專利名稱：Vangl1肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術領域：
本申請要求2009年3月4日提交的美國臨時申請No. 61/209，242的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。本發(fā)明涉及生物科學領域，更具體的說是癌癥治療領域。具體而言，本發(fā)明涉及新的肽(它們作為癌癥疫苗極其有效)和用于治療和預防腫瘤的藥物。
背景技術：
已經(jīng)證明，⑶8陽性CTL可識別主要組織相容性復合物(MHC) I類分子上的腫瘤相關抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細胞。從TAA的第一個例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，人們通過免疫學手段(NPL1/Boon Τ, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) :177-80 ；NPL 2/Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) 725-9)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA，而且這些TAA中的一些目前正處于作為免疫治療靶標的臨床開發(fā)過程中。能夠誘導強力且特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定保證了針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床應用的進一步開發(fā)(NPL 3/Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) :1442-55 ；NPL 4/Butterfield LH et al. ,Cancer Res 1999 Jul 1， 59(13) :3134-42 ；NPL 5/Vissers JL et al.，Cancer Res 1999 Nov 1,59(21) :5554-9; NPL 6/van der Burg SH et al.，J Immunol 1996 Mayl,156(9) :3308-14 ；NPL 7/Tanaka F et al. ,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) :4465-8 ；NPL 8/Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72 ;NPL9/Kikuchi M et al. ，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) 459-66 ；NPL 10/0iso M etal. ,Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387-94)。迄今為止，已經(jīng)報告了數(shù)項使用這些腫瘤相關抗原衍生的肽進行的臨床試驗。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗中只能觀察到較低的客觀響應率(NPL 11/Belli F et al. ,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20) :4169-80 ；NPL 12/Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct,188 33-42 ；NPL 13/Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep, 10(9) 909-15)。癌細胞增殖和存活不可缺少的TAA適合作為免疫療法的靶標，因為使用此類TAA 可使廣為記載的癌細胞免疫逃避的風險最小化，癌細胞的免疫逃避可歸于因治療驅(qū)動的免疫選擇而發(fā)生的TAA刪除、突變、或下調(diào)。一種稱作Van Gogh(Vang)的果蠅基因最初被鑒定為對具有異常小眼、腿和剛毛的果蠅的出現(xiàn)負責的突變來源(NPL 14/Taylor et al. , Genetics. 1998Sep ；150(1) 199-210)。使用含有23，040種基因的全基因組cDNA微陣列的基因表達譜分析，與果蠅 Vang基因同源的Vang樣1 (VANGLl) 1被鑒定為在數(shù)種癌細胞中，例如肝細胞癌、胰腺癌和膀胱癌中上調(diào)的新分子(NPL 15/0kabe et al.，Cancer Res. 2001 Mar 1 ；61 (5) :2129-37)。 根據(jù)人正常組織中的表達分析，在16種成體正常組織中，在睪丸和卵巢中特異性地檢測到 VANGLl轉(zhuǎn)錄物。另外，在表達VANGLl的肝瘤細胞中，siRNA或反義對VANGLl表達的下調(diào)引起細胞生長遏制(NPL 16/Yagyu et al. , Int J Oncol. 2002 Jun ；20 (6) 1173-8，PTL1/W003/027322)。引用表專利文獻[PTL 1]W0 03/027322非專利文獻[NPL l]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) :177-80[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9[NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) :1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul 1,59(13) :3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov 1,59(21) :5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. ，J Immunol 1996 May 1,156(9) :3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) :4465-8[NPL 8]Fujie T et al. ， Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. ， Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459-66[NPL 10]Oiso M et al. ， Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20) :4169-80[NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct, 188 :33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al. ，Nat Med 2004 Sep,10(9) :909-15[NPL 14]Taylor et al.，Genetics. 1998 Sep ；150(1) :199-210[NPL 15]Okabe et al. , Cancer Res. 2001 Mar 1 ；61 (5) :2129-37[NPL 16]Yagyu et al.，Int J Oncol. 2002 Jun ；20 (6) :1173-8

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分地基于合適的免疫治療靶標的發(fā)現(xiàn)。由于TAA —般被免疫系統(tǒng)察覺為“自身”，并因此往往沒有免疫原性，合適的靶標的發(fā)現(xiàn)是極為重要的。如上所述， VANGLl (SEQ ID NO :35，其由 GenBank 登錄號 AB057596 (SEQ ID NO 34)編碼)已經(jīng)被鑒定為在癌癥諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC(非小細胞肺癌)、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC(小細胞肺癌)和AML膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、 子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML中上調(diào)。因此，VANGLl是免疫療法的候選靶標。本發(fā)明至少部分基于VANGLl的基因產(chǎn)物的擁有誘導對VANGLl特異性的CTL的能力的特定表位肽的鑒定。如下文詳細討論的，使用自VANGLl衍生的HLA-AM402結(jié)合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細胞(PBMC)。然后建立了具有針對經(jīng)每一種候選肽沖激的HLA-AM陽性靶細胞的特異性細胞毒性的CTL系。這些結(jié)果證明，這些肽是可誘導針對表達VANGLl的細胞的強力且特異性的免疫應答的HLA-AM限制表位肽。另外，它指明，VANGLl具有強免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶標。因而，本發(fā)明提供分離的能與HLA抗原結(jié)合的肽，該肽由VANGLl (SEQ ID NO 34) 或其免疫學活性片段組成。這些肽預期具有CTL誘導能力且可用于離體誘導CTL或給受試者施用以誘導針對癌癥(諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML)的免疫應答。優(yōu)選地，那些肽是九肽或十肽，更優(yōu)選地，由選自SEQ ID NO :1-33的氨基酸序列組成。特別地，由選自SEQ ID NO =1,8,9,11, 12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列組成的肽顯示強的CTL誘導能力。本發(fā)明的肽涵蓋如下的肽，其中替代或添加了 1個、2個或更多個氨基酸，只要經(jīng)過修飾的肽保留原始的CTL誘導能力。另外，本發(fā)明的提供了分離的編碼任何本發(fā)明肽的多核苷酸。這些多核苷酸可用于誘導或制備具有CTL誘導能力的APC，或施用給受試者以誘導針對本發(fā)明的肽以及癌癥的免疫應答。當施用給受試者時，本發(fā)明的肽被呈遞在APC的表面上，然后誘導靶向相應肽的 CTL0因此，依照本發(fā)明的一個方面，還提供包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)， 供誘導CTL。另外，該等包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)可用于治療和/或預防癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、 胰腺癌、SCLC和AMLjn /或預防其手術后復發(fā)。是故，本發(fā)明還提供用于治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)的藥物組合物或物質(zhì)，其包含任何本發(fā)明的肽或多核苷酸。 作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或補充，本發(fā)明的藥物組合物或物質(zhì)可包含呈遞任何本發(fā)明肽的APC或外來體作為活性組分。本發(fā)明的肽或多核苷酸可誘導在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復合物的PAC，例如通過使源自受試者的APC接觸肽或?qū)⒕幋a本發(fā)明肽的多核苷酸導入APC來實現(xiàn)。此類APC具有針對靶肽的高CTL誘導能力，而且可用于癌癥免疫療法。因此，本發(fā)明涵蓋用于誘導具有CTL誘導能力的APC的方法及通過該等方法獲得的APC。本發(fā)明還提供用于誘導CTL的方法，其包括共培養(yǎng)CD8陽性細胞與在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體的步驟或?qū)肴缦禄虻牟襟E，該基因包括編碼能與本發(fā)明肽結(jié)合的T細胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸。通過本發(fā)明方法獲得的CTL可用于治療和/或預防癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、 骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。因此，本發(fā)明涵蓋通過本發(fā)明方法獲得的CTL。此外，本發(fā)明提供用于誘導針對癌癥的免疫應答的方法，其包括施用包括VANGLl 多肽、編碼VANGLl多肽的多核苷酸、或呈遞VANGLl多肽的外來體或APC的組合物或物質(zhì)的步驟。本發(fā)明可用于任何涉及VANGLl過表達的疾病，諸如癌癥，例示性的癌癥包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和 AML。應當理解前面的發(fā)明內(nèi)容和下面的詳細描述均為示例性的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其他可替換實施方案構(gòu)成限制。附圖簡述

圖1。圖1描繪照片，顯示了用VANGLl衍生肽誘導的CTL的IFN- y ELISPOT測定的結(jié)果。用 VANGLl-AM-9-443 (SEQ ID NO 1)刺激的 5 號孔(a)、用 VANGL1-AM-9-182 (SEQ ID NO 8)刺激的 1 號孔(b)、用 VANGLl-A24-9-184(SEQ ID NO 9)刺激的 5 號孔(c)、 ffi VANGL1-A24-9-109 (SEQ ID NO 11)刺激的 2 號、3 號、5 號、6 號、7 號和 8 號孔(d)、用 VANGL1-A24-9-195 (SEQ ID NO 12)刺激的 2 號和 4 號孔(e)、用 VANGL1-A24-10-234 (SEQID NO 18)刺激的 2 號孔(f)、用 VANGL1-A24-10-123(SEQ ID NO :22)刺激的 1 號、3 號、 6 號和 8 號孔(g)、用 VANGL1-A24-10-231 (SEQ ID NO 24)刺激的 5 號和 6 號孔(h)、用 VANGL1-A24-10-152(SEQ ID NO :25)刺激的 3 號孔(i)、用 VANGL1-A24-10486 (SEQ ID NO 26)刺激的1號和8號孔(j)、及用VANGL1-A24-10-215 (SEQ ID NO 32)刺激的2號孔 (k)中的CTL分別顯示與對照相比強力的IFN-γ生成。這些圖片的孔上的方框指示擴增來自相應孔的細胞以建立CTL系。在圖中，“+"指示針對經(jīng)過適宜的肽沖激過的靶細胞的 IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的細胞的IFN-Y生成。圖加-f。圖加-f描繪線圖，顯示了通過IFN-γ ELISA測定法檢測的經(jīng)過SEQ ID NO: 1(a)、SEQ ID N0:8(b)、SEQ ID NO :9 (c)、SEQ ID NO: 11(d)、SEQ ID NO : 12 (e)、和 SEQ ID NO 18(f)刺激的CTL系的IFN-Y生成。它證明了用每一種肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照相比強力的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對經(jīng)過適宜的肽沖激過的靶細胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的靶細胞的IFN-Y生成。圖2g_j。圖2g_j描繪線圖，顯示了通過IFN-Y ELISA測定法檢測的經(jīng)過SEQ ID NO :22(g)、SEQ ID NO 24(h)、SEQ ID NO :25(i)和 SEQ ID NO :32(j)刺激的 CTL 系的 IFN-Y生成。它證明了用每一種肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照相比強力的IFN-Y 生成。在圖中，“+"指示針對經(jīng)過適宜的肽沖激過的靶細胞的IFN-Y生成，而"-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的靶細胞的IFN-Y生成。圖3。圖3顯示通過有限稀釋而從經(jīng)過SEQ ID NO 8 (a)、SEQ ID NO :18 (b)、SEQ ID NO :22 (c)和SEQ ID NO 24(d)刺激的CTL系建立的CTL克隆的IFN-γ生成。它證明了用 SEQ ID NO :8(a)、SEQ ID NO 18(b)、SEQ ID NO 22 (c)和 SEQ ID NO 24(d)刺激而建立的CTL克隆顯示與對照相比強力的IFN-Y生成。在圖中，“+〃指示針對經(jīng)過SEQ ID N0:8(a)、SEQ ID NO 18(b),SEQ ID NO 22(c)和 SEQ ID NO 24(d)沖激過的靶細胞的 IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的靶細胞的IFN-Y生成。圖4。圖4描繪線圖，顯示了針對表達VANGLl和HLA_AM402的靶細胞的特異性 CTL活性。制備只用HLA-AM402或只用全長VANGLl基因轉(zhuǎn)染的C0S7細胞作為對照。用肽 VANGL1-A24-9-443 (SEQ ID NO 1)建立的 CTL 克隆顯示了針對經(jīng) VANGLl 和 HLA_A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達HLA-AM402 (三角形)或VANGLl (圓形)任一的靶細胞的特異性CTL活性。VANGLl基因，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、 NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。實施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因為它們可依照例行實驗和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。I.定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非另有明確說明。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應的天然存在氨基酸的人工化學模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在氨基酸聚合物。如本文中使用的，術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在氨基酸具有相同的基礎化學結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。術語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，與氨基酸類似，通過它們普遍接受的單字母符號來指稱。除非另有定義，術語“癌癥”指過表達VANGLl基因的癌癥，它的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC 禾口 AML0除非另有定義，術語“細胞毒性T淋巴細胞”、“細胞毒性T細胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞(例如腫瘤細胞、病毒感染的細胞)并誘導此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。除非另有定義，術語“HLA-AM”指HLA-AM型，包括諸如HLA-AM02等亞型。除非另有定義，如本文中使用的，術語“試劑盒”用于指試劑和其它材料的組合。本文中涵蓋，試劑盒可包括微陣列、芯片、標志物、等等。術語“試劑盒”并非意圖限于試劑和 /或材料的特定組合。除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員的普遍理解相同的含義。II.肽為了證明VANGLl衍生的肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對VANGLl (SEQ ID NO 35)衍生的肽進行分析以確定它們是否為HLA-AM(它們是常見的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47 :93-101,1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；Kubo RT et al.，J Immunol 152:3913—24,1994)。使用它們對HLA-AM的結(jié)合親和力的信息來鑒定VANGLl衍生的HLA-AM結(jié)合肽的候選者。下述肽是候選肽VANGL1-A24-9-443(SEQ ID NO 1),VANGL1-A24-9-416(SEQ ID NO 2),VANGL1-A24-9-264(SEQ ID NO 3),VANGLl-A24-9-117(SEQ ID NO 4),
VANGL1-A24-9-129(SEQ IDNO 5)，
VANGLl-A24-9-152(SEQ IDNO 6)，
VANGL1-A24-9-397(SEQ IDNO 7),
VANGL1-A24-9-182(SEQ IDNO 8)，
VANGL1-A24-9-184(SEQ IDNO 9)，
VANGL1-A24-9-286(SEQ IDNO 10)，
VANGL1-A24-9-109(SEQ IDNO 11)，
VANGL1-A24-9-195(SEQ IDNO 12),
VANGL1-A24-9-480(SEQ IDNO 13),
VANGL1-A24-9-215(SEQ IDNO 14)，
VANGL1-A24-9-457(SEQ IDNO 15),
VANGL1-A24-9-244(SEQ IDNO 16)，
VANGL1-A24-9-419(SEQIDNO 17),
VANGL1-A24-10-234(SEQIDNO18),
VANGL1-A24-10-109(SEQIDNO19),
VANGL1-A24-10-221(SEQIDNO20),
VANGL1-A24-10-199(SEQIDNO21),
VANGL1-A24-10-123(SEQIDNO22),
VANGL1-A24-10-193(SEQIDNO23),
VANGL1-A24-10-231(SEQIDNO24),
VANGL1-A24-10-152(SEQIDNO25),
VANGL1-A24-10-286(SEQIDNO26),
VANGL1-A24-10-505(SEQIDNO27),
VANGL1-A24-10-407(SEQIDNO28),
VANGL1-A24-10-186(SEQIDNO29),
VANGL1-A24-10-418(SEQIDNO30),
VANGL1-A24-10-289(SEQIDNO31),
VANGL1-A24-10-215(SEQIDNO:3 ，和
VANGL1-A24-10-263(SEQIDNO33)。
此外，用加載了這些肽的樹突細胞(DC)體外刺激T細胞后，使用每個下述肽，成功地建立了 CTL
VANGL1-A24-9-443(SEQIDNO 1)，
VANGL1-A24-9-182(SEQIDNO 8)，
VANGL1-A24-9-184(SEQIDNO 9)，
VANGL1-A24-9-109(SEQIDNO 11)，
VANGL1-A24-9-195(SEQIDNO 12),
VANGL1-A24-10-234(SEQ ID NO18),
VANGL1-A24-10-123(SEQ ID NO22),
VANGL1-A24-10-231(SEQ ID NO24),
VANGL1-A24-10-152(SEQ ID NO :25)，VANGL1-A24-10-286 (SEQ ID N0:26)，禾口VANGL1-A24-10-215(SEQ ID NO :32)。這些建立的CTL針對經(jīng)相應肽沖激的靶細胞顯示強且特異性的CTL活性。這些結(jié)果證明VANGLl是被CTL識別的抗原，且測試的肽是VANGLl的受HLA-AM限制的表位肽。由于VANGLl基因在諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、 肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML的癌細胞中過表達且在大多數(shù)正常器官中不表達，它是良好的免疫治療靶標。因此，本發(fā)明提供來自VANGLl的被CTL識別的表位的九肽 (由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)?；蛘撸景l(fā)明提供了分離的能結(jié)合HLA抗原和誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的肽，其中該肽由SEQ ID NO 35的氨基酸序列組成或是它的免疫學活性片段。更具體地，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了由選自SEQ ID NO :1，8，9，11，12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列組成的肽。一般而言，目前可以通過例如互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序，諸如Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1，152 (1) 163-75中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1,152(1) :163-75 禾口 Kuzushima K et al.，Blood 2001， 98(6) :1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 20070ct 31 ；8 :424，及Buus S et al. Tissue Antigens. ,62 =378-84,2003中描述的那樣進行測定。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如 Journal of Immunological Methods, 1995,185 :181-190. ；Protein Science, 2000,9 :1838-1846中有描述。因此，可使用此類軟件程序來選擇與HLA抗原具有高結(jié)合親和力的自VANGLl衍生的片段。因此，本發(fā)明涵蓋由使用這些已知程序確定為可與HLA抗原結(jié)合的VANGLl衍生的任何片段組成的肽。另外，此類肽可以包括由全長VANGLl組成的肽。本發(fā)明的這些肽的側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要肽保持其CTL誘導能力即可。所述額外的氨基酸序列可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要它們不損害原來的肽的 CTL誘導能力。因此，本發(fā)明涵蓋包括自VANGLl衍生的且具有對HLA抗原的結(jié)合親和力的肽。這樣的肽為，例如，少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸。—般而言，已知肽中一個或多個氨基酸的修飾不會影響肽的功能，或者在有些情況下甚至會增強原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比通過替換或添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982,10 :6487-500 ；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982，79 :6409-13)。是故，依照本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的具有 CTL誘導能力的肽可以由如下的肽構(gòu)成，其由選自SEQ ID NO 1，8，9，11，12，18，22，24，25， 26和32的氨基酸序列組成，其中添加和/或替代1個、2個或甚至更多個氨基酸。本領域技術人員會認可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加或替換會導致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它經(jīng)常稱作“保守替換”或 “保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導致具有類似功能的蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W, Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N, E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有互為保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留CTL誘導能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不排除VANGLl的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導CTL的肽。為了保持所需的CTL誘導能力，可以修飾(添加或替換)少數(shù)(例如，1個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術語“數(shù)個”意指5個以下的氨基酸，如3個以下。要被修飾的氨基酸的百分比可以是20%或更少，例如15%或更少，例如10%或者1至5%。此外，可在肽中替代或添加氨基酸殘基以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。當在免疫療法中使用時，本發(fā)明的肽作為與HLA抗原的復合物呈遞在細胞或外來體的表面上。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994,152 3913 ；Immunogenetics 1995，41 178 ;J Immunol 1994，155 :4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。例如，在顯示高HLA-AM結(jié)合親和力的肽中，它們N端起第二個氨基酸已被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，而且也可以有利地使用C端氨基酸已被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代的肽。因此， 具有選自SEQ ID NO :1，8，9，11，12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列，其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列中自N端起第二個氨基酸被替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸和/或所述SEQ ID NO的氨基酸序列中位于C端的氨基酸被替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替代，而且可以在潛在T細胞受體(TCR)識別位置處引入替代。數(shù)項研究證明了具有氨基酸替代的肽可等同于或好于原始的，例如CAP1、p53 (264-272)、 Her~2/neu (369—377) 或 gpioo
(209-217)
(Zaremba et al. Cancer Res. 57,4570-4577,1997 ；Τ.K.Hoffmann et al. J Immunol.
(2002)Feb1 ；168 (3) :1338-47 ；S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.
(2003)52:199-206 禾口 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。另外，也可向本發(fā)明肽的N和/或C端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高 HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。然而，當肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能誘導副作用，諸如自身免疫性病癥或針對特定物質(zhì)的變應性癥狀。因此，可利用可得的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。 當根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標肽相比差1個或2個氨基酸的肽亦不存在時，可以修飾目標肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。雖然預期如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標選出的候選肽檢查了 CTL誘導能力的存在。這里，短語 “CTL誘導能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細胞(APC)上時誘導CTL的能力。另外，“CTL誘導能力”包括肽誘導CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。CTL誘導能力的確認如下來實現(xiàn)，誘導攜帶人MHC抗原的APC (例如B-淋巴細胞、 巨噬細胞、和樹突細胞(DC))，或者更具體地說，衍生自人外周血單核白細胞的DC，并且在用肽誘導后，與CD8陽性細胞混合，然后測量由CTL針對靶細胞生成和釋放的IFN-γ。作為反應系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L，Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61 (8) 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice :dependence on HLA class II restricted T (H)response中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標記靶細胞，并且可以自靶細胞釋放的放射性計算細胞毒性活性?；蛘?，可如下來進行檢驗測量在攜帶固定化肽的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- γ，并使用抗IFN- γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。作為如上所述檢查肽的CTL誘導能力的結(jié)果，選自由SEQ ID NO =1,8,9,11,12, 18，22，24, 25，26和32所示的氨基酸序列組成的肽的九肽或十肽顯示特別高的CTL誘導能力以及對HLA抗原的高親和力。因此，這些肽是本發(fā)明的例示性實施方案。另外，同源性分析的結(jié)果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒有顯著的同源性。這降低了用于免疫療法時未知的或不想要的免疫應答的可能性。因此，也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對VANGLl的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選由選自SEQ ID NO :1，8，9，11，12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列組成的肽。除了上文所述對本發(fā)明肽的修飾之外，可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要它們保留CTL誘導能力。其它肽的例子包括本發(fā)明的肽或自其它TAA衍生的CTL可誘導肽。 肽之間的接頭是本領域公知的，例如AAY(P.M. Daftarian et al.，J Trans Med 2007,5 26)、AAA、NKRK (R. P. M-SutmuIler et al. ,J Immunol. 2000，165 :7308-7315)或K (S. Ota et al.，Can Res. 62，1471-1476 ；K. S. Kawamura et al.，J Immunol. 2002，168 :5709-5715)。例如，還可基本上同時使用非VANGLl腫瘤相關抗原肽以提高經(jīng)I類和/11類HLA 的免疫應答。已經(jīng)公認癌細胞能表達超過一種腫瘤相關基因。確定特定受試者是否表達別的腫瘤相關基因，然后在VANGLl組合物或疫苗中包括自此類基因的表達產(chǎn)物衍生的I類 HLA和/或II類HLA結(jié)合肽在本領域普通技術人員的例行實驗的范圍內(nèi)。I類HLA和II類HLA結(jié)合肽會是本領域普通技術人員知道的(例如參見Coulie， Stem Cells 13 :393_403，1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。本領域普通技術人員能依照分子生物學的標準規(guī)程來制備包括一種或多種VANGLl肽和一種或多種非VANGLl肽的多肽或編碼此類多肽的核酸。是故，此類“多表位”(polytope)為兩種或更多種可以以各種排列(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起的、潛在的免疫原性或免疫應答刺激性肽的組。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以在標準免疫方案中施用于例如動物以測試該多表位在刺激、增強和/或引起免疫應答的有效性。所述肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領域公知的(參見例如Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13) 5845-5849,1995 ；Gilbert et al. ,Nature Biotechnol. 15(12) :1280-1284,1997 ；Thomson et al.，J Immunol. 157(2) :822-826,1996 ；Tarn et al.，J Exp. Med. 171(1) :299-306, 1990)?？芍苽浜懈鞣N表位數(shù)目和組合的多表位并測試CTL識別和提高免疫應答的功效。另外，可將本發(fā)明的肽進一步連接至其它物質(zhì)，只要它們保留CTL誘導能力。此類物質(zhì)可包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物、等。本發(fā)明肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化，只要該修飾不破壞本文所述肽的生物學活性。可實施這些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或使多肽穩(wěn)定。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽?？梢砸远喾N方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 此外，如上所述，在替代、刪除或添加1個、2個或數(shù)個氨基酸殘基的經(jīng)修飾肽中， 可篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽的方法。例如，該方法可包括下述步驟a 替代、刪除或添加本發(fā)明肽中的至少一個氨基酸殘基；b:測定所述肽的活性；和c 選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。在本文中，該活性可包括MHC結(jié)合活性、APC或CTL誘導能力和細胞毒性活性。在本文中，本發(fā)明的肽也可以記為“VANGL1肽”或“VANGL1多肽，，。III. VANGLl 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術來制備。例如，肽可以通過合成、通過重組DNA技術或化學合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為包括兩個或更多個肽的較長多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述肽的生物學活性。其它修飾包括摻入D-氨基酸或其它氨基酸模擬物，其可用于例如延長肽的血清半衰期。可以根據(jù)選定的氨基酸序列，借助化學合成來獲得本發(fā)明的肽。例如，可適用于合成的常規(guī)肽合成法包括(i)Peptide Synthesis, Interscience，New York，1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York，1976 ;
(iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co.，1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67^8 ；禾口(vii)Barany G. & Merrifield R. B. ,Peptides Vol. 2, “ Solid Phase Peptide Synthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118?；蛘?，可應用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達形式(例如處于相當于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)移入合適宿主細胞。本發(fā)明也提供此類載體和宿主細胞。然后培養(yǎng)宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括由天然存在型VANGLl 基因(GenBank Accession No. AB057596 (SEQ ID NO :；34))衍生的多核苷酸及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。 本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領域技術人員會認識到，可以修飾核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。 因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物構(gòu)成。正如本領域公知的，DNA分子由堿基諸如天然存在的堿基A、T、C、和G構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。技術人員會認識到，多核苷酸中也包括非天然存在的堿基。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，其中有或無居間氨基酸序列存在。例如， 居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標志基因等等的表達載體 (質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學合成技術都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘撸山柚鶳CR技術或通過在合適宿主中的表達來擴增多核苷酸(參見例如Sambrook et al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘?，可使用固相技術來合成多核苷酸，如 Beaucage SL &Iyer RP, Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ； Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。V.夕卜來體(exosomes)本發(fā)明進一步提供了稱作外來體的細胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來制備，并可以用從治療和/或預防所針對的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗與本發(fā)明的肽相似地進行接種。復合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型匹配。例如，對于日本人，HLA-AM(特別是HLA-AM02)常常是適宜的。使用在日本人和白種人中高表達的AM型有利于獲得有效的結(jié)果，而且可使用諸如A2402等亞型。典型的，在臨床上，預先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對此抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導能力的肽。此外，為了獲得顯示高結(jié)合親和力和CTL誘導能力的肽，可以在天然存在的VANGLl部分肽的氨基酸序列的基礎上進行1個、2個或幾個氨基酸的取代、刪除、或添加。在將AM型HLA抗原用于本發(fā)明的外來體的情況中，可使用包括SEQ ID N0:1,8, 9，11，12，18，22，24，25，26 和 32 的序列的肽。VI.抗原旱.遞細胞(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復合物的分離的APC。APC可衍生自要進行治療和/或預防的患者，而且可作為疫苗以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。APC不限于特定種類的細胞，包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的APC。例如，可通過自外周血單核細胞誘導DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得本發(fā)明的APC。當對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導出呈遞本發(fā)明肽的APC。因此，本發(fā)明的APC可通過將本發(fā)明的肽施用于受試者后自受試者收集APC來獲得?；蛘?，本發(fā)明的APC可通過使自受試者收集的APC接觸本發(fā)明的肽來獲得?？梢詫⒈景l(fā)明的APC施用于受試者以在受試者中以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL)組合來誘導針對癌癥的免疫應答。例如，離體施用可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b 使肽接觸步驟a的APC ；并c 對第二受試者施用步驟b的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。通過步驟b獲得的APC可作為疫苗用來治療和/或預防癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、 子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。依照本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導能力。在術語“高水平的CTL 誘導能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導能力的APC可通過上文所述方法以及下述方法來制備，該方法包括在體外將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)移至APC的步驟。所導入的基因可以是DNA 或RNA的形式。用于進行導入的方法的例子包括但不具體限于本領域中常規(guī)實施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Resl996, 56 :5672-7 ;J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Med 1996，184 :465-72 ；國際公開文本 No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的部分肽。VII.細胞毒件T淋巴細胞(CTL)被誘導的針對任何本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強靶向癌細胞的免疫應答，并且因此可以與肽相似地用作疫苗。因此，本發(fā)明提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導或活化的、分離的 CTL。此類CTL可通過下述步驟來獲得(1)對受試者施用本發(fā)明的肽；或( 在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細胞、或外周血單核白細胞；或(3) 在體外使CD8-陽性細胞或外周血單個核白細胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與肽之間形成的復合物的APC或外來體；或(4)導入包括編碼T細胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因，所述TCR亞單位能結(jié)合本發(fā)明的肽。上述APC或外來體可通過上文記載的方法來制備，而且(4)之方法的詳情記載于下文“VIII. T細胞受體(TCR) ”部分?？梢詮囊M行治療和/或預防的患者獲取本發(fā)明的CTL，而且可以將它們單獨施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽，例如與用于誘導的肽相同的肽的靶細胞起作用。靶細胞可以是內(nèi)源表達VANGLl的細胞，諸如癌細胞，或被VANGLl基因轉(zhuǎn)染的細胞；而且因肽的刺激而在細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細胞也可充當活化CTL攻擊的靶標。VIII. T 細胞受體(TCR)本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的多核苷酸，及使用該組合物的方法。TCR亞基具有形成賦予T細胞針對呈遞VANGLl的腫瘤細胞的特異性的TCR的能力。通過使用本領域已知的方法，可鑒定出用本發(fā)明的一種或多種肽誘導的CTL的TCR亞基α和β鏈的核酸(W02007/032255及Morgan et al.，J Immunol, 171, 3288 (2003)) 0例如，優(yōu)選使用PCR方法來分析TCR。用于分析的PCR引物可以是但不限于例如作為5'側(cè)引物的5' -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3 ‘) (SEQ ID NO 36)和作為3 ‘側(cè)引物的對TCRa鏈C區(qū)特異性的3_TRa_C引物 (5 ‘ -tcagctggaccacagccgcagcgt-3 ‘ ) (SEQ ID NO 37)、對 TCRβ 鏈 Cl 區(qū)特異性的 3-TRb-Cl 引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3‘ ) (SEQ ID NO :38)或?qū)?TCRβ 鏈 C2 區(qū)特異性的 3-TObeta_C2 引物(5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3‘ ) (SEQ ID NO 39) 衍生的TCR能以高親合力結(jié)合展示VANGLl肽的靶細胞，且任選在體內(nèi)和在體外介導有效的對呈遞VANGLl肽的靶細胞的殺傷?？梢詫⒕幋aTCR亞基的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領域公知的?？蓪⒂杏玫暮怂峄蚝兴鼈兊妮d體轉(zhuǎn)移入T細胞，例如來自患者的T細胞。 有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自己的T細胞(或其他哺乳動物的T細胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。特異性TCR是一種能夠特異性識別本發(fā)明肽和HLA分子形成的復合物的受體，當 TCR在T細胞的表面上呈遞時，給予T細胞針對靶細胞的特異性活性。對上述復合物的特異性識別可通過任何已知方法來確認，而且優(yōu)選的方法包括例如使用HLA分子和本發(fā)明肽的四聚物分析，及ELISP0T測定法。通過實施ELISP0T測定法，能確認在細胞表面上表達TCR 的T細胞通過TCR來識別細胞，而且信號在細胞內(nèi)傳輸。當上文所述復合物存在于T細胞表面上時，該復合物可給予T細胞以細胞毒性活性的確認也可通過已知方法來進行。一種優(yōu)選的方法包括例如測定針對HLA陽性靶細胞的細胞毒性活性，諸如鉻釋放測定法。此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-AM的背景下結(jié)合SEQ ID N0:1,8,9,11, 12，18，22，24，25，26和32的VANGLl肽的TCR亞單位的核酸轉(zhuǎn)導而制備的CTL0經(jīng)過轉(zhuǎn)導的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細胞，并且可以利用公知的體外培養(yǎng)方法擴增(例如 Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))?？梢岳帽景l(fā)明的 CTL 來形成免疫原性組合物，所述組合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療或預防癌癥 (W02006/031221)。預防和防范包括降低來自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病進展和癥狀出現(xiàn)以及降低已建立的疾病的負面影響的活動，這通過恢復功能和減輕疾病相關并發(fā)癥來實現(xiàn)?；蛘撸A防和防范包括廣泛的預防療法，它們旨在減輕特定病癥的嚴重性，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移、降低血管發(fā)生。治療和/或預防癌癥或，和/或預防其手術后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術清除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、 及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預防降低患癌個體的死亡率并改善其預后，降低血液中腫瘤標志物的水平，及減輕伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預防包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。IX.藥物物質(zhì)或組合物預防和防范包括降低來自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病進展和癥狀出現(xiàn)以及降低已建立的疾病的負面影響的活動，這通過恢復功能和減輕疾病相關并發(fā)癥來實現(xiàn)?；蛘?，預防和防范包括廣泛的預防療法，它們旨在減輕特定病癥的嚴重性，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移、降低血管發(fā)生。治療和/或預防癌癥或，和/或預防其手術后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術清除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、 及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預防降低患癌個體的死亡率并改善其預后，降低血液中腫瘤標志物的水平，及減輕伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預防包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。由于VANGLl表達在癌癥(諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML)中與正常組織相比特異性升高，本發(fā)明的肽或多核苷酸可用于治療和/或預防癌癥，和/或預防它們的手術后復發(fā)。因此，本發(fā)明提
17供用于治療和/或預防癌癥，和/或預防它們的手術后復發(fā)的藥物物質(zhì)或組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的肽或多核苷酸作為活性組分?；蛘撸梢栽谌魏紊鲜鐾鈦眢w或細胞諸如 APC的表面上表達本發(fā)明的肽，以用作藥物物質(zhì)或組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物的活性組分。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)中的用途(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞?；蛘?，本發(fā)明進一步提供用于治療或預防癌癥或腫瘤的選自下組的活性組分(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。或者，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學或生理學可接受載體與選自下組的活性組分作為活性組分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學或生理學可接受載體的步驟，其中所述活性組分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可用作疫苗。在本發(fā)明中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩， 特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括SEQ ID而1，8，9，11，12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列的肽是HLA-AM限制性表位肽或能誘導針對表達強且特異性的免疫應答的候選者。因此，包括任何這些具有SEQ ID而1，8，9，11，12，18，22，24，25，26和32的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-AM的受試者施用。這同樣適用于含有編碼任何這些肽的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥物物質(zhì)或藥物組合物。要用本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物治療的癌癥不受限制，包括其中涉及(例如過表達)VANGLl的任何癌癥，例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、 NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。除上述活性組分之外，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物還可含有其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞等等。在本文中，其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分例如任何本發(fā)明肽的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎物質(zhì)或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學物質(zhì)或組合物順序或同時施用。藥物和藥理學物質(zhì)或組合物的量取決于例如所使用的藥理學物質(zhì)或組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。應當理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可包括與所討論的配制劑類型相關的本領域常規(guī)的其它物質(zhì)或組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物的容器及標簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。 容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標簽應指明該物質(zhì)或組合物用于治療或預防一種或多種疾病狀況。標簽還可指明關于施用的指導等等。除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物的試劑盒還可任選進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受稀釋劑。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。如果期望的話，藥物組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(1)含有肽作為活性組分的藥物物質(zhì)或組合物本發(fā)明的肽可以作為藥物物質(zhì)或組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除了本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、等等。另外，藥物物質(zhì)或組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可組合制備，其包括兩種或更多種本發(fā)明的肽，以在體內(nèi)誘導CTL。 肽可處于雞尾酒的形式，或者可使用標準技術彼此綴合。例如，可以將肽化學連接或表達成為單一融合多肽序列，其可具有一個或數(shù)個氨基酸作為接頭(例如賴氨酸接頭 K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002，168 :5709-5715)。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度呈遞在APC上，然后誘導出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復合物特異性起反應的CTL?；蛘?，自受試者取出APC (例如 DC)，然后用本發(fā)明的肽刺激以獲得在其細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的APC。將這些APC再施用于受試者以在受試者中誘導CTL，結(jié)果能提高針對腫瘤相關內(nèi)皮的攻擊性。包括本發(fā)明肽作為活性組分、用于治療和/或預防癌癥的藥物物質(zhì)或組合物可包括佐劑以便有效建立細胞免疫，或者它們可以與其它活性組分一起施用，而且它們可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時增強針對蛋白質(zhì)的免疫應答的化合物?？蓱玫淖魟┌ㄎ墨I中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89)。例示性的佐劑包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISC0Matrix、GM_CSF、CpG、0/W乳液、諸如此類，但不限于此。另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制劑、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽也可以以藥學可接受鹽的形式施用。 鹽的優(yōu)選例子包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽和與無機酸的
Τττ . ο在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物包括引發(fā)(Prime)CTL的成分。已經(jīng)將脂質(zhì)鑒定為能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的物質(zhì)或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基附著至賴氨酸殘基的和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應答的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚酰基-S-甘油基半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)，當共價附著至適宜的肽時，可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres et al.，Nature 1989,342 :561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依照要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調(diào)整，而且通常是 0. OOlmg至1，OOOmg,例如0. OOlmg至1，OOOmg,例如0. Img至10mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物物質(zhì)或組合物本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物也可包括處于可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達形式的”意味著多核苷酸在導入細胞時會在體內(nèi)表達成能誘導抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細胞的基因組所需的配置(關于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51 :503-12)。參見例如 Wolff et al.，Science 1990,247 :1465-8 ； U. S. Patent Nos. 5，580，859 ；5，589，466 ；5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ； 和TO98/04720?；贒NA的投遞技術的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導的)投遞、陽離子脂質(zhì)復合物、和顆粒介導的(“基因槍”)或壓力介導的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。 在導入宿主后，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應答。可用于免疫接種方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是BCG(卡介苗)。 BCG載體記載于Mover et al.，Nature 1991,351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如Siata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol2000，68 :793-806 ； Hipp et al.，In Vivo 2000,14:571-85。將多核苷酸投遞入患者可以是直接的，在該情況中患者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，在該情況中首先在體外用感興趣多核苷酸轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植入患者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33:573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993,62 :191-217 ；Trends in Biotechnology 1993,11(5) 155-215。重組DNA技術領域普遍知道的也可用于本發(fā)明的方法記載于eds. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993 ；禾口 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化?？梢砸勒找委煹募膊?、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當調(diào)整合適載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞中的多核苷酸的劑量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和多核苷酸可用于制備或誘導APC和CTL。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不抑制它們的CTL誘導能力。是故，任何上述本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物均可用于誘導 CTL，而且在它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導APC，如下文解釋的。(1)誘導抗原呈遞細胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導具有高CTL誘導能力的APC的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸APC的步驟。例如，離體用肽接觸APC的方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;并b 用肽接觸步驟a的APC。APC不限于特定種類的細胞，而且包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細胞識別。優(yōu)選地，由于DC是APC中具有最強CTL誘導能力的，可使用DC。任何本發(fā)明肽可以以
21它們自身或與其它本發(fā)明肽一起使用。另一方面，在將本發(fā)明肽施用于受試者時，APC在體內(nèi)接觸肽，因此在受試者的身體中誘導出具有高CTL誘導能力的APC。是故，本發(fā)明包括將本發(fā)明的肽施用于受試者。類似地，在將可表達形式的本發(fā)明多核苷酸施用于受試者時，本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達并與APC 接觸，因此在受試者的身體中誘導出具有高CTL誘導能力的APC。是故，本發(fā)明還可涵蓋將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者?！翱杀磉_形式”描述于上文“IX.藥物物質(zhì)或組合物(2) 含有多核苷酸作為活性組分的藥物物質(zhì)或組合物”部分。另外，本發(fā)明包括將本發(fā)明的多核苷酸導入APC以誘導具有CTL誘導能力的APC。 例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;并b 導入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。步驟b可如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分中所述來實施?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于制備能特異性誘導針對VANGLl的CTL活性的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中該方法包括下述步驟之一(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸本發(fā)明的肽；和(b)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導入APC。(2)誘導CTL的方法另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導CTL的方法。本發(fā)明還提供了使用編碼能夠形成如下的T細胞受體(TCR)亞單位的肽的多核苷酸來誘導CTL的方法，其中該T細胞受體(TCR)亞單位識別本發(fā)明的肽和HLA抗原形成的復合物。優(yōu)選地，用于誘導CTL的方法包括至少一個選自下組的步驟a)使CD8陽性T細胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的抗原呈遞細胞和/或外來體；和b)將編碼能夠形成如下的TCR亞單位的多肽的多核苷酸導入CD8陽性細胞，其中該TCR亞單位識別本發(fā)明的肽和HLA抗原形成的復合物。當本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC、或外來體被施用給受試者后，在受試者的身體中誘導出CTL，并增強靶向癌細胞的免疫應答的強度。是故，本發(fā)明的方法包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者的步驟。或者，也可通過離體使用它們來誘導CTL，并在誘導CTL后，將活化的CTL返還受試者。例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b 使步驟a的APC接觸肽；并c 將步驟b的APC與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)。上文步驟c中要與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分所述；但是不限于此，而且任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的APC均可用于本發(fā)明的方法。作為此類APC的替代，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的外來體。即，本發(fā)明可包括共培養(yǎng)在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物
22的外來體的步驟。此類外來體可通過上文“V.外來體”部分中描述的方法來制備。另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)擘?陽性細胞來誘導CTL。此類轉(zhuǎn)導可如上文“VIII. T細胞受體(TCR) ”部分中所述來實施。描述了合適的方法和材料，盡管在實施或檢驗本發(fā)明時可以使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。通過述及完整收錄本文中提及的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文獻。若有沖突，以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法、和實施例只是例示性的，而且并非意圖為限制性的。(3)誘導免疫應答的方法此外，本發(fā)明提供了用于誘導針對涉及VANGLl的疾病的免疫應答的方法。合適的疾病包括癌癥，其例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。該方法包括施用含有任何本發(fā)明肽或編碼它們的多核苷酸的物質(zhì)或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC。關于詳情參見“IX.藥物物質(zhì)或組合物”部分，特別是描述本發(fā)明的藥物物質(zhì)或組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于誘導免疫應答的本發(fā)明方法的外來體和APC詳細描述于上文“V.外來體”、“VI. 抗原呈遞細胞(APC) ”、和“X.使用肽、外來體、APC和CTL”的(1)和(2)部分。本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導免疫應答的藥物物質(zhì)或組合物的方法或工藝， 其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學可接受載體的步驟?；蛘撸景l(fā)明的方法可包括施用疫苗或藥物組合物的步驟，其包含(a)本發(fā)明的肽；(b)處于可表達形式的編碼本文中公開的此類肽的核酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體；或(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。在本發(fā)明中，過表達VANGLl的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、 SCLC和AML。因而，在施用包括活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認要治療的細胞或組織中的VANGLl表達水平與相同器官的正常細胞相比增強了。是故，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療(過)表達VANGLl的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟i)測定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的VANGLl表達水平；ii)將VANGLl表達水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達VANGLl的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分。或者，本發(fā)明還提供了包括至少一種選自上文所述(a)至(d) 的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對具有過表達VANGLl的癌癥的受試者施用。換言之， 本發(fā)明進一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明VANGLl多肽來治療的受試者的方法，所述方法可包括測定源自受試者的細胞或組織中的VANGLl表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明VANGLl多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法將在下面更加詳細的加以敘述。要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在自受試者獲得的細胞或組織中VANGLl的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平確定，使用本領域已知方法。舉例而言，VANGLl的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈嵤┧鰴z測。對檢測VANGLl的表達水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領域技術人員可利用VANGLl的序列信息制備上述探針。舉例而言，VANGLl的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標志，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達水平可以所雜交的標記物的強度檢測。進一步，VANGLl的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO 34)可通過基于擴增的檢測方法 (例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等條件或低嚴格條件下與 VANGLl的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約 0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實現(xiàn)?；蛘撸梢詸z測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定VANGLl蛋白(SEQ ID NO 35)或其免疫學片段的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，其使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv, Fab,F(ab' )2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對VANGLl蛋白的結(jié)合能力即可。本發(fā)明還提供此類針對本發(fā)明肽的抗體及其片段。 制備這些種類的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于VANGLl的翻譯產(chǎn)物檢測VANGLl基因表達水平的方法，可利用針對VANGLl蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量染色的強度。意即，在此測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時表明VANGLl的高表達水平。對于靶基因例如VANGLl基因在癌細胞中的表達水平，如果該水平較之靶基因的對照水平(例如在正常細胞中的水平)增加了例如10^^25%或50%，或增加到超過1. 1 倍、超過1. 5倍、超過2. 0倍、超過5. 0倍、超過10. 0倍或者更多的話，可確定該水平是增加的。對照水平可以使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品與癌細胞同時確定。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細胞可用作正常對照?；蛘撸瑢φ账娇梢越柚y(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的VANGLl基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達樣式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中VANGLl基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中VANGLl基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值士2S.D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標準值。在本發(fā)明的語境中，從已知非癌性的生物學樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物學樣品確定，則稱作“癌性對照水平”。當VANGLl基因的表達水平相比正常對照水平有所提高或與癌性對照水平相似/ 等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。更具體地，本發(fā)明提供了一種(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii) 選擇受試者進行癌癥治療的方法，該方法包括下述步驟a)測定VANGLl在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的表達水平；b)將VANGLl的表達水平與正常對照水平比較；c)若VANGLl的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟C)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。或者，此類方法包括下述步驟a)測定VANGLl在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的表達水平； b)將VANGLl的表達水平與癌性對照水平比較；c)若VANGLl的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟C)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。本發(fā)明還提供了用于診斷或確定患有或懷疑患有癌癥的受試者是否能用本發(fā)明 VANGLl多肽來治療的診斷試劑盒，其亦可用于評價和/或監(jiān)測癌癥免疫療法功效或?qū)嵱眯浴?yōu)選地，所述癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、 肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選包含至少一種用于檢測源自受試者的細胞中的VANGLl基因表達的試劑，所述試劑可選自下組(a)檢測VANGLl基因的mRNA的試劑；(b)檢測VANGLl的蛋白質(zhì)或其免疫學片段的試劑；和(c)檢測VANGLl的蛋白質(zhì)的生物學活性的試劑。適于檢測VANGLl基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或鑒定VANGLlmRNA的核酸，諸如具有與VANGLl mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類的寡核苷酸以對VANGLl mRNA特異性的引物和探針為例。可基于本領域眾所周知的方法制備這些種類的寡核苷酸。 如果需要，檢測VANGLl mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測VANGLl mRNA的試劑。另一方面，適于檢測VANGLl蛋白質(zhì)或其免疫學片段的試劑可包括針對VANGLl蛋白質(zhì)或其免疫學片段的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，所述抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、sCFV、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與VANGLl蛋白或其免疫學片段的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備這些種類的抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或非直接標記技術進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其靶結(jié)合的方法在本領域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測VANGLl蛋白質(zhì)的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、針頭、注射器、和帶有使用說明的包裝插頁(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑之類的可與標簽一起包含在容器中。 合適的容器包括瓶、管形瓶和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的一個實施方案，當所述試劑是針對VANGLl mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)上，例如多孔條，以形成至少一個檢測位點。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位點?；蛘?，對照位點可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位點上量較大而在接下來的位點上量較小。在添加測試樣品之后，展示可檢測信號位點的數(shù)目提供了在樣品中存在的VANGLl mRNA量的定量指征。所述檢測位點可配置成任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或VANGLl標準樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集VANGLl陽性樣品，隨后測定其VANGLl水平來制備?；蛘撸蓪⒓兓腣ANGLl蛋白或多核苷酸添加到不表達VANGLl的細胞中以形成所述陽性樣品或 VANGLl標準樣品。在本發(fā)明中，純化的VANGLl可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的 VANGLl水平大于截留值。在一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種診斷試劑盒，其包括能夠特異性識別本發(fā)明抗體或其片段的蛋白或其部分蛋白。本發(fā)明的蛋白的部分肽的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個、優(yōu)選15個、更優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸組成的多肽。癌癥可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽(多肽) 檢測樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明蛋白和肽的方法。用于癌癥的診斷方法可通過如上所述測定抗VANGLl抗體量和相應對照樣品中的量之間的差異來進行。若受試者的細胞或組織含有針對該基因的表達產(chǎn)物(VANGLl)的抗體和抗VANGLl抗體的數(shù)量測定為大于截留值(與正常對照中的水平相比)的話，則該受試者懷疑患有癌癥。在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA 分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的方法早已確立(例如Altman JD etal.，Science. 1996,274(5284) :94-6)。是故，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復合物可用于檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌癥的復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進一步，它可用于選擇適合包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的受試者或評估該藥物的治療效果。特別地，依照已知方法(參見例如Altman JD et al. ,Science. 1996,274(5284) 94-6)，可制備放射性標記的HLA分子和本發(fā)明肽的寡聚物復合物，諸如四聚體。憑借使用該復合物，可例如通過對來源于懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細胞中的抗原-肽特異性CTL進行定量來實施診斷。本發(fā)明進一步提供了如本文所述使用肽表位來評估受試者的免疫學應答的方法或診斷劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用本文所述的HLAA-24限制型肽作為試劑來評估或預測受試者的免疫應答。要評估的免疫應答通過在體外或在體內(nèi)使免疫原接觸有免疫能力的細胞來誘導。在一些實施方案中，可采用任何能導致識別和結(jié)合肽表位的抗原特異性CTL生成的作用劑作為試劑。肽試劑無需用作免疫原。用于此類分析的測定系統(tǒng)包括相對較新的技術發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放測定法、或ELISP0T測定法。在一個優(yōu)選的實施方案中，要用肽試劑接觸的有免疫能力的細胞可以是抗原呈遞細胞， 包括樹突細胞。例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測定法，在暴露于腫瘤細胞抗原或免疫原后， 對外周血單個核細胞評估抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復合物可用于直接顯現(xiàn)抗原特異性 CTL(參見例如 Ogg et al.，Science 279 :2103_2106，1998 ；和 Altman et al, Science 174 =94-96,1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下來生成與HLA分子結(jié)合的肽在相應HLA重鏈和β 2_微球蛋白存在下重折疊以生成三分子復合物。在該復合物中，重鏈的羧基末端在先前改造入蛋白質(zhì)的位點處被生物素化。然后，將鏈霉親合素添加至復合物以形成由三分子復合物和鏈霉親合素組成的四聚體。通過熒光標記的鏈霉親合素，四聚體能用于對抗原特異性細胞染色。然后可鑒定細胞，例如通過流式細胞術。此類分析可用于診斷或預后目的。通過該規(guī)程鑒定的細胞也可用于治療目的。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應答的試劑(參見例如Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100 :503-513,1997 和 Penna et al.，J Exp. Med. 174 :1565-1570, 1991)。例如，使用特定肽對來自具有要治療的癌癥的個體的患者PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細胞的血液樣品可通過培養(yǎng)PBMC并用本發(fā)明的肽刺激該細胞來加以評估。經(jīng)過適宜的培養(yǎng)時段后，可對擴增的細胞群體分析例如CTL活性。肽還可作為試劑用于評估疫苗的功效?？墒褂美缟衔乃龇椒▉矸治鲎砸呙缃臃N免疫原的患者獲得的PBMC。對患者測定HLA型，并選擇識別該患者體內(nèi)存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領域公知技術(參見例如 CURRENTPR0T0C0LSINIMMUN0L0GY， Wiley/Greene, NY;和 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用于診斷或監(jiān)測癌癥。此類抗體可包括識別HLA分子背景中的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC 復合物的抗體。
或者，本發(fā)明還提供了多種用途，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明提供了一種用于診斷或檢測以VANGLl免疫原性多肽表達為特征的病癥的方法。這些方法涉及測定 VANGLl HLA結(jié)合肽、或VANGLl HLA結(jié)合肽和I類HLA分子形成的復合物在生物學樣品中的表達。肽或肽與I類HLA分子形成的復合物的表達可通過用針對肽或復合物的結(jié)合配偶測定來測定或檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對肽或復合物的結(jié)合配偶是識別和特異性結(jié)合肽的抗體。VANGLl在生物學樣品諸如腫瘤活檢中的表達也可使用VANGLl引物通過標準PCR擴增方案來測試。本文中呈現(xiàn)了腫瘤表達的一個例子，而且用于VANGLl擴增的例示性條件和引物的進一步公開內(nèi)容可見于102003/^27322。優(yōu)選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學樣品接觸對VANGL1HLA結(jié)合肽特異性的試劑以檢測VANGLl HLA結(jié)合肽在生物學樣品中的存在。如本文中使用的，“接觸”意味著在適宜條件(例如濃度、溫度、時間、離子強度)下將生物學樣品置于足夠接近試劑處， 以容許試劑和生物學樣品中存在的VANGLl HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般地，試劑接觸生物學樣品的條件是本領域普通技術人員知道的促進生物學樣品中分子與其關聯(lián)物(例如蛋白質(zhì)與其受體關聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關聯(lián)物、核酸與其互補序列關聯(lián)物) 之間的特異性相互作用的條件。用于促進分子與其關聯(lián)物之間的特異性相互作用的例示性條件記載于授權(quán)給Low等人的美國專利No. 5，108，921。本發(fā)明的診斷方法可以在體外和/或在體外實施。因而，生物學樣品在本發(fā)明中可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對VANGLl免疫原性多肽特異性的試劑來檢測此類分子在組織中的存在?；蛘?，可在體外收集或分離生物學樣品 (例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物學樣品可以是含有細胞的樣品，更優(yōu)選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤細胞的樣品?；蛘撸\斷可通過容許通過對熒光素標記的HLA多聚體復合物染色而直接定量抗原特異性 T 細胞的方法來進行(例如 Altman, J. D. et al.，1996，Science274 :94 ；Altman, J. D. et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :10330)。還提供了對胞內(nèi)淋巴因子的染色和干擾素-Y釋放測定法或ELISP0T測定法。四聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染色和ELISP0T 測定法都表現(xiàn)出比更常規(guī)的測定法靈敏至少10倍(Murali-Krishna, K. et al.，1998， Immunity 8 177 ；Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186 :859 ；Dunbar, P. R. et al., 1998，Curr. Biol. 8 :413)。也可使用五聚體(例如 US 2004-209295A)、Dextramers (e. g.， WO 02/07洸31)、和 Mi^ptamers (例如 Nature medicine 6. 631-637 (2002)) XI.抗體本發(fā)明提供了能與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體能特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會結(jié)合(或會微弱結(jié)合)非本發(fā)明的肽?；蛘?，抗體能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同源物。針對本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥診斷和預后測定法、及成像方法。類似地，此類抗體可用于其它癌癥的治療、針對、和/或預后，只要癌癥患者中也表達或過表達VANGL1。此外，胞內(nèi)表達的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用于治療涉及VANGLl表達的癌癥，諸如例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、 SCLC 禾口 AML0本發(fā)明還提供了多種免疫學測定法，用于檢測和/或量化VANGLl蛋白(SEQ ID NO 35)或其片段，包括由選自SEQ ID NO 1_33的氨基酸序列組成的多肽。此類測定法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識別和結(jié)合VANGLl蛋白或其片段的抗VANGLl抗體。在本發(fā)明中，能與VANGLl多肽結(jié)合的抗VANGLl抗體優(yōu)選識別由選自SEQ ID NO 1-33的氨基酸序列組成的多肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測試來確認。即，當抗體與所分析的全長VANGLl 多肽之間的結(jié)合在任何由選自SEQ ID NO :1-33的氨基酸序列組成的片段多肽的存在下受到抑制時，顯示此抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明中，此類免疫學測定法以本領域公知的各種免疫學測定模式實施，這些模式包括但不限于各種類型的放射免疫測定、免疫層析技術、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定(ELIFA)、等等。本發(fā)明的有關的免疫學的但非抗體的測定法也包括T細胞免疫原性測定法(抑制性的或刺激性的)以及主要組織相容性復合物(MHC)結(jié)合測定法。另外，本發(fā)明還提供了能夠檢測表達VANGLl的癌癥的免疫學成像方法，包括但不限于使用經(jīng)標記的本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測定法在臨床上可用于表達VANGLl的癌癥的檢測、監(jiān)測、和預后，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC 禾口 AML。本發(fā)明提供了能與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用， 諸如單克隆或多克隆抗體，而且包括通過用本發(fā)明的肽免疫動物諸如家兔而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。作為抗原用于獲得抗體的本發(fā)明肽可源自任何動物物種，但優(yōu)選源自哺乳動物， 諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選源自人。源自人的肽可以由本文所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。在本文中，抗體定義為能與VANGLl肽的全長或片段起反應的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體識別VANGLl的片段肽，其由選自SEQ ID N0:l_33的氨基酸序列組成。用于合成寡肽的方法是本領域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。在本發(fā)明中，寡肽(例如9或10聚物)可綴合或連接有載體以增強免疫原性。匙孔蟲威血藍蛋白(KLH)作為載體是公知的。綴合KLH與肽的方法也是本領域公知的?；蛘?，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述宿主細胞?？梢酝ㄟ^任何標準方法從宿主細胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片段，然后可將其用作抗原?；蛘?，表達肽的完整細胞或其溶胞物或者化學合成的肽也可用作抗原?？梢杂每乖庖呷魏尾溉閯游铮珒?yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。嚙齒目動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如家兔。靈長目動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、沸沸(sacred baboon)禾口黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫動物的方法是本領域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑諸如弗氏(Freimd)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不
29完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的載體進行免疫。如上所述進行免疫后，通過標準方法檢驗血清中所需抗體的量的增加?？梢匀缦轮苽溽槍Ρ景l(fā)明肽的多克隆抗體從經(jīng)過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經(jīng)檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液，并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，并且可以從所述血清中分離含有該多克隆抗體的級分。可以使用例如偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識別本發(fā)明肽的級分中制備免疫球蛋白G 或M,并進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。為了制備單克隆抗體，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細胞，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細胞融合的優(yōu)選親本細胞包括例如哺乳動物骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細胞而獲得的特性的骨髓瘤細胞。根據(jù)已知的方法，例如Milstein 等 O^alfre 和 Milstein，Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))的方法，可與將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞進行融合。通過在標準選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基) 中進行培養(yǎng)，可以選擇出由細胞融合得到的雜交瘤。通常，細胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數(shù)天至數(shù)周，這段時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然后，進行標準有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細胞。除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達肽的細胞或其溶胞物免疫人淋巴細胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細胞。然后，使經(jīng)過免疫的淋巴細胞與能夠無限分裂的人衍生骨髓瘤細胞諸如U266融合，以產(chǎn)生生成所需人抗體(它能夠與所述肽結(jié)合)的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請No. (JP-A)Sho 63-17688)。隨后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進行純化。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動劑和拮抗劑的候選物。或者，可以通過癌基因使生成抗體的免疫細胞，諸如經(jīng)過免疫的淋巴細胞永生化，并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術來重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導入宿主細胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它能結(jié)合一種或多種本發(fā)明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv 片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83(1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段?；蛘撸梢詷?gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在合適的宿主細胞中表達(參見例如 Co et al.，J Immunol 152 =2968-76(1994) ；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989) ；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178 :497-515(1989) ；Lamoyi, Methods Enzymol 121 :652-63(1986) ；Rousseaux et al. , Methods Enzymol 121 :663-9(1986) ；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9 132-7(1991))?？贵w可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這樣修飾的抗體?？赏ㄟ^化學修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領域常規(guī)的。或者，可以以衍生自非人抗體的可變區(qū)與衍生自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含衍生自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、衍生自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術來制備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替換人抗體的相應序列來進行(參見例如Verhoeyen et al., Science 239 1534-1536 (1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的很小一部分(substantially less than intact human variable domain)已被來自非人物禾中的相應序列所替換。也可以使用在人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完全人的抗體。此類抗體可使用本領域已知的多種技術來制備。例如，體外方法牽涉使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如 Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos. 6，150，584 ；5, 545，807 ；5, 545，806 ； 5，569，825 ；5, 625，126 ；5, 633，425 ；5, 661，016?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體 (Antibodies :A Laboratory Manual. Ed Harlow 禾口 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和S印harose F. F. (Pharmacia)。除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層 1斤、吸附層 1斤、等等(Strategies for Protein Purification ^P Characterization A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進行層析規(guī)程，諸如HPLC和FPLC。例如，可使用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)和/或免疫熒光來測量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有所需抗體的樣品，諸如生成抗體的細胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標記的、識別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對硝基苯酯，并測量吸光度以評估樣品的抗原結(jié)合活性。可以使用肽的片段，諸如C-末端或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Wmrmacia)來評估本發(fā)明抗體的活性。
使用上述方法可以按照下述方式檢測或測量本發(fā)明的肽將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測或測量由抗體與肽形成的免疫復合物。因為依照本發(fā)明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用于使用肽的各種實驗。XII.載體和宿主細胞本發(fā)明還提供了導入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明的載體可用于在宿主細胞中維持本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA，用于表達本發(fā)明的肽，或者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。當宿主細胞為大腸桿菌且在大腸桿菌(例如JM109、DH5 α、HBlOl或XLlBlue)中大量擴增和生成載體時，載體應具有能在大腸桿菌中擴增的“(復制)起點”和用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標志基因(例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用Μ13系列載體、pUC系列載體、PBR322、 pBluescript.pCR-Script等。另外，與上述載體一樣，pGEM_T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提取cDNA。當使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，表達載體是尤其有用的。例如， 要在大腸桿菌中表達的表達載體應具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當使用大腸桿菌諸如JM109、DH5 α、HBlOl或XLlBlue作為宿主細胞時，載體應具有能在大腸桿菌中高效表達所需基因的啟動子，例如 IacZ 啟動子(Ward et al.，Nature 341:544-6(1989) ；FASEB J 6 :2422-7(1992))、araB 啟動子(Better et al. , Science 240 1041-3 (1988))、T7 啟動子等。在這方面，可以使用例如 pGEX-5X-l (Pharmacia)、“QIAexpress 系統(tǒng)” Oliagen)、pEGFP 和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體還可以包含用于多肽分泌的信號序列。指導肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列有 pelB信號序列(Lei et al. ,J Bacteriol 169 :4379 (1987))。用于將載體導入靶宿主細胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。除了大腸桿菌外，可以使用例如衍生自哺乳動物的表達載體(例如 pcDNA3(Invitrogen)禾口 pEGF—BOS(Nucleic Acids Res 18(17) :5322(1990))、 pEF、 PCDM8)、衍生自昆蟲細胞的表達載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、 pBacPAK8)、衍生自植物的表達載體(例如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、衍生自動物病毒的表達載體(例如 pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表達載體(例如“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢桿菌的表達載體(例如PPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。為了在動物細胞諸如CHO、COS或OTH3T3細胞中表達載體，載體應具有在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.，Nature 277 108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EFl α 啟動子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18: 5322(1990))、CMV啟動子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標志基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如 pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 p0P13。提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領域普通技術人員來制備和使用本發(fā)明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
32實施例材料和方法細胞系AM淋巴母細胞樣細胞系(AMLCL)是通過將Epstein-bar病毒轉(zhuǎn)化入HLA-AM陽性人B淋巴細胞而建立的。C0S7，非洲綠猴腎細胞系，購自ATCC。VANGLl衍牛的肽的候詵者的詵擇使用結(jié)合預測軟件“BIMAS“ (www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind) (Parker et al. (J Immunol 1994，152(1) : 163-75)，Kuzushima et al. (Blood 2001， 98 (6) 1872-81)))預測了 VANGLl衍生的結(jié)合HLA-A*2402分子的9聚物和10聚物肽。 由SIGMA (Sapporo，Japan)依照標準固相合成法合成了這些肽，并通過反相高效液相層析 (HPLC)進行了純化。分別通過分析性HPLC和質(zhì)譜術分析測定了肽的純度(> 90% )和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞砜(DMSO)中溶解，并保存于_80°C。體外CTL誘導使用單核細胞衍生的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞(APC)來誘導針對人白細胞抗原(HLA)上呈遞的肽的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。如別處(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003 Jul 15,63(14) :4112-8)所述在體外生成 DC。具體而言，將用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_AM402陽性)分離的外周血單個核細胞(PBMC)通過粘附至塑料組織培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)來加以分離，以將它們作為單核細胞級分富集。在含有2%熱滅活自體血清(AS)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中在 1，000U/ml粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和1，000U/ml白介素 (IL)-4(R&D System)存在下培養(yǎng)富集了單核細胞的群體。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細胞因子誘導的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml的每一種合成肽于37°C沖激3小時。所生成的細胞表觀上在它們的細胞表面上表達DC相關分子，諸如 ⑶80、⑶83、⑶86和II類HLA (數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC通過X輻照(20Gy) 滅活，并以1 20比例與用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細胞混合。在48孔板(Corning)中設立這些培養(yǎng)物；每個孔在0. 5ml AIM_V/2% AS培養(yǎng)基中含有 1·5χ 104 個經(jīng)肽沖激的 DC、3x 105 個 CD8+T 細胞禾口 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，給這些培養(yǎng)物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進一步刺激。每次以與上文所述相同的方式來制備DC。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的A24LCL細胞的CTL(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Decl5,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006 May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug,96(8) :498-506)。CTL擴增規(guī)程使用與Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996 Feb, 2 (2) :216-23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴增CTL。將總共切IO4個CTL在25ml AIM_V/5% AS培養(yǎng)基中懸浮，其中有在 40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經(jīng)絲裂霉素C滅活的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補加新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM-V/5% AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8) 1052-7 ；Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97 (5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8) :498-506)。CTL克降的津立在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc hternational)中進行稀釋以獲得0. 3、1、 和3個CTL/孔。在總共150微升/孔的含5% AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與IxlO4個細胞/孔的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體、和125U/ml的IL-2 — 起培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以達到終濃度125U/ml的IL-2。在第14天測試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴增CTL克隆(Uchida N et al. ,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006May,97(5) 411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。特異件CTL活件為了檢查特異性CTL活性，實施了干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T) 測定法和IFN-Y酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的AMLCL(lx IO4/孔)作為刺激細胞。使用48孔中培養(yǎng)的細胞作為應答細胞。依照制造商的規(guī)程實施 IFN- y ELISP0T 測定法和 IFN- y ELISA 測定法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通過PCR來擴增編碼靶基因可讀框或HLA_AM402的cDNA。將PCR擴增產(chǎn)物克隆入pCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入靶基因和HLA-AM陰性細胞系C0S7。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene(Invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，并用作CTL活性測定法的靶細胞(5X IO4個細胞/孔)。結(jié)果癌癥中增強的VANGLl表達使用cDNA微陣列自多種癌癥獲得的全局基因表達譜數(shù)據(jù)揭示了 VANGLl (GenBank 登錄號AB057596 ;SEQ ID No :34)的表達升高。VANGLl表達在23/27例膀胱癌、30/47例乳腺癌、14/17例宮頸癌、9/12例膽管細胞癌、5/12例子宮內(nèi)膜異位癥、11/13例肝癌、29/35 例NSCLC、8/23例骨肉瘤、8/8例胰腺癌、12/15例SCLC和14/35例AML中與相應正常組織相比確實升高了(表1)。表 1在癌性組織中與正常相應組織相比觀察到VANGLl上調(diào)的病例之比
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合HLA抗原且具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力的分離的肽，其中該肽由氨基酸序列SEQ ID NO :35或其免疫學活性片段組成。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-AM。
3.權(quán)利要求1或2的分離的肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQID N0:l，8，9，ll， 12，18,22,24,25,26 和 32。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的分離的肽，其是九肽或十肽。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其由選自SEQID N0:l，8，9，ll，12，18，22，24，25，26和32 的氨基酸序列組成，其中替換、刪除或添加了 1個、2個或幾個氨基酸。
6.權(quán)利要求5的肽，其具有至少一處選自下組的替換(a)N端起第二個氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和(b)C端氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
7.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽。
8.一種用于誘導CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項的肽或者一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
9.一種用于治療和/或預防癌癥和/或防止其手術后復發(fā)的藥物組合物，其中該組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項的肽，或一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其意圖用于對HLA抗原為HLA-AM的受試者施用。
11.權(quán)利要求9或10的藥物組合物，其意圖用于治療癌癥。
12.一種用于誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其包括選自下組的步驟(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸權(quán)利要求1-6中任一項的肽；和(b)將編碼權(quán)利要求1-6任一項的肽的多核苷酸導入APC。
13.一種用于誘導CTL的方法，其通過包括選自下組的步驟的任何方法來進行(a)將CD8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6任一項的肽的復合物的APC共培養(yǎng)；(b)將CD8-陽性T細胞中與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-6任一項的肽的復合物的外來體共培養(yǎng)；和(c)將包含編碼可結(jié)合權(quán)利要求1-6中任一項的肽的T細胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細胞。
14.一種分離的APC，該APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6中任一項的肽的復合物。
15.權(quán)利要求14的APC，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導的。
16.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-6中任一項的肽。
17.權(quán)利要求16的CTL，其是通過權(quán)利要求13的方法誘導的。
18.一種在受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法，包括對所述受試者施用包含權(quán)利要求1-6中任一項的肽、其免疫學活性片段、或編碼所述肽或片段的多核苷酸的組合物。
19.一種外來體，其呈遞包含權(quán)利要求1至6中任一項的肽和HLA抗原的復合物。
20.一種抗體或其片段，其針對權(quán)利要求1至6中任一項的肽。
21.一種載體，其包含編碼權(quán)利要求1至6中任一項的肽的核苷酸序列。
22.經(jīng)過權(quán)利要求21的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
23.—種診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1至6中任一項的肽、權(quán)利要求7的核苷酸或權(quán)利要求20的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的自SEQ ID NO35衍生的肽或片段，其能結(jié)合HLA抗原和誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。該等肽可包括上文所述氨基酸序列之一及一個、兩個、或數(shù)個氨基酸的替代、刪除或添加。本發(fā)明還提供了包括這些肽的藥物組合物。本發(fā)明的肽可用于治療癌癥。
文檔編號C12N5/07GK102439147SQ20108001963
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者吉村祥子, 大澤龍司, 渡邊朝久, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司