構(gòu)建體中。兩種表位都由多角體蛋白啟動(dòng)子polh控制(附圖1B，SEQ ID NO :2)。為了改善表達(dá)產(chǎn)量，在進(jìn)一步的構(gòu)建體中刪除 PlO啟動(dòng)子(附圖1C，SEQ ID NO :5)。在其他構(gòu)建體中，HPV16表位由plO啟動(dòng)子控制，而選擇多角體蛋白啟動(dòng)子polh用于HPV18表位(附圖1D，SEQ ID NO :4)。實(shí)施例2 重組桿狀病毒的產(chǎn)生
這個(gè)病毒含有多個(gè)表位來(lái)產(chǎn)生病毒樣顆?；虿《灸M物，其在它們的表面上呈遞這些表位。病毒樣顆?？梢杂糜诓煌膽?yīng)用，例如，作為流感領(lǐng)域中的疫苗。AcNPV衍生的桿狀病毒含有多個(gè)不同的表位，所述表位來(lái)自WHO建議的用于2008/2009-VLP疫苗接種運(yùn)動(dòng)的病毒毒株。根據(jù)WO 2005/08M56的方案，轉(zhuǎn)移載體的所有基因通過(guò)位點(diǎn)特異性同源重組移位到MultiBac細(xì)胞中。10 ng的轉(zhuǎn)移載體添加到100 μ 1 MultiBac感受態(tài)細(xì)胞中， 在4°C孵育30分鐘。在42 °C熱激45秒和在4 V冷激2分鐘之后，添加400 μ 1 LB培養(yǎng)基，細(xì)胞溶液在37°C和220 rpm孵育4 h。不同的稀釋物平鋪在含有各種抗生素抗性的合適的LB瓊脂平板上。根據(jù)藍(lán)/白和PCR篩選，選擇幾個(gè)正確的MultiBac克隆。相應(yīng)的 MultiBac bacmid DNA 使用 Birnboim & Doly 方法分離。選擇至少四個(gè) MultiBac bacmid 克隆用于昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf9或Sf21的起始轉(zhuǎn)染來(lái)產(chǎn)生重組的AcNPV-衍生桿狀病毒。這通過(guò)1 μ g多基因MultiBac bacmid使用轉(zhuǎn)染試劑Fugene (Roche)根據(jù)廠家方案在0. 9xl06 個(gè)Sf21 (Invitrogen)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染來(lái)產(chǎn)生。病毒擴(kuò)增如早先描述的進(jìn)行(Fitzgerald et al. , Nature Methods, 3，1021，2006 ；Bac-to-Bac-Manual, Invitrogen)。擴(kuò)增病毒來(lái)擴(kuò)大體積和提高傳染性滴度，其根據(jù)Bac-to-Bac-Manual (hvitrogen)通過(guò)噬菌斑分析來(lái)測(cè)定。最好的表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)50 mL小規(guī)模表達(dá)實(shí)驗(yàn)和隨后的通過(guò)Bradford分析(ADV， Cytosceleton)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量測(cè)定來(lái)確定。最好的表達(dá)物的表達(dá)進(jìn)一步通過(guò)Western印跡分析用針對(duì)多種不同表位的抗體來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證(附圖2A)。
_仿丨丨3■磁·白姓內(nèi)_化
在最好的表達(dá)構(gòu)建體的確定之后，生物技術(shù)生產(chǎn)參數(shù)如細(xì)胞系、細(xì)胞量(Τ0Ι)、重組病毒接種物的量(感染復(fù)數(shù)，Μ0Ι)和收獲時(shí)間(TOH)在50 mL生物反應(yīng)器中測(cè)定。根據(jù)Eibl， Riesen 禾口 John (Bioforum 03/2009)禾口 Friesen J. (Bachelor thesis, University of Applied Science, Esslingen, Germany)，設(shè)計(jì)不同的 TOI、MOI 和 TOH 的矩陣。使用每天的樣品采集，分泌的或細(xì)胞內(nèi)的多表位病毒樣顆粒的表達(dá)觀察六到八天。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的顆粒(例如，HPV)，細(xì)胞團(tuán)粒用 50 mM TrisCl.pH 7. 6,100 mM NaCl.O. l%TritonX100 來(lái)裂解， 在4°C和8000 Xg離心10分鐘。上清液中存在的病毒樣顆粒的表位使用Dot-印跡裝置 (Biometra)和隨后用特異性抗體的Western印跡來(lái)驗(yàn)證。產(chǎn)生最高產(chǎn)量的條件參考三到四天的收獲時(shí)間來(lái)定義為表達(dá)參數(shù)。根據(jù)這些限定的參數(shù)，在搖動(dòng)燒瓶或波浪培養(yǎng)袋中，在草地粘蟲(chóng)Spodoptera frugiperda細(xì)胞Sf9和Sf21中生產(chǎn)病毒樣顆粒。對(duì)于多表位流感病毒樣顆粒表達(dá)，選擇Sf21細(xì)胞，使用以下條件1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/mL、M0I 0. 05以及感染后四天的收獲時(shí)間。細(xì)胞在27°C沒(méi)有二氧化碳和胎牛血清補(bǔ)充的情況下增殖。根據(jù)限定的收獲時(shí)間，通過(guò)在4°C在500-1000 X g離心20分鐘采集分泌的病毒樣顆粒。含有顆粒的上清液容積 ffliiil!用 100 kDa ^ff^^iliffi^CSartocon-Slice 200, Sartorius and CentramateOS, PALL)通過(guò)切向流動(dòng)過(guò)濾來(lái)降低用于純化。病毒樣顆粒的純化用可擴(kuò)大的層析方法和蔗糖梯度超速離心來(lái)進(jìn)行。層析純化是利用陽(yáng)離子交換、陰離子交換和凝膠過(guò)濾層析的多步驟的純化。上清液在50 mM磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中加載到連接于FPLC-系統(tǒng)(AEKTA提純器， GE Healthcare)的CaptoQ柱上。顆粒利用50 mM磷酸鹽、1 M NaCUpH 7. 4在線性梯度中以不斷提高的鹽濃度來(lái)洗脫。集中含有顆粒的部分，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析來(lái)進(jìn)一步純化(來(lái)自 SEQ ID N0:1的VLP，附圖3)。純化在50 mM磷酸鹽、150 mM NaCl pH 7. 4緩沖液中使用 HighLoad Superdex 200 pg柱進(jìn)行。所有的層析步驟通過(guò)SDS-PAGE和隨后的考馬斯染色與免疫印跡來(lái)分析為了確認(rèn)不同的表位的存在，純化的材料通過(guò)SDS-PAGE和隨后考馬斯染色或Western 印跡來(lái)分析。150 μ 1不同的層析級(jí)分加載到4-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen) 上，在 150 V 運(yùn)行 15 分鐘，在 175 V 運(yùn)行 45 分鐘，使用 SimplyBlueSafestainC Invitrogen) 考馬斯染色。對(duì)于免疫印跡，使用半干的裝置(BioRAD)在19V下40分鐘，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(BioRAD)上。在用5%脫脂奶粉-TrisCl-Tween20 (0. 1%)溶液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)30分鐘之后，膜在4°C與針對(duì)HA、NA和基質(zhì)蛋白質(zhì)的抗體孵育過(guò)夜。膜用 TrisCl-Tween20 (0. 1%)緩沖液洗滌幾次。取決于初級(jí)抗體的來(lái)源，第二抗體是與堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶連接的抗小鼠或抗兔抗體用于檢測(cè)。這些蛋白質(zhì)的共同定位顯示了來(lái)自一個(gè)表達(dá)載體和一個(gè)桿狀病毒的組裝和產(chǎn)生(附圖3B，來(lái)自SEQ ID Ν0:1)ο對(duì)于含有基因HA、NA和基質(zhì)蛋白質(zhì)Ml和M2兩者，包括它們的膜錨體，的表達(dá)構(gòu)建體，這種共同定位也可以顯示。實(shí)施例5 流感病毒樣顆粒(VLP)的功能件
為了分析VLP是否正確地在它們的表面整合了血凝素蛋白質(zhì)(HA)，利用來(lái)自雞的紅血細(xì)胞(RBC)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集分析(附圖4，來(lái)自SEQ ID NO 3的VLP)。純化的VLP的兩倍連續(xù)稀釋用PBS (IX)在V形的96孔平板中進(jìn)行。添加等量的紅血球(1%溶液)，在4°C 孵育1 h。RBC聚集物在反應(yīng)孔底部的出現(xiàn)表明沒(méi)有血細(xì)胞凝集。滴度表示為凝集RBC的純化的VLP溶液的最高稀釋度的倒數(shù)。獲得的結(jié)果顯示，VLP能夠凝集雞紅血球，間接地展現(xiàn)了 HA在VLP表面的存在。陰性對(duì)照(PBS)沒(méi)有顯示凝集。實(shí)施例6 流感VLP的體內(nèi)評(píng)估
VLP (從SEQ ID NO :3制備的)的免疫原性(免疫系統(tǒng)的刺激)使用兩組小鼠體內(nèi)測(cè)試， 小鼠在初免強(qiáng)化日程中分別在O周和3周皮下地免疫。免疫使用懸浮液中50或100 μ (50或100 ng)的VLP進(jìn)行。為了測(cè)定單獨(dú)的VLP的免疫反應(yīng)的質(zhì)量，不使用佐劑。小鼠在第3和6周放血，分析血清來(lái)尋找針對(duì)免疫的VLP的抗體反應(yīng)。獲得的結(jié)果顯示了，VLP在刺激抗體免疫反應(yīng)方面是有效的。當(dāng)用100 μ 1進(jìn)行免疫時(shí)獲得了最好的結(jié)果，表明了劑量依賴性的免疫反應(yīng)。在強(qiáng)化之后觀察到抗VLP抗體的清楚的提高。如所預(yù)計(jì)的，首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物不顯示免疫反應(yīng)。為了再證實(shí)免疫反應(yīng)的特異性，在第6周進(jìn)行血球凝集抑制測(cè)試來(lái)分析特異性抗 HA抗體的存在。結(jié)果顯示了，特異性抗流感HA抗體能夠抑制紅血球凝集最高達(dá)到稀釋度 128 (小鼠6)和稀釋度256 (小鼠8)。使用首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的血清樣品沒(méi)有觀察到血細(xì)胞凝集抑制。新產(chǎn)生的多表位流感VLP能夠以劑量依賴性方式刺激免疫系統(tǒng)。當(dāng)免疫系統(tǒng)用強(qiáng)化來(lái)重新刺激時(shí)，免疫反應(yīng)提高至至少15倍。引發(fā)的免疫反應(yīng)的特異性通過(guò)ELISA 和血凝測(cè)試來(lái)分析。
cooes] ^mm 7 產(chǎn)和純化
生物技術(shù)生產(chǎn)參數(shù)如細(xì)胞系、細(xì)胞量(Τ0Ι)、重組病毒接種物的量(感染復(fù)數(shù)，Μ0Ι)和收獲時(shí)間(TOH)根據(jù)Eibl et al. (Bioforum 3/2009)在50 mL生物反應(yīng)器中測(cè)定(附圖7)。 根據(jù)這些限定的參數(shù)，在搖動(dòng)燒瓶或波浪培養(yǎng)袋中，在草地粘蟲(chóng)Spodoptera frugiperda細(xì)胞Sf9和Sf21中生產(chǎn)病毒樣顆粒。多表位乳頭狀瘤病毒樣顆粒在Sf21細(xì)胞中使用2xl06個(gè)細(xì)胞/mL、MOI 0.5和感染后三天的收獲時(shí)間從SEQ ID NO :2表達(dá)。細(xì)胞在27°C、沒(méi)有二氧化碳和胎牛血清補(bǔ)充的情況下增殖。在限定的收獲時(shí)間(感染后三天)通過(guò)在4°C在 500-1000Xg離心20分鐘來(lái)采集細(xì)胞內(nèi)病毒樣顆粒。細(xì)胞使用低滲的磷酸鹽緩沖液和隨后的超聲破碎來(lái)裂解。在4°C和2000Xg的離心步驟之后，采集上清液。病毒樣顆粒的純化用可擴(kuò)大的層析方法和蔗糖梯度超離心來(lái)進(jìn)行。層析純化是利用陽(yáng)離子交換、陰離子交換和凝膠過(guò)濾層析的多步驟的純化。上清液在50 mM磷酸鹽緩沖液pH 7. 4中加載到連接于FPLC-系統(tǒng)(AEKTA提純器，GE Healthcare)的CaptoDEAE柱上。顆粒利用50 mM磷酸鹽、1 M NaCl、pH 7. 4在線性梯度中以不斷提高的鹽濃度來(lái)洗脫(附圖8A)。集中含有顆粒的級(jí)分，使用羥磷灰石柱進(jìn)一步純化。在20 mM磷酸鹽緩沖液pH 7.0中進(jìn)行結(jié)合，隨后用 500 mM磷酸鹽，150 mM NaCl, pH 7. 0線性梯度洗脫。為了精煉多表位顆粒，進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。純化在50 mM磷酸鹽、150 mM NaCl pH 7. 4緩沖液中使用HighLoad Superdex 200 Pg柱進(jìn)行。所有的層析步驟通過(guò)SDS-PAGE和隨后的考馬斯染色與免疫印跡來(lái)分析。棚列8 艦細(xì)犬麵■析
為了確認(rèn)純化的材料中不同的表位的存在，從SEQ ID NO :2制備的VLP通過(guò) SDS-PAGE和隨后的考馬斯染色(附圖8Β)與Western印跡(附圖8C)來(lái)分析。對(duì)于免疫印跡，使用針對(duì)不同血清型的Ll蛋白質(zhì)的抗體。150 μ 1不同的層析級(jí)分加載到4-12% Bis-Tris NuPAGE 凝膠Gnvitrogen)上，在 150 V 運(yùn)行 15 分鐘，在 175 V 運(yùn)行 45 分鐘， 使用SimplyBlue&ifestain (Invitrogen)考馬斯染色。對(duì)于免疫印跡，使用半干的裝置 (BioRAD)在19V下40分鐘，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(BioRAD)上。在用5%脫脂奶粉-TriSCl-Tween20(0. 1%)溶液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)30分鐘之后，膜在4°C與針對(duì)Ll表位的抗體孵育過(guò)夜。Camvir抗體(SantaCruz)用于HPV16,抗HPV18ab (Abeam)用于HPV18 檢測(cè)。膜用TrisCl-Tween20 (0. 1%)緩沖液洗滌幾次。膜與連接了堿性磷酸酶的抗小鼠抗體孵育Ih用于檢測(cè)。表位通過(guò)BCIP/NPT溶液來(lái)檢測(cè)。這些蛋白質(zhì)的共同定位顯示了來(lái)自一個(gè)表達(dá)載體和一個(gè)桿狀病毒的組裝和產(chǎn)生。實(shí)施例9 嵌合的人類乳頭狀瘤病毒樣顆粒(VLP)的功能性
為了分析從SEQ ID NO :2制備的人乳頭狀瘤病毒樣顆粒是否在它們的表面正確地整合 Ll蛋白質(zhì)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ELISA分析。純化的VLP的兩倍連續(xù)稀釋用PBS (1 X )在V形96孔平板中進(jìn)行。添加等量的血清型特異性抗體(濃度1:1000)，在37°C孵育lh?？贵w與Ll蛋白質(zhì)的合適的結(jié)合使用帶有辣根過(guò)氧化物酶的第二抗體和化學(xué)熒光檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)。獲得的結(jié)果顯示了抗體與重組表達(dá)的表位以劑量依賴性方式的結(jié)合。陰性對(duì)照(PBS)沒(méi)有顯示
纟口口。
權(quán)利要求
1.一種重組病毒樣顆粒，其包含兩種或更多種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或 (b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒樣顆粒，包含三種或更多種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒樣顆粒，包含四種或更多種不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的重組病毒樣顆粒，包含六種、九種或十二種表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，其中所述表位來(lái)自三種或更多種不同的病毒毒株或血清型。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，進(jìn)一步包含B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表位。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，進(jìn)一步包含形成完整病毒樣表面的蛋白質(zhì)和任選地包含衣殼和/或核孔蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，進(jìn)一步包含熒光蛋白質(zhì)、對(duì)顆粒的純化目的或用于附著標(biāo)記物有用的蛋白質(zhì)、和/或運(yùn)輸過(guò)程所需的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，其中所述病毒是流感病毒。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒，其中所述病毒是人乳頭狀瘤病毒。
11.一種載體，其包含編碼不同的表位或編碼不同的包含表位的蛋白質(zhì)的兩種或更多種多核苷酸，所述不同的表位或不同的包含表位的蛋白質(zhì)選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的載體，編碼根據(jù)權(quán)利要求1到10的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的載體，其是桿狀病毒載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的載體，包含選自SEQID NO 1到5的多核苷酸序列。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求11到14的任一項(xiàng)的載體的宿主細(xì)胞。
16.包含根據(jù)權(quán)利要求1到10的任一項(xiàng)的重組病毒樣顆粒的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明描述了根據(jù)用于生產(chǎn)的重組DNA和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的新的病毒樣顆粒，其用作疫苗、診斷工具和R&D工具。本發(fā)明的重組病毒樣顆粒由多肽鏈組裝，所述多肽鏈摻入了幾種，特別地兩種或更多種不同的表位，所述表位選自(a)同一病毒的不同病毒毒株和/或(b)同一病毒的不同血清型和/或(c)對(duì)不同宿主特異的不同病毒毒株。這些表位然后被展示在顆粒表面上。
文檔編號(hào)C12N7/04GK102414313SQ201080018892
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月1日
發(fā)明者約翰 C., 紹布 C., 韋爾尼茨 S. 申請(qǐng)人:雷德生物科技股份公司