專利名稱：飼料補(bǔ)充物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飼料補(bǔ)充物。更具體而言，本發(fā)明涉及包含可用于提高動物飼料的消化的植酸酶和脂解酶的飼料補(bǔ)充物以及涉及包含飼料補(bǔ)充物的飼料。
背景技術(shù)：
植酸鹽是磷在谷類和豆類中的主要貯藏形式。但是，單胃動物如豬、禽和魚不能夠代謝或吸收植酸鹽(phytate)(或植酸(phytic acid))，因此它被排泄，導(dǎo)致牲畜密集飼養(yǎng)區(qū)域的磷污染。此外，植酸還通過螯合金屬如鈣、銅和鋅而在單胃動物中起到抗?fàn)I養(yǎng)劑的作用。為了給這些動物的生長和健康提供充足的磷酸鹽，無機(jī)磷酸鹽被添加至它們的飲食中。這種添加可能費用高，且進(jìn)一步加劇污染問題。通過植酸酶的作用，植酸鹽通常水解產(chǎn)生較低分子量的肌醇-磷酸鹽和無機(jī)磷酸鹽。植酸酶可用作動物飼料的添加劑，據(jù)以改善有機(jī)磷對動物的可用性并降低環(huán)境的磷酸鹽污染(ffodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42，263-302 (1996))。將植酸酶添加到肉雞飼料也已被證實能提高表觀代謝能(AME)、氮和氨基酸的可用性(Ravindran, V.等人，Brit. Poultry Sci. 41，193-200 (2000))。文獻(xiàn)中描述了許多真菌來源的植酸酶(Wyss M.等人，Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999) ；Berka R. Μ.等人，Appl. Environ. Microbiol. 64 (11)， 4423-4427(1998) ；Lassen S.等人，Appl. Environ. Microbiol. 67 (10)，4701-4707 UOOl)) 和細(xì)菌來源的植酸酶(Greiner R.等人，Arch. Biochem. Biophys. 303 (1)，107-113 (1993)； Kerovuo ^ A, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6) , 2079-2085 (1998) ；Kim H. W.等 K, Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003) ；Greiner R.等 K, Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997) ；Yoon S. J.等人，Enzyme and microbial technol. 18， 449-454(1996) ；Zinin N. V.等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)) 然而，真菌植酸酶往往因蛋白水解而不穩(wěn)定(Igbasan F.A.等人，Arch.Anim. Nutr. 53, 353-373 (2000))，因此易受降解，而一些細(xì)菌植酸酶僅對植酸鹽具有窄的底物特異性，對中度磷酸化的肌醇磷酸鹽的降解差(Greiner R.等人，Arch. Biochem. Biophys. 303(1)，107-113(1993) ；Kerovuo J 等人，Biochem. J. 352，623-628 (2000))。此外，已知鈣與植酸鹽相互作用形成鈣-植酸鹽復(fù)合物對于植酸酶活性是有害的 (Selle,P. H.等人，Livestock Science. 124,126-141 (2009)) 據(jù)猜測，這些鈣-植酸鹽復(fù)合物中的鈣會使植酸鹽不能接觸植酸酶或者與非復(fù)合的植酸鹽競爭酶的活性位點(Long， C. , Phytase, Biochemists Handbook, Princeton, NY, Van Nostrand-Reinhold(1961)； Wise, A. , Nutrition Abstracts&Reviews，53，791-806(1983))。已證實添加植酸酶能增加高植酸鹽飲食的ΑΜΕ。Ravindran等人(Br. Poult. Sci.， 2000,41,193-200)提出鈣-植酸鹽復(fù)合物與脂肪酸反應(yīng)而在腸內(nèi)腔中形成不溶性皂，從而降低脂肪的消化率。已提出添加植酸酶來降低這些皂的水平。植酸鹽與玉米中的脂質(zhì)相互作用的證據(jù)(Cosgrove，1966，Rev. Pure App. Chem. 16 :209-224)支持了這個假設(shè)。這些“月旨肪植酸鹽鈣鎂(lipophytins) ”已被描述為Ca/Mg-植酸鹽、脂質(zhì)和肽的復(fù)合物(Cosgrove， 1966，Rev. Pure App. Chem. 16 :209-224)。其他的報道也已提出了飲食中鈣、脂肪和植酸鹽之間的相互作用。例如，Matyka 等人(1990) (Anim. Feed. Sci. Technol. 31 :223-230)發(fā)現(xiàn)， 飲食中的動物脂降低了植酸鹽的磷在幼雞中的利用率，提高了作為皂脂肪酸排泄的脂肪的百分比。外源脂肪酶的添加在提高脂質(zhì)和礦物質(zhì)消化率方面取得了有限的成功。但是，這可能受到了游離脂肪酸與鈣和植酸鹽結(jié)合形成復(fù)合物的限制(Cosgrove，1966(同上))，該復(fù)合物在胃腸道中不可溶，吸收差(Matyka等人，1990 (同上))。之前已有人建議在動物飼料中使用外源脂肪酶，目的是改善動物對脂肪的消化。 脂肪酶據(jù)猜測能改善消化，因為它使得可吸收的游離脂肪酸(FFA)的釋放比沒有脂肪酶的情況下快。但是，通過使用外源脂肪酶來證明動物性能或消化率的改進(jìn)的嘗試，在最好的情況下也是不一致的，且往往證實脂肪酶并不起作用。Dierick和Decuypere Q004) (J. Sci. Food Agric. 84:1443-1450)證實在豬飲食中添加微生物脂肪酶沒有改善脂肪消化率。 Hurtado等人Q000) (Rev. Bras. Zootec. 29 =794-802)沒有檢測到因為在小豬中使用外源脂肪酶導(dǎo)致的體重增加、飼料效率和能量消化率的增量。另外，他們報道當(dāng)將這種脂肪酶與淀粉酶和蛋白酶組合時對任何這些參數(shù)沒有相加作用。Officer (1995) (Anim. Feed Sci. Technol. 56 :55-65)報道說使用外源酶類的兩種組合沒有導(dǎo)致小豬的飼料攝入的體重增加的顯著改變，這兩種組合他們描述為脂肪酶、蛋白酶、B-葡聚糖酶、淀粉酶和纖維素酶以及脂肪酶、B-葡聚糖酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶。在肉雞中，Meng等人Q004) (Poult. Sci. 83 :1718-1727)當(dāng)在基于小麥的飲食中使用細(xì)菌脂肪酶時，未能檢測到脂肪酶對脂肪、淀粉、氮和NSP的表觀消化率以及AME的任何作用。另外，他們否定了這樣的假說，即在脂肪酶之上的糖酶(包括木聚糖酶、葡聚糖酶和纖維素酶)的組合會通過降低消化物的粘度和增加脂肪消化和吸收而提高脂肪酶對營養(yǎng)物消化率的作用。Al-Marzooqi和Leeson (1999)測試了來自動物來源和胰腺提取物的脂肪酶。雖然他們能夠證明當(dāng)這些添加劑用于飲食時脂肪消化率改善和在糞便水平上皂的水平下降，但他們也報道了厭食效應(yīng)(飼料攝入的減少)，這一點他們解釋為在這類提取物中可能存在縮膽囊素的污染。該事實限制了其在動物飼料中的利用和動物中生長或飼料效率的可能改進(jìn)。本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供這樣的飼料補(bǔ)充物，其能使至少一種營養(yǎng)物的可用性改善或者來自飼料材料的表觀代謝能改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣的出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即向飼料中添加包含至少一種特異性脂解酶和至少一種特異性植酸酶的飼料補(bǔ)充物，能導(dǎo)致與單獨使用這些酶類相比，至少一種營養(yǎng)物和/或礦物質(zhì)的攝入改善。根據(jù)本發(fā)明的最廣泛的方面，提供了包含如下酶類的飼料補(bǔ)充物_i.至少一種脂解酶；和
ii.至少一種植酸酶。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與之前的報道(Mulyantini，N.G.A.等人，Aust. Poult. Sci. Symp, 17,305-307(2005))相反，向飼料材料中添加包含至少一種特異性植酸酶和至少一種特異性脂解酶的飼料補(bǔ)充物以生產(chǎn)飼料，能導(dǎo)致至少一種營養(yǎng)物的可用性提高和/或表觀代謝能(AME)的提高。雖然不想受理論的約束，但本發(fā)明人還是猜測，該出乎意料的發(fā)現(xiàn)可能是由于脂解酶在PH為酸性的消化早期階段釋放游離脂肪酸(FFA)的作用所致。這些FFA可與過量的鈣結(jié)合而在腸中形成皂。于是可供與植酸鹽結(jié)合的游離鈣變少，從而增加胃腸道(GIT) 中植酸和鈣往往會形成抗植酸酶復(fù)合物的區(qū)域中的植酸酶活性。這導(dǎo)致磷酸鹽釋放和吸收增加。游離脂肪酸鈣復(fù)合物隨后在GIT中溶解，導(dǎo)致脂肪和鈣吸收提高和/或AME提高。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供制備飼料補(bǔ)充物的方法，所述方法包括將至少一種脂解酶和至少一種植酸酶混合。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供包含飼料材料和根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶的飼料。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供制備飼料的方法，所述方法包括向飼料材料添加根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供提高至少一種膳食營養(yǎng)物的可用性和/或提高來自飼料材料的表觀代謝能(AME)的方法，所述方法包括向飼料材料添加包含至少一種脂解酶和至少一種植酸酶的組合的飼料補(bǔ)充物，或者向飼料材料添加至少一種脂解酶和至少一種植酸酶。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供提高動物的生長速率的方法，所述方法包括給動物飼喂有效量的根據(jù)本發(fā)明的飼料。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供至少一種植酸酶和至少一種脂肪酶在制造飼料中的用途，用來提高至少一種營養(yǎng)物的可用性和/或提高來自飼料材料的可利用代謝能。應(yīng)認(rèn)識到，本文公開的任何優(yōu)選的特征都被認(rèn)為同等適用于如上所述的任何方面，除非另有明確說明。任何優(yōu)選的特征也被認(rèn)為與本文公開的任何其他優(yōu)選特征相組合進(jìn)行公開。為了能有效作為動物飼料的酶添加劑，植酸酶必需兼有多種不同的性質(zhì)。為了能夠在動物的胃的酸性環(huán)境中降解植酸，其必須在低PH下、優(yōu)選在寬廣的pH值范圍內(nèi)具有活性。另外，它必須具有高特異性活性，優(yōu)選具有高熱穩(wěn)定性，以使得它這種蛋白質(zhì)能夠承受在飼料(如顆粒飼料)的制備中常見的高溫。還重要的是，該酶具有寬廣的底物特異性，使得它能不僅水解植酸鹽，而且能水解植酸鹽降解的中間產(chǎn)物，如肌醇五磷酸、四磷酸和三磷酸。對植酸鹽在豬中的降解的研究顯示，若沒有該酶則這些肌醇寡磷酸在小腸和大腸中保持基本上不可溶，從而難以接觸動物和腸道微生物群落所產(chǎn)生的堿性磷酸酶(Schlemmer U.等人Arch. Anim. Nutr. 55， 255-280(2001)).已鑒別了不同的酶的底物特異性譜(profile)的變化。例如，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的植酸酶所產(chǎn)生的肌醇三磷酸基本上抵抗由此酶進(jìn)行的進(jìn)一步水解 [Kerovuo J.等人 Biochem J. 352，623-628 (2000)]。在優(yōu)選的實施方案中，植酸酶優(yōu)選是由Danisco A/S以商品名I^hyzyme XP 銷售的大腸桿菌植酸酶?；蛘?，植酸酶可以是布丘氏菌屬(Buttiauxella)植酸酶，例如在WO 2006/043178、WO 2008/097619、W02008/092901 和 PCT/US2009/41011 中所教導(dǎo)的植酸酶， 將所有這些專利以弓I用方式并入本文。在最優(yōu)選的實施方案中，植酸酶包含大腸桿菌植酸酶和/或布丘氏菌屬植酸酶。 更優(yōu)選地，植酸酶包含具有SEQ ID NO :1-6或SEQ ID NO :13中任一種所示的氨基酸序列的多肽；或者與SEQ ID NO :1-6或SEQ ID NO 13中任一種相比具有一個或幾個氨基酸添加、 缺失和/或置換的多肽；或者與SEQ ID NO :1-6或SEQ ID NO 13中任一種具有至少70%、 80%、90(%、95(%、98(%或99(%同一性的多肽；或者通過表達(dá)含有如下序列的核苷酸序列所產(chǎn)生的多肽SEQ ID NO :11的序列；或SEQ ID NO :14的核苷酸253-1483，或者由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :14的核苷酸253-1483不同的序列；或者與 SEQ ID NO :11的序列或SEQ ID NO 14的核苷酸253-1483相比具有一個或幾個核苷酸添力口、缺失和/或置換的序列；或者與SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 14的核苷酸253-1483具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，植酸酶至少在約pH 2. 5至約pH 5. 5范圍內(nèi)的pH下具有植酸酶活性。更優(yōu)選地，當(dāng)通過下文“材料和方法”部分中公開的植酸酶測定法測量時， 植酸酶至少在約PH 2. 5至約pH 3. 5范圍內(nèi)以及在約pH 5至約pH 5. 5范圍內(nèi)的pH下具
有植酸酶活性。優(yōu)選地，植酸酶具有至少100FTU/mg酶的比活性水平。更優(yōu)選地，至少200、300、 400、500、700、1000FTU/mg。應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的IFTU(植酸酶單位)定義為在“材料與方法”部分中所述的 PH 5. 5下植酸酶測定中在本文所定義的反應(yīng)條件下在一分鐘內(nèi)從底物釋放1 μ mol的無機(jī)正磷酸鹽所需的酶量。在優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明的植酸酶具有在pH 2-5. 5、優(yōu)選4. 0-4. 5范圍內(nèi)的PH最佳值，保留pH 2. 0-5. 5范圍內(nèi)最大活性的至少50%和/或具有300FTU/mg以上的比活性。優(yōu)選地，當(dāng)通過下文“材料和方法”部分中所述的脂肪酶測定法測量時，用于本發(fā)明的脂解酶在約PH 1.5至約pH 5. 5范圍內(nèi)的pH下具有脂肪酶活性。更優(yōu)選地，脂解酶在約pH 1. 5至約pH 3. 5或約pH 2. 0至約pH 3. 5范圍內(nèi)的pH下具有脂肪酶活性。應(yīng)當(dāng)理解，用于本發(fā)明的脂解酶可以為任何合適的顯示脂解酶活性(使用本文所定義的測定法)的脂解酶。優(yōu)選地，脂解酶具有至少100LIPU/mg酶的活性水平。更優(yōu)選地， 至少 200、300、400、500、700、1000LIPU/mg。本文所用的ILIPU (脂肪酶單位)定義為在下文“材料與方法”部分中所述的脂肪酶測定中所描述的條件下每分鐘釋放ι μ mol的H+所需的酶量。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明的脂解酶衍生自如W098/4M53中所述的
(Aspergillus tubingensis)。優(yōu)選地，脂解酶包含具有SEQ ID NO :7或8中所示的氨基酸序列的多肽；或者與 SEQ ID NO :7或8相比具有一個或幾個氨基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或者與SEQ ID NO :7或8具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽；或者通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的多肽SEQ ID NO :9或10的序列；或者由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO 9或10不同的序列；或者與SEQ ID NO 9或10的序列相比具有一個或幾個核苷酸添加、缺失和/或置換的序列或者與SEQ ID NO :9或10具有至少70^^80%、 90%、95%、98%或99%同一性的序列?；蛘撸久缚蛇x自來自I^seudomonas gessardii的酸性脂肪酶(Ramani， K.等人，J Ind Microbiol Biotechnol Q010) 37 :531-535)、來自少根根霉(Rhizopus arrhizus)的酸性脂肪酶(Kumar，KK.等人，Hindustan Antibiot Bull. 1993 Feb-May ； 35(1-2) :33-42) (SEQ ID NO :32，33)、來自簡青霉(Penicillium simplicissimum)的酸性脂肪酶(Gutarra M. L. E.等人，Bioresource Technology 10(^2009) 5249-5254)、來自黑曲霉(Aspergillus niger)NCIM 1207 的酸性脂肪酶(Mhetras N. C.等人，Bioresource TechnologylOO (2009) 1486-1490，Pel，H. J.等人，Nat. Biotechnol. 25 (2)，221-231 (2007)) (SEQ ID NO :27)、來自例如人(SEQ ID NO 17，18)、牛(SEQ ID NO 19，20)、小鼠(SEQ ID N0:21，22)、大鼠(SEQ ID NO -.23,24)和犬(SEQ ID NO 25,26)的哺乳動物胃脂肪酶(Chahinian，H.等人，Biochemistry 2006，45，993-1001)、來自蓖麻豆的酸性脂肪酶 (Eastmond, P.J.The Journal of Biological Chemistry,279(2004) ；45540-45545)(SEQ ID NO :28,29)和來自解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)的 LIP2 脂肪酶(Aloulou， Α.等人，Biochimica et Biophysica Acta 1771 (2007)228-237) (SEQ ID NO :30,31) 如上所指出，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明飼料補(bǔ)充物的性能的改善是由于脂解酶在消化的早期階段釋放游離脂肪酸(FFA)的作用所致的。這導(dǎo)致鈣皂的形成和鈣-植酸鹽復(fù)合物的相關(guān)減少。在又一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明的脂解酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞中產(chǎn)生，例如通過在里氏木霉宿主細(xì)胞中表達(dá)具有SEQ ID NO :9或SEQ ID N0: 10的序列的核苷酸產(chǎn)生。在又一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物包含i)脂解酶，其為由如下特征中的至少一種來表征的脂解酶_a)當(dāng)通過本文公開的脂肪酶測定法測量時在約pH 1. 5至約pH 3. 5范圍內(nèi)的pH 下具有脂肪酶活性的脂解酶；b)包含具有SEQ ID NO :7或8中所示的氨基酸序列的多肽或者與SEQ ID NO 7 或8具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的多肽的脂解酶；c)通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的脂解酶SEQ ID NO :9或10的序列；或者由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO 9或10不同的序列；或者與SEQ ID NO 9 或10具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；和ii)植酸酶，其為由如下特征中的至少一種來表征_d)細(xì)菌植酸酶；e)當(dāng)通過下文所述的植酸酶測定法測量時在約pH 2. 5至約pH 3. 5范圍內(nèi)的pH 下具有植酸酶活性的植酸酶；f)包含具有SEQ ID NO :1_6或SEQ ID NO 13中任一種所示的氨基酸序列的多肽或者與 SEQ ID NO :1-6 或 SEQ ID NO :13 中任一種具有至少 70%、80%、90%、95%、98%或 99%同一性的多肽的植酸酶；g)通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的植酸酶SEQ ID NO=Il的序列或SEQ ID NO 14的核苷酸253-1483 ；或者由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO :11或 SEQ ID NO 14的核苷酸253-1483不同的序列；或者與SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 14的核苷酸253-1483具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。在又一個優(yōu)選的實施方案中，飼料補(bǔ)充物包含脂解酶和植酸酶，脂肪酶活性(以脂肪酶單位(LIPU)測量)與植酸酶活性(以植酸酶單位(FTU))的比率在約1 5至約 12 1的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1 3至約3 1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約1 1至約3 1的范圍內(nèi)，如由下文描述的PH5. 5下脂肪酶和植酸酶測定所定義的。優(yōu)選地，其可用性得到提高的所述至少一種膳食營養(yǎng)物選自磷、鈣、氨基酸、脂肪和/或淀粉。優(yōu)選地，所述可用性在回腸和/或整個胃腸道中都得到改善。技術(shù)人員會認(rèn)識到，用于本發(fā)明的脂解酶和植酸酶可作為液體或作為固體/顆粒狀組合物獨立提供。優(yōu)選地，當(dāng)所述酶為液體形式時，所述酶處于在培養(yǎng)包含所述酶的細(xì)胞之后所述酶已被分泌至其中的培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基是無細(xì)胞的(即已從該培養(yǎng)基分離了細(xì)胞)。優(yōu)選地，對所述培養(yǎng)基進(jìn)行濃縮。應(yīng)當(dāng)理解，可將培養(yǎng)基進(jìn)行制粒以提供固體酶組合物。還應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶可以以溶液的形式提供或者作為固體提供，這取決于用途和/或應(yīng)用模式和/或施用模式。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶處于適合食用的液體制劑中，優(yōu)選這種液體組合物含有緩沖劑、鹽類、山梨醇和/或甘油。在一個另選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶可作為一個或多個包含所述脂解酶和/或植酸酶的細(xì)胞提供。在一個實施方案中，將飼料補(bǔ)充物制?；蚺c其他酶一起制粒。優(yōu)選地，飼料補(bǔ)充物還包含至少一種生理上可接受的載體。生理上可接受的載體優(yōu)選選自如下物質(zhì)中的至少一種麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、淀粉、消泡劑、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它們的混合物。在一個實施方案中，植酸酶和/或脂解酶在生理上可接受的載體上干燥。在優(yōu)選的實施方案中，飼料補(bǔ)充物可包含至少一種另外的酶。在優(yōu)選的實施方案中，該至少一種另外的飼料酶選自那些參與淀粉代謝、纖維降解、脂質(zhì)代謝的酶，參與糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶，乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、 過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、-半乳糖苷酶、-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、-葡萄糖苷酶(包括β葡萄糖苷酶)、葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲基酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇異果甜蛋白、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖02_氧化還原酶，ECl. 1. 3. 5)、β -葡聚糖酶、α -淀粉酶、果膠酶、 纖維二糖水解酶、酸性磷酸酶和/或其他酶類或者它們的組合。這些包括例如能調(diào)節(jié)飼料的粘度的酶類。在一個更優(yōu)選的實施方案中，飼料補(bǔ)充物包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和/或淀粉酶。在一個最優(yōu)選的實施方案中，飼料補(bǔ)充物包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和淀粉酶。優(yōu)選地，淀粉酶以10U/kg-10000U/kg飼料的范圍存在，更優(yōu)選100U/kg_7500U/ kg,甚至更優(yōu)選500U/kg-5000U/kg。應(yīng)理解，一淀粉酶單位是在pH 6. 5和37°C下每分鐘從水不溶性交聯(lián)淀粉聚合物底物釋放Immol的糖苷鍵的酶量。優(yōu)選地，木聚糖酶以100U/kg-10000U/kg飼料的范圍存在，更優(yōu)選250U/ kg-7500U/kg，甚至更優(yōu)選500U/kg-5000U/kg。應(yīng)理解，一木聚糖酶單位是在pH 5. 3和 50°C下每分鐘從燕麥斯佩耳特小麥木聚糖底物釋放Ο.δμπιο 的還原糖當(dāng)量(通過DNS[4]) 還原糖法以木糖計)的酶量。(Bailey, Μ. J. Biely, P.和 Poutanen, K.，Journal of Biotechnology,第 23 卷，(3)，1992 年 5 月，257-270)。應(yīng)理解，飼料補(bǔ)充物可用于任何合適的動物。優(yōu)選地，動物是單胃動物，例如禽或豬。顯然的是，飼料補(bǔ)充物可以以任何合適的量含有至少一種植酸酶和至少一種脂解酶。優(yōu)選地，飼料補(bǔ)充物包含至少0. 1重量％的脂解酶和植酸酶(單獨地或作為組合百分?jǐn)?shù))。更優(yōu)選地，飼料補(bǔ)充物可包含至少0. 5重量％、至少1重量％、至少2重量％、至少3 重量％、或至少4、5、6、7、8、9或10重量％的脂解酶和植酸酶(單獨地或作為組合百分?jǐn)?shù))。對于技術(shù)人員顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶還可包含其他組分，如穩(wěn)定劑和/或增量劑和/或其他酶類。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶對于高達(dá)約70°C、高達(dá)約85°C或高達(dá)約95°C的熱處理將是熱穩(wěn)定的。熱處理可進(jìn)行長達(dá)約1分鐘、 長達(dá)約5分鐘、長達(dá)約10分鐘、長達(dá)約30分鐘、長達(dá)約60分鐘。術(shù)語“熱穩(wěn)定的”意指在加熱到指定溫度之前在添加劑中存在/有活性的酶組分有至少約75%在其冷卻到室溫后仍存在/有活性。優(yōu)選地，在加熱到指定溫度之前在添加劑中存在和有活性的酶組分有至少約80%在其冷卻到室溫后仍存在和有活性。根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶可具有大于約30 個星期、大于約40個星期、大于約50個星期、大于約1年、大于約1. 5年的貯藏期。貯藏期意指在添加劑制備時在添加劑中存在和有活性的酶組分有至少約80%仍存在和有活性。優(yōu)選地，制備根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物的方法包括混合步驟，該步驟包括將至少一種植酸酶和至少一種脂解酶任選與至少一種生理上可接受的載體進(jìn)行混合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，將飼料補(bǔ)充物均化以產(chǎn)生粉末。在一個另選的優(yōu)選實施方案中，如W02007/044968中所述將飼料補(bǔ)充物配制成顆粒(稱為TPT顆粒)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)將飼料補(bǔ)充物配制成顆粒時，顆粒包含涂覆在蛋白質(zhì)芯上的水合阻擋鹽。這種鹽涂層的優(yōu)點在于使耐熱性改善，使保藏穩(wěn)定性改善和保護(hù)免受其他原本會不利影響該酶的飼料添加劑的影響。優(yōu)選地，用于鹽涂層的鹽在20°C下具有大于0. 25的水活度或者大于60%的恒定濕度。優(yōu)選地，鹽涂層包含Na2SO4。
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制備飼料補(bǔ)充物的方法還可包括將粉末?；牧硗獠襟E。粉末可以與本領(lǐng)域已知的其他組分進(jìn)行混合?？善仁狗勰┗虬勰┑幕旌衔锿ㄟ^模具，并將所得的料條切成可變長度的合適粒料。任選地，?；襟E可包括在粒料形成之前進(jìn)行的蒸汽處理或調(diào)理階段。可將包含粉末的混合物置于調(diào)理機(jī)中，例如帶蒸汽噴射的混合機(jī)。將混合物在調(diào)理機(jī)中加熱至指定的溫度，如60-100°C，典型的溫度將為70°C、85°C、90°C或95°C。停留時間不定，可從數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘甚至數(shù)小時。如5秒鐘、10秒鐘、15秒鐘、30秒鐘、1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘和1小時。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物適合添加到任何適宜的飼料材料。本文所用的術(shù)語飼料材料指待由動物食用的基礎(chǔ)飼料材料。還應(yīng)理解，這可包含例如至少一種或多種未經(jīng)加工的谷物，和/或經(jīng)加工的植物和/或動物材料如大豆粉或骨粉。在一些實施方案中，飼料材料將包含如下組分中的一種或多種a)谷類，如小谷物(例如小麥、大麥、黑麥、燕麥以及它們的組合)和/或大谷物如玉蜀黍或高粱；b)谷類的副產(chǎn)物，如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、小麥麩皮、粗小麥粉、次小麥粉、米糠、稻殼、 燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣；c)從諸如如下的來源獲得的蛋白質(zhì)大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、卡諾拉、魚粉、干血漿蛋白質(zhì)、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、小麥、干椰子肉、 芝麻；d)從植物和動物來源獲得的油類和脂肪；e)礦物質(zhì)和維生素。還顯然的是，本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物當(dāng)添加到高植酸鹽飼料材料時是特別有利的。本文所用的術(shù)語飼料指已添加了一種或多種飼料補(bǔ)充物的飼料材料。技術(shù)人員會認(rèn)識到，不同的動物要求不同的飼料，甚至同一種動物也可能要求不同的飼料，這取決于飼養(yǎng)該動物的目的。還應(yīng)理解，取決于初始飼料材料，飼料可以是高纖維飼料或低纖維飼料。優(yōu)選地，飼料可包含這樣的飼料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麥、大麥、黑小麥、 黑麥、大米、木薯、高粱和/或任何副產(chǎn)物，以及富含蛋白質(zhì)的成分，如大豆粉、油菜籽粉、卡諾拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、動物副產(chǎn)物粉和它們的混合物。更優(yōu)選地，飼料可包含動物脂和 /或植物油。任選地，飼料還可含有額外的礦物質(zhì)(例如鈣)和/或額外的維生素。技術(shù)人員會清楚，本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物當(dāng)用于鈣含量高的飼料中時將是特別有益的。更具體而言，鈣和植酸鹽含量高的飼料。技術(shù)人員會清楚，代表高鈣飲食的鈣水平可隨動物的類型甚至飼養(yǎng)動物的用途而變。例如，對于下蛋的母雞，含量> 3%的飲食將是高鈣飲食。對于肉雞和所有火雞，鈣含量> 的飲食將是高鈣飲食。出于本發(fā)明的目的，高鈣飲食認(rèn)為是包含至少1-2%鈣的飲合技術(shù)人員還會清楚，高植酸鹽飲食是包含> 0. 90重量％的植酸的飲食。如本文所定義，低纖維飼料是這樣的包含一種或多種飼料材料的飼料，其含有的水不溶性細(xì)胞壁的最大含量為約25%，和/或可溶性非淀粉多糖的最大含量為約4%。更優(yōu)選地，水不溶性細(xì)胞壁的最大含量為約22. 5%、約20%、約17. 5%、約15%、約12.5% ； 和/或可溶性非淀粉多糖的最大含量為約3%、約2. 5%、約2%、約1. 75%、約1. 5%、約1. 25%。在優(yōu)選的實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶與至少一種低纖維飼料材料(例如玉米、小麥、動物副產(chǎn)物粉或大豆和/或任何副產(chǎn)物)混合，以提供低纖維飼料。優(yōu)選地，飼料為玉米大豆粉混合物。優(yōu)選地，飼料材料不是脫脂米糠。在優(yōu)選的實施方案中，飼料包含的植酸酶水平為約250FTU/kg至約15，000FTU/kg 飼料(例如 250-10，000FTU/kg、400-7，500FTU/kg 以及 500_5000FTU/kg)。在另外優(yōu)選的實施方案中，飼料包含的脂解酶水平為約125LIPU/kg至約 45，000LIPU/kg飼料(例如 500-30，000LIPU/kg、1000_20000LIPU/kg 以及 3000-10000LIPU/ kg)。技術(shù)人員會很清楚，為了使本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物能提供所宣稱的優(yōu)點，植酸鹽必須存在于飼料材料或飼料中。還應(yīng)很清楚的是，這個植酸鹽可以作為飼料材料的組分天然存在，或者可作為額外的補(bǔ)充物以所需的水平添加。在另一個方面，提供生產(chǎn)飼料的方法。飼料通常在飼料磨機(jī)中生產(chǎn)，在磨機(jī)中首先將原料研磨成合適的顆粒大小，然后與適宜的添加劑混合。然后可將飼料生產(chǎn)成糊料或粒料；后者通常涉及這樣的方法將溫度提高的目標(biāo)水平，然后使飼料通過模具以生產(chǎn)出特定大小的粒料。讓粒料冷卻。隨后，可添加液體添加劑如脂肪和酶。飼料的生產(chǎn)還可涉及這樣的額外步驟，其包括在進(jìn)行?；跋冗M(jìn)行擠出或膨脹-具體而言通過可包括至少使用蒸汽的合適技術(shù)來進(jìn)行。飼料可以是用于單胃動物如禽(如肉雞、蛋雞、肉種雞、火雞、鴨、鵝、水禽)、豬(所有年齡類別)、寵物(例如狗、貓)或魚。任選地，飼料可包含另外的添加劑。例如，可將鈣以任何合適的量添加到飼料中以補(bǔ)充動物的飲食和/或作為增量劑。鈣可以為有機(jī)鈣形式(例如多葉綠色植物)或無機(jī)鈣形式(石灰石/碳酸鈣)。優(yōu)選地，在添加鈣補(bǔ)充物后，飼料將包含至少約0.5%的鈣。更優(yōu)選地，至少約0.8%、至少約1.0%、至少約2.0%、至少約3 %的鈣。飼料可包含至少0. 0001重量％的飼料補(bǔ)充物。合適地，飼料可包含至少0. 0005重量％、至少0. 0010重量％、至少0. 0020重量％、至少0. 0025重量％、至少0. 0050重量％、 至少0. 0100重量％、至少0. 020重量％、至少0. 100重量％、至少0. 200重量％、至少0. 250 重量％、至少0. 500重量％的飼料補(bǔ)充物。在又一個方面，提供至少一種植酸酶和至少一種脂解酶用于制造飼料的用途，用于提高至少一種營養(yǎng)物的可用性和/或提高來自飼料材料的可利用代謝能。優(yōu)選地，將該至少一種植酸酶和至少一種脂解酶配制成飼料補(bǔ)充物。更優(yōu)選地，飼料補(bǔ)充物是根據(jù)本發(fā)明的飼料補(bǔ)充物。在優(yōu)選的實施方案中，該至少一種營養(yǎng)物選自磷、鈣、總脂肪和/或氨基酸。本文所用的術(shù)語“提高至少一種營養(yǎng)物的可用性和/或提高可利用代謝能”意指與可從單位重量的沒有添加植酸酶和脂解酶或飼料補(bǔ)充物的飼料材料獲得的營養(yǎng)物或能量相比，食用單位重量的所述飼料時可供動物使用的營養(yǎng)物或能量的量的提高。在又一個優(yōu)選的實施方案中，飼料材料是包含高水平的植酸鹽和/或鈣的飼料材料。


現(xiàn)將參考如下附圖描述本發(fā)明，其中_圖1示出了野生型布丘氏菌屬植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 1)。圖2示出了命名為BP-112的布丘氏菌屬植酸酶變體的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)。圖3示出了野生型布丘氏菌屬植酸酶和4種布丘氏菌屬植酸酶變體的氨基酸比對 (SEQ ID NO. 1-5)。圖4示出了命名為BP-Il的另一種布丘氏菌屬植酸酶變體的氨基酸序列(SEQ ID No. 6)。圖5示出了塔賓曲霉的脂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 7)，其中內(nèi)源信號肽以粗體顯示。圖6示出了塔賓曲霉的脂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 8)，其除了內(nèi)源信號肽已被去除之外與SEQ ID No. 7相同。圖7示出了編碼包含信號肽的塔賓曲霉脂解酶(如SEQ ID No. 7中所示)的核苷酸序列一該核苷酸序列是基因組DNA序列(已被命名為SEQ ID No. 9)。信號肽序列以粗體顯示，內(nèi)含子以小寫字母顯示。圖8示出了編碼不包含信號肽的塔賓曲霉脂解酶(如SEQ ID No. 8中所示)的核苷酸序列-該核苷酸序列是基因組DNA序列(已被命名為SEQ ID No. 10)。內(nèi)含子以小寫字母顯不。圖9示出了源自布丘氏菌屬的植酸酶變體BP-17、BP-110、BP-111和BP-112以及 Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P對漸增的胃蛋白酶濃度的抗性。圖 10 示出了 ^Technological Institute in Kolding 的?；b置的示意圖。圖11示出了得自用于本發(fā)明的三種植酸酶B變體的?；囼灥南鄬堄嗷钚?。圖12示出了當(dāng)將Wiyzyme XP (—種大腸桿菌植酸酶)配制在全磨(whole grounded)小麥上時的相對殘余活性。圖13示出了試驗結(jié)果，在該試驗中將植酸酶從帶涂層的Ronozyme產(chǎn)品提取出來并配制在全磨小麥上以研究植酸酶分子在沒有保護(hù)的情況下的熱穩(wěn)定性。圖14-17示出了在不同pH下用于本發(fā)明的植酸酶和對照物對植酸鹽的活性。圖18和19是HPLC色譜圖，其清楚顯示來自布丘氏菌屬變體的植酸酶在高于85°C 的溫度下催化了植酸的水解。圖20示出了含有塔賓曲霉脂肪酶3基因組DNA的pD0NR221:: Iip 3。圖21示出了最終的脂肪酶表達(dá)構(gòu)建體ATlipase3TreX。圖22示出了編碼野生型布丘氏菌屬植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID No 11)。圖23A示出了插導(dǎo)管的豬的回腸能量消化系數(shù)(SEM = 0.0009)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05水平差異。圖2 示出了插導(dǎo)管的豬的回腸粗蛋白質(zhì)消化系數(shù)(SEM = 0.0009)。帶不同字母的柱條以P <0. 05水平差異。
圖M示出了豬的總管道(total tract)可消化能量系數(shù)(SEM = 0. 009)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05水平差異。圖25A示出了豬的總管道鈣保持率(SEM = 0. 027)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05
水平差異。圖25B示出了豬的總管道磷保持率(SEM = 0. 030)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05
水平差異。圖沈示出了包含信號序列的野生型大腸桿菌植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。圖27示出了成熟野生型大腸桿菌植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 13)。圖28示出了編碼野生型大腸桿菌植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。圖四示出了當(dāng)玉米-大豆飼料與多種脂解酶/植酸酶組合一起溫育時，游離脂肪酸從玉米-大豆飼料的產(chǎn)生。圖30示出了抗植酸酶的植酸和鈣復(fù)合物的產(chǎn)生以及通過添加游離脂肪酸進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)。圖30A示出了漸增的CaCl2濃度對植酸酶活性的影響。圖30B示出了向含有15mM的反應(yīng)混合物添加游離脂肪酸對植酸酶活性的影響。圖31示出了抗植酸酶的植酸和鈣復(fù)合物的產(chǎn)生以及通過添加包含脂肪酶的脂肪酶反應(yīng)混合物進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)。圖3IA示出了漸增的CaCl2濃度對植酸酶活性的影響，圖3IB示出了向含有30mM CaCl2的植酸酶反應(yīng)混合物添加脂肪酶反應(yīng)混合物對植酸酶活性的影響。圖32示出了在玉米-大豆飲食中測量的脂肪酶3和胰腺脂肪酶的pH譜。圖33顯示磷在肉雞中的回腸消化系數(shù)。帶不同字母的柱條以P <0.05水平差異。圖34示出了鈣在肉雞中的回腸消化系數(shù)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05水平差
已圖35示出了磷在肉雞中的總管道保持系數(shù)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05水平差異。圖36鈣在兩個肉雞實驗中的總管道保持系數(shù)。帶不同字母的柱條以P < 0. 05水
平差異。圖37示出了本發(fā)明人關(guān)于涉及脂肪酶和植酸酶在禽消化道中的相互作用的機(jī)制的假設(shè)。該圖顯示了所觀察到的脂肪酶和植酸酶之間的協(xié)同作用的可能機(jī)制的示意圖。由于脂肪酶3在酸性條件下的作用，與沒有脂肪酶3的情況相比，游離脂肪酸(FFA)在消化前期階段釋放出來。這些FFA可與過量的鈣(Ca)結(jié)合而在腸子中形成皂。于是可供結(jié)合植酸(IP6)并形成抗植酸酶的復(fù)合物的游離鈣變少。最終，與沒有添加脂肪酶3的情況相比， 更多的IP6被植酸酶降解。這導(dǎo)致磷酸鹽⑵釋放和隨后動物吸收的增加。FFA-Ca復(fù)合物之后可在消化道中溶解，導(dǎo)致脂肪和鈣吸收增加。如果沒有植酸酶存在以水解IP6，這可與 FFA-Ca皂復(fù)合而形成不溶性的非可降解的IP6-Ca-FFA皂，從而導(dǎo)致脂肪、鈣和磷吸收的降低。
具體實施例方式除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本公開文本所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY, 20ED. ,John Wiley and Sons, New York (1994)以及 Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)為技術(shù)人員提供了在本公開文本中用到的許多術(shù)語的一般詞典。本公開文本并不受本文公開的示例性方法和材料的限制，任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公開文本的實施方案的實施或試驗。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另有指明，否則分別地，核酸序列是從左到右以5' -3' 取向書寫，氨基酸序列是從左到右以氨基到羧基方向書寫。本文提供的標(biāo)題并非對本公開文本的各個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，這些方面或?qū)嵤┓桨缚赏ㄟ^將說明書作為一個整體來參考而得到。相應(yīng)地，下面就要定義的術(shù)語通過將說明書作為一個整體來參考會得到更完全的定義。氨基酸在本文中用氨基酸名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指代。本文所用的術(shù)語“同源物”是指與所述氨基酸序列和所述核苷酸序列具有一定的同源性的實體。本文中，術(shù)語“同源性”可等同于“同一性”。合適地，“同源(的)”在這個上下文中指兩種酶之間在用下文更詳細(xì)描述的比對算法將它們的序列進(jìn)行比對后所得的序列同一性百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明的上下文中，同源氨基酸序列被認(rèn)為包括與所述序列可具有至少75、80、 81、85或90%同一性，優(yōu)選至少95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。通常，同源物將包含相同的活性位點等-例如與主題氨基酸序列的相同。盡管同源性可以相似性(即氨基酸殘基具有類似的化學(xué)性質(zhì)/功能)考慮，但在本發(fā)明的語境中優(yōu)選以序列同一性表達(dá)同源性。所謂“功能性片段”其意指多肽保留該多肽的特征性性質(zhì)的片段。在本發(fā)明的情形中，植酸酶的功能性片段為保留整個蛋白質(zhì)的從植酸釋放磷酸鹽的能力的片段。對于氨基酸序列和核苷酸序列，同源性比較可通過眼睛，或更通常地，借助于易于獲得的序列比較程序來進(jìn)行。這些市售的計算機(jī)程序可計算兩條或更多條序列之間的％同源性。%同源性可在連續(xù)的序列上計算，即將一條序列與另一條序列進(jìn)行比對，并將一條序列中的每個氨基酸與另一條序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，一次一個殘基。這稱為“不產(chǎn)生空位的”比對。通常，這種不產(chǎn)生空位的比對僅在相對較短數(shù)目的殘基上進(jìn)行。盡管這是十分簡單和可靠的方法，但其不能考慮，例如，在原本相同的一對序列中，一個插入或缺失將引起后面的氨基酸殘基不再對齊，從而在進(jìn)行全局比對時可能導(dǎo)致％同源性有大的降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計產(chǎn)生最佳的比對，該最佳比對考慮可能的插入和缺失而不會罰掉過多的整體同源性分?jǐn)?shù)。這通過在序列比對中插入“空位” 以試圖使局部同源性最大化來實現(xiàn)。然而，這些更復(fù)雜的方法給比對中出現(xiàn)的每一個空位賦給“空位罰分”使得，對于同樣數(shù)目的相同氨基酸，具有盡可能少空位的序列比對(反映兩條比較序列之間相關(guān)性較高)將獲得比具有許多空位的序列比對更高的分?jǐn)?shù)。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其對空位的存在征收相對較高的成本，對空位中每一個后續(xù)的殘基征收較少的罰分。這是最通常使用的空位打分系統(tǒng)。高的空位罰分將當(dāng)然會產(chǎn)生具有較少空位的最佳比對。大多數(shù)比對程序允許修改空位罰分。然而，當(dāng)用這種軟件進(jìn)行序列比較時優(yōu)選使用默認(rèn)值。例如，當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit程序包時，對于氨基酸序列的默認(rèn)空位罰分為 空位-12，每個空位延伸-4。最大％同源性的計算因而首先需要在考慮空位罰分的情況下產(chǎn)生最佳比對。適用于進(jìn)行這種比對的計算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等人1984 Nuc. Acids Research 12第387頁)?？蛇M(jìn)行序列比較的其他軟件的實例包括但不限于 BLAST 軟件包(參見 Ausubel 等人，1999Short Protocols in Molecular Biology，第 4 版-第 18 章)、FASTA(Altschul 等人，1990 J. Mol. Biol. 403-410)和 GENEffORKS 比較工具包。BLAST和FASTA 二者均可用于離線或在線搜索(參見Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology,第 7-58 至 7-60 頁)。然而，對于某些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱為BLAST 2Sequences 的新工具也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2) 247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) 187-8 和 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。盡管最終的％同源性可以同一性測量，但比對過程本身通常不是基于要么全有要么全無的成對比較。相反，通常使用標(biāo)度相似性打分矩陣，該矩陣基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離給每一成對比較賦給分值。通常使用的這種矩陣的實例是BL0SUM62矩陣-BLAST程序包的默認(rèn)矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公用默認(rèn)值或定制的符號比較表(如果提供的話)(對于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參見手冊)。對于某些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG軟件包的公共默值，或者在其他軟件的情形中，使用默認(rèn)矩陣，如BL0SUM62。作為另一種選擇，百分比同源性可用DNASIS (Hitachi Software)中的多比對功能，基于類似于 CLUSTAL (Higgins DG&Sharp PM (1988)，Gene73 (1)，237-244)的算法計算。一旦該軟件產(chǎn)生了最佳比對，則有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。作為序列比較的一部分該軟件通常進(jìn)行這些計算，并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，使用如下軟件和設(shè)置來計算序列同源性/同一性百分?jǐn)?shù)。對于氨基酸序列，通過 AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance9. 1，得自 hvitrogen Corporation,Carlsbad,California,USA.)針對每個可能的氨基酸序列對計算同一性(同源性)或“陽性”的百分?jǐn)?shù)。設(shè)置值是默認(rèn)參數(shù)(空位開放罰分-10，空位延伸罰分0.1)。對于核酸序列，通過得自hformax Inc. (USA)的AlignX VectorNTI程序針對每個可能的核酸序列對計算同一性(同源性)或“陽性”的百分?jǐn)?shù)。設(shè)置值是DNA的默認(rèn)設(shè)置值空位開放罰分15，空位延伸罰分6. 66。(與多序列比對的設(shè)置值相同)。優(yōu)選地，計算全長氨基酸序列的氨基酸同一性(同源性)，或者對于核酸而言，編碼各自全長氨基酸序列的相應(yīng)多核苷酸。序列還可具有氨基酸殘基的插入或置換，該插入或置換產(chǎn)生了沉默改變和導(dǎo)致功能等價的物質(zhì)。可根據(jù)氨基酸性質(zhì)(如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì))的相似性作出有意的氨基酸置換，因此按官能團(tuán)將氨基酸歸類在一起是有用的。 氨基酸可單獨根據(jù)它們的側(cè)鏈歸類在一起。但是，更有用的是也將突變數(shù)據(jù)包括在內(nèi)。由此衍生的氨基酸組別由于結(jié)構(gòu)原因很可能是保守的。這些組別可以以Verm圖表的形式描述 (Livingstone C. D.禾口 Barton G. J. (1993) “Protein sequence alignments :a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation，，Comput· Appl Biosci. 9 745-756) (Taylor W. R. (1986) “The classification of amino acid conservation，，J.Theor.Biol. 119 ；205-218)。保守置換可例如按照下表作出，該表描述了公認(rèn)的氨基酸 Venn圖表歸類。
權(quán)利要求
1.一種包含植酸酶和脂解酶的飼料補(bǔ)充物，其中所述脂解酶在約PHI. 5至約pH3. 5范圍內(nèi)的PH下具有脂肪酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述脂解酶包含具有SEQID NO :7或SEQ ID NO 8的序列的多肽，或與SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8的序列具有至少70%同一性的多肽；或者通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的多肽SEQ ID NO :9或10的序列； 或者由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO 9或10不同的序列；或者與SEQ ID NO 9或 10具有至少70%同一性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述脂解酶在里氏木霉細(xì)胞中產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述植酸酶包含具有SEQID NO 13的序列的大腸桿菌植酸酶和/或布丘氏菌屬植酸酶，所述布丘氏菌屬植酸酶具有SEQ ID NO :1-6中任一種的序列或與SEQ ID NO 1_6中任一種具有至少70%同一性的多肽或通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的多肽SEQ ID NO :11的序列；或SEQ ID NO 14 的核苷酸253至1483，或由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID N0:11或者SEQ ID N0:14的核苷酸253至1483不同的序列；或與SEQ ID N0:11或者SEQ ID NO 14的核苷酸253至 1483具有至少70%同一性的序列。
5.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述植酸酶在約pH2.5至約？!1 5. 5范圍內(nèi)的pH下具有植酸酶活性。
6.一種飼料補(bǔ)充物，所述飼料補(bǔ)充物包含i)脂解酶，其為由如下特性中的至少一種來表征的脂解酶_a)當(dāng)通過本說明書公開的脂肪酶測定法測量時在約pH1.5至約pH 3. 5范圍內(nèi)的pH 下具有脂肪酶活性的脂解酶；b)包含具有SEQID NO :7或8中所示的氨基酸序列的多肽或者與SEQ ID NO :7或8 具有至少70%同一性的多肽的脂解酶；c)通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的脂解酶SEQID NO 9或10的序列； 或由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO 9或10不同的序列；或與SEQ ID NO :9或10具有至少70%同一性的序列；和 )植酸酶，其為由如下特性中的至少一種來表征_d)當(dāng)在約pH2. 5至約pH 5. 5范圍內(nèi)的pH下測量時具有植酸酶活性的植酸酶；e)包含具有SEQID NO :1-6或SEQ ID NO :13中任一種所示的氨基酸序列的多肽或與 SEQ ID NO 1-6或SEQ ID NO 13中任一種具有至少70%同一性的多肽的植酸酶；f)通過表達(dá)包含如下序列的核苷酸序列而產(chǎn)生的植酸酶SEQID NO :11的序列或SEQ ID NO :14的核苷酸253至1483 ；或由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID N0:11或者SEQ ID NO 14的核苷酸253至1483不同的序列；或與SEQ ID NO: 11或者SEQ ID NO: 14的核苷酸 253至1483具有至少70%同一性的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述植酸酶在約pH5.0至約 pH 5. 5范圍內(nèi)的pH下也具有植酸酶活性。
8.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述植酸酶具有至少100FTU/mg 的比活性水平。
9.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述脂解酶具有至少100LIPU/ mg的比活性水平。
10.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，其中脂解酶與植酸酶之比在約1 3 至約12 1的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，所述飼料補(bǔ)充物還包含至少一種生理上可接受的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述生理上可接受的載體選自如下物質(zhì)中的至少一種麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環(huán)糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、淀粉、消泡劑、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它們的混合物。
13.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述飼料補(bǔ)充物包含至少一種另外的酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的飼料補(bǔ)充物，其中所述至少一種另外的飼料酶選自那些參與淀粉代謝、纖維降解、脂質(zhì)代謝的酶，參與糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶，乙酰酯酶、氨基肽酶、 淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、表異構(gòu)酶、酯酶、-半乳糖苷酶、-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、包括β葡萄糖苷酶在內(nèi)的-葡萄糖苷酶、葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、 氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲基酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇異果甜蛋白、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖02-氧化還原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果膠酶、纖維二糖水解酶、酸性磷酸酶和/或其他酶類或者它們的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的飼料補(bǔ)充物，所述飼料補(bǔ)充物包含至少一種木聚糖酶和/或至少一種淀粉酶。
16.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物，所述飼料補(bǔ)充物包含至少1重量％、 至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％或至少25重量％的脂解酶和植酸酶。
17.—種飼料，所述飼料包含根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的飼料補(bǔ)充物或至少一種脂解酶和至少一種植酸酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的飼料，所述飼料包含一種或多種選自如下的飼料材料a) 谷類，如小谷物(例如小麥、大麥、黑麥、燕麥以及它們的組合)和/或大谷物如玉蜀黍或高粱；b)谷類的副產(chǎn)物，如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、小麥麩皮、粗小麥粉、次小麥粉、米糠、稻殼、燕麥殼、棕櫚仁和柑橘渣；c)從諸如如下的來源獲得的蛋白質(zhì)大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、卡諾拉、魚粉、干血漿蛋白、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、小麥、干椰子肉、芝麻；d)從植物和動物來源獲得的油類和脂肪；e)礦物質(zhì)和維生素。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的飼料，所述飼料包含至少一種低纖維飼料材料以提供低纖維飼料，所述低纖維飼料材料選自玉米、小麥、動物副產(chǎn)物粉或大豆和/或所述至少一種低纖維飼料材料的至少一種副產(chǎn)物。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的飼料，所述飼料包含含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆的飼料。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項所述的飼料，所述飼料包含水平為約200FTU/kg至約 15，000FTU/kg(例如 300 至 10，000FTU/kg、400-7，500FTU/kg 以及 500_5000FTU/kg)的植酸酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一項所述的飼料，所述飼料包含水平為約125LIPU/ kg 至約 45，000LIPU/kg(例如 125 至 30，000LIPU/kg、1000_20000LIPU/kg 以及 3000-10000LIPU/kg)的脂解酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至21中任一項所述的飼料，所述飼料包含至少0.0001重量％、 至少0. 0005重量％、至少0. 0010重量％、至少0. 0020重量％、至少0. 0025重量％、至少 0. 0050重量％、至少0. 0100重量％、至少0. 020重量％、至少0. 100重量％、至少0. 200重量％、至少0. 250重量％、至少0. 500重量％的所述飼料補(bǔ)充物。
24.用于單胃動物食用的根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項所述的飼料，所述單胃動物選自禽、豬、家養(yǎng)寵物或魚。
25.根據(jù)權(quán)利要求16至23中任一項所述的飼料，所述飼料包含至少一種另外的添加劑。
26.一種制備根據(jù)權(quán)利要求16至M中任一項所述的飼料的方法，所述方法包括向飼料材料添加根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的飼料補(bǔ)充物。
27.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的飼料補(bǔ)充物的方法，所述方法包括將至少一種脂解酶與至少一種植酸酶混合。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，所述方法還包括添加至少一種生理上可接受的載體，所述生理上可接受的載體選自如下物質(zhì)中的至少一種麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、 環(huán)糊精、小麥或小麥組分、蔗糖、淀粉、消泡劑、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它們的混合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項所述的方法，所述方法包括均化所述飼料補(bǔ)充物的額外步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至觀中任一項所述的方法，所述方法包括對所述飼料補(bǔ)充物進(jìn)行制粒的額外步驟。
31.一種用于增加至少一種膳食營養(yǎng)物的可利用性和/或增加來自飼料材料的表觀代謝能(AME)的方法，所述方法包括向飼料材料添加根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的飼料補(bǔ)充物。
32.—種增加動物的生長速率的方法，所述方法包括給所述動物飼喂有效量的根據(jù)權(quán)利要求16至M中任一項所述的飼料。
33.至少一種植酸酶和至少一種脂肪酶在制造飼料中的用途，所述用途用于增加至少一種營養(yǎng)物的可利用性和/或增加來自飼料材料的可利用代謝能。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的用途，其中將所述至少一種植酸酶和至少一種脂肪酶配制為飼料補(bǔ)充物。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其中所述飼料補(bǔ)充物是根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的飼料補(bǔ)充物。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項所述的用途，其中所述至少一種營養(yǎng)物選自磷、鈣、 氨基酸、脂肪和/或淀粉。
37.一種飼料補(bǔ)充物，所述飼料補(bǔ)充物包含基本上如本文所述的植酸酶和脂肪酶。
38.一種飼料，所述飼料包含基本上如本文所述的飼料補(bǔ)充物或至少一種植酸酶和至少一種脂肪酶。
39.一種制備飼料的方法，所述飼料基本上如本文所述。
40.至少一種植酸酶和至少一種脂肪酶的用途或飼料補(bǔ)充物的用途，所述用途用于生產(chǎn)基本上如本文所述的飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含植酸酶和脂解酶的飼料補(bǔ)充物，其中所述脂解酶在約pH1.5至約pH3.5范圍內(nèi)的pH下具有脂肪酶活性。
文檔編號C12N9/16GK102573516SQ201080019666
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者C·林, L·F·羅梅羅米蘭, M·F·伊薩克森, M·R·扎爾加希, M·沃德, P·普盧姆斯泰德, R·H·洛倫特森, S·M·馬德里 申請人:丹尼斯科有限公司