專利名稱：檢測(cè)抗生素耐藥細(xì)菌的方法和試劑盒的制作方法
檢測(cè)抗生素耐藥細(xì)菌的方法和試劑盒本發(fā)明涉及引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥性(即碳青霉烯耐藥菌)的碳青霉烯酶基因的檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明還涉及可用于所述檢測(cè)的寡核苷酸引物。對(duì)β -內(nèi)酰胺抗生素、例如青霉素和頭孢菌素(kefalosporins)耐藥性的增加，提出了由革蘭氏陰性桿菌引起的感染的治療問題。因而，必須越來越經(jīng)常用廣譜抗生素替換 β-內(nèi)酰胺抗生素。碳青霉烯代表了治療難治性醫(yī)院感染的重要的廣譜抗生素類別。碳青霉烯通常對(duì)最需氧的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌以及對(duì)厭氧菌有效。經(jīng)常使用的碳青霉烯是亞胺培南、美羅培南和厄他培南。住院患者，特別是希臘、以色列、美國、土耳其和遠(yuǎn)東(中國)以及中美洲的住院患者，都出現(xiàn)了對(duì)這些藥物耐藥的菌株。對(duì)碳青霉烯敏感性降低的典型細(xì)菌是大腸桿菌(E. coli)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella sp.)及其他腸桿菌屬(Enterobacteriaceae sp.)。此外，銅綠假單胞菌和它在環(huán)境源中密切相關(guān)的菌種，以及患者中存在的危害免疫應(yīng)答的不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacterium sp.)，經(jīng)常對(duì)碳青霉烯的敏感性降低。對(duì)碳青霉烯抗生素的敏感性降低可以由上百個(gè)不同的β -內(nèi)酰胺抗生素耐藥性基因中的一個(gè)或多個(gè)與細(xì)胞壁滲透性改變(例如特定的孔蛋白改變)和/或與ampCii-內(nèi)酰胺酶的過量生產(chǎn)有關(guān)的主動(dòng)流出相結(jié)合而引起。這通常引起碳青霉烯敏感性降低，這種降低經(jīng)常是可逆的，當(dāng)抗生素治療結(jié)束時(shí)終止。對(duì)此的原因在于該機(jī)制的維持對(duì)細(xì)菌是耗能的，并對(duì)它的營養(yǎng)供應(yīng)不利。碳青霉烯耐藥性的另一種并且更重要的原因是降解碳青霉烯抗生素的酶，稱為碳青霉烯酶。與野生型細(xì)菌相比較，在碳青霉烯酶存在下，細(xì)菌不需要費(fèi)大力進(jìn)行競爭。因此， 碳青霉烯酶單獨(dú)就可以是顯著的碳青霉烯耐藥性的原因。這種機(jī)制可以與前面提到的機(jī)制組合出現(xiàn)，增加了敏感性降低和隨之而來的耐藥性。碳青霉烯酶基因可以存在于染色體中和質(zhì)粒中。特別是位于質(zhì)粒中的那些基因，容易轉(zhuǎn)移到其它菌種中，例如在廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)菌株中的那些基因。產(chǎn)生碳青霉烯酶的菌株往往也是ESBL-菌株。尤其是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)碳青霉烯酶(KPC)-和 Verona imipenemase (VIM)-基因家族對(duì)現(xiàn)行的抗生素治療是潛在的威脅。因?yàn)镵PC-生產(chǎn)菌可能難以基于常規(guī)的抗菌素敏感試驗(yàn)檢測(cè)到，所以它們可能在感染控制措施中造成問題。另一種常見的具有碳青霉烯酶性質(zhì)的β -內(nèi)酰胺酶家族是Guiana超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(GES)，它也特別難以基于常規(guī)抗菌素敏感試驗(yàn)來測(cè)到。碳青霉烯耐藥基因在環(huán)境物種中的大貯備結(jié)合碳青霉烯日益增加的應(yīng)用，激起了可能一直末被檢出的罕見或新的碳青霉烯酶基因出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，碳青霉烯耐藥性可以由如上所述的可逆的機(jī)制所引起。因此，需要有改進(jìn)的方法來檢測(cè)生物樣品中引起碳青霉烯耐藥菌的碳青霉烯酶基因。概要本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的至少一部分問題。具體而言，本發(fā)明的目的是提供查明生物樣品是否包含對(duì)碳青霉烯抗生素類型耐藥的細(xì)菌的方法。
更具體說，本發(fā)明的目的是提供引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥性、即引起對(duì)碳青霉烯類型抗生素耐藥性的碳青霉烯酶基因的篩查方法。
本發(fā)明是基于應(yīng)用分子生物學(xué)方法從生物樣品中篩查耐藥基因。具體而言，本發(fā)明是基于應(yīng)用專門設(shè)計(jì)的、能夠檢測(cè)引起碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶基因的引物。這些方法可用于代替生化方法或與其結(jié)合。
本發(fā)明提供存在于生物樣品的細(xì)菌(碳青霉烯耐藥菌)中引起碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶基因的檢測(cè)方法。
本發(fā)明還提供了鑒定碳青霉烯酶基因的試劑盒和引物。
此外，本發(fā)明提供鑒定碳青霉烯酶基因的裝置。本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)。它使得可以迅速鑒定威脅醫(yī)院保健和連續(xù)隨訪的菌株。而這通過使用生化方法只有部分可能。單獨(dú)或與生化方法結(jié)合應(yīng)用分子生物學(xué)方法顯著改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)。
在下文中，將借助于具體說明并參考一些工作實(shí)施例，更密切地查驗(yàn)本發(fā)明。


圖1顯示了四種不同碳青霉烯酶基因的基因擴(kuò)增曲線。
圖2顯示了解鏈曲線分析，不同的基因產(chǎn)物可以基于它們的不同解鏈溫度而分開。
發(fā)明的具體說明
本發(fā)明使得有可能篩查對(duì)碳青霉烯抗生素耐藥的基因。所述方法基于檢測(cè)引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶基因。更具體地說，所述篩查基于應(yīng)用擴(kuò)增方法，例如 LCR(連接酶鏈反應(yīng))或PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法。
優(yōu)選，擴(kuò)增反應(yīng)是PCR方法，具體是實(shí)時(shí)PCR。更有利的是，所述方法基于實(shí)時(shí)STOR Green檢測(cè)來應(yīng)用PCR并優(yōu)選產(chǎn)物的解鏈曲線分析。
SYBR Green在此是指核酸結(jié)合性熒光染料發(fā)光擴(kuò)增產(chǎn)物帶有與其結(jié)合的核酸結(jié)合性熒光染料，所述熒光染料以選定的光波長從其引發(fā)熒光，并監(jiān)測(cè)熒光發(fā)射，當(dāng)所述熒光發(fā)射達(dá)到平臺(tái)階段表明反應(yīng)完成時(shí)，確定周期。優(yōu)選，所述核酸結(jié)合性熒光染料是選自 SYBR. TM. GREEN I、溴化乙錠、pico green、EVA GREEN、吖啶橙、噻唑橙、Y0-PR0-1 和色霉素 A3的成員。
實(shí)時(shí)STOR Green檢測(cè)在此是指生物樣品中靶核酸序列的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法。所述方法包括通過聚合酶鏈反應(yīng)、優(yōu)選在STOR. TM. Green I存在下擴(kuò)增靶序列，所述聚合酶鏈反應(yīng)包括以下步驟向生物樣品添加針對(duì)靶核酸序列的熱穩(wěn)定的聚合酶和引物，在至少變性溫度和延伸溫度之間熱循環(huán)所述生物樣品；用被所述STOR. TM. Green I 吸收的波長的光激發(fā)所述生物樣品和檢測(cè)從所述生物樣品的發(fā)射光；以及監(jiān)測(cè)來自STOR. TM. Green I的溫度依賴性熒光。優(yōu)選，所述監(jiān)測(cè)步驟包括確定擴(kuò)增的靶序列的解鏈曲線圖。
“生物樣品”在此是指直接臨床樣品，例如體液諸如血液或尿、或喉拭子、鼻拭子、 皮膚拭子、痰、糞便或支氣管吸出物。生物樣品還可以是指來自各種環(huán)境的細(xì)菌的純培養(yǎng)物。細(xì)菌培養(yǎng)物典型可以通過鋪板和生長細(xì)菌從生物樣品制備。
擴(kuò)增反應(yīng)，典型是PCR反應(yīng)，可用于直接擴(kuò)增生物樣品中或細(xì)菌的純培養(yǎng)物中的核酸，生物樣品在此典型是臨床樣品，或者擴(kuò)增反應(yīng)，典型是PCR反應(yīng)可用于擴(kuò)增分離的核酸。
“引物”在此是指設(shè)計(jì)成特異性針對(duì)待檢測(cè)的多核苷酸的寡核苷酸。引物可以被設(shè)計(jì)成包含或具有與靶多核苷酸序列互補(bǔ)的序列?？梢栽O(shè)計(jì)能夠通過與靶多核苷酸堿基配對(duì)進(jìn)行雜交的正向和反向引物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，引物被設(shè)計(jì)成檢測(cè)預(yù)期引起碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述引物包含至少部分或者包含或具有選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 49的序列。
引物優(yōu)選長度為15至50個(gè)核苷酸，典型長度為20至40、或20至35個(gè)核苷酸。 可以在引物的任一端或兩端加上附加的核苷酸，例如1、2或3個(gè)核苷酸。或者，可以從引物的任一端或兩端缺失或取代1、2或3個(gè)核苷酸。在一些情況下，可以在中間、即引物的末端部分以外的部分中添加、缺失或取代1、2或3個(gè)核苷酸。
修飾(特別是遺傳修飾)引物的部分序列是可能的，只要所述引物與靶核酸序列具有足夠互補(bǔ)性、能夠與所述靶核酸序列雜交即可。修飾的引物或引物的部分序列，如果其仍然能夠檢測(cè)靶多核苷酸序列、即造成碳青霉烯耐藥性的基因碳青霉烯酶基因，則屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
雜交條件優(yōu)選是嚴(yán)緊條件，在此是指在58°C +/_7°C、優(yōu)選+/_3°C下雜交。試驗(yàn)可以使用含有對(duì)引物雜交(在PCR的情況下為退火)和延伸反應(yīng)最適宜的離子濃度、例如Mg2+、K+和NH4+的商業(yè)PCR主混合物來運(yùn)行。例如，MAXIMA SYBR qPCR主混合物為了 PCR效率高使用了低量的STOR Green0反應(yīng)中的組分是10微升qPCR主混合物、6. 8微升 oligomix 1、或 6. 4 微升 oligomix 2、和 1 微升 DNA 模板。
只使用生化方法不可能解決碳青霉烯耐藥性背后的遺傳機(jī)制，因?yàn)樗瞿退幮杂沙^110個(gè)基因所引起。對(duì)耐藥性機(jī)制的認(rèn)識(shí)極大改善了抗生素敏感性分析的判讀和用于治療患者的藥物選擇。例如，具有廣泛的底物譜的碳青霉烯酶，例如VIM，阻礙了任何β-內(nèi)酰胺抗生素的體內(nèi)應(yīng)用，而其它機(jī)制，例如ΙΜΙ，留下了一些可用的β -內(nèi)酰胺治療選擇。
本公開內(nèi)容提供了引物，其已被設(shè)計(jì)成檢測(cè)造成碳青霉烯耐藥性的基因(即碳青霉烯酶抗性的碳青霉烯酶基因)。所述引物已經(jīng)過試驗(yàn)檢驗(yàn)和優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在兩個(gè)分開的反應(yīng)中執(zhí)行鑒定反應(yīng)。在這些反應(yīng)中，擴(kuò)增條件通常是相容的。 這使得可以進(jìn)行HTP篩查(高通量篩查)。
因此，本方法使得測(cè)試成本有可能最小化。本方法也是簡單的和用戶友好的。此外，本方法適于日常的診斷應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本試驗(yàn)可以鑒定110個(gè)耐藥基因以及它們的亞變體。這優(yōu)選在基于實(shí)時(shí)STOR Green為基礎(chǔ)的鑒定和測(cè)定解離溫度的兩個(gè)(或更多，優(yōu)選兩個(gè))多重PCR反應(yīng)中進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，一個(gè)(或第一個(gè))多重反應(yīng)覆蓋腸細(xì)菌 (Enterobacteriaceae)內(nèi)99%以上的碳青霉烯酶。通過使用第一個(gè)多重反應(yīng)，有可能篩查屬于腸細(xì)菌的大腸桿菌。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案，另一個(gè)(第二個(gè))多重反應(yīng)的具體目的是篩查免疫受損患者的多重耐藥菌。這些典型是屬于假單胞細(xì)菌屬O^eudomonas sp.)和 Acinetobacterium sp.的細(xì)菌。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，一個(gè)(或第一個(gè))多重反應(yīng)典型檢測(cè)B群金屬-β-內(nèi)酰胺酶基因、大多數(shù)A群碳青霉烯酶基因(青霉素酶基因)和屬于D群(苯唑西林酶)的0ΧΑ-48基因。另一個(gè)(或第二個(gè))多重反應(yīng)典型檢測(cè)D群碳青霉烯酶基因(苯唑西林酶基因)、C 群碳青霉烯酶基因(頭孢菌素酶基因)以及屬于A群(青霉素酶)的SFC基因和NMD-I。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法包括以下步驟
1和2.制備生物樣品。
這可以包括分離核酸。其典型通過煮沸或由提取機(jī)器人半自動(dòng)執(zhí)行。樣品也可以直接使用或可以使用從樣品制備的細(xì)菌純培養(yǎng)物。
3.基因擴(kuò)增
a)包含聚合酶和PCR緩沖液的主混合物；
b)核苷三磷酸單體；
c)反應(yīng)的寡核苷酸引物；
d)來自樣品的核酸模板；
e)擴(kuò)增和分析產(chǎn)物的解離曲線。這優(yōu)選通過實(shí)時(shí)PCR設(shè)備執(zhí)行。
4.結(jié)果分析
a)介紹陽性和陰性對(duì)照；
b)解離溫度往往表明機(jī)制；如果需要，結(jié)果可以通過在另外的反應(yīng)中對(duì)產(chǎn)物測(cè)序來驗(yàn)證；
c)陰性結(jié)果排除了具有高概率的碳青霉烯酶，因?yàn)樗鲈囼?yàn)基本包括臨床菌種中公開的所有碳青霉烯酶基因。
從樣品和核酸模板分離的核酸優(yōu)選是DNA。
因?yàn)榇蠖鄶?shù)樣品是陰性的，所以所述篩查方法在非常有效并且性質(zhì)上是高通量的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)選自下列的基因或基因家族或基因亞變體
VIM 1-22、MP 1-24、OXA-48、KPC 1-7,GES 1-10、SPM、NMC-A、IMI 1-3,SME 1-3、 GIM-I、和 SM-I。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)各基因或基因家族中的至少一個(gè)。在更加的優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)以上基因或基因家族或者一個(gè)以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
0XA-24、-25、26、-40、-72、0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-66、68-71、75-78、83、 84、86-89、-92、-94、-95、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、SFC-1、和 CMY-1、-10。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)各基因或基因家族中的至少一個(gè)。在更加的優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)以上基因或基因家族或者一個(gè)以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)各OXA基因或基因家族中的至少一個(gè)，更優(yōu)選在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)以上基因或基因家族或者一個(gè)以上基因亞變體或者所有 OXA基因或基因家族或基因亞變體。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
OXA-48、SME、GIM-U VIM 1-22、SPM、GES 1-10, KPC 1-7、IMI 1-3/NMC-A、IMP 1-24。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)各基因或基因家族中的至少一個(gè)。在更加的優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)以上基因或基因家族或者一個(gè)以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
0XA-23 群、0ΧΑ-Μ 群、具有 ISabal 啟動(dòng)子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、 0XA-62、CMY 1、-10、-11、SFC-I、NDM-I 和 SIM-I0
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)各基因或基因家族中的至少一個(gè)。在更加的優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)以上基因或基因家族或者一個(gè)以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
NDM-I是來自印度和巴基斯坦的新的金屬-β -內(nèi)酰胺酶(MBL)，其與其它MBL的同一性非常少，最類似的MBL是VIM-1/VIM-2，與它只有32. 4%同一性。NDM-I可以水解除了氨曲南以外的所有-β -內(nèi)酰胺。與VIM-2相比，NDM-I表現(xiàn)出與大多數(shù)頭孢菌素特別是頭孢呋肟、頭孢噻肟、頭孢金素(頭孢噻吩)以及與青霉素的結(jié)合更緊密。NDM-I可以通過轉(zhuǎn)接合質(zhì)粒介導(dǎo)，與其它細(xì)菌菌種在體內(nèi)接合。
盡管通過研究許多碳青霉烯酶基因的存在，可以獲得生物樣品中碳青霉烯酶抗性的大多數(shù)可靠結(jié)果，但要檢測(cè)的最重要的基因(或基因家族或基因亞變體)選自KPC 1-7、 OXA-48, VIM 1-22, GES 1-10、和/或IMPlH要檢測(cè)的最重要的是KPC 1-7，第二重要的是0XA-48和/或VIM 1-22，第三重要的是GES 1_10，第四重要的是IMP 1_24。
此外，要檢測(cè)的重要的還有以下基因(或基因家族或基因亞變體)SME 1-3、 GIM-I、SPM 和 / 或 IMI1-3/NMC-A。
要檢測(cè)的重要的還有以下基因(或基因家族或基因亞變體):0XA-23群、0XA-24 群、具有ISabal啟動(dòng)子的0XA-51群、0XA-58和/或NDM-I。此外，要檢測(cè)的重要的還有 CMY-1、-10、-11、SFC-1和/或SIM-I基因(或基因家族或基因亞變體)。還可以檢測(cè)0XA-55、 0XA-60和/或0XA-62基因(或基因家族或基因亞變體)。
但是，哪種基因是檢測(cè)最重要的還取決于地理區(qū)域，即某些耐藥基因和/或細(xì)菌在那個(gè)地理區(qū)域的發(fā)生率。
所有上述基因已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。除了陽性對(duì)照菌株之外，試驗(yàn)還驗(yàn)證了 250種以上臨床ESBL菌株，其中50種以上多重耐藥不動(dòng)桿菌-和假單孢菌菌株與大約60種其它陰性對(duì)照菌株(特異性)涵蓋了最重要的臨床需氧桿菌。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，寡核苷酸優(yōu)選具有或包含以下序列
權(quán)利要求
1.檢測(cè)生物樣品中碳青霉烯酶基因的方法，其包括以下步驟-在來自生物樣品的核酸模板和引物的存在下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS 15和16、和/或1或49和2、和/或9和 10、和/或13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列；-分析產(chǎn)物的解離曲線，和-確定KPC、OXA-48、VIM、GES和/或IMP基因的一個(gè)或多個(gè)或它們?cè)斐商记嗝瓜┠退幮缘膩喿凅w的存在，表明所述生物樣品包含引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥的碳青霉烯酶基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、7、8、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定SME、GIM-I、SIM-I、SPM和/或IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定SME、GIM-I、SPM和/或IMI/NMC-A的一種或多種的存在。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至 50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS :23、24、25、26、27、28、四、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41和42的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定0XA-24、 25、26、-40、-72、0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-71、75-78、83、84、86_89、-92、-94、-95、 0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、SFC-1、和 / 或 CMY-1_10、-11 基因中的一種或多種或它們的亞變體的存在。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至 50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS :25、26、43、44、45、46、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、47和48的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定0XA-23 群、0XA-24 群、具有 ISabaI 啟動(dòng)子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、 CMY-U-10,-IU SFC-I、NDM-I和/或SIM-I基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)在具有共同相容的擴(kuò)增條件的兩個(gè)或更多個(gè)分開的多重反應(yīng)上進(jìn)行。
7.試劑盒，其包含用于鑒定引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶基因的一組引物對(duì)，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS 15和16、1或49 和2、9和10、13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定KPC、 OXA-48、VIM、GES和/或IMP基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、7、8、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定SME、GIM-I、SIM-I、SPM、IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
9.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或包含選自3、4、5、6、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定SME、GIM-1、SPM、和/或IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選23、24、25、26、27、28、四、30、31、32、33和；34、35、 36、37、38、39、40、41和42的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定0XA_24、25、26、-40、-72、 0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-71、75-78、83、84、86-89、-92、-94、-95、0XA-55、0XA-58、 0XA-60、0XA-62、SFC-1、和/或CMY-1-10、-11基因中的一種或多種或它們的亞變體的存在。
11.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至 50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自25、26、43、44、45、46、31、32、33、34、；35、36、37、 38、39、40、41、42、47和48的核苷酸序列或其修飾序列，用于確定0XA-23群、0XA-24群、具有 ISabaI 啟動(dòng)子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、CMY-U -10、-11、SFC-U NDM-I和/或SIM-I基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
12.用于鑒定碳青霉烯耐藥基因的寡核苷酸引物對(duì)，其中所述寡核苷酸長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID N0S: 15和16、和/或1或49和2、和/或9和 10、和/或13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列。
13.用于鑒定引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥的碳青霉烯酶基因的裝置，其包含第一和第二個(gè)多重反應(yīng)，其中在第一個(gè)多重反應(yīng)中在單個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)選自KPC、OXA-48、VIM、GES和/或 IMP的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個(gè)或多個(gè)或全部；所述檢測(cè)通過使用引物進(jìn)行，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID N0S:15和16、和/ 或1或49和2、和/或9和10、和/或13和14、和/或19、20、21和22或其修飾序列的引物對(duì)。
14.權(quán)利要求13的裝置，其中在所述多重反應(yīng)中在單個(gè)反應(yīng)內(nèi)進(jìn)一步檢測(cè)選自SME、 GIM-USPM和/或IMI/NMC-A的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個(gè)或多個(gè)或全部， 所述檢測(cè)通過使用引物進(jìn)行，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自 SEQ ID NOS 3和4、和/或5禾口 6、和/或11禾口 12、和/或17禾口 18的引物對(duì)。
15.權(quán)利要求13或14的裝置，其中在第二個(gè)多重反應(yīng)中在單個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)選自 0XA-23 群、0XA-24 群、具有 ISabaI 啟動(dòng)子的 0XA-51 群、NDM-1、0XA-58、CMY、SFC-1 和 / 或 SIM-I的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個(gè)或多個(gè)或全部，所述檢測(cè)通過使用引物進(jìn)行，所述引物長15至50個(gè)核苷酸并至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS : 和25、 和/或43和44、和/或45和46禾口 /或47和48、和/或33禾口 34、和/或39禾口 40、和/或 41和42和/或7和8、或其修飾序列的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及引起細(xì)菌碳青霉烯耐藥性的碳青霉烯酶抗性基因的檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明提供可用于所述檢測(cè)的寡核苷酸引物。所述方法可用于在單個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)OXA-48、SME、GIM-1、VIM 1-22、SPM、GES 1-10、KPC 1-7、IMI 1-3/NMC-A、IMP 1-24，和在另一個(gè)單個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)OXA-23群、_OXA-24群、具有ISabaI啟動(dòng)子的OXA-51群、OXA-55、OXA-58、OXA-60、OXA-62、CMY 1、-10、-11、SFC-1、NDM-1、和SIM-1。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102482712SQ201080021305
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者尤哈·科夫斯卡里, 蘇維·克斯克拉 申請(qǐng)人:尤哈·科夫斯卡里, 托馬斯·特坎恩