專利名稱：產(chǎn)生甲烷的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的處理方法，所述處理可增加木質(zhì)纖維素纖維的可降解能力。具體地，本發(fā)明涉及由肥料(manure)，優(yōu)選來自牲畜的肥料產(chǎn)生甲烷， 其中與未處理的肥料相比，使用本發(fā)明的處理方法可增加甲烷的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
大多數(shù)基于天然植物的材料都包含大量的木質(zhì)纖維素纖維，其在很多生物系統(tǒng)中不可消化或者只能緩慢消化。這導(dǎo)致對于很多轉(zhuǎn)化基于植物的材料的生物過程而言，在處理過程中，大部分經(jīng)處理的材料不可消化或者只能進(jìn)行低水平的消化。例如在常用的沼氣(biogas)生產(chǎn)中，在厭氧條件下發(fā)酵植物肥料，形成沼氣和廢料，所述廢料在很大程度上由木質(zhì)纖維素纖維組成，其在厭氧沼氣過程的條件下幾乎不消化。在集中的動物生產(chǎn)的地區(qū)，肥料經(jīng)常引起環(huán)境問題。這些包括臭味形成，水道污染和產(chǎn)生貧瘠土地。隨著世界范圍動物生產(chǎn)持續(xù)增加，其對環(huán)境的影響也越來越大。同時，肥料是主要的未開采的可再生能源，具體為沼氣如甲烷的生產(chǎn)。由肥料產(chǎn)生沼氣是項古老的技術(shù)，現(xiàn)在的生產(chǎn)設(shè)備從簡單的帶蓋水塘到具有可控過程參數(shù)的復(fù)雜工業(yè)工廠。由于原始肥料(尿和糞的組合)的低能量強(qiáng)度，以及建立沼氣工廠需要的相對較大的資本支出，現(xiàn)在的基于工業(yè)肥料的工廠具有低的投資回報率(ROI)。 這種技術(shù)的用途通常較為有限，除非沼氣或電力生產(chǎn)是得到補(bǔ)貼的(例如在德國)。由于肥料中存在的木質(zhì)纖維素的低轉(zhuǎn)化率(目前對于奶牛肥料，實現(xiàn)多至約50%的理論甲烷生產(chǎn)潛力)，通常加入高能材料來獲得更多的沼氣。這種材料包括高能玉米或食品加工廢料。然而，據(jù)估計高能廢料的有限利用度和成本會將沼氣提取的應(yīng)用限制到僅為可用肥料的5%。有益的是提供增強(qiáng)由包含木質(zhì)纖維素纖維的材料(如來自奶?；蚱渌蟮姆柿?生產(chǎn)甲烷的方法。此技術(shù)能促進(jìn)肥料管理實踐的全球轉(zhuǎn)變，并將環(huán)境問題轉(zhuǎn)變成可獲利并且對環(huán)境有益的解決方案。發(fā)明簡述在第一個方面，本發(fā)明涉及包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的處理方法，所述方法包括步驟a.提供包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；b.用一種或多種微生物接種來自步驟a的材料；c.在需氧條件下培育所述材料。根據(jù)這個方面的方法可增加木質(zhì)纖維素纖維的可降解能力，使其更容易進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程，如沼氣生產(chǎn)過程，導(dǎo)致比本來有可能但未進(jìn)行本發(fā)明處理時更高的得率(yield)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及從包含木質(zhì)纖維素纖維的材料(優(yōu)選肥料) 產(chǎn)生甲烷的方法，所述方法進(jìn)一步包括a.提供包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；1.對來自步驟a的材料進(jìn)行第一厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生第一量的甲烷；2.在步驟1之后，任選地分離包含纖維的級分；b.用一種或多種微生物接種步驟1或2的材料；c.在需氧條件下培育來自步驟b的接種的材料；和d.對步驟c中獲得的材料進(jìn)行第二厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生第二量的甲烷。與通常僅包含第一厭氧發(fā)酵步驟的傳統(tǒng)沼氣方法相比，根據(jù)這個實施方案的方法提供更高的甲烷得率。因此，根據(jù)本發(fā)明，基于相同量的起始材料可以產(chǎn)生顯著更高量的沼氣。在第二個方面，本發(fā)明涉及選擇能消化木質(zhì)纖維素纖維級分的微生物或兩種或多種所述微生物的混合物的方法，所述方法包括步驟i)提供包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；ii)在需氧條件下，用候選微生物或兩種或多種微生物的混合物接種步驟i中提供的包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；iii)分析步驟ii中獲得的纖維級分，以確定是否有部分木質(zhì)纖維素纖維可以進(jìn)行處理(have been made accessible by the treatment)。在這個方面，包含木質(zhì)纖維素纖維的材料優(yōu)選來自肥料，所述肥料已通過提供包含木質(zhì)纖維素的級分的分級方法進(jìn)行厭氧發(fā)酵用于產(chǎn)生沼氣。在第三個方面，本發(fā)明提供選擇適合于本發(fā)明的方法的微生物的便利方法。在第四個方面，本發(fā)明提供微生物或微生物的混合物，其特別適合于根據(jù)本發(fā)明的方法。在第五個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)所述方法中第四方面的微生物或兩種或多種微生物的用途。附圖簡述

圖1.甲烷校準(zhǔn)曲線，濃度為1χ10_7至3. 8xl0_6mol CH4，其包括括號中的由樣本獲 白勺甲白勺t示}t· (includes standards bracketing the methane concentrations obtained in the samples)0圖2.處理3天(圖2a)、7天(圖2b)和14天(圖2c)的纖維的甲烷產(chǎn)生曲線 (實施例1)。包括來自僅用水處理的纖維的甲烷水平作為參照。圖3.處理9天(圖3a)和15天(圖3b)的纖維的甲烷產(chǎn)生曲線(實施例2)。包括來自僅用水處理15天的纖維的甲烷水平作為參照。圖4.甲烷產(chǎn)生曲線，顯示在纖維需氧處理觀天的過程中加入的微生物產(chǎn)物的劑量對于甲烷生產(chǎn)的影響(實施例3)。包括來自僅用水處理的纖維的甲烷水平作為參照。發(fā)明詳述描述根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“沼氣”意指使用肥料在傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵罐中獲得的氣體。沼氣的主要成分是甲烷，并且在本申請中術(shù)語“沼氣”和“甲烷”可互換使用。在本申請中，術(shù)語“初級消化器”意指發(fā)生第一厭氧發(fā)酵的容器。在本申請中，術(shù)語“二級消化器”意指發(fā)生第二厭氧發(fā)酵的容器。根據(jù)沼氣設(shè)施的具體配置，初級消化器也可用作二級消化器。在根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的處理方法中，通常在容器中提供所述材料，然而本發(fā)明的處理可以無容器進(jìn)行，例如在堆中(in a pile)進(jìn)行。包含木質(zhì)纖維素纖維的材料可以是任何已處理或未處理的植物材料以及包含這種植物材料的任何組合物。可以處理或不處理植物材料。在本申請中，已處理植物材料意指植物材料的任何適當(dāng)處理，例如可以使用適當(dāng)技術(shù)如剁碎(mince)、截砍(chop)或切割(cut)而破碎植物材料；或者使用例如蒸汽處理或煮沸等進(jìn)行加熱。根據(jù)本發(fā)明的包含木質(zhì)纖維素纖維的材料可以是任何包含木質(zhì)纖維素纖維的材料。這種材料的實例包括，但不限于，木材，稻草，干草，草，青貯，如谷類青貯、玉米青貯、草青貯；甘蔗渣和肥料，如來自牲畜例如家畜或牛(cattle)、?；蚰膛?cow)、家禽、豬、羊和馬的肥料。優(yōu)選的包含木質(zhì)纖維素纖維的材料是肥料，優(yōu)選來自家畜的肥料，最優(yōu)選來自奶牛的肥料。干草和稻草包含近90 % w/w的木質(zhì)纖維素。在家畜肥料中，木質(zhì)纖維素纖維(粗纖維)占總固體的40-50%。木質(zhì)纖維素纖維由碳水化合物的核心組成，特別是纖維素和半纖維素，其占纖維結(jié)構(gòu)的63-78 %。纖維素和半纖維素由木質(zhì)素包裹并支撐，所述木質(zhì)素占木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的15-38%。比較各種產(chǎn)奶家畜/奶牛和豬肥料的組成的研究顯示，平均來說家畜/牛肥料包含VFA(揮發(fā)性脂肪酸)(36g/kg VS)，蛋白質(zhì)(150g/kg VS)，脂肪(69g/kg VS)，可降解碳水化合物G34g/kg VS)，不可降解碳水化合物(191g/kg VS)，木質(zhì)素(121g/ kgVS)，和粗纖維(270g/kg VS)。豬肥料平均包含:VFA(30g/kg VS)，蛋白質(zhì)(202g/kg VS)， 脂肪(163g/kg VS)，可降解碳水化合物(390g/kg VS)，不可降解碳水化合物(148g/kg VS)， 木質(zhì)素(68g/kg VS)，和粗纖維(171g/kg VS)。在本申請中，術(shù)語木質(zhì)纖維素纖維意指以任何形式、數(shù)量和比例包含木質(zhì)纖維素、 木質(zhì)素和/或纖維素的任何植物材料。木質(zhì)纖維素纖維可以進(jìn)一步包含其它植物來源的組分如淀粉，葡聚糖，阿拉伯聚糖，半乳聚糖，果膠，甘露聚糖，半乳甘露聚糖和半纖維素如木聚糖。根據(jù)本發(fā)明的微生物可以選自細(xì)菌，酵母或真菌，或者它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明的微生物或兩種或多種微生物的混合物具有在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的第二厭氧發(fā)酵步驟中提供高甲烷產(chǎn)生量的益處。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用根據(jù)本發(fā)明的微生物提供了令人驚訝的高甲烷產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的微生物的優(yōu)選實例包括如下屬菌株 芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬G^seudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)禾口曲霄屬(Aspergillus),如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、溶解腸桿菌 (Enterobacter dissolvens)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜口比唆紅球菌 (Rhodococcus pyridinivorans)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida) >^ZfeMlixIfilif (Pseudomonas pseudoalcaligenes) > 南極假單胞菌(Pseudomonas Antarctica)、蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteilii)、門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉 (Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)，或者其兩種或更多種的任意組合。特別優(yōu)選的菌株包括枯草芽孢桿菌(NRRL B_50136)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256)，溶解腸桿菌(NRRL B-50257)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258)，變形假單胞菌 (ATCC 31483)，惡臭假單胞菌(NRRL B-50247)，變形假單胞菌(NRRL B-50248)，嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249)，惡臭假單胞菌(ATCC 49451)，門多薩假單胞菌(ATCC 53757)，鮑曼不動桿菌(NRRL B-5O2M)，短小芽孢桿菌(NRRL B-5O255)，地衣芽孢桿菌(NRRL B-5OHl),解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50151)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50019)，門多薩假單胞菌(ATCC 53757)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50250)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50251)，蒙氏假單胞菌 (NRRL B-50252)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50253)，南極假單胞菌(NRRL B-50259)，解淀粉芽孢桿菌(ATCC 5M05)，黑曲霉(NRRL 50245)，和米曲霉(NRRL 50246)。技術(shù)人員理解在根據(jù)本發(fā)明的用途中如何使用公知技術(shù)確定這些優(yōu)選菌株的合適的量。在優(yōu)選的實施方案中，以1. OxlO6至5. 0xl09CFU/g的量加入菌株。作為特別優(yōu)選的微生物或兩種或多種微生物的混合物的實例可提及-混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；1. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌 (NRRL B-50256 ；0. 6xl09CFU/g)，溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ；0. 6xl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ；0. 8xl09CFU/g)，熒光假單胞菌(ATCC31483 ；0. SxlOtFU/g)，惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ;0. 4xl09CFU/g)，變形假單胞菌(NRRL B-50248 ;0. 4xl09CFU/g)，嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249 ；0. SxlOtFU/g)，惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. 4xl09CFU/g)，門多薩假單胞菌(ATCC53757 ；0. 8xl09CFU/g)，和鮑曼不動桿菌(NRRL B-50254 ；0. 2xl09CFU/g)；-混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；1. 6xl09CFU/g)，短小芽孢桿菌 (NRRL B-50255 ；0. 2xl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50141 ；0. 2xl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50151 ；0. 2xl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50019 ；0. 2xl09CFU/ g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256 ；0. 2xl09CFU/g)，溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ； 0. 3xl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ；0. 8xl09CFU/g)，變形假單胞菌(ATCC 31483 ；0. 7xl09CFU/g)，惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ；0. 2xl09CFU/g)，變形假單胞菌(NRRL B-50248 ；0. 2xl09CFU/g)，嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249 ；0. 3xl09CFU/g)，惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. 2xl09CFU/g)，門多薩假單胞菌(ATCC 53757 ；0. 3xl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50250 ；0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50251 ；0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌 (NRRL B-50252 ;0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50253 ;0. lxl09CFU/g)，和南極假單胞菌(NRRL B-50259 ；0. 2xl09CFU/g)；禾口-混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；3. 5xl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌 (ATCC 55405 ；1. 0xl09CFU/g)，南極假單胞菌(NRRL B-50259 ；0. 2xl09CFU/g)，黑曲霉(NRRL 50245 ；0. 8xl09CFU/g)，和米曲霉(NRRL 50246 ；0. 8xl09CFU/g)。此外，根據(jù)下述商品名由Novozymes Biological he.商業(yè)上可得到的微生物或兩種或多種微生物的混合物也根據(jù)本發(fā)明的第三方面適用BI-CHEM ABR-Hydrocarbon, BI-CHEM DC 1008 CB 和 Manure Degrader0
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需氧條件下的培育可以以分批過程、補(bǔ)料分批過程或連續(xù)過程進(jìn)行。在分批過程中，裝入容器，加入微生物的適當(dāng)接種物并進(jìn)行所需時間的所述過程。在補(bǔ)料分批過程中， 向容器中加入初始體積的包含木質(zhì)纖維素纖維的材料，通常為容器總操作體積的25-75%， 加入微生物的適當(dāng)接種物并進(jìn)行過程直至達(dá)到一定的轉(zhuǎn)化率/細(xì)胞密度，此時以適當(dāng)速率加入包含木質(zhì)纖維素纖維的材料形式的額外補(bǔ)料，并繼續(xù)進(jìn)行過程直至容器已滿并任選地，在不加入額外補(bǔ)料的情況下繼續(xù)進(jìn)行一段時間。在連續(xù)過程中，通過向容器中加入包含木質(zhì)纖維素纖維的材料而開始所述過程，并加入微生物的適當(dāng)接種物，當(dāng)達(dá)到所需的細(xì)胞密度時，去除容器中的組合物液體并同時向容器中加入包含木質(zhì)纖維素的材料液體，使體積保持基本恒定并且該過程原則上盡可能長時間地繼續(xù)進(jìn)行。甚至可能使用這些技術(shù)的組合。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已知，并且技術(shù)人員了解如何根據(jù)容器的具體維度和性質(zhì)為具體過程找到合適的參數(shù)。通氣的手段在本領(lǐng)域中公知，并且技術(shù)人員能夠為本發(fā)明選擇合適的通氣手段。 通常通過向?qū)⒖諝獯颠^組合物而進(jìn)行通氣，通常通過位于容器下部的一個或多個管路或管道進(jìn)行，所述一個或多個管路或管道上設(shè)有規(guī)則間隔的洞，以提供空氣在組合物中均勻分布。根據(jù)本發(fā)明也可以使用其它通氣手段。選擇需氧發(fā)酵步驟中的通氣速率，為微生物提供便利的生長速率?？梢砸泽w積空氣每體積發(fā)酵每分鐘(v/v/m)測量通氣速率，并且通常在O.Olv/v/m至lOv/v/m范圍中的通氣是適當(dāng)?shù)模瑑?yōu)選0. 05v/v/m至5v/v/m，更優(yōu)選0. lv/v/m至2v/v/m，更優(yōu)選0. 15v/v/m 至 1. 5v/v/m 并且最優(yōu)選 0. 2v/v/m 至 lv/v/m。在考慮下述情況時可決定這個步驟的持續(xù)時間在一方面，需氧條件下的培育應(yīng)該持續(xù)足夠長的時間，從而使相當(dāng)部分的木質(zhì)纖維素溶解，可以進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程；在另一方面，需氧步驟不應(yīng)進(jìn)行太長時間而消耗(combust) 了大部分纖維級分。通常地，需氧步驟持續(xù)5至30天，優(yōu)選7至25天，更優(yōu)選10至20天，并且最優(yōu)選約15天。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用這樣的培育時間可將適當(dāng)高部分的木質(zhì)纖維素纖維轉(zhuǎn)化成可在后續(xù)微生物或生物過程中轉(zhuǎn)化的形式。應(yīng)在考慮根據(jù)本發(fā)明實驗的微生物或兩種或多種微生物的混合物的具體要求的情況下選擇這個步驟中的溫度。通常地，在10°c至60°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選在15°C至50°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在20°C至45°C的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在25°C至40°C的范圍內(nèi)選擇所述溫度， 并且最優(yōu)選約35 °C。根據(jù)本發(fā)明的方法可增加木質(zhì)纖維素纖維的可降解能力，使其更容易進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程，如沼氣生產(chǎn)過程，導(dǎo)致比未使用本發(fā)明的方法時可能獲得的更高的得率。需氧條件下的培育持續(xù)至木質(zhì)纖維素纖維的可降解能力已經(jīng)增加到令人滿意的程度，從而相當(dāng)部分的木質(zhì)纖維素纖維容易進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明，木質(zhì)纖維素纖維容易處理時，可處理的纖維或其部分將可以進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程，表示可處理的纖維或其部分可以在后續(xù)的微生物或生物過程中轉(zhuǎn)化。因此，通過下述可以確定木質(zhì)纖維素的可處理能力(accessibility)是否通過本發(fā)明的方法來增加對根據(jù)本發(fā)明處理的材料進(jìn)行后續(xù)的微生物或生物過程，并比較所述后續(xù)微生物或生物過程的得率與使用包含木質(zhì)纖維素纖維相同的材料但未使用本發(fā)明方法的相應(yīng)后續(xù)微生物或生物過程的得率。以沼氣形成作為后續(xù)微生物或生物過程的實例，可以確定根據(jù)本發(fā)明的處理方法是否增加了包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的可處理能力，包含木質(zhì)纖維素纖維的材料可以使用本發(fā)明的方法處理，然后進(jìn)行通常的厭氧沼氣形成過程，確定根據(jù)本發(fā)明處理的包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的沼氣得率，并與相同的沼氣形成過程但未使用本發(fā)明方法的得率相比較。如果使用本發(fā)明的方法時沼氣得率較高，根據(jù)本發(fā)明，木質(zhì)纖維素纖維的可處理能力提尚。另一個確定木質(zhì)纖維素纖維的可處理能力是否增加的方法是在進(jìn)行本發(fā)明的方法后確定可溶碳水化合物的量，例如，如實驗方法部分1-3中所示。技術(shù)人員了解使用不同的后續(xù)微生物或生物方法能夠用不同的方法確定根據(jù)本發(fā)明所增加的可處理能力。根據(jù)本發(fā)明的方法可以與任何后續(xù)微生物或生物過程聯(lián)合使用，在所述過程中理想地可實現(xiàn)包含木質(zhì)纖維素纖維的更高程度的利用(increased utilisation).本發(fā)明可以用于但不限于下述微生物或生物過程沼氣形成和牲畜飼料。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及甲烷的生產(chǎn)。在這個實施方案中，甲烷的生產(chǎn)可以以兩步驟過程進(jìn)行，所述過程包含根據(jù)本發(fā)明的方法，之后進(jìn)行沼氣生產(chǎn)過程，其原則上可以是本領(lǐng)域已知的任何用于沼氣形成的過程。在另一個實施方案中，甲烷的生產(chǎn)可以以下述過程進(jìn)行，所述過程包括第一沼氣形成過程，之后是根據(jù)本發(fā)明的方法，然后是第二沼氣形成過程。在另一個實施方案中，包含木質(zhì)纖維素纖維的材料優(yōu)選為肥料如任何牲畜產(chǎn)生的肥料。典型地，肥料來自家畜/牛、豬、馬、綿羊、雞或山羊，其中優(yōu)選來自家畜/牛的肥料， 特別是來自產(chǎn)奶家畜/奶牛的肥料。參照肥料進(jìn)一步解釋這個實施方案，然而，應(yīng)理解的是，其不限于肥料。方法中的第一厭氧發(fā)酵對應(yīng)于生產(chǎn)沼氣的肥料傳統(tǒng)發(fā)酵。因此這個步驟原則上可以實驗本領(lǐng)域已知的用于發(fā)酵肥料產(chǎn)生沼氣的技術(shù)進(jìn)行。第一厭氧發(fā)酵步驟如本領(lǐng)域已知在適當(dāng)?shù)娜萜髦邪l(fā)生。在這個步驟中使用已知技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵直至沼氣產(chǎn)生減慢到不可接受的較慢速率。 技術(shù)人員能夠選擇所述發(fā)酵的合適終止點。也可以使用本領(lǐng)域已知的用于分離具有流變性質(zhì)的組合物的技術(shù)進(jìn)行包含纖維的級分的分離，所述組合物與沼氣發(fā)酵過程留下的已發(fā)酵的肥料相似。這些分離技術(shù)在本領(lǐng)域中已知，并且為分離過程選擇適當(dāng)參數(shù)在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。需氧發(fā)酵后，使用原則上與第一厭氧發(fā)酵相同的過程將已發(fā)酵肥料進(jìn)行厭氧發(fā)酵，并且在這個步驟中產(chǎn)生更多的沼氣。這第二厭氧發(fā)酵原則上在與需氧發(fā)酵發(fā)生的相同容器中發(fā)生，通過簡單的停止通氣和加入適當(dāng)量接種物而進(jìn)行發(fā)酵?？商鎿Q地，具體對于連續(xù)過程，需氧發(fā)酵后的肥料轉(zhuǎn)移至另一個容器中進(jìn)行第二厭氧發(fā)酵。這個容器可以是發(fā)生第一厭氧發(fā)酵的相同的容器，或者可以是單獨(dú)的容器。過程獲得的甲烷的量依賴于肥料的組成，所述肥料的組成又依賴于肥料來源的動物，所述動物的飼料等；但是典型地，在第一厭氧發(fā)酵中可獲得約225ml CH4/g VS的甲烷量。第二厭氧發(fā)酵罐通常提供第一厭氧發(fā)酵中獲得的沼氣量的至少10%，優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少30 %，更優(yōu)選至少35 %，更優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少45 %，甚至更優(yōu)選至少 50%，最優(yōu)選至少55%和在一個特別優(yōu)選的實施方案中為至少60%。在本發(fā)明的第二方面提供選擇適于增強(qiáng)第一厭氧發(fā)酵中纖維級分的甲烷產(chǎn)生潛力的微生物或兩種或多種微生物的混合物的方法。用于本發(fā)明這個方面的纖維級分原則上可以以與根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法中提供的纖維級分相似的方法制備。然而，本發(fā)明的第一方面涉及大規(guī)模(生產(chǎn)規(guī)模)進(jìn)行的方法，通常為幾個m3，而本發(fā)明的第二方面通常以小得多的規(guī)模進(jìn)行，比如通常在實驗室實驗的規(guī)模，比如幾g或kg的數(shù)量級。當(dāng)提供纖維級分時，將候選微生物或兩種或多種微生物的混合物與纖維級分的等分試樣一起溫育，通常為幾克，然而用于此步驟的實際量對于本發(fā)明不是重要的。此外，可以加入營養(yǎng)物、鹽、維生素和支持候選微生物或兩種或多種微生物的混合物生長的其他生長因子。候選微生物或兩種或多種微生物的混合物與纖維級分的溫育通常進(jìn)行5至30天， 優(yōu)選7至25天，更優(yōu)選10至20天，并且最優(yōu)選約15天。
實施例 實驗方法在400-ml燒杯中，將50g纖維與70ml去離子水和5ml微生物聚生體(consortium) 組合至終濃度為 hl05cfU/ml。在纖維中將水和微生物聚生體徹底混合。每個燒杯上覆蓋蒸汽紙以允許氣體交換，并將它們在每次實驗開始時稱重。加蓋的燒杯在30°C溫育長達(dá) 2周。定期地，重新稱重?zé)⒄舭l(fā)損失的水加回。2.厭氧甲烷生產(chǎn)能力在需氧處理后，將每種條件下的4g處理后的纖維轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的500ml棕色瓶 (amber bottle)中。對于每個棕色瓶，加入200ml厭氧消化接種物，并且用隊氣注滿頂部空間。使用前，將新鮮的厭氧可消化接種物在52°C溫育至少2周，去除殘余的甲烷生產(chǎn)潛力并降低背景甲烷產(chǎn)生。給瓶子加塞并密封，防止氣體損失并保持厭氧狀態(tài)。每個處理的兩個瓶子和相關(guān)對照在52°C溫育觀天。定期使用鎖定的1-ml氣體密封注射器從頂部空間取樣，轉(zhuǎn)移至氣封GC小瓶中，并使用氣相色譜分析甲烷含量。3.氣相餼譜(GC)方法使用配有火焰離子化檢測器(GC-FID)和SupeIQPLOT 30m χ 0. 53m柱(Supelco) 的Siimadzu GC-2010氣相色譜測量甲烷。使用流速為30ml/min的He載氣，而且進(jìn)樣口、 爐和檢測器溫度分別為100°C、35°C和235°C，甲烷峰的保留時間為2. 7士0. 2分鐘。通過注射從49%甲烷標(biāo)準(zhǔn)品制備的不同濃度甲烷產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。4.微生物聚生體簡述聚生體1包含枯草芽孢桿菌(NRRL B-50136 ；1. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌 (NRRL B-50256 ；0. 6xl09CFU/g)，溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ；0. 6xl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ；0. 8xl09CFU/g)，變形假單胞菌(ATCC31483 ；0. SxlOtFU/g)，惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ;0. 4xl09CFU/g)，變形假單胞菌(NRRL B-50248 ;0. 4xl09CFU/g)，嗜吡啶
10紅球菌(NRRL 50249 ；0. SxlOtFU/g)，惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. 4xl09CFU/g)，門多薩假單胞菌(ATCC53757 ；0. 8xl09CFU/g)，和鮑曼不動桿菌(NRRL B-50254 ；0. 2xl09CFU/g)。聚生體2包含枯草芽孢桿菌(NRRL B-50136 ;1. 6xl09CFU/g)，短小芽孢桿菌 (NRRL B-50255 ；0. hl09CFU/g)，地衣芽孢桿菌(NRRL B-50141 ；0. hl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50151 ；0. hlOtFU/g)，解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50019 ；0. 2xl09CFU/g)， 蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256 ;0. 2xl09CFU/g)，溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ；0. 3xl09CFU/ g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ；0. 8xl09CFU/g)，變形假單胞菌(ATCC 31483 ； 0. 7xl09CFU/g)，惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ；0. 2xl09CFU/g)，變形假單胞菌(NRRL B-50248 ；0. 2xl09CFU/g)，嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249 ；0. 3xl09CFU/g)，惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. 2xl09CFU/g)，門多薩假單胞菌(ATCC 53757 ；0. 3xl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50250 ；0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50251 ；0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌 (NRRL B-50252 ;0. lxl09CFU/g)，蒙氏假單胞菌(NRRL B-50253 ;0. lxl09CFU/g)，和南極假單胞菌(NRRL B-50259 ；0. 2xl09CFU/g)。聚生體3包含枯草芽孢桿菌(NRRL B-50136 ；3. 5xl09CFU/g)，解淀粉芽孢桿菌 (ATCC 55405 ；1. 0xl09CFU/g)，南極假單胞菌(NRRL B-50259 ；0. 2xl09CFU/g)，黑曲霉(NRRL 50245 ；0. 8xl09CFU/g)，和米曲霉(NRRL 50246 ；0. 8xl09CFU/g)。實施例1.通過測量分批類型厭氧消化器中在需氧微生物處理后獲得的額外甲烷的量，可以評價來自初始厭氧處理中殘余纖維的成功的微生物轉(zhuǎn)化。用選出的微生物菌株進(jìn)行纖維的這種需氧處理稱作“需氧處理”或“處理”。首先，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，其使用從1χ10_7至3. 8xl0_6mol CH4的甲烷濃度，其在括號中表示典型樣品中獲得的甲烷濃度(圖1)。獲得的直線的R2值為0.9983。在這第一個實施方案中，用一種上述微生物聚生體(1、2或幻將來自厭氧消化過程的殘余纖維在30°C處理3、7或14天。向所述厭氧消化瓶加入來自所有處理樣品的纖維。 在指定時間將來自微生物處理樣品和對照的甲烷產(chǎn)生定量，如上所述。將這一結(jié)果與僅用水處理的纖維產(chǎn)生的甲烷相比較。水的加入并未顯著增加甲烷生產(chǎn)。用三種不同微生物聚生體(1、2和幻處理的纖維導(dǎo)致在觀天厭氧溫育期過程中產(chǎn)生的甲烷增加(圖2)。在用微生物產(chǎn)物處理3天時，觀察到15-16. 2mlCH4/g VS的甲烷產(chǎn)生。對于每種纖維處理，評價三個單獨(dú)的需氧瓶以提供給出的標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用更長的溫育時間獲得甲烷產(chǎn)生量的持續(xù)增加，在后處理2周的纖維中觀察到獲得的最大甲烷產(chǎn)生量。用三種微生物聚生體(1、2和幻處理的纖維中的總體甲烷產(chǎn)生量在需氧后處理14 天后比水處理的纖維對照高80至IOOml額外CH4/g VS0實施例2.完成第二個研究以確認(rèn)微生物聚生體的活性，現(xiàn)在評價9天和15天需氧處理的效果。結(jié)果(圖幻確認(rèn)了聚生體1、2和3從已處理纖維增強(qiáng)甲烷回收率的能力。使用的所有方法如實施例1中所述。在需氧堆肥15天后實現(xiàn)實施例2中最大的甲烷產(chǎn)生量。實施例3.在這個實驗中研究了在纖維需氧處理過程中加入的微生物產(chǎn)物的劑量對于甲烷生產(chǎn)的影響。如上所述在30°C進(jìn)行兩周的纖維需氧處理，但是以5*104，5*105和5*106cfu/ml的劑量加入如上所述的聚生體1，聚生體2和聚生體3的微生物產(chǎn)物。需氧處理后，對4g 微生物處理的纖維分析其厭氧甲烷產(chǎn)生潛力。在52°C溫育1、2、3和4周后測量甲烷產(chǎn)生量。在陰性對照(未加入微生物的實驗)中，甲烷產(chǎn)生量小于5ml/g VS0這個實驗的結(jié)果如圖4所示。曲線顯示四周過程中獲得的最高甲烷生產(chǎn)量。結(jié)果顯示隨著微生物的劑量在IO4至106CFU/ml范圍內(nèi)增加，甲烷產(chǎn)生潛力增加。實施例4.在這個實驗中在兩個獨(dú)立實驗室進(jìn)行微生物處理。在實驗室之間交換處理后的纖維。在30°C進(jìn)行兩周的纖維需氧處理，加入5*105cfu/ml如上所述的聚生體1的三種不同微生物產(chǎn)物變體。在兩個實驗室中測試相同的微生物產(chǎn)物，并且測試的纖維相同。需氧處理后，對4g纖維分析其厭氧甲烷產(chǎn)生潛力。在52°C溫育1、2、3和4周后測量甲烷產(chǎn)生量。兩個獨(dú)立的實驗室在開始測定厭氧甲烷產(chǎn)生潛力之前使用在52°C預(yù)培養(yǎng) 2-3周的厭氧接種物。厭氧接種物來自兩個不同并且完全獨(dú)立的沼氣裝置。實驗室1使用的接種物來自位于美國的工廠，實驗室2的接種物來自丹麥沼氣工廠。還包括了用于測量來自每個厭氧沼渣(digestate)源的內(nèi)在背景甲烷產(chǎn)生潛力(inherent background methane potential)的陰性對照。表1顯示這個實驗的結(jié)果。這些結(jié)果顯示在兩個實驗室進(jìn)行的所有微生物需氧處理都顯著增加甲烷的生產(chǎn)。然而，僅在實驗室1中進(jìn)行的厭氧甲烷產(chǎn)生潛力研究中觀察到了高于陰性對照的顯著的CH4增強(qiáng)。在實驗室2中使用的厭氧沼渣源中測試的所有樣品 (包括陰性對照)中都產(chǎn)生更高量的甲烷，這顯示來自沼渣的內(nèi)在背景甲烷產(chǎn)生潛力顯著高于實驗室1中使用的厭氧沼渣的相關(guān)潛力。這些結(jié)果顯示依賴于厭氧系統(tǒng)的效率、底物源、加入?yún)捬跸髦暗孜锏奶幚砗推渌硗獾募庸?，需氧微生物處理可能具有限制。?.兩個獨(dú)立實驗室進(jìn)行的實驗中的甲烷產(chǎn)生量每克揮發(fā)性固體(VS)。對于實驗室1/實驗室1列的結(jié)果，需氧處理和厭氧甲烷產(chǎn)生潛力均在實驗室1進(jìn)行。對于實驗室 2/實驗室1列的結(jié)果，需氧處理在實驗室2進(jìn)行，而厭氧甲烷產(chǎn)生潛力在實驗室1評價。對于實驗室2/實驗室2，全部實驗在實驗室2進(jìn)行。對于實驗室1/實驗室2，需氧處理在實驗室1進(jìn)行，而厭氧甲烷產(chǎn)生潛力在實驗室2確定。
權(quán)利要求
1.包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的處理方法，所述方法包括步驟a.提供包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；b.用一種或多種微生物接種來自步驟a的材料；和c.在需氧條件下培育所述材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述包含木質(zhì)纖維素纖維的材料選自下組玉米青貯、 草青貯、甘蔗渣和肥料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述肥料選自牛、家禽、豬或其它牲畜的肥料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述一種或多種微生物選自下組芽 ？包桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)禾口曲霄屬(Aspergillus),如地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、溶解腸桿菌 (Enterobacter dissolvens)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜口比唆紅球菌 (Rhodococcus pyridinivorans)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、變形假單胞菌 (Pseudomonas plecoglossicida) >^ZfeMlixIfilif (Pseudomonas pseudoalcaligenes) > 南極假單胞菌(Pseudomonas Antarctica)、蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteilii)、門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉 (Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)，或者其兩種或更多種的任意組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中每種菌株以1.0x106-5. 0xl09CFU/g的量加入。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括在步驟c后進(jìn)行的厭氧發(fā)酵用于產(chǎn)生沼氣。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包含在步驟b前進(jìn)行的厭氧發(fā)酵用于產(chǎn)生沼氣。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中步驟c中在需氧條件下的培育進(jìn)行預(yù)定的時間或者直到實現(xiàn)包含木質(zhì)纖維素纖維的材料的所需程度的降解。
9.用于由包含木質(zhì)纖維素纖維的材料產(chǎn)生甲烷的方法，所述方法包括(a)提供包含木質(zhì)纖維素纖維的材料；(1)對來自步驟a的材料進(jìn)行第一厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生第一量的甲烷；(2)在步驟1之后，任選地分離包含纖維的級分；(b)用一種或多種微生物接種步驟1或2的材料；(c)在需氧條件下培育來自步驟b的接種的材料；和(d)對步驟c中獲得的材料進(jìn)行第二厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生第二量的甲烷。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述包含木質(zhì)纖維素纖維的材料來自已進(jìn)行過沼氣生產(chǎn)方法的肥料，所述方法包括提供包含木質(zhì)纖維素纖維的級分的分級方法。
11.能增強(qiáng)木質(zhì)纖維素纖維級分產(chǎn)甲烷能力的微生物或者兩種或多種微生物的混合物，所述微生物選自下組枯草芽孢桿菌(NRRL B-50136)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256)、 溶解腸桿菌(NRRL B-50257)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258)、變形假單胞菌(ATCC 31483)、 惡臭假單胞菌(NRRL B-50247)、變形假單胞菌(NRRL B-50248)、嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249)、惡臭假單胞菌(ATCC 49451)、蒙氏假單胞菌(ATCC 53757)、鮑曼不動桿菌(NRRL B-50254)、短小芽孢桿菌(NRRL B-50255)、地衣芽孢桿菌(NRRL B-50141)、解淀粉芽孢桿菌 (NRRL B-50151)、解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50019)、門多薩假單胞菌(ATCC 53757)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50250)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50251)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50252)、 蒙氏假單胞菌(NRRL B-50253)、南極假單胞菌(NRRL B-50259)、解淀粉芽孢桿菌(ATCC 55405)、黑曲霉(NRRL50245)，和米曲霉(NRRL 50246)，或者它們的任意組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物或微生物的混合物，其中每種微生物以 1. 0x106-5. 0xl09CFU/g 的量存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的微生物的混合物，其中所述混合物為(a)微生物混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；1. lxl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256 ；0. 6xl09CFU/g)、溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ；0. 6xl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ;0. 8xl09CFU/g)、熒光假單胞菌(ATCC 31483 ;0. 8xl09CFU/g)、惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ;0. 4xl09CFU/g)、變形假單胞菌(NRRL B-50248 ;0. 4xl09CFU/g)、嗜吡啶紅球菌(NRRL50249 ；0. 8xl09CFU/g)、惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. 4xl09CFU/g)、門多薩假單胞菌(ATCC 53757 ;0. 8xl09CFU/g)，和鮑曼不動桿菌(NRRL B-50254 ；0. 2xl09CFU/ g)；(b)微生物混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；1. 6xl09CFU/g)、短小芽孢桿菌(NRRL B-50255 ;0. 2xl09CFU/g)、地衣芽孢桿菌(NRRL B-50017 ；0. 2xl09CFU/ g)、解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50151 ;0. 2xl09CFU/g)、解淀粉芽孢桿菌(NRRL B-50019 ； 0. 2xl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50256 ；0. 2xl09CFU/g)、溶解腸桿菌(NRRL B-50257 ；0. 3xl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50258 ；0. 8xl09CFU/g)、變形假單胞菌 (ATCC 31483 ；0. 7xl09CFU/g)、惡臭假單胞菌(NRRL B-50247 ；0. 2xl09CFU/g)、變形假單胞菌(NRRL B-50248 ；0. 2xl09CFU/g)、嗜吡啶紅球菌(NRRL 50249 ；0. 3xl09CFU/g)、惡臭假單胞菌(ATCC 49451 ；0. hl09CFU/g)、門多薩假單胞菌(ATCC53757 ；0. 3xl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50250 ；0. lxl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50251 ；0. lxl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50252 ；0. lxl09CFU/g)、蒙氏假單胞菌(NRRL B-50253 ；0. lxl09CFU/g)和南極假單胞菌(NRRL B-50259 ；0. 2xl09CFU/g)；(c)微生物混合物，其包含枯草芽孢桿菌(NRRLB-50136 ；3. 5xl09CFU/g)、解淀粉芽孢桿菌(ATCC 5M05 ;1. 0xl09CFU/g)、南極假單胞菌(NRRL B-50259 ;0. 2xl09CFU/g)、黑曲霉 (NRRL 50245 ；0. 8xl09CFU/g)和米曲霉(NRRL 50246 ；0. 8xl09CFU/g)；或(d)以下述商品名銷售的商業(yè)上可得到的產(chǎn)品中的微生物混合物=BI-CHEM ABR-Hydrocarbon, BI-CHEM DC 1008CB 禾口 Manure Degrader0
14.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的微生物或兩種或多種微生物的混合物的用途。
全文摘要
披露了含木質(zhì)纖維素纖維的材料的處理方法。更具體地，所述處理可增加后續(xù)微生物或生物方法對于木質(zhì)纖維素纖維的利用能力。
文檔編號C12P5/02GK102439160SQ201080020414
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日
發(fā)明者A.P.簡森, D.萊因, S.波爾-古德 申請人:澤吉股份公司, 諾維信公司