專利名稱：一種通過(guò)微小rna表達(dá)水平評(píng)估人同種異體移植物狀況的方法
一種通過(guò)微小RNA表達(dá)水平評(píng)估人同種異體移植物狀況的方法
本申請(qǐng)要求一項(xiàng)申請(qǐng)?zhí)枮?1/160，188，申請(qǐng)日為2009年3月13日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)益，此臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容在此全文參考并入。
本申請(qǐng)所述的發(fā)明在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的資助下完成，基金號(hào)為AI51652和 Al72790。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)益。
發(fā)明背景
在過(guò)去短短的五十年中，器官移植已經(jīng)由一項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)較高的實(shí)驗(yàn)性治療發(fā)展成為一種安余的和能夠挽救生命的治療方法。然而，移植接受者需要使用非特異性的、有毒性的多種免疫抑制藥物進(jìn)行長(zhǎng)期治療，而且會(huì)因?yàn)橐浦财鞴俅嬖诿庖邤偝夥磻?yīng)而一直生活在可能失去其網(wǎng)種異體移植物的陰影之下。
在人體問(wèn)進(jìn)行器官移植時(shí)產(chǎn)生的急性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致同種異體移植失敗的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。但是急性排斥反應(yīng)的結(jié)果卻很難預(yù)測(cè)。
目前，預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)能否對(duì)抗排斥治療產(chǎn)生應(yīng)答的最佳方法是通過(guò)芯針進(jìn)行組織活檢，取得同種異體移植物的組織，以觀察其組織學(xué)特點(diǎn)。但是，進(jìn)行組織活檢的侵入性搡作會(huì)導(dǎo)致諸如出血、動(dòng)靜脈瘺、甚至移植物損失等并發(fā)癥。因此，需要一種非侵入性測(cè)定方法，以確定移植器官出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的患者是否存在喪失移植器官的風(fēng)險(xiǎn)。
發(fā)明概述
本發(fā)明滿足了上述需求，在一個(gè)方面，其提供了一種對(duì)帶有移植器官的患者進(jìn)行器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法。本方法包括測(cè)定患者生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量。本方法進(jìn)一步包括比較患者非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量。
在一實(shí)施方式中，非編碼標(biāo)記小RNA選自SEQ ID NOs : 1_9，或其變體，其中與所述非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量相比，所述非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量升高至少I倍時(shí)，即提示移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，非編碼標(biāo)記小RNA選自SEQ ID NOs : 10_49，或其變體，其中與所述非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量相比，所述非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量升高小于I倍時(shí)，即提示所述移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，這種方法進(jìn)一步包括(C)測(cè)定生物樣本中非編碼標(biāo)記小 RNA的表達(dá)量與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量之間的差異；(d)測(cè)定患者的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量；(e)測(cè)定患者的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量與內(nèi)源性非編碼參比小RNA的參考表達(dá)量之間的差異；(f)比較步驟 (c)中的差異與步驟(e)中的差異；其中步驟(c)中的差異大于步驟(d)中的差異時(shí)，進(jìn)一步提示所述移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)帶有移植器官的患者進(jìn)行器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法包括(a)測(cè)定患者生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量,所述非編碼標(biāo)記小RNA選自 SEQ ID NOs :1-9或其組合；(b)測(cè)定患者生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的菲編碼參比小RNA的表達(dá)量；(C)比較步驟(a)的測(cè)定結(jié)果與步驟(b)的測(cè)定結(jié)果，以確定第一個(gè)比率；(d)測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中所述非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量，所述非編碼標(biāo)記小 RNA選自SEQ ID NOs :1_9或其組合；(e)測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量，且比較步驟(d)的測(cè)定結(jié)果與步驟(e)的測(cè)定結(jié)果，以確定第二個(gè)比率；其中計(jì)算得到第一個(gè)比率比第二個(gè)比率至少高I倍時(shí)，即提示所述移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)帶有移植器官的患者進(jìn)行器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法包括(a)測(cè)定患者生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量,所述非編碼標(biāo)記小RNA選自 SEQ ID NOs 10-49或其組合；(b)測(cè)定患者生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量；(c)比較步驟(a)的測(cè)定結(jié)果與步驟(b)的測(cè)定結(jié)果，以確定第一個(gè)比率；(d)測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中所述非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量，所述非編碼標(biāo)記小RNA選自SEQ ID NOs : 10-49或其組合；(e)測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參考小RNA的表達(dá)量，且比較步驟(d)的測(cè)定結(jié)果與步驟(e)的測(cè)定結(jié)果，以確定第二個(gè)比率；其中計(jì)算得到第一個(gè)比率比第二個(gè)比率高至少小于I倍時(shí)，即提示所述移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于對(duì)帶有移植器官的患者進(jìn)行器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的試劑盒。這種試劑盒包括至少一種與選自SEQ ID NO :l-49s或其變體的非編碼標(biāo)記小RNA互補(bǔ)的核酸分子，以及一種用于測(cè)定生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量的方式。



圖1.對(duì)miRNA表達(dá)譜差異進(jìn)行的無(wú)監(jiān)督聚類分析和主成分分析能夠區(qū)分人腎臟同種異體移植物的急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本與正常同種異體移植物組織活檢樣本。(A) 采用含有365個(gè)人成熟miRNA的引物對(duì)和TaqMan探針的微流控芯片，測(cè)定7份人腎臟同種異體移植物組織活檢樣本[3份樣本顯示出急性排斥反應(yīng)(AR)的組織學(xué)特征，4份樣本顯示出正常同種異體移植物的組織活檢結(jié)果(N)]中微小RNA(miRNA)的表達(dá)類型。在所有樣品中，共有174±7個(gè)miRNA的表達(dá)水平具有顯著性(即，Ct < 35)。性別、年齡、種族、移植類型以及從移植到組織活檢的時(shí)間如下AR1 (男性，黑人，52歲，活體捐贈(zèng)，161天)，AR2(男性，白人，32歲，活體捐贈(zèng)，119天)，AR3 (女性，白人，48歲，尸體捐贈(zèng)，31天)，NI (女性，黑人，40歲，活體捐贈(zèng)，203天)，N2(男性，印第安人，50歲，活體捐贈(zèng)，191天)，N3(男性，黑人，31歲，活體捐贈(zèng)，196天)和N4 (男性，亞裔，51歲，尸體捐贈(zèng)，88天)。根據(jù)表達(dá)類型的相似性，用無(wú)監(jiān)督聚類分析對(duì)組織活檢樣本進(jìn)行分組。組織活檢樣本表達(dá)類型的相關(guān)程度以圖片頂部的樹(shù)狀圖表示。分枝長(zhǎng)度表示各樣品(上部)或miRNA(左側(cè))之間的相似程度。兩個(gè)主要的簇(上部)將AR組織活檢樣本與正常同種異體移植物組織活檢樣本精確分離。各列代表腎臟同種異體移植物組織活檢樣本的表達(dá)譜，各行代表miRNA。各格的顏色反映了與在組織活檢樣本的整體集合中相應(yīng)miRNA的平均表達(dá)水平相比，相應(yīng)樣品中相應(yīng) miRNA的表達(dá)水平。紅色強(qiáng)度增加表示給定樣品中特定miRNA的表達(dá)量較高，綠色強(qiáng)度增加表示該miRNA的表達(dá)量較低。標(biāo)尺(右下角)表示，給定樣品中miRNA的豐度與所有樣品中的平均水平之比。(B)根據(jù)在所有樣本中具有顯著性表達(dá)的174個(gè)小RNA( BP, Ct < 35)，對(duì)7個(gè)腎臟同種異體移植物組織活檢樣本進(jìn)行主成分分析。PCA是一種用于減少多變量系統(tǒng)維度的雙線性分解方法，其用于概述多變量數(shù)據(jù)中的簇。其將若干相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為被稱為主成分(PC)的少數(shù)非相關(guān)變量。第一個(gè)PC用于解釋數(shù)據(jù)中盡可能多的變異性，各后續(xù)成分用于解釋盡可能多的剩余變異性。PCA顯示了明顯的聚類性，并且證實(shí)可以將AR樣本從正常同種異體移植物組織活檢樣本中分離。通過(guò)PCl將樣本精確分組，其解釋了 miRNA 表達(dá)總體變異性的45. 91%，而PC2解釋了變異性的21. 48%，且不能根據(jù)其診斷將樣本分類。
圖2. miRNA在急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本與正常同種異體移植物組織活檢樣本中的差異性表達(dá)，P值< O. 05。采用含有365個(gè)人成熟miRNA的引物對(duì)和TaqMan探針的徽流控芯片，測(cè)定7份人腎臟同種異體移植物組織活檢樣本[3份樣本顯示出急性排斥反應(yīng)(AR)的組織學(xué)特征，4份樣本顯示出正常同種異體移植物組織活檢的結(jié)果(N)]中微小 RNA(miRNA)的表達(dá)類型。各列代表腎臟同種異體移植物組織活檢樣本的表達(dá)譜，各行代表 miRNA。利用ABqPCR軟件，鑒別在AR組織活檢樣本和正常同種異體移植物組織活檢樣本中差異性表達(dá)的miRNA。首先執(zhí)行Ct過(guò)濾程序。當(dāng)各組中50%以上樣品的Ct值> 35時(shí)，則認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)為未檢出。兩組均為未檢出的實(shí)驗(yàn)不包括在分析中。對(duì)于其余各實(shí)驗(yàn)，通過(guò)t 檢驗(yàn)確定差異表達(dá)的miRNA。miRNA聚類樹(shù)位于圖的左側(cè)。分枝長(zhǎng)度表示各miRNA之間的相似程度。紅色強(qiáng)度較高則表示表達(dá)水平較高。
圖3.在人腎臟同種異體移植物的AR組織活檢樣本和正常同種異體移植物組織活檢樣本中驗(yàn)證微小RNA的表達(dá)差異。用含有9個(gè)急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本和17個(gè)正常腎同種異體移植物組織活檢樣本的獨(dú)立驗(yàn)證集，測(cè)定了移植物內(nèi)miR-142-5p、-155、-223、_ 10b、-30a_3p和let_7c的表達(dá)水平。表達(dá)水平的定量采用經(jīng)改良的TaqMan miRNA實(shí)驗(yàn)，該方法可以絕對(duì)定量miRNA。使用穩(wěn)定表達(dá)的RNU44小核仁RNA對(duì)miRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理，并以miRNA的拷貝數(shù)對(duì)RNU44拷貝數(shù)的平均比率(土SE)表示。RNU44的拷貝數(shù)在 9個(gè)急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本(8. 87X 106±1. 48X IO6個(gè)拷貝/ μ g RNA)和17個(gè)正常同種異體移植物組織活檢樣本(8. 72X IO6±8. 42X IO5個(gè)拷貝/ μ g RNA,P = O. 92)之間不存在差異。采用t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖4.人同種異體移植物組織活檢樣本中的miRNA與mRNA呈正相關(guān)。采用TaqMan miRNA實(shí)驗(yàn)來(lái)定量miRNA在移植物內(nèi)的水平，采用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)定量mRNA在移植物內(nèi)的水平，顯示了 miRNA和mRNA在移植物內(nèi)的水平之間的關(guān)系，還顯示了皮爾森相關(guān)性系數(shù)(R2)和P值。⑶3mRNA的水平與在急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本中過(guò)表達(dá)的miRNA的水平被發(fā)現(xiàn)有明顯的正相關(guān)(A)miR-142-5p(R2 = O. 72,P < O. 0001) ； (B)miR-155 (R2 = O. 69， P < O. 0001);或(C)miR-223(R2 = O. 66，P < O. 0001)。還觀察到腎小管特異性 NKCC_2mRNA 與在急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本中低表達(dá)的miRNA呈現(xiàn)出相關(guān)性(E)miR-30a-3p (R2 = O. 53, P < O. 0001) ； (F)mif-1Ob (R2 = O. 36, P < O. 0001);或(G)let_7c(R2 = O. 13，P = O. 04)。顯示了所有33個(gè)腎同種異體移植物組織活檢樣本的測(cè)定結(jié)果(紅色，12個(gè)急性排斥反應(yīng)組織的活檢樣本；綠色，21個(gè)正常同種異體移植物組織活檢樣本)。閾值循環(huán)(Ct)是指在miRNA/mRNA測(cè)定中突光信號(hào)越過(guò)固定閾值時(shí)的循環(huán)分?jǐn)?shù)。
(D)mRNA(18S rRNA，24. 8±1. 3vs. 24. 7±1.1，P = O. 86，t 檢驗(yàn))和(H) miRNA (RNU44 小核仁 RNA，27. 1±0. 7vs. 27.1 ±O. 5，P = O. 97，t 檢驗(yàn))的內(nèi)源性對(duì)照的平均(土SD)CT值在急性排斥反應(yīng)樣本中與在正常腎同種異體移植物樣本中相似。
圖5.靜息或活化的正常人外周血單核細(xì)胞中miRNA的水平。外周血單核細(xì)胞 (PBMC)取自健康人，將其在不含(空心柱)或含有(實(shí)心柱)2 μ g/mL PHA的條件下培養(yǎng) 2處(六，卩和6) (η = 7名受試者)、48h(D) (η = 4名受試者)，或24、48和72小時(shí)(B，C，E，H 和I) (η = 2名受試者)，分離RNA進(jìn)行miRNA定量(A-E)或mRNA定量(F-1)。采用RNU44 小核仁RNA的拷貝數(shù)對(duì)miRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理，采用18S rRNA的拷貝數(shù)對(duì)mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果顯示為miRNA拷貝數(shù)對(duì)RNU44拷貝數(shù)的比值的平均值(土SE) 或mRNA拷貝數(shù)對(duì)18S rRNA拷貝數(shù)的比值的平均值(土SE)。采用配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖6.靜息或活化的正常人腎上皮細(xì)胞中miRNA的水平。將原代正常人腎上皮細(xì)胞(HREC)與靜息PBMC的無(wú)細(xì)胞上清液(空心柱)或加入2 μ g/mL PHA的活化PBMC的無(wú)細(xì)胞上清液(實(shí)心柱)共同培養(yǎng)24h(A，B)或24和48h(C)。從HREC中分離總RNA，采用改良的TaqMan miRNA實(shí)驗(yàn)對(duì)急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本中過(guò)表達(dá)(A)或低表達(dá)(B或C)的 miRNA亞群進(jìn)行定量。采用RNU44小核仁RNA的拷貝數(shù)對(duì)miRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理， 結(jié)果顯示為miRNA拷貝數(shù)對(duì)RNU44拷貝數(shù)比值的平均值(土SE)。結(jié)果來(lái)自兩次連續(xù)實(shí)驗(yàn)， 采用來(lái)自兩個(gè)人腎臟的兩份獨(dú)立的HREC原代培養(yǎng)物。采用配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖7.靜息或活化的正常人腎上皮細(xì)胞中趨化因子mRNA的水平。將原代正常人腎上皮細(xì)胞(HREC)與靜息PBMC的無(wú)細(xì)胞上清液(空心柱)或加入2 μ g/mLPHA的活化PBMC 的無(wú)細(xì)胞上清液(實(shí)心柱)共同培養(yǎng)24h。從HREC中分離總RNA，采用實(shí)時(shí)PCR定量趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCPl)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)和平擾素誘導(dǎo)蛋白IO(IP-1O)的mRNA絕對(duì)水平。采用18S rRNA的拷貝數(shù)對(duì)mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果顯示為mRNA拷貝數(shù)對(duì)18S rRNA拷貝數(shù)比值的平均值(土SE)表示。結(jié)果來(lái)自兩次連續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用來(lái)自兩個(gè)人腎臟的兩份獨(dú)立的HREC原代培養(yǎng)物。采用配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖8.人腎臟同種異體移植物組織活檢樣本中移植物內(nèi)的mRNA的水平。箱線圖顯示，在人腎臟同種異體移植物的12個(gè)急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本和21個(gè)正常同種異體移植物樣本中，IFN-Y (A)和白介素_4⑶的mRNA拷貝數(shù)與18S rRNA拷貝數(shù)比值 的第10、第 25、第50 (中位數(shù))、第75和第90百分位數(shù)值。與正常同種異體移植物組織活檢樣本相比， 急性排斥反應(yīng)組織活檢樣本中IFN-Y的水平升高，但白介素_4的水平未升高。采用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)定量mRNA的絕對(duì)水平。采用t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖9.尿細(xì)胞中miRNA 155的水平用于診斷急性排斥反應(yīng)。從腎同種異體移植接受者的尿細(xì)胞中分離包含miRNA的總RNA，采用定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定RNU44(管家基因) 和miRNA 155的水平。與來(lái)自移植物功能穩(wěn)定和組織活檢結(jié)果正常患者的尿液相比(η = 13個(gè)樣本)，在組織活檢樣本分類為急性排斥反應(yīng)患者的尿液中(η = 3個(gè)樣本)，尿細(xì)胞中 miRNA 155的水平顯著升高，而RNU 44未出現(xiàn)升高。
對(duì)發(fā)明內(nèi)容的詳細(xì)說(shuō)明
本發(fā)明涉及采用微小RNA對(duì)器官排斥反應(yīng)進(jìn)行非侵入性測(cè)定的方法和組合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，器官衰竭(例如，急性排斥反應(yīng))會(huì)引起某些標(biāo)記微小RNA(miRNA)過(guò)表達(dá)或低表達(dá)，等等。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種對(duì)帶有移植器官的患者進(jìn)行器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法。
帶有移植器官的患者指帶有移植的器官并且該器官的排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)將要被評(píng)估的任何人。
如本申請(qǐng)所述，移植器官指任何器官。示例性的器官包括腎臟、心臟、肝臟、肺、腸、 胰腺、胰島等。
器官排斥反應(yīng)指因反向免疫應(yīng)答導(dǎo)致的移植器官的任何衰竭。例如，器官排斥反應(yīng)包括急性和/或慢性排斥。器官的急性排斥反應(yīng)事件可能由抗體介導(dǎo)或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答引起。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中涉及的細(xì)胞包括，例如，活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。如果患者未使用免疫抑制劑，則急性排斥反應(yīng)事件通常發(fā)生在器官移植后的14天以內(nèi)，更通常的發(fā)生在10天以內(nèi)，特別通常的發(fā)生在5天以內(nèi)。
但是，大部分，如果不是全部，接受移植的患者均使用了免疫抑制劑。這樣，急性排斥反應(yīng)事件通常發(fā)生在器官移植后約I年以內(nèi)，更特別是發(fā)生在器官移植后約9個(gè)月以內(nèi)， 尤其特別是發(fā)生在約6個(gè)月以內(nèi)，以及最特別是發(fā)生在約3個(gè)月以內(nèi)。然而，急性排斥反應(yīng)可以發(fā)生在移植器官的生存期的任何時(shí)間。而且，一名患者的移植器官可能會(huì)發(fā)生不止一次的急性排斥反應(yīng)事件。
非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量的測(cè)定
這種方法包括測(cè)定患者的生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量。
如本發(fā)明所述，非編碼小RNA指不編碼蛋白質(zhì)的核糖核酸序列。例如，非編碼小 RNA可能在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，利用與互補(bǔ)mRNA序列的序列特異性堿基配對(duì)從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
非編碼小RNA的長(zhǎng)度小于約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選地小于約30個(gè)核苷酸，例如，長(zhǎng)度約為29、28、27、26、25、24、23、22、21或20個(gè)核苷酸。非編碼小RNA的長(zhǎng)度大于約10個(gè)核苷酸，例如，長(zhǎng)度為11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。任意最大值均能與任意最小值進(jìn)行組合，以定義一個(gè)范圍。
非編碼小RNA的例子包括，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、 小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)和/或信號(hào)識(shí)別顆粒RNA復(fù)合物(SRP)。優(yōu)選地，非編碼小RNA為miRNA。
本發(fā)明所述的非編碼標(biāo)記小RNA是指用于評(píng)估器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的非編碼小 RNA0非編碼標(biāo)記小RNA的具體例子包括下述核酸分子和/或與下文所列舉的序列至少約有 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一'I"生的核酸分子
miR-142-5p CAUAAAGUAGAAAGCACUAC(SEQ ID NO 1)
miR-142-3p UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO 2)
miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG(SEQ ID NO :3)
miR-146a UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO :4)
miR-146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO :5)
miR-342 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC(SEQ ID NO :6)
miR-650 AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC(SEQ ID NO :7)
miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO :8)
miR-425-5p AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA(SEQ ID NO :9)
miR-30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC(SEQ ID NO :10)
miR-30a-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC(SEQ ID NO :11)
miR-lOa UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG(SEQ ID NO :12)
miR-30e-3p CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC (SEQ ID NO :13)
miR-30b UGUAAACAUCCUACACUCAGCU(SEQ ID NO :14)
miR-lOb UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU(SEQ ID NO :15)
miR-32 UAUUGCACAUUACUAAGUUGC(SEQ ID NO :16)
miR-9 UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(SEQ ID NO :17)·
miR-193b AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCUUU(SEQ ID NO :18)
miR-143 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA(SEQ ID NO :19)
miR-489 AGUGACAUCACAUAUACGGCAGC(SEQ ID NO :20)
miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC(SEQ ID NO :21)
miR-126 CAUUAUUACUUUUGGUACGCG(SEQ ID NO :22)
miR-193a AACUGGCCUACAAAGUCCCAG(SEQ ID NO :23)
miR-378 CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU (SEQ ID NO :24)
miR-429 UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU(SEQ ID NO :25)
miR-181c AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO :26)
miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGG(SEQ ID NO :27)
miR-199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC(SEQ ID NO :28)
miR-660 UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG(SEQ ID NO :29)
miR-203 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG(SEQ ID NO :30)
miR-204 UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(SEQ ID NO :31)
miR-30e-5p UGUAAACAUCCUUGACUGGA(SEQ ID NO :32)
miR-30a-5p UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG(SEQ ID NO :33)
miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG(SEQ ID NO :34)
miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA(SEQ ID NO :35)
miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU(SEQ ID NO :36)
miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGC(SEQ ID NO :37)
miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(SEQ ID NO :38)
miR-26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGC(SEQ ID NO :39)
miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU(SEQ ID NO :40)
miR-497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU(SEQ ID NO :41)
miR-152 UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG(SEQ ID NO :42)
miR-141 UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID NO :43)
miR-296 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(SEQ ID NO :44)
miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU(SEQ ID NO :45)
miR-99a AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO :46)
miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG(SEQ ID NO :47)
miR-186 CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCUU(SEQ ID NO :48)
let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO :49)
miR-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCC(SEQ ID NO :50)
let-7e UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO :51)
miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG(SEQ ID NO :52)
miR-200a UAACACUGUCUGGUAACGAUGU(SEQ ID NO :53)
確定序列同一性的方法為本領(lǐng)域的公知常識(shí)。與本申請(qǐng)所列的非編碼小RNA的核酸序列具有的核苷酸序列同一性百分比定義為，將候選序列與特定非編碼小RNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，必要時(shí)引入空缺，以達(dá)到最大的序列同一性，此時(shí)候選序列中與特定非編碼小 RNA序列中相同的核酸所占的百分比，任何保守性取代都不計(jì)入序列同一性。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種途徑進(jìn)行序列比對(duì)，以確定核酸序列同一性的百分比，例如，采用公眾能夠獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定比對(duì)時(shí)采用的適宜參數(shù)，包括在被比對(duì)序列全長(zhǎng)范圍內(nèi)為實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。
然而，在本申請(qǐng)中，采用序列比較計(jì)算機(jī)程序NCB1-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997))確定核酸序列同一性百分比(％ )?？梢詮拿绹?guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站上下載NCB1-BLAST2序列比較程序，另外還可以從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(Bethesda，Md)獲得此程序。NCB1-BLAST2中采用了多個(gè)檢索參數(shù)，所有這些檢索參數(shù)均設(shè)定為默認(rèn)值，包括，例如，暴露=是，鏈=全部，預(yù)期事件=10，最低復(fù)雜性長(zhǎng)度=15/5，多途徑e值=O. 01，多途徑常數(shù)=25，最終有間隔的序列比對(duì)減少=25。
本發(fā)明所述的方法可以包括測(cè)定一種非編碼小RNA的表達(dá)量，或者上述非編碼小 RNA的某一組合的表達(dá)量。
非編碼小RNA通常來(lái)自于患者的生物樣本。如本發(fā)明所述，生物樣本指取自患者的任何樣本。生物樣本的例子包括血液、尿液、各器官的組織樣本和/或移植器官的組織樣本。優(yōu)選尿液樣本。
非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量
本方法進(jìn)一步包括將患者生物樣本中測(cè)得的非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量進(jìn)行比較。
在一個(gè)實(shí)施方式中，非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量可以通過(guò)測(cè)定在帶有非排斥器官的人體中該非編碼小RNA的表達(dá)量來(lái)獲得。例如，帶有非排斥器官的人體包括健康人。 優(yōu)選地，健康人是指，與帶有移植器官并且該器官的衰竭風(fēng)險(xiǎn)將要被評(píng)估的患者具有相似年齡、性別、種族、移植器官供體來(lái)源、Banff組織學(xué)分級(jí)接近和/或接受相同的初始抗排斥反應(yīng)治療的人。
帶有非排斥器官的人體的另外一個(gè)例子是，帶有功能良好(例如，穩(wěn)定)的移植器官的人。功能良好(例如，穩(wěn)定)的移植器官可以被定義為未出現(xiàn)器官衰竭(例如，排斥反應(yīng))的移植器官。優(yōu)選地，功能良好的移植器官是指，未出現(xiàn)移植體機(jī)能異?；驘o(wú)形態(tài)學(xué)證據(jù)表明在移植體區(qū)域出現(xiàn)移植體損傷的移植器官。例如，功能穩(wěn)定的腎臟移植體可以被定義為，在收集用于測(cè)定非編碼小RNA的生物樣本前7天和后7天這期間，其血清肌酸酐濃度的變化量不超過(guò)約O. 2mg每分升。優(yōu)選地，帶有功能良好(例如，穩(wěn)定)移植器官的人是指，與帶有移植器官并且該器官的衰竭風(fēng)險(xiǎn)將要被評(píng)估的患者具有相似年齡、性別、種族、移植器官供體來(lái)源、Banff組織學(xué)分級(jí)接近和/或接受相同的初始抗排斥反應(yīng)治療的人。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，參考量可以通過(guò)測(cè)定來(lái)自患者的另外一份生物樣本中所述非編碼小RNA的表達(dá)量來(lái)獲得。例如，另外一份生物樣本可以在所述患者進(jìn)行器官移植前取得和/或取自所述患者的另外一個(gè)非排斥器官。
在又一個(gè)實(shí)施方式中，非編碼小RNA的參考表達(dá)量是指本領(lǐng)域公認(rèn)的非編碼小 RNA的表達(dá)量。
與測(cè)得的非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量進(jìn)行比較
本方法包括將測(cè)得的非編碼小RNA的表達(dá)量與該非編碼小RNA的參考表達(dá)量進(jìn)行比較。非編碼標(biāo)記小RNA可以是，例如，選自SEQ ID NOs : 1_53或其變體的非編碼小RNA。 優(yōu)選地，非編碼標(biāo)記小RNA選自SEQ ID NOs1:49，或其變體。
在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，非編碼標(biāo)記小RNA是選自SEQ ID NOs :1_9或其變體的序列。例如，非編碼標(biāo)記小RNA包括選自miR-142-5p ；miR-142-3p ；miR-155 ；miR-223 ； miR-146a ；miR-146b ；miR-342 ；miR-650 ；miR-21 和 / 或 miR-425_5p 的非編碼小 RNA,或其組合，其中與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量相比，非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量升高至少I 倍時(shí)，即提示移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，非編碼標(biāo)記小 RNA 為 miR-142-5p ;miR-142_3p 和 / 或 miR-155。
表達(dá)量升高至少I倍可以是指，與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量的升高量相比， 表達(dá)量升高至 少為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 倍或以上。優(yōu)選地，升高量為倍數(shù)值。用于定量表達(dá)量升高的示例方法是本領(lǐng)域的公知常識(shí)，參見(jiàn)下文中的一般方法章節(jié)。
在不同患者和不同類型的器官移植中，器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加情況不同。一般情況下，與不存在器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的人相比，增加的風(fēng)險(xiǎn)為至少約25%、至少約50%、至少約75%或至少約90%。
相反的，在一個(gè)實(shí)施方式中，選自SEQ ID NOs :1_9的序列或其變體的非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量比該非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量升高約小于I倍時(shí)，即提示移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低。在不同患者和不同類型的器官移植中，器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低情況不同。一般情況下，與不存在器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的人相比，降低的風(fēng)險(xiǎn)為至少約 25%、至少約50%、至少約75%或至少約90%。
在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，非標(biāo)記編碼標(biāo)記小RNA選自SEQ ID NOs 10-49 中的序列或其變體。例如，非編碼標(biāo)記小RNA包括選自miR-30c ；miR-30a-3p ；miR-10a ； miR-30e_3p ;miR_30b ;miR_10b ;miR_32 ;miR_9 ;miR_193b ;miR_143 ;miR_489 ;miR_27b ； miR-126 ;miR_378 ;miR_429 ;miR_181c ;miR_196b ;miR_199a ;miR_660 ;miR_203 ;miR_204 ； miR-30e_5p ;miR-30a_5p ;miR_30d ;miR_125b ;miR_130a ;miR_126 ;miR_195 ;miR_26a ； miR-26b ；miR-497 ；miR-152 ；miR-141 ；miR-296 ；miR-365 ；miR-99a ；miR-100 ；miR-186 ；和 /或let_7a的非編碼小RNA，其中與非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量相比，所述非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量升高小于I倍時(shí)，即提示移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。
表達(dá)量升高小于I倍可以是指，與非編碼標(biāo)記小RNA參考表達(dá)量的升高量相比，表達(dá)量升高至多為約O. 9、0. 8、0. 7、0. 6、0. 5、0. 4、0. 3、0. 2或O.1倍或以下。優(yōu)選地，升高量為倍數(shù)值。用于定量表達(dá)量升高的示例方法是本領(lǐng)域的公知常識(shí)，參見(jiàn)下文中的一般方法早下。
相反的，在一個(gè)實(shí)施方式中，選自SEQ ID NOs 10-49中的序列或其變體的非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量比該非編碼標(biāo)記小RNA的參考表達(dá)量升高至少約I倍或以上時(shí)，即提示移植器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低。在不同患者和不同類型的器官移植中，器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低情況不同。一般情況下，與不存在器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的人相比，降低的風(fēng)險(xiǎn)為至少約25%、至少約50%、至少約75%或至少約90%。
采用內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA進(jìn)一步提示器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加
測(cè)定和比較內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的量
在又一個(gè)實(shí)施方式中，評(píng)估器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的方法進(jìn)一步包括測(cè)定患者的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量。除此之外，這種方法包括測(cè)定生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的參考量。
如上文所述，參考量可以通過(guò)測(cè)定在帶有非排斥器官的人體中，或者在來(lái)自該患者的另外一份生物樣本中，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量來(lái)獲得。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，參考量是指，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA在本領(lǐng)域公認(rèn)的表達(dá)量。
內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA是指一種內(nèi)源性表達(dá)的非編碼小RNA(例如，在患者、細(xì)胞和/或組織中表達(dá))，且其在生物樣本中的表達(dá)相對(duì)恒定和豐富。
選擇和驗(yàn)證內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的方法是本領(lǐng)域的公知常識(shí)。參見(jiàn)， 例如，美圖應(yīng)用生物系統(tǒng)公 司的TaqMan 微小RNA的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選地，內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA是穩(wěn)定的，其大小與待測(cè)非編碼小RNA接近(例如，SEQ ID NOs :1_53)，且適用于測(cè)定表達(dá)的方式。
內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的例子包括，RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、 RNU49、Z30、RNU6B、RNU4 8、RNU43和/或RNU44。優(yōu)選地，內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA 為內(nèi)源性的小核仁RNA RNU44。
測(cè)定標(biāo)記RNA與參比RNA的表達(dá)差異
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,本方法進(jìn)一步包括測(cè)定生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量與非編碼標(biāo)記小RNA參考表達(dá)量之間的差異。例如，本方法能夠包括測(cè)定患者生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量與非編碼標(biāo)記小RNA參考表達(dá)量之間的差異。
如上文所述，參考量可以通過(guò)測(cè)定在帶有非排斥器官的人體中，或者在來(lái)自該患者的另外一份生物樣本中，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量來(lái)獲得。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，參考量是指，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA在本領(lǐng)域公認(rèn)的表達(dá)量。
實(shí)施方式進(jìn)一步包括測(cè)定生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量與該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的參考表達(dá)量之間的差異。或者例如，本方法包括測(cè)定患者生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量與該內(nèi)源性非編碼參比小RNA 參考表達(dá)量之間的差異。
如上文所述，參考量可以通過(guò)測(cè)定在帶有非排斥器官的人體中，或者在來(lái)自該患者的另外一份生物樣本中，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量來(lái)獲得。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，參考量是指，該內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA在本領(lǐng)域公認(rèn)的表達(dá)量。
本實(shí)施方式進(jìn)一步包括，比較(i)患者樣本中非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量與參考量之間的差異，和(ii)患者樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA表達(dá)量與參考量之間的差異。當(dāng)(i)中的差異(即，患者樣本中非編碼標(biāo)記小RNA表達(dá)量與參考量之間)高于(ii) 中的差異(即，患者樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA表達(dá)量與參考量之間)時(shí)，比較結(jié)果進(jìn)一步提示移植器官出現(xiàn)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)升高。
優(yōu)選地，當(dāng)⑴中差異比(ii)中差異高至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20倍或以上時(shí)，提示移植器官出現(xiàn)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)升高。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)⑴中差異比(ii)中差異高小于I倍時(shí)，例如，最多約O. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O.1倍或以下，提示移植器官出現(xiàn)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)升聞。
相應(yīng)地，本實(shí)施方式對(duì)應(yīng)一個(gè)實(shí)施例，據(jù)此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測(cè)定和/或確定患者中非編碼小RNA表達(dá)量的增加與參考量相比是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
歸一化
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明包 括對(duì)非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。本方法包括依照如上所述的方法測(cè)定患者生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA的表達(dá)量。本方法進(jìn)一步包括測(cè)定患者生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量。除此之外，本方法包括比較患者菲編碼標(biāo)記小RNA的測(cè)定結(jié)果與患者內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小 RNA的測(cè)定結(jié)果，以確定第一個(gè)比率。
本方法進(jìn)一步包括測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中非編碼標(biāo)記小RNA 的表達(dá)量。本方法進(jìn)一步包括測(cè)定帶有非排斥器官的人體的生物樣本中內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA的表達(dá)量。除此之外，本方法包括比較帶有非排斥器官的人體的非編碼標(biāo)記小RNA的測(cè)定結(jié)果與帶有非排斥器官的人體的非編碼參比小RNA的測(cè)定結(jié)果，以確定第二個(gè)比率。
當(dāng)計(jì)算得到的第一個(gè)比率比第二個(gè)比率至少高I倍時(shí)，計(jì)算結(jié)果提示帶有移植器官的患者中所述移植器官出現(xiàn)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)升高。計(jì)算得到的第一個(gè)比率比第二個(gè)比率至少高 I 倍可以是指，高至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20倍或以上。
當(dāng)計(jì)算得到的第一個(gè)比率比第二個(gè)比率高小于I倍時(shí)，計(jì)算結(jié)果提示帶有移植器官的患者中所述移植器官出現(xiàn)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)升高。計(jì)算得到的第一個(gè)比率比第二個(gè)比率高小于I倍可以是指，高至多約O. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O.1倍或以下。
相應(yīng)地，在本實(shí)施方式中，所述非編碼標(biāo)記小RNA的變化倍數(shù)或等同參數(shù)采用內(nèi)源性表達(dá)的非編碼參比小RNA進(jìn)行歸一化處理。
血清肌酸酐和附加實(shí)施方式
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)移植器官為腎臟時(shí)，用于評(píng)估患者器官排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的方法可以進(jìn)一步包括確定患者體內(nèi)血清肌酸酐蛋白的含量。血清肌酸酐含量可以用本領(lǐng)域公知的任意方法進(jìn)行測(cè)定，如美國(guó)專利公開(kāi)文本US20080131441中所述的方法，其在此參考并入。
在本實(shí)施方式中，將患者血清肌酸酐的檢測(cè)結(jié)果與健康人或有功能良好(例如，穩(wěn)定)移植體的人體的血清肌酸酐對(duì)照檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，參見(jiàn)U.S.專利公開(kāi)文本 US20080131441，其在此參考并入。例如，在健康人或有功能良好移植體的人體中，血清肌酸酐的正常水平一般約為O. 8-1. 6毫克/分升。所述人可以是患者或患者以外的人。
沒(méi)有必要在每次使用本方法時(shí)均測(cè)定對(duì)照樣本中的肌酸酐水平。例如，可以將患者的血清肌酸酐水平與此前獲得的一個(gè)或多個(gè)對(duì)照樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，或者與實(shí)施本方法的內(nèi)科醫(yī)師或臨床醫(yī)師認(rèn)可的水平進(jìn)行比較，或由醫(yī)療委員會(huì)和/或執(zhí)業(yè)醫(yī)師判定。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，這種方法進(jìn)一步包括告知患者其出現(xiàn)器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)是否降低或增加?；颊叱霈F(xiàn)移植器官排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的信息是有用的。據(jù)此就能為患者開(kāi)具處方和/或給予治療，以避免排斥反應(yīng)的發(fā)生和/或移植器官的損失。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，治療包括給予患者有效劑量的藥物組合物，以預(yù)防排斥反應(yīng)的發(fā)生和/或移植器官的損失。此類藥物組合物為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，包括例如激素沖擊療法、抗體等。
例如，激素沖擊療法可以包括給藥高劑量的皮質(zhì)激素(例如，IOOmg以上)3至6 天。抗體療法的例子包括給藥多克隆抗體Thymoglobin或單克隆抗體0KT37至14天。
治療方法的另外一個(gè)例子為血漿置換。血漿置換是將血液中的液體部分(即，血漿)與血細(xì)胞相分離的過(guò)程。通常，采用細(xì)胞分離器除去血漿。一般會(huì)將細(xì)胞回輸至接受治療的人體內(nèi)，而棄去包含抗體的血漿。
本發(fā)明所述的各種方法和實(shí)施方式均可單獨(dú)使用，或與其他方法的一種或多種或全部聯(lián)合使用。
一般方法
患者或健康人的生物樣本可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任意方法獲得。除上文所述的例子以外， 生物樣本的例子進(jìn)一步包括移植組織的組織活檢樣本、血液、尿液、膽汁、支氣管肺泡灌洗液和心包液。適宜的方法包括，例如，通過(guò)靜脈穿刺獲得血液樣本、收集尿樣以及經(jīng)皮芯針抽吸組織活檢。
本領(lǐng)域公知的任意方法均可以用于確定非編碼小RNA的量。通常，從生物樣本中分離總RNA?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的任意方法從樣本中分離RNA。例如，商品化的試劑盒， 如購(gòu)自 Molecular Research Center, Inc. (Cincinnati, OH)的 TRI Reagent ,或 Ambion 的mirVana miRNA分離試劑盒均可用于分離RNA。可以采用NanoDropND-1OOO型分光光度計(jì)測(cè)定RNA的收率和純度。
可以采用本領(lǐng)域公知的任意方法對(duì)生物樣本總mRNA中的非編碼小RNA進(jìn)行定量。 例如，涉及逆轉(zhuǎn)錄總RNA的動(dòng)態(tài)定量PCR(例如，采用Taqman陣列人微小RNA芯片vl. O適用的Taqman Multiplex RT)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)?？梢圆捎肁pplied BioSystems 7900HT型溫度循環(huán)儀或其同類產(chǎn)品完成定量PCR，檢測(cè)過(guò)程中使用生產(chǎn)廠商推薦的循環(huán)條件。簡(jiǎn)言之，采用特異性的非編碼小RNA引物對(duì)總RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，引物可通過(guò)TaqMan微小RNA檢測(cè)(Applied Biosystems)獲得，試劑來(lái)自TaqMan微小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)。
一般情況下，可以采用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)分離得到的非編碼小RNA進(jìn)行擴(kuò)增。 使用例如PCR或RT-PCR的方法的擴(kuò)增系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知。擴(kuò)增技術(shù)的一般性概述，參見(jiàn)， 例如，Dieffenbach et al. , PCR Primer A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1995)。例如,可以采用動(dòng)態(tài)定量PCR確定非編碼小RNA的量。優(yōu)選地，采用TaqMan微小RNA實(shí)驗(yàn)(Applied Biosystems)獲得的cDNA樣本來(lái)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。
用于測(cè)定非編碼小RNA表達(dá)量的另一種方法包括，使用分子信標(biāo)以及其他可用于，例如多重PCR，的標(biāo)記探針。在多重PCR檢測(cè)中，PCR混合物含有指向非編碼小RNA PCR 產(chǎn)物的引物和探針。通常，在實(shí)驗(yàn)中使用單個(gè)熒光染料。通過(guò)檢測(cè)分子信標(biāo)或探針確定非編碼小RNA的量。分子信標(biāo)的描述請(qǐng)見(jiàn),例如，Tyagi和Kramer (Nature Biotechnology 14, 303-308，1996)以及Andrus和Nichols在U. S.專利申請(qǐng)
發(fā)明者M·蘇桑瑟冉 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)