專利名稱：合成移植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及塑性-壓縮的膠原凝膠(塑性-壓實(shí)的膠原凝膠， plastically-compacted collagen gel)作為用于角膜細(xì)胞，尤其是角膜緣上皮干細(xì)胞(緣角膜上皮干細(xì)胞，limbal corneal epithelial stem cell)生長(zhǎng)的基底的應(yīng)用。在這樣的基底上生長(zhǎng)的細(xì)胞可以被培養(yǎng)以產(chǎn)生人造眼上皮或人造角膜組織，其可以在眼毒性試驗(yàn)中使用或用于移植。
背景技術(shù)：
在商品化前，新的藥物和化妝品必須在眼毒性試驗(yàn)如Draize兔眼刺激試驗(yàn)中被測(cè)試，以便確定那些新的藥物/化妝品的毒性可能性。在這點(diǎn)上，眼被使用，因?yàn)樗韺?duì)我們的日常環(huán)境的最通常暴露的和化學(xué)-敏感極限。在這樣的試驗(yàn)中，每年使用數(shù)千只兔子，這個(gè)在兔眼上測(cè)試藥物和化妝品的方法在過(guò)去的50年間幾乎沒(méi)有改變。然而，Draize 兔眼試驗(yàn)已經(jīng)不僅在倫理方面，而且在科學(xué)方面(因?yàn)橥醚酆腿搜鄣妮^大差異)受到批評(píng)。 然而，目前沒(méi)有非動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為Draize試驗(yàn)的替代物被接受；歐洲立法方面即將到來(lái)的改變可能增加對(duì)這樣的替代的需求。動(dòng)物模型的體外可替代方式的應(yīng)用先前已經(jīng)利用器官培養(yǎng)、人類細(xì)胞系和人類供體組織被研究，但是這些模型的有效性已經(jīng)被遺傳不穩(wěn)定性、二維組織培養(yǎng)限制(沒(méi)有模擬上皮屏障功能)、缺乏正常生長(zhǎng)和分化、種間遺傳變異和有限的可用性妨礙。因?yàn)檫@些原因，最近對(duì)三維(3D)角膜模型的需求已經(jīng)導(dǎo)致作為眼刺激試驗(yàn)的體外可替代方式的兩個(gè)商業(yè)上皮模型(SkinEthic Laboratories 和 EpiOculanMatiTek Corp)的開發(fā)。SkinEthic 模型使用永生的人類角膜上皮細(xì)胞(Doucet，0. et al. Toxicol In Vitro, 2006. 20(4) p. 499-512)，而 MatTek 模型使用正常角質(zhì)形成細(xì)胞(Van Goethem, F. et al. Toxicol. In Vitro, 2006. 20(1) :p. 1_17)。雖然這些模型均展現(xiàn)出角膜樣上皮結(jié)構(gòu)，但是它們既沒(méi)有使用生理基底，也沒(méi)有模擬角膜干細(xì)胞在維持角膜上皮的功能中所起的重要作用。已經(jīng)嘗試提供用于角膜細(xì)胞生長(zhǎng)的基底，其模擬由體內(nèi)角膜提供的生理基底。 已經(jīng)嘗試了范圍廣泛的基底，包括羊膜、溫度敏感的水凝膠、血漿聚合物涂覆的基底和膠原、血纖蛋白、和纖連蛋白/血纖蛋白凝膠。在作為用于收獲的角膜干細(xì)胞的載體的羊膜、膠原凝膠和膠原罩之間的比較中，羊膜被發(fā)現(xiàn)為較好的載體(khwab，I. R. Trans. Am. Opthalmol. Soc. 1999,97 :p. 891-986)。自從那時(shí)，羊膜已經(jīng)被用作標(biāo)準(zhǔn)角膜細(xì)胞基底，因?yàn)樗龠M(jìn)在其上生長(zhǎng)的細(xì)胞的增殖、粘附和分化。它還已顯示為用于眼表面移植的角膜干細(xì)胞的臨床擴(kuò)展的優(yōu)異基底(例如Koizumi N et al. , Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000 ；41 :2506-2513)。然而，羊膜在結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成方面顯示出顯著的樣品間和樣品內(nèi)的變化 (Hopkinson, A. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，2006. 47 (10) :ρ· 4316-4322)，并且在臨床應(yīng)用前沒(méi)有常規(guī)地被表征。最重要的，作為基底的羊膜缺乏工程化的聚合物構(gòu)造的可量測(cè)性。
因此，已經(jīng)在除了羊膜以外的基底上制作來(lái)自擴(kuò)展的緣干細(xì)胞(角膜緣干細(xì)胞， limbal stem cell)的離體角膜上皮移植構(gòu)造方面進(jìn)行了嘗試。適用于利用角膜干細(xì)胞的體外眼毒性試驗(yàn)的基底需要具有下列基本要求(i)支持干細(xì)胞擴(kuò)展，以及(ii)為細(xì)胞分層提供固體載體。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新型基底，所述基底提供與羊膜類似的組織工程能力，但是更易得到比并且更容易標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了塑性-壓縮的膠原凝膠作為用于角膜細(xì)胞生長(zhǎng)的基底的應(yīng)用。未壓縮的膠原凝膠包含在隙間液體(間質(zhì)液體，interstitial liquid)周圍形成連續(xù)支架的膠原原纖維的基質(zhì)。例如，溶解的膠原可以通過(guò)添加稀釋的堿而被誘導(dǎo)聚合/ 聚集，以形成交聯(lián)的膠原原纖維的凝膠網(wǎng)絡(luò)。所述原纖維的凝膠網(wǎng)絡(luò)支持溶解的膠原纖維的初始體積，保留隙間液體。用于產(chǎn)生這樣的膠原凝膠的一般方法是本領(lǐng)域熟知的(例如， W02006/003442, W02007/060459 和 W02009/004;351)。如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“塑性-壓縮的膠原凝膠”指的是這樣的膠原凝膠，其初始體積已經(jīng)通過(guò)外部壓縮/脫水處理被減小，其中初始隙間液體的一部分或大部分已經(jīng)從所述凝膠中被去除，并且其中所述膠原凝膠在去除外部處理后保持其新的(減小)的體積。所述塑性-壓縮的膠原凝膠也可以被稱為脫水的。與現(xiàn)有技術(shù)的膠原凝膠如商標(biāo)Gelfoam 下的生產(chǎn)的那些膠原凝膠(其據(jù)說(shuō)能夠在血液中吸收45倍它們的重量)相比，本發(fā)明的塑性-壓縮的膠原凝膠被永久地壓縮并基本上不能吸收。在這個(gè)上下文中，術(shù)語(yǔ)“塑性壓縮的”意味著壓縮導(dǎo)致所述凝膠的結(jié)構(gòu)的永久壓縮/變形。這里涉及的塑性-壓縮的凝膠未被玻璃化(即，它們沒(méi)有被干燥到產(chǎn)生剛性、玻璃狀物質(zhì)的程度)；它們不是玻璃狀的；它們不是剛性的；它們是柔性的。這里使用的膠原凝膠能夠具有捕獲在它們的結(jié)構(gòu)中的活細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和/或角膜細(xì)胞。在所述膠原凝膠中使用的膠原可以為任何原纖維-形成膠原。原纖維-形成膠原的實(shí)例為I、II、III、V、VI、IX和XI型。所述凝膠可以包含全然相同類型的膠原或不同類型的膠原的混合物。優(yōu)選地，所述凝膠包含I型膠原或由I型膠原組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述凝膠排他地或基本上由膠原原纖維形成，即，膠原原纖維是所述凝膠中僅有的或基本上僅有的聚合物。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述膠原凝膠可以另外包含其他天然存在的聚合物，例如絲、纖連蛋白、彈性蛋白、殼多糖和/或纖維素。一般來(lái)說(shuō)，非膠原的天然存在的聚合物的量將少于凝膠的5%，優(yōu)選少于凝膠的4^^3^^2%或(wt/wt)。類似量的非天然聚合物也可以在凝膠中存在，如，聚內(nèi)酯、聚交酯、聚甘油栓(聚糖苷配糖基， polyglycone)、聚己內(nèi)酯(polycapryolactone)和 / 或磷酸鹽玻璃。所述隙間液體可以為其中膠原原纖維可以被溶解和其中膠原原纖維可以凝膠化的任何液體。通常，它會(huì)是水成液，例如含水緩沖劑或細(xì)胞培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述膠原凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面被涂覆有層粘連蛋白(Iaminin)、或一個(gè)或多個(gè)層粘連蛋白域，以便提高角膜細(xì)胞的粘附。層粘連蛋白，一種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)多域三聚糖蛋白，為支持粘附、增殖和分化的基板(基底層)的主要非成膠成分。它最初從小鼠EngeIbreth-H0Im-Swarm(EHS)腫瘤(層粘連蛋白-1)中分離。層粘連蛋白蛋白質(zhì)是動(dòng)物組織中結(jié)構(gòu)性支架的組成分。層粘連蛋白經(jīng)由巢蛋白(entactin)和基底膜聚糖(基底膜蛋白多糖，perlecan)與IV型膠原聯(lián)合并通過(guò)整聯(lián)蛋白受體、營(yíng)養(yǎng)不良聚糖糖蛋白復(fù)合體和盧塞蘭血型糖蛋白結(jié)合到細(xì)胞膜。如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“層粘連蛋白域”包括，尤其是α -鏈的RGD和IKVAV序列、 β 1-鏈的 YIGSRJP γ -鏈的 RNIAEIIKDI。優(yōu)選地，所述層粘連蛋白來(lái)自EngeIbreth-HoIm-Swarm鼠肉瘤基膜。層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白域可以，例如，以1_2μ g/cm2的濃度被使用。層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白域可以在壓縮之前或壓縮之后被應(yīng)用于膠原凝膠。優(yōu)選地，僅角膜細(xì)胞被放置其上的表面被涂覆。這可以，例如，為膠原凝膠的上表面(使用時(shí))。在一些實(shí)施方式中，所述未壓縮的膠原凝膠可以在凝膠內(nèi)不包含細(xì)胞。在還有的其他實(shí)施方式中，所述未壓縮的膠原凝膠可以包含一種或多種類型的細(xì)胞。這樣的接種的細(xì)胞的實(shí)例包括間質(zhì)祖細(xì)胞如分化或未分化形式的角膜成纖維細(xì)胞(角膜細(xì)胞)。優(yōu)選地，這些角膜成纖維細(xì)胞從外周緣(外周角膜緣，peripheral limbus)或從緣環(huán)(limbal ring)獲得，其在約37°C下與約0. 02%膠原酶過(guò)夜孵育。這樣的細(xì)胞，如果存在，通常在壓縮(S卩，脫水)前被接種到膠原凝膠中，例如，通過(guò)在聚合/聚集前將它們與膠原溶液混合。凝膠壓縮(凝膠中有或沒(méi)有細(xì)胞)的合適的方法的實(shí)例包括以下(i)到凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣(edge)的壓縮力的應(yīng)用；(ii)到凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣的脫水力的應(yīng)用；(iii)凝膠在一個(gè)或兩個(gè)平面(例如長(zhǎng)度和/或?qū)挾?中的拉伸；或(iv) (i)-(iii)中的一個(gè)或多個(gè)的組合。上述方法的每個(gè)可以與隙間液體-吸收物質(zhì)到凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣的直接施加(即接觸)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述膠原凝膠的壓縮可以通過(guò)將壓縮力施加到凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣而產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述凝膠在壓縮力的施加期間被限制。優(yōu)選地，所述壓縮力被施加至凝膠的上表面。例如，重力可以被施加至凝膠的上表面，可選地連同將隙間液體-吸收物質(zhì)施加至凝膠。重力的量和壓縮的持續(xù)時(shí)間將取決于希望的壓縮水平而變化。 在一些實(shí)施方式中，重力將為20-100g，優(yōu)選40-60g，最優(yōu)選約50g。在一些實(shí)施方式中，壓縮的持續(xù)時(shí)間將為10-600秒，優(yōu)選20-400秒，最優(yōu)選約5分鐘。在其他實(shí)施方式中，膠原凝膠的壓縮可以通過(guò)將脫水力施加于凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣產(chǎn)生。例如，隙間液體-吸收物質(zhì)可以被施加于凝膠的上表面和/或下表面。這樣的液體-吸收物質(zhì)的實(shí)例包括一個(gè)或多個(gè)組織薄片或吸墨紙。隙間液體-吸收物質(zhì)的施加持續(xù)時(shí)間將取決于希望的壓縮水平而變化。在還有的其他實(shí)施方式中，膠原凝膠的壓縮可以通過(guò)在一個(gè)或兩個(gè)平面(例如長(zhǎng)度和/或?qū)挾?中拉伸所述凝膠而產(chǎn)生。這樣的拉伸作用可以擠出部分隙間液體。例如， 所述凝膠可以從第一邊緣被懸吊，負(fù)荷被施加于第二(如相對(duì))邊緣。所述負(fù)荷將為能夠拉伸凝膠而不打斷凝膠的量。不同的負(fù)荷可以穿過(guò)凝膠的不同軸被施加。負(fù)荷的施加持續(xù)時(shí)間和負(fù)荷的量將取決于希望的壓縮水平而變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，隙間液體-抽出力或脫水力可以沿著與負(fù)荷相同的軸施加，例如通過(guò)隙間液體-吸收物質(zhì)被放置于負(fù)荷被施加的凝膠的一個(gè)邊緣或兩個(gè)邊緣。在凝膠的壓縮之前或之后，所述凝膠可以經(jīng)受(a)施加單軸拉伸負(fù)荷和(b)去除所述負(fù)荷的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)循環(huán)。相信這樣的加載和卸載的重復(fù)循環(huán)以定向方式增加了壓縮的凝膠中膠原原纖維的融合(參見(jiàn)，例如，W02007/060459)。用于生產(chǎn)壓縮的凝膠膠原的另外的方法在本領(lǐng)域是已知的(例如， W02006/003442, W02007/060459 和 W02009/004;351)。在外部壓縮/脫水處理下，隙間液體從壓縮的凝膠中被永久去除。與初始(未壓縮的)凝膠相比，得到的凝膠具有永久-減小的體積、增加的密度和增加的強(qiáng)度。所述膠原凝膠的體積可以，例如，被減小至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 99%或99. 9%。優(yōu)選地，所述凝膠的體積為初始體積的0. 1-2. 0%。實(shí)現(xiàn)壓縮所需的時(shí)間可以取決于施加的外部處理而變化。例如，壓縮可以在少于 24小時(shí)、少于12小時(shí)、少于6小時(shí)、少于3小時(shí)或少于1小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)施方式中， 壓縮可以在少于30、20、10、5或2分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)。與初始凝膠相比，從凝膠中失去的隙間液體的量可以為至少50 %、60 %、70 %、 80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。為了產(chǎn)生用于移植或用于眼毒性試驗(yàn)或這里披露的任何其他應(yīng)用的人造眼上皮細(xì)胞，所述塑性-壓縮的膠原凝膠將優(yōu)選為l-60mm長(zhǎng)，更優(yōu)選20-40mm長(zhǎng)。它還可以為 0. 5-60mm 寬，優(yōu)選 20_40mm 寬。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠將為作為5-10000 μ m 厚，優(yōu)選10-1000 μ m,更優(yōu)選20-100 μ m厚，最優(yōu)選約50 μ m厚的片的形式。所述塑性-壓縮的膠原凝膠的組成通常為3-4%膠原(優(yōu)選3. 3-3. 5%，更優(yōu)選約3. 4%的膠原)，剩余物為水和來(lái)自緩沖劑的鹽/糖。在這個(gè)剩余物中，水將通成> 99%。所述壓縮的膠原凝膠中膠原原纖維的直徑優(yōu)選為lO-lOOnm。所述壓縮的膠原凝膠中膠原原纖維的間距優(yōu)選為l-200nm。這些參數(shù)可以通過(guò)以下方法測(cè)量膠原凝膠可以在室溫下在PBS中的2. 5%戊二醛中固定1小時(shí)，接著在室溫下在四氧化鋨中固定1小時(shí)，隨后在增加的乙醇濃度(直到100%)中脫水，接著在環(huán)氧丙烷中充氣，隨后埋置在瓊脂 100樹脂中在60°C下聚合M小時(shí)。70nm部分可以被切下，在電子透射電子顯微鏡(TEM)檢查前通過(guò)檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾復(fù)染色，此時(shí)膠原原纖維直徑和間距可以被量化。膠原原纖維的定向也可以通過(guò)這個(gè)方法被定性評(píng)估，如高(或低)程度的定向。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了塑性-壓縮的膠原凝膠作為基底的應(yīng)用，在所述基底上生長(zhǎng)角膜細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)人造眼上皮的方法，包括在塑性-壓縮的膠原凝膠基底上培養(yǎng)角膜干細(xì)胞或包含角膜干細(xì)胞的組合物，其中所述細(xì)胞或所述組合物在這樣的條件下培養(yǎng)以便提供在基底上產(chǎn)生人造眼上皮的角膜上皮細(xì)胞群。本發(fā)明中使用的塑性壓縮的凝膠提供了角膜細(xì)胞在其上生長(zhǎng)的基底，這個(gè)基底形態(tài)上與裸露的角膜基質(zhì)(角膜間質(zhì))相似。所述細(xì)胞在這個(gè)基底的表面上生長(zhǎng)，沒(méi)有或基
9本上沒(méi)有這樣的細(xì)胞生長(zhǎng)到基底中。所述塑性-壓縮的膠原凝膠的壓縮水平是使得其防止了施加的上皮細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)到壓縮的凝膠中。在一些實(shí)施方式中，所述人造眼上皮隨后與所述基底分離。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述人造眼上皮被保持在所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底上，后者被用作人造角膜基質(zhì)。如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“人造角膜基質(zhì)”優(yōu)選涉及這里定義的塑性壓縮的膠原凝膠，其可以可選地包含捕獲在其中的角膜成纖維細(xì)胞和/或角質(zhì)形成細(xì)胞，和/或其可以可選地是交聯(lián)的(優(yōu)選利用核黃素/UV)。在一些實(shí)施方式中，所述人造眼上皮隨后被儲(chǔ)存在適于人類組織的儲(chǔ)存和保存的介質(zhì)中，具有或沒(méi)有基底，優(yōu)選地為基于軟骨素-硫酸鹽的儲(chǔ)存介質(zhì)，例如Optisol (Bausch&Lomb)，可選地連同作為人造眼上皮使用的說(shuō)明書。優(yōu)選地，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底通過(guò)這里描述的方法獲得或可以獲得。本發(fā)明還提供了通過(guò)上述方法獲得或可獲得的人造眼上皮。本發(fā)明還提供了優(yōu)選通過(guò)這里定義的方法獲得或可獲得的人造眼上皮，包含表達(dá) CK3(細(xì)胞角蛋白幻分化標(biāo)記物和CK14(細(xì)胞角蛋白14)未分化標(biāo)記物的3-7個(gè)細(xì)胞層的連續(xù)復(fù)層上皮，在基細(xì)胞內(nèi)和基細(xì)胞下具有基膜成分(例如，層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白、半橋粒)。所述人造眼上皮優(yōu)選在450nm處具有0. 00-0. 50的光密度(OD)。優(yōu)選地，具有埋置的角質(zhì)形成細(xì)胞和人造眼上皮的層粘連蛋白-涂覆的塑性-壓縮膠原凝膠具有0.01-0. 10， 優(yōu)選約 0. 073 的 OD (450nm)。橋粒和半橋粒(分別是細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基底粘附復(fù)合體)在人造眼上皮中的存在可以用于量化組織完整性和對(duì)下面的基質(zhì)的粘附。尤其是，本發(fā)明涉及這樣的人造眼上皮，其中半橋粒在一些或所有基細(xì)胞中存在和/或一些或所有鄰近上皮細(xì)胞經(jīng)由橋粒結(jié)構(gòu)被相互連接。包含角膜干細(xì)胞的組合物優(yōu)選包含緣上皮細(xì)胞(角膜緣上皮細(xì)胞，Iimbal epithelial cell)，即干細(xì)胞和分化細(xì)胞的非均勻混合物，其可以從角膜邊緣處的緣(角膜緣，limbus)獲得。換言之，包含角膜干細(xì)胞的組合物可以包含角膜干細(xì)胞和還沒(méi)有完全定向(commit)于角膜上皮表型的細(xì)胞的混合物。如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“角膜細(xì)胞”涉及從動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物)角膜獲得的細(xì)胞。 優(yōu)選地，所述細(xì)胞從角膜的緣環(huán)獲得，即，排除結(jié)膜、虹膜和中心角膜的角膜的外緣。所述細(xì)胞可以包含上皮細(xì)胞或由上皮細(xì)胞組成。所述細(xì)胞可以包含角膜干細(xì)胞或由角膜干細(xì)胞組成，優(yōu)選角膜緣上皮干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述角膜干細(xì)胞為人類角膜干細(xì)胞。所述壓縮的膠原凝膠的膠原可以在壓縮之前或之后被交聯(lián)以便提高所述凝膠的機(jī)械性能。優(yōu)選地，所述交聯(lián)利用核黃素和UV(優(yōu)選UVA，最優(yōu)選在約365nm處)進(jìn)行。例如，所述交聯(lián)可以通過(guò)在室溫下在核黃素溶液(優(yōu)選在15-25%葡聚糖溶液中0. 05-0. 2% 的核黃素)中孵育壓縮的凝膠達(dá)20-40分鐘進(jìn)行。隨后任何不用的核黃素可以例如利用 PBS被從凝膠中洗掉。以這個(gè)方式處理的膠原凝膠與未處理的凝膠相比能夠經(jīng)受住增加的負(fù)荷，并且在移植到眼表面時(shí)被縫線較好地維持在原位。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述交聯(lián)不是利用1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基) 碳二亞胺(EDC)或N-羥基琥珀酰亞胺(MB)或任何其他基于碳二亞胺或琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑進(jìn)行的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，交聯(lián)的塑性壓縮的膠原凝膠被使用(優(yōu)選利用核黃素/UV交聯(lián))，其中所述壓縮的凝膠不包含捕獲的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了塑性-壓縮的膠原凝膠，其中所述膠原纖維已經(jīng)利用核黃素(優(yōu)選利用UV光)被交聯(lián)；這樣的凝膠作為人造眼上皮可以在其上生長(zhǎng)的基底的應(yīng)用；以及所述膠原凝膠在這里披露的其他用途中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述塑性-壓縮的膠原凝膠是通過(guò)這里披露的方法生產(chǎn)的凝膠。所述組合物或干細(xì)胞在這樣的條件下被培養(yǎng)，以便提供在基底的表面上產(chǎn)生人造眼上皮的角膜上皮細(xì)胞群。這樣的條件在本領(lǐng)域是眾所周知的(例如肪站0 B.，et al. Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 1988 ；29 :1533-1537 ；de Paiva C. S. et al. Stem Cells 2005 ；23 :63-73)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的人造眼上皮和塑性-壓縮的膠原凝膠基底的人造眼組織，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得，優(yōu)選地，其中所述人造眼上皮正在或已經(jīng)在所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底的表面上生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了評(píng)估試驗(yàn)化合物對(duì)人造眼上皮或人造眼組織的作用的方法， 包含以下步驟(a)提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織；(b)將所述人造眼上皮或組織與一定量的試驗(yàn)化合物接觸；以及(c)評(píng)估所述化合物對(duì)人造眼上皮或組織的作用。所述化合物的作用可以，例如通過(guò)任何分析、生物化學(xué)、光學(xué)、顯微鏡或其他方式評(píng)估。在一些實(shí)施方式中，要評(píng)估的作用為所述人造眼上皮或組織的光學(xué)特性的改變， 或者人造眼上皮或組織的通透性的改變。所述改變可以，例如，在測(cè)試化合物應(yīng)用之前和之后測(cè)量，或者所述改變可以與對(duì)照進(jìn)行比較。在其他實(shí)施方式中，所述化合物的作用可以通過(guò)人造眼上皮或組織的組織學(xué)檢查，或者通過(guò)測(cè)量任何促炎介質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)評(píng)估。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織在提供測(cè)試化合物對(duì)哺乳動(dòng)物角膜的毒性指征中的應(yīng)用。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的眼上皮或組織在提供模型來(lái)研究角膜上皮的基礎(chǔ)/基本生物學(xué)(例如，增殖、分化、粘附和分層的分子控制)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織作為人造角膜的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織作為用于將細(xì)胞遞送到需要其的組織的試劑應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了處理眼外傷的方法，包括(a)提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織；(b)將眼外傷與所述人造眼上皮或組織接觸；以及可選地(c)將所述人造眼上皮或組織固定在眼外傷的部位。
可以被處理的眼外傷包括那些涉及不足的間質(zhì)微環(huán)境以支持干細(xì)胞功能的外傷， 如無(wú)虹膜、角膜炎、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病變(neurotrophic keratopathy)和慢性Iimbitis ； 或者涉及破壞緣干細(xì)胞的外在因素的那些外傷，如化學(xué)或熱傷、史蒂文斯-約翰遜綜合征、 眼瘢痕類天皰瘡、接觸鏡佩戴并發(fā)癥(contact lens wear)、或廣泛的微生物感染。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療方法、優(yōu)選處理眼外傷如上面定義的那些的方法中的通過(guò)上述方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織。本發(fā)明還提供了通過(guò)上述方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織在制造用于治療方法、優(yōu)選處理眼外傷如上面定義的那些的方法的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了在哺乳動(dòng)物受試者中替換角膜的方法，包括(a)提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織；(b)用所述人造眼上皮或組織替換哺乳動(dòng)物受試者的角膜。本發(fā)明還提供了用于手術(shù)方法中的通過(guò)上述方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織，優(yōu)選地，其中哺乳動(dòng)物受試者的角膜被所述人造眼上皮或組織替換。 本發(fā)明還提供了通過(guò)上述方法獲得或可獲得的人造眼上皮或組織在制造用于手術(shù)的方法的組合物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，其中哺乳動(dòng)物受試者的角膜被所述人造眼上皮或組織替換。


圖1.通過(guò)來(lái)自牛角膜基質(zhì)的緣的角膜細(xì)胞的初始球形成。代表性的球分別培養(yǎng) 5㈧、7⑶和9(C)天。(D)來(lái)自初始球的分化的后代。比例尺=50μπι。圖2.埋置的角膜細(xì)胞的活/死染色。A 培養(yǎng)7天后壓縮的膠原凝膠內(nèi)埋置的角膜細(xì)胞。B 通過(guò)它們的綠色染色表明角膜細(xì)胞是活的。C 顯示紅色染色的死的角膜細(xì)胞沒(méi)有被檢測(cè)到。圖3Α-Β.人類角膜(圖3Α)和羊膜(圖3Β)的透射電子顯微鏡檢查(TEM)。圖4Α-Β.羊膜的X-射線衍射(圖4Α)顯示穿過(guò)X-射線衍射圖樣的橫切面(圖 4Β)。圖5.不同支架的掃描電子顯微照片。A 壓縮的膠原凝膠；B 裸露的羊膜。圖6.角膜上皮片和正常牛角膜上皮的透射電子顯微鏡圖像。A 基細(xì)胞顯示經(jīng)由半橋粒附著充分粘附到壓縮的膠原支架(箭頭)；B:正常牛角膜上皮中的半橋粒附著(箭頭)；C:鄰近的細(xì)胞清楚地顯示壓縮凝膠上的橋粒連接(箭頭)；D 正常角膜上皮中的橋粒連接(箭頭)。比例尺=SOOnm0圖7.透明度的評(píng)估。A 第1行(“膠原”)具有埋置的角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠；第2行(“AM”)裸露的羊膜；第3行(“膠原+”)在壓縮的膠原凝膠上擴(kuò)展的LEC的組合；第4行(“AM+”)在裸露的羊膜上擴(kuò)展的LEC的組合。組織置于 96孔板中。B:得到的OD測(cè)量值。條形圖代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖8A-C.羊膜上分離的緣細(xì)胞(角膜緣細(xì)胞)的分層。擴(kuò)展的細(xì)胞來(lái)自在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中孵育11天后的緣片(角膜緣片)(A)和在14天后懸浮的細(xì)胞(B)。脫水的膠原片上擴(kuò)展的細(xì)胞顯示細(xì)胞密度和分層的可比較水平(C)。染色顯示細(xì)胞核。圖9A-B. K3 (紅色)和K14 (綠色)的20x顯微照片，在培養(yǎng)11天后角膜緣細(xì)胞的DAPI (藍(lán)色)雙標(biāo)記。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞㈧和外植體培養(yǎng)的細(xì)胞(B)。比例尺100 μ m。圖10.擴(kuò)展的緣上皮細(xì)胞的免疫熒光染色。A 埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠上LEC (紅色)的CK3染色(綠色)。B 裸露的羊膜上LEC (藍(lán)色)的CK3 染色(紅色)。C:埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠上LEC(紅色)的 CK14(綠色)染色。D 裸露的羊膜上LEC(藍(lán)色)的CK14(綠色)染色。比例尺=50μπι。圖11.在埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠(膠原)上和裸露的羊膜(AM)上培養(yǎng)的LEC的CK3(A- “K3”)和CK14(B_ “K4”)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡和免疫印跡。圖12.在埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠(膠原)上和裸露的羊膜(AM)上培養(yǎng)的LEC中的CK12 mRNA表達(dá)。圖13.膠原凝膠的塑性壓縮。A 穩(wěn)定的未壓縮的膠原凝膠；B 示出用于穩(wěn)定的膠原凝膠的PC的方法的圖；C 壓縮的膠原凝膠。圖14.緣上皮長(zhǎng)出物。A 未壓縮的膠原凝膠上的外植體長(zhǎng)出物；B 壓縮的膠原凝膠上的外植體長(zhǎng)出物；C:示出膠原支架上的外植體長(zhǎng)出物的面積(區(qū)域)的圖。比例尺= 50 μ m0圖15.不同的支架的掃描電子顯微照片。A 未壓縮的膠原凝膠；B 壓縮的膠原凝膠；C:裸露的牛角膜基質(zhì)。圖16.膠原凝膠和正常角膜上的LEC的掃描電子顯微鏡(圖像)。A 未壓縮的膠原凝膠上的細(xì)胞；B 壓縮的膠原凝膠上的細(xì)胞；C 正常的牛角膜上皮。圖17.膠原纖維、角膜上皮細(xì)胞片和正常牛角膜上皮的透射電子顯微鏡圖像。A-C 來(lái)自不同支架的膠原纖維未壓縮的膠原凝膠(A)，壓縮的膠原凝膠(B)和正常牛角膜基質(zhì)(C) ；D 基細(xì)胞沒(méi)有非常良好地粘附于未壓縮的膠原凝膠；E 基細(xì)胞顯示經(jīng)由半橋粒附著(箭頭)良好地粘附于壓縮的膠原支架；F:正常牛角膜上皮中的半橋粒附著(箭頭)； G 細(xì)胞層之間的大的間隙在未壓縮的凝膠上是可見(jiàn)的(箭頭)；H:鄰近細(xì)胞清楚地顯示出壓縮的凝膠上的橋粒連接(箭頭)；I 正常角膜上皮中的橋粒連接(箭頭)。比例尺 (A-C) 10 μ m ； (D-I) 1 μ m。圖18.在膠原凝膠和正常牛角膜上皮上生長(zhǎng)的細(xì)胞的免疫染色。碘化丙啶(紅色)和CK 3 (綠色)。A 在未壓縮的膠原凝膠上生長(zhǎng)的細(xì)胞；B 在壓縮的膠原凝膠上生長(zhǎng)的細(xì)胞；C:正常牛角膜上皮。比例尺=50 μ m。圖19.未處理(左)和核黃素/UV處理的(右)的壓縮的膠原凝膠。圖20.用于分析壓縮的膠原凝膠的斷裂應(yīng)變的裝置。圖21.對(duì)于未處理的(圖21A)和核黃素/UV處理的(圖21B)壓縮的膠原凝膠， 針對(duì)時(shí)間增加負(fù)荷的實(shí)施例。圖22.在核黃素/UV處理的膠原凝膠上生長(zhǎng)的細(xì)胞的免疫染色。碘化丙啶(紅色)和CK 3(綠色)。角膜緣細(xì)胞可以穿過(guò)核黃素處理的壓縮的膠原凝膠生長(zhǎng)。圖23.移植到兔子的眼表面的壓縮的膠原凝膠(薄片狀移植物)。A 移植后的壓縮的膠原凝膠不能有效地支持縫線；B 用核黃素處理的壓縮的膠原凝膠能夠改進(jìn)移植，因?yàn)樗梢愿玫乇豢p合并保持在原位。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例本發(fā)明在下面的實(shí)施例中被進(jìn)一步定義，除非另外說(shuō)明，其中份數(shù)和百分比為按重量計(jì)，度數(shù)為攝氏度。應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例，雖然表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但僅以示例的方式給出。根據(jù)上面的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，而不偏離其精神和范圍，可以進(jìn)行本發(fā)明的多種變化和改變以使其適應(yīng)多種應(yīng)用和條件。因此，除了本文中那些顯示和描述的，根據(jù)前面的說(shuō)明，本發(fā)明的多種改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。這樣的改變也將旨在落入所附權(quán)利要求的范圍。這里陳述的每個(gè)參考文獻(xiàn)披露的內(nèi)容以其整體通過(guò)引用方式并入本文中。實(shí)施例1 利用初始球形成試驗(yàn)分離角膜細(xì)胞正常牛眼在死亡后2小時(shí)內(nèi)從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)(Chity批發(fā)屠宰場(chǎng)，Guildford，UK)獲得，在4°C被運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室并立即使用。利用標(biāo)準(zhǔn)眼庫(kù)技術(shù)切開角膜鞏膜扣(corneoscleral button) 0簡(jiǎn)單地，用杜伯科氏最小必需培養(yǎng)基(DMEM，GIBC0)漂洗角膜鞏膜組織三次。在仔細(xì)去除中心角膜、過(guò)量鞏膜、虹膜、角膜內(nèi)皮、結(jié)膜和眼球囊后，剩余的緣邊(角膜緣邊， limbal rim)被切成約25mm2的小片。緣間質(zhì)角膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞隨后從這些片被分離。為了緣間質(zhì)角膜細(xì)胞分離，將緣邊的片用0.02%膠原酶(GIBCO)在37°C下過(guò)夜孵育。其余的緣間質(zhì)片隨后被收集并用0. 2% EDTA(Sigma, UK)在37°C下處理5分鐘，隨后通過(guò)21規(guī)格針抽吸以分離為單獨(dú)的細(xì)胞。在離心后，所述細(xì)胞被重新懸浮在包含DMEM和Ham’ s F12培養(yǎng)基(DMEM/F12，1 1)，補(bǔ)充有 B27 Qnvitrogen, UK)，20ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(EGF, Sigma, UK)，40ng/ml 基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 Mary Ann Liebert, Inc. , 140 Huguenot Street, New Rochelle, NY 10801 (bFGF, Sigma, UK)，lOOU/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，和 250ng/ ml兩性霉素B的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。采用球形成試驗(yàn)以利用包含甲基纖維素凝膠基質(zhì)(0.8%， Sigma-Aldrich)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)這些分離的緣角膜細(xì)胞。平板接種在60mm培養(yǎng)皿27中以十個(gè)可存活細(xì)胞/μ 1的密度進(jìn)行。實(shí)施例2 球集落的分化初始球由懸浮的緣角膜細(xì)胞形成并在培養(yǎng)7天后被轉(zhuǎn)移到涂有50 μ g/ml 聚-L-賴氨酸(Sigma，UK)和10 μ g/ml纖連蛋白(Sigma，UK)的玻璃蓋玻片用于顯微鏡研究。為了促進(jìn)緣角膜細(xì)胞的分化，將1 %胎牛血清加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)被持續(xù)7天。得到的分化的角膜細(xì)胞在0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA (Sigma,UK)中被消化并以2. OX IO5 個(gè)細(xì)胞的密度被重新懸浮在基礎(chǔ)介質(zhì)中。當(dāng)緣間質(zhì)被解聚為單獨(dú)的細(xì)胞并培養(yǎng)9天時(shí)，在此期間存活細(xì)胞球生長(zhǎng)。在5、7、 9天培養(yǎng)的代表性球的照片分別在圖1A、1B和IC中示出。來(lái)自每個(gè)初始球的分化的后代顯示出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖1D)。實(shí)施例3 無(wú)細(xì)胞膠原凝膠的形成如先前描述的(Brownet al.，Adv. Funct. Mater.，2005，15 1762-1770)，通過(guò)用 0. 5mL Imol 氫氧化鈉(Merck，Leicestershire，UK)中和在 ImL 10X濃度 Eagle 最小必需培養(yǎng)基(Gibco,Paisley,UK)中的 4mL 無(wú)菌鼠尾 I 型膠原(First Link Ltd. West Midlands, UK)來(lái)制備無(wú)細(xì)胞膠原凝膠。凝膠被流延成矩形模型(33mmX 13mmX4mm)并在37°C 0. 5% CO2孵育箱中被凝固/穩(wěn)定30分鐘。在凝固和孵育后，利用尼龍網(wǎng)層和紙片(沒(méi)有使用由Brown等人使用的另外的金屬絲網(wǎng))，通過(guò)壓縮和吸收的組合來(lái)壓縮凝膠。為了實(shí)現(xiàn)凝膠的壓縮，尼龍網(wǎng)的層(50μπι篩目大小)被放置在雙層吸收紙上，膠原凝膠被放置在尼龍網(wǎng)上并覆蓋有第二尼龍網(wǎng)，在室溫下加50g重量的負(fù)荷達(dá)5分鐘，導(dǎo)致在雙尼龍網(wǎng)之間保護(hù)的平坦膠原片厚)的形成。實(shí)施例4 載有成纖維細(xì)胞的膠原凝膠的形成將從新鮮角膜組織或成纖維細(xì)胞細(xì)胞系提取的間質(zhì)成纖維細(xì)胞的小粒懸浮在ImL IOX濃度Eagle最小必需培養(yǎng)基(Gibco，Paisley, UK)中的4mL無(wú)菌鼠尾I型膠原(First Link Ltd. West Midlands,UK)中，并用 0. 5mL Imol 氫氧化鈉(Merck,Leicestershire,UK) 中和。包含細(xì)胞的凝膠被流延成矩形模型(33mmX 13mmX4mm)并在37°C 0. 5% CO2孵育箱中被凝固/穩(wěn)定30分鐘。在凝固和孵育以后，利用尼龍網(wǎng)層和濾紙片，通過(guò)壓縮和吸收的組合來(lái)壓縮凝膠。為了實(shí)現(xiàn)凝膠的壓縮，將尼龍網(wǎng)的層(50 μ m篩目大小)放置在雙層吸收紙上，將膠原凝膠放置在尼龍網(wǎng)上并用第二尼龍網(wǎng)覆蓋，在室溫下加50g重量的負(fù)荷達(dá)5分鐘，導(dǎo)致在雙尼龍網(wǎng)之間保護(hù)的平坦膠原片厚)的形成。實(shí)施例5 膠原凝膠的層粘連蛋白涂覆在一些情況中，埋置有角膜細(xì)胞的得到的壓縮的膠原凝膠，隨后被轉(zhuǎn)移到6孔板 (透孔(transwells)，costar)，每個(gè)凝膠用層粘連蛋白溶液(50 μ g/ml，Sigma，UK)涂覆，在 37°C下孵育2小時(shí)，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ沖洗3次，在這個(gè)點(diǎn)膠原支架準(zhǔn)備好用于LEC 擴(kuò)展。實(shí)施例6 角膜細(xì)胞存活試驗(yàn)在補(bǔ)充有10 % FBS (Sigma, UK)、0· 5 % DMSO (Sigma, UK)、lOng/mlEGF (Sigma， UK)、5mg/ml 胰島素(Sigma，UK) UOOIU/ml 青霉素以及 lOOmg/ml 鏈霉素的 DMEM 和 Ham，s F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，利用活/死雙重染色試劑盒(Calbiochem，German)檢查埋置在壓縮的凝膠內(nèi)的角膜細(xì)胞的存活。所述試劑盒利用細(xì)胞-染料，一種細(xì)胞-可透過(guò)的綠色熒光染料以對(duì)活細(xì)胞染色，同時(shí)死細(xì)胞被碘化丙啶(PI)染色，PI是一種非透過(guò)性紅色熒光染料，其僅在導(dǎo)致透化作用的膜損壞時(shí)可以進(jìn)入細(xì)胞。共焦顯微鏡(LEICADMIRE2， 德國(guó))被用于檢測(cè)活與死角膜細(xì)胞的比率。埋置的角膜細(xì)胞被培養(yǎng)7天，其間膠原凝膠直徑?jīng)]有顯著變化。凝膠內(nèi)的細(xì)胞被處理為活/死雙重染色并通過(guò)共焦顯微鏡檢查(圖2A)。通過(guò)聚焦在通過(guò)凝膠的多個(gè)深度， 我們檢測(cè)到細(xì)胞保持存活(圖2B)，沒(méi)有死細(xì)胞被看到(圖2C)，表明在此期間膠原凝膠內(nèi)角膜細(xì)胞的封裝和隨后的壓縮沒(méi)有影響細(xì)胞存活性。實(shí)施例7 角膜、羊膜和膠原凝膠的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)人類角膜和羊膜的透射電子顯微鏡檢查(TEM)顯示膠原纖維直徑、間距和定向方面的結(jié)構(gòu)類似性(圖3A和圖;3B)。羊膜的X-射線衍射顯示43nm的原纖維直徑，46nm的原纖維間距并示出原纖維組織(圖4)。實(shí)施例8 來(lái)自緣細(xì)胞(角膜緣細(xì)胞)的細(xì)胞懸液的制備位于角膜的外緣的緣環(huán)從結(jié)膜、虹膜和中心角膜被切開，維持緣環(huán)結(jié)構(gòu)用于緣上皮細(xì)胞分離。緣環(huán)被切成約Icm長(zhǎng)的幾個(gè)片，其在37°C下在濕潤(rùn)的5%二氧化碳和95%空氣的氣氛中，用包含 DMEM，F(xiàn)M12(1 1)介質(zhì)(Fisher Sci，U. K.)、50 μ g/ml 抗生素、5% FBS、 0. 5%二甲亞砜、2ng/ml人類表皮生長(zhǎng)因子、Syg/ml胰島素、B27補(bǔ)充培養(yǎng)基(Fisher Sci,U. K.)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的0. 02% IA型膠原酶(Sigma-Aldrich)在37°C孵育12小時(shí)。上皮片通過(guò)精細(xì)鉗從酶孵育的緣片被剝下，隨后被轉(zhuǎn)移到包含0. 05%胰蛋白酶/ EDTA的15ml管中用于在37°C下孵育10到15分鐘，最后通過(guò)21規(guī)格針經(jīng)由攪拌被分離為單獨(dú)的細(xì)胞。通過(guò)加入具有FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接著通過(guò)在室溫下幾輪離心IOOOrpm 5分鐘來(lái)去除胰蛋白酶/EDTA。細(xì)胞被重新懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并被接種到膠原凝膠或羊膜上。實(shí)施例9 包含緣干細(xì)胞的外植體的制備緣環(huán)結(jié)構(gòu)被均等地切成8-10個(gè)片，這些片中的每一個(gè)測(cè)量為5mmX 5mm正方形，最后下面的緣間質(zhì)(約為間質(zhì)厚度的三分之二)也被仔細(xì)去除。緣片用無(wú)菌PBS沖洗3次， 接著在青霉素/鏈霉素抗生素溶液(Gibco)中漂洗3分鐘。緣角膜緣片被放置在培養(yǎng)皿上，上皮側(cè)朝上，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基浸沒(méi)。將緣片在濕潤(rùn)的5%二氧化碳和95%空氣的氣氛中， 在37°C下孵育2-3天。一旦在培養(yǎng)皿上緣上皮細(xì)胞可以被看到遷移到緣外植體的邊緣(通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡)，它們被認(rèn)為“健康”并適于進(jìn)一步培養(yǎng)。這樣的緣片從塑料皿被仔細(xì)去除，并通過(guò)覆蓋的6孔板內(nèi)的培養(yǎng)插入物被輕輕地轉(zhuǎn)移到基底(膠原凝膠或羊膜)。實(shí)施例10 緣上皮細(xì)胞在壓縮的膠原凝膠和裸露的羊膜上的擴(kuò)展羊膜(AM)被無(wú)菌PBS緩沖劑沖洗三次，隨后用0. 25%胰蛋白酶在37°C下處理30 分鐘。在孵育后，用刮刀去除膜上的上皮細(xì)胞。無(wú)細(xì)胞AM隨后被轉(zhuǎn)移到6透孔中，基膜表面向上。分離的LSC以IO6個(gè)細(xì)胞/ml被接種到具有埋置的角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠和裸露的AM上。在14天以后，通過(guò)降低培養(yǎng)基水平達(dá)另外的7天，擴(kuò)展的 LEC被暴露于空氣。3周孵育后，具有多層細(xì)胞的角膜上皮膜準(zhǔn)備好用于進(jìn)一步檢查。實(shí)施例11 電子顯微鏡檢查通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)檢查壓縮的膠原凝膠和裸露的AM的表面。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)檢查在壓縮的膠原凝膠上擴(kuò)展的LEC。所有的樣品被固定在2. 5% (ν/ ν)戊二醛中，在PBS中沖洗三次達(dá)10分鐘，并在含水四氧化鋨中后固定2小時(shí)。隨后樣品在通過(guò)分級(jí)的乙醇系列(50^^70^^90%和100% )之前在PBS中被再?zèng)_洗三次。為了 SEM，樣品被轉(zhuǎn)移到六甲基二硅氮烷20分鐘并被允許風(fēng)干。這些樣品隨后被安放在鋁樁 (柱，stubs)上并在利用SEM(FEI Quanta FEG 600,UK)檢查前噴涂金。為了 TEM，脫水的樣品被埋置在環(huán)氧樹脂(瓊脂 100 ；Agar Scientific, Ltd.，Stansted, UK)中。超薄(70nm) 切片在銅載網(wǎng)上被收集并用乙酸鈾酰和磷鎢酸(phosphotungstic acid)染色1小時(shí)， 隨后在利用透射電子顯微鏡(Philips CM20,Holland)檢查前用Reynold(雷諾)檸檬酸鉛染色20分鐘。壓縮的凝膠內(nèi)膠原纖維的SEM分析(圖5A)顯示密集而均勻的，形態(tài)和結(jié)構(gòu)類似裸露的AM (圖5B)。TEM分析顯示LEC —旦在壓縮的凝膠上擴(kuò)展，就產(chǎn)生定義的基膜層，在基細(xì)胞中有半橋粒形成的跡象(圖6A)，類似于由正常角膜上皮顯示的(圖6B)。此外，鄰近細(xì)胞經(jīng)由橋粒結(jié)構(gòu)被粘附(圖6C)，也類似于在正常角膜上皮中看到的(圖6D)。實(shí)施例12 透明度的評(píng)估為了評(píng)估壓縮的膠原凝膠和裸露的AM的透明度，在LEC擴(kuò)展之前和之后，得到的角膜構(gòu)造利用環(huán)鋸被切成3. 5-mm直徑的片并被單獨(dú)地放置入96-孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)。 Bio-Tek儀器(Elx800UV，UK)被用于測(cè)量組織光密度(OD)。
采取光密度G50nm處的0D)測(cè)量以促進(jìn)在壓縮的膠原凝膠和裸露的AM上生長(zhǎng)的 LEC之間的透明度的比較(圖7A)。來(lái)自埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠(0.003士0.001)和裸露的AM(0.003士0.001)的OD值非常低，它們之間沒(méi)有顯著的差別(P >0.05)。從埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠和裸露的AM采集的OD值，每個(gè)在加入擴(kuò)展的LEC后，分別為0. 073 士 0. 003和0. 072 士 0. 003，它們之間沒(méi)有顯著的差別$>0.05)(圖78)。實(shí)施例13 緣細(xì)胞在膠原凝膠或羊膜上的分層核(DAPI)染色顯示利用緣外植體(圖8A)和緣懸浮介質(zhì)(圖8B)在培養(yǎng)10_14天后擴(kuò)展的細(xì)胞之間角膜緣細(xì)胞的分層的程度。培養(yǎng)的緣細(xì)胞的分層在培養(yǎng)10-14后為3-6 層。通過(guò)在脫水(塑性壓縮的)膠原凝膠上生長(zhǎng)的緣細(xì)胞看到分層到類似的水平(圖8C)。實(shí)施例14:免疫化學(xué)將得到的角膜構(gòu)造在壓縮的膠原凝膠和裸露的AM上LEC擴(kuò)展后，通過(guò)免疫熒光顯微鏡檢查。角膜構(gòu)造被埋置在OCT(TissueTek)中，在液氮中被冷凍，隨后被低溫切片。在免疫細(xì)胞化學(xué)前，利用包含0. 4% TritonX-IOO的50mM Tris-緩沖鹽水(TBS ；pH 7. 2)中的5%牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉每個(gè)切片(ΙΟμπι厚)達(dá)60分鐘。隨后，切片用針對(duì)細(xì)胞角蛋白(CK)3(1 50 ;Chemicon，UK)和 CK14(1 100, Chemicon, UK)的一抗在 4°C過(guò)夜孵育，在包含0. 4% Triton X-100的TBS中的BSA中稀釋。FITC-標(biāo)記的二抗 (1 50，Sigma, UK)在室溫下使用1小時(shí)。切片與碘化丙啶(Sigma，UK)共染色并通過(guò)熒光顯微鏡(Carl Zeiss Meditec，德國(guó))觀察。實(shí)施例15 培養(yǎng)的緣細(xì)胞內(nèi)的K14和K3表達(dá)懸浮的緣上皮細(xì)胞顯示在基層細(xì)胞內(nèi)的強(qiáng)K14表達(dá)(未分化細(xì)胞的標(biāo)記物)，其在空運(yùn)之前對(duì)CK3(分化細(xì)胞的標(biāo)記物(圖9A)是陰性的。三到四層厚基細(xì)胞顯示充滿的細(xì)胞空間排列，具有極小的細(xì)胞間隙。細(xì)胞核顯示高核/胞質(zhì)比。上基層細(xì)胞更可能變平，具有清楚的細(xì)胞界限，這些細(xì)胞是CK14陰性的，也是CK3陰性的。相同條件下緣外植體培養(yǎng)的細(xì)胞也顯示出對(duì)CK14(圖9B)的正染色，在外植體培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)CK3也是陰性或非常弱的染色。與懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞不同，CK14陽(yáng)性細(xì)胞被看到穿過(guò)所有的細(xì)胞層(3-4層)和甚至最上的上基層上的一些單獨(dú)的細(xì)胞。這些細(xì)胞全部顯示核/胞質(zhì)的大比率和非常緊密的堆積。CK3，也用作角膜上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，在壓縮的膠原凝膠(圖10A)和裸露的 AM(圖10B)兩者上生長(zhǎng)的LEC的表面細(xì)胞層中強(qiáng)表達(dá)。另外的角膜上皮標(biāo)記物，CK14(推定的祖細(xì)胞標(biāo)記物)，被發(fā)現(xiàn)在壓縮的膠原凝膠(圖10C)和裸露的AM(圖10D)兩者上生長(zhǎng)的LEC的全部細(xì)胞層中表達(dá)。實(shí)施例16 蛋白質(zhì)印跡來(lái)自在具有埋置的角膜細(xì)胞的壓縮的膠原支架和裸露的AM(對(duì)于每個(gè)條件4yg 總蛋白質(zhì)；利用改良的勞里試驗(yàn)評(píng)估)上生長(zhǎng)的LEC的蛋白質(zhì)通過(guò)一維十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，利用10%凝膠被分離。它們被轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，與膜的非特異性結(jié)合通過(guò)用溶解在IX Tris-緩沖鹽水-吐溫(TBS-T) (20mM Tris-堿，0. 14M NaCl，0. 吐溫 -20 ;pH 7.6)中的5% (w/v)牛奶孵育被阻斷。膜用在 2% (w/v)牛奶(溶解在IX TBS-T中)中稀釋的抗-CK3 —抗(1 μ gml-1)和抗-CK14 一抗(1 μ gml-1)在4°C過(guò)夜孵育。在用小鼠-結(jié)合的二抗(1 6000稀釋)在室溫下孵育2小時(shí)之前，印記在IX TBS-T中沖洗45分鐘。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)在X-射線膠片上檢測(cè)蛋白質(zhì)。在兩個(gè)支架(壓縮的膠原和裸露的AM)上培養(yǎng)的LEC中觀察CK3蛋白質(zhì)表達(dá)，與在裸露的AM上培養(yǎng)的LEC相比，CK3在壓縮的膠原基底上培養(yǎng)的LEC中更強(qiáng)地表達(dá)。CK14 蛋白質(zhì)也在兩個(gè)支架上培養(yǎng)的LEC中觀察到，兩個(gè)支架之間的表達(dá)水平?jīng)]有可辨別的差異 (圖 11)。實(shí)施例17 實(shí)時(shí)定量的PCR根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)約，利用TRI試劑(Sigma，Poole, UK)，從具有埋置的角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原支架和裸露的AM兩者上培養(yǎng)的LEC中分離總的RNA?？偟腞NA被分光光度計(jì)測(cè)量(GE醫(yī)療保健，UK)量化，遵循生產(chǎn)商的規(guī)約，利用RevertAid H Minus First Strand cDNA 合成試劑盒(Fermentas, UK)反轉(zhuǎn)錄 Ing RNA。定制的 PerfectProbe 試驗(yàn)(PrimerDesign，UK)被用于量化角蛋白 12(登錄號(hào)XM_00125M61)基因表達(dá)。每個(gè)反應(yīng)用包含10 μ 1 2Χ qPCR Mastermix (Primerdesign, UK), 1 μ 1重組完美探針(reconsitituted perfectprobe)引物 / 探針混合物(Primerdesign, UK) >4 μ 1 PCR-級(jí)水O^rimerdesign，UK)和5 μ 1 cDNA(l 10的初始濃度)的20 μ 1的最終反應(yīng)體積進(jìn)行3 次。非模板對(duì)照也被進(jìn)行。實(shí)時(shí)反應(yīng)在ABI PRISM 7700序列檢測(cè)儀(Applied Biosystem, UK)中的96孔板(Fisher, UK)上進(jìn)行。利用微軟Excel進(jìn)行Mudent t檢驗(yàn)(未配對(duì)的)，以分析OD和實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)。 結(jié)果以3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值與平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差提供，P值< 0. 05被認(rèn)為顯著。CK12(像其對(duì)應(yīng)物CD)為分化的角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。利用持家基因， GAPDH作為對(duì)照，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示在埋置有角膜細(xì)胞的層粘連蛋白涂覆的壓縮的膠原凝膠上擴(kuò)展的LEC中的CK12 mRNA表達(dá)水平(1. 18士0. 09)稍高于在裸露的AM上擴(kuò)展的 LEC(1. 00士0. 07)。該差異發(fā)現(xiàn)是不顯著的(P > 0. 05)(圖12)。實(shí)施例18 膠原凝膠上的緣上皮長(zhǎng)出物無(wú)細(xì)胞膠原凝膠如上所述進(jìn)行制備。在孵育器中凝固30分鐘后，膠原凝膠被充分形成(圖13A)，通過(guò)壓縮和吸收的組合，利用尼龍網(wǎng)的層和紙片，與壓縮的凝膠一起，液體被排出(圖13B)。壓縮的膠原凝膠是密集的，機(jī)械上強(qiáng)的，具有高程度的透明度(圖13C)。膠原凝膠上的緣上皮長(zhǎng)出物角膜上皮細(xì)胞由緣外植體生長(zhǎng)。來(lái)自先前的分離步驟的殘余的完整的緣邊被切成幾片(約2X2mm)，它們的上皮側(cè)向上的兩個(gè)片被直接置于壓縮和未壓縮的膠原凝膠的表面上，在所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。長(zhǎng)出物的面積(區(qū)域)在組織培養(yǎng)板的頂部被標(biāo)記，同時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。長(zhǎng)出物的總面積(區(qū)域)在第3、6、和9天被精確地標(biāo)記，測(cè)量并經(jīng)受定量分析。進(jìn)行Mudent t_檢驗(yàn)(未配對(duì)的)以利用微軟Excel來(lái)比較未壓縮的和壓縮的膠原凝膠上LSC的長(zhǎng)出物。結(jié)果以3個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值與平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)提供， P值<0. 05被認(rèn)為顯著。在3天以后，LEC從置于未壓縮的(圖14A)和壓縮的(圖14B)的膠原凝膠兩者上的外植體長(zhǎng)出，觀察到長(zhǎng)出物內(nèi)的細(xì)胞是小和規(guī)則的。在未壓縮的膠原凝膠(14. 1 士0. 4 ；35. 7 士 1. 2 ；63. 0 士 2. 4 ；117. 5 士 5. Imm2)和壓縮的膠原凝膠(12. 3 士 0. 4 ；41. 4 士 1. 3 ； 57. 1 士3.2 ； 147. 2士4. 8mm2)上，第3、5、7和9天，分別標(biāo)記和測(cè)量長(zhǎng)出物面積(區(qū)域)。上皮長(zhǎng)出物的面積(區(qū)域)的定量分析顯示在兩種凝膠類型上類似的指數(shù)生長(zhǎng)(P > 0. 05) (圖 14C)。膠原凝膠上離體擴(kuò)展LSC懸浮液在無(wú)菌條件下，未壓縮的和壓縮的膠原凝膠被無(wú)菌PBS緩沖劑沖洗三次并隨后安放在透孔插入物(transwell insert) (Corning,UK)的底部。100 μ 1分離的LEC的懸浮液以IO6個(gè)細(xì)胞/ml被接種到每個(gè)凝膠上。細(xì)胞在如所述的培養(yǎng)基中被培養(yǎng)2周，隨后通過(guò)降低培養(yǎng)基水平被暴露于空氣達(dá)7天4。重要的是培養(yǎng)基水平被降低到恰好符合培養(yǎng)物的表面，允許培養(yǎng)基濕潤(rùn)表面，因此組織構(gòu)造在其頂部表面保持濕潤(rùn)。在3周的孵育后，具有多層細(xì)胞的角膜上皮構(gòu)造準(zhǔn)備好用于檢查。電子顯微鏡通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)檢查在LEC擴(kuò)展之前和之后的壓縮和未壓縮的膠原凝膠和在膠原酶消化之后的緣環(huán)。樣品被固定在2. 5% (ν/ν)戊二醛中，在PBS中沖洗三次達(dá)10分鐘，在含水四氧化鋨中后固定2小時(shí)。樣品隨后在通過(guò)分級(jí)的乙醇系列(50%、70%、90%和100% )之前在PBS中被再?zèng)_洗三次。為了 SEM， 樣品被轉(zhuǎn)移到六甲基二硅氮烷20分鐘并被允許風(fēng)干。這些樣品隨后被安放在鋁樁上并在利用SEM(FEI Quanta FEG 600, UK)檢查前噴涂金。為了 TEM，脫水的樣品被埋置在環(huán)氧樹脂(瓊脂 100 ；Agar Scientific，Ltd. , Stansted, UK)中。超薄(70nm)切片在銅載網(wǎng)上被收集并用乙酸鈾酰和磷鎢酸染色1小時(shí)，隨后在利用透射電子顯微鏡(Philips CM20, Holland)檢查前用Reynold檸檬酸鉛染色20分鐘。膠原凝膠上的SEM分析顯示在未壓縮的凝膠內(nèi)膠原纖維非常松散的排列(圖 15A)，而在壓縮的凝膠內(nèi)，膠原纖維顯示密集和均勻的(圖15B)，形態(tài)類似于裸露的角膜基質(zhì)(圖15C)。比較相對(duì)孔大小(膠原纖維之間的間隙)，壓縮的凝膠類似于裸露的間質(zhì)，具有比未壓縮的凝膠更小的且更規(guī)則的孔大小。觀察到LEC在未壓縮和壓縮的膠原凝膠兩者上增殖。未壓縮的凝膠上的細(xì)胞的 SEM圖像顯示細(xì)胞被不均勻分布且細(xì)胞的形狀不規(guī)則(圖16A)，而壓縮的凝膠上的細(xì)胞的圖像表明細(xì)胞更均勻的分布且在形狀和大小方面均勻(圖16B)，與正常牛角膜上的上皮顯示的相同(圖16C)。不同支架上的LEC的結(jié)構(gòu)的透射電子顯微鏡檢杳在未壓縮的膠原凝膠內(nèi)的膠原纖維松散，直徑多樣(圖17A)，而在壓縮的凝膠內(nèi)的纖維更密集，直徑較少變化且更有序(圖17B)。在壓縮的凝膠內(nèi)的膠原纖維比來(lái)自未壓縮的支架的那些更接近地類似于來(lái)自牛角膜的正常間質(zhì)纖維(圖17C)。TEM分析顯示接種到未壓縮的膠原凝膠上的LEC既沒(méi)有形成細(xì)胞基質(zhì)粘附，也沒(méi)有形成實(shí)質(zhì)的基膜層(圖 17D)。然而，在壓縮的凝膠上擴(kuò)展的LEC產(chǎn)生定義的基膜層和在基細(xì)胞中半橋粒形成的證據(jù)(圖17E)，類似于由正常角膜上皮顯示的那樣(圖17F)。多細(xì)胞層形成在未壓縮的膠原凝膠上，但是在這些細(xì)胞之間存在大的間隙，表明不良的細(xì)胞-細(xì)胞粘附(圖17G)。在壓縮的凝膠上，鄰近細(xì)胞經(jīng)由橋粒結(jié)構(gòu)粘附(圖17H)，再次類似于正常角膜上皮顯示的那樣(圖171)。免疫組織化學(xué)在膠原凝膠上的LEC擴(kuò)展后，得到的角膜構(gòu)造，通過(guò)免疫熒光被檢查。低溫切片 (ΙΟμπι厚)被包含 0. 4% Triton X-100 的 50mM Tris-緩沖鹽水(TBS ；pH 7. 2)中的 5% 牛血清白蛋白(BSA)在室溫處理60分鐘。隨后切片用在包含0. 4% Triton X-100的TBS 中的BSA中稀釋的針對(duì)細(xì)胞角蛋白(CK)3(1 50 ;Chemicon，UK)和CK14(1 100， Chemicon, UK)的一抗在4°C過(guò)夜孵育。使用FITC-標(biāo)記的二抗(Sigma，UK)。切片與碘化丙啶(Sigma，UK)共染色并通過(guò)熒光顯微鏡(Carl Zeiss Meditec，德國(guó))觀察。LEC成功地在兩種形式的膠原支架上被擴(kuò)展和分層，但是被看到在壓縮的凝膠 (圖18B)上形成比在未壓縮的凝膠(圖18A)上的更多的細(xì)胞層，使得壓縮的組更類似于正常角膜上皮(圖18C)。碘化丙啶(紅色)染色的組織切片清楚地顯示在未壓縮的組內(nèi)的核間距離遠(yuǎn)大于壓縮的組。在未壓縮的、壓縮的和正常牛間質(zhì)上的每mm2細(xì)胞密度分別為 0.41,0. 72,0. Sl0 CK3(綠色)，通常用作分化的角膜上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，在未壓縮的 (圖18A)和壓縮的膠原凝膠(圖18B)上擴(kuò)展的表面上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，類似于正常角膜上皮(圖18C)。實(shí)施例19:毒性試驗(yàn)利用充分表征的眼表面毒素和作用于上皮屏障功能、細(xì)胞存活性和形態(tài)的新型納米顆粒評(píng)估人造眼上皮細(xì)胞精確測(cè)量眼毒性的能力。選自ECETOC數(shù)據(jù)庫(kù)的試驗(yàn)化學(xué)品(所述數(shù)據(jù)庫(kù)排列化學(xué)品的眼刺激可能性 (ECETOC, Eye Irritation ECETOC Technical Report. 1998, Reference Chemicals Data Bank, ECETOC, Brussels, Belgium, p. 236))，被選擇以代表一定范圍的眼刺激(即，無(wú)、溫和、中等、嚴(yán)重)。液體樣品濃度使用去離子水用于按照歷史上體內(nèi)Draize試驗(yàn)記錄稀釋， 0. 3% TritonX-100用作陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)物質(zhì)被直接施加于上皮培養(yǎng)物(100 μ 1液體/懸浮液或IOOmg固體/粉末)的表面上，達(dá)到不同的暴露時(shí)間(10、20、30和60分鐘)。納米顆粒毒性通過(guò)0. 1、0. 5和InM濃度的10-20nm大小金納米顆粒逐滴施加到角膜等同物的表面達(dá) M、48和72小時(shí)來(lái)評(píng)估。聚乙二醇化金納米顆粒和已經(jīng)被共軛到感溫(thermoresponsive) 嵌段共聚物、聚(N-異丙基丙烯酰胺)的金納米顆粒(在每個(gè)金納米顆粒周圍形成角膜) 也被評(píng)估細(xì)胞和組織毒性。誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(細(xì)胞增殖的改變)通過(guò)常規(guī)使用的比色 MTT(344，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑溴化物)試驗(yàn)(Mosmann，T.J Immunol Methods, 1983. 65(1-2) :p. 55-63)被量化，計(jì)算存活性百分比。毒性的定性測(cè)量通過(guò)評(píng)估細(xì)胞表面破壞的頻率和程度和通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)的細(xì)胞微皺襞(microplicae)和微絨毛的外觀實(shí)現(xiàn)。先前開發(fā)的數(shù)字分級(jí)系統(tǒng)被用于輔助角膜上皮細(xì)胞的相對(duì)損壞的分類 (Burstein,N. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.，1980. 19(3) :ρ· 308-313)。毒性的其他測(cè)量包括錐蟲藍(lán)(Trypan Blue)排除細(xì)胞存活性試驗(yàn)和針對(duì)應(yīng)激、毒性和DNA損傷相關(guān)的基因的 PCR陣列。X-射線微量分析(EDAX)也被包括用于納米金顆粒定位和確認(rèn)。模型的預(yù)測(cè)力通過(guò)研究體外基于干細(xì)胞的試驗(yàn)的存活性與體內(nèi)Modified Maximum Average Scores (修改的最大平均得分)(MMAS)的關(guān)系來(lái)評(píng)估，MMAS是一種得分系統(tǒng)，其量化對(duì)角膜的作用，如ECETOC數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的。除了 ECETOC報(bào)道，另外的(因特網(wǎng))體內(nèi)數(shù)據(jù)的源(Toxnet, (http://toxnet.nlm.nih. gov)毒理學(xué)、有害化學(xué)品和相關(guān)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫(kù)的集合)和在其他可替換實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蝎@得的結(jié)果(例如，牛角膜渾濁和通透性試驗(yàn)；Slug粘膜刺激試驗(yàn)；商業(yè)上皮模型)，被包括在角膜干細(xì)胞模型的最終有效性評(píng)估中。上面的實(shí)施例中所用的羊膜經(jīng)由Queen Mary's Hospital (UK)和University of Nottingham⑴K)從匿名女性捐贈(zèng)者獲得。許可從Nottingham University獲得。人類角膜經(jīng)由Royal Berkshire Hospital (UK)從匿名人類捐贈(zèng)者獲得。Regional Ethical Committee批準(zhǔn)被給予用于角膜細(xì)胞的使用。實(shí)施例20 壓縮的膠原凝膠的核黃素/UV交聯(lián)為了提高壓縮的膠原凝膠的機(jī)械性能，這些凝膠中的膠原纖維利用核黃素和UV 被交聯(lián)° 基本方法在 Wollensak G. et al. (American Journal of Ophthalmology, Volume 135，Issue 5，May 2003，pages 620-627)中描述。基本上，壓縮的膠原凝膠在室溫下，在 0. 核黃素溶液(在IOmL葡聚糖20%溶液中IOmg核黃素)中被孵育30分鐘。在膠原凝膠和365nm處的UVA燈之間的5cm距離處進(jìn)行照射30分鐘。隨后凝膠在PBS中被沖洗以去除任何不用的核黃素。在下面給出對(duì)8個(gè)壓縮的凝膠的數(shù)據(jù)。另外的信息在圖19-21中給出。
權(quán)利要求
1.一種人造眼組織，包含人造眼上皮和塑性-壓縮的膠原凝膠基底，通過(guò)包括在塑性-壓縮的膠原凝膠基底上培養(yǎng)角膜干細(xì)胞或包含角膜干細(xì)胞的組合物的方法而獲得或可獲得，其中，所述細(xì)胞或所述組合物在這樣的條件下培養(yǎng)以便提供在所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底上產(chǎn)生人造眼上皮的角膜上皮細(xì)胞群。
2.一種用于生產(chǎn)人造眼上皮的方法，包括在塑性-壓縮的膠原凝膠基底上培養(yǎng)角膜干細(xì)胞或包含角膜干細(xì)胞的組合物，其中，所述細(xì)胞或所述組合物在這樣的條件下培養(yǎng)以便提供在基底上產(chǎn)生人造眼上皮的角膜上皮細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，隨后將所述人造眼上皮與所述基底分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，隨后將所述人造眼上皮儲(chǔ)存在適于人類組織的儲(chǔ)存和保存的介質(zhì)中，其中，將所述眼上皮在具有或沒(méi)有所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底的情況下儲(chǔ)存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述角膜干細(xì)胞為角膜緣上皮干細(xì)胞，優(yōu)選為人類角膜緣上皮干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底通過(guò)提供在隙間液體中包含膠原原纖維的基質(zhì)的膠原凝膠并隨后通過(guò)下述對(duì)所述凝膠進(jìn)行塑性-壓縮(i)將壓縮力施加到所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣；( )將脫水力施加到所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣；(iii)在一個(gè)或兩個(gè)平面中拉伸所述凝膠；或(iv)(i)-(iii)中的一個(gè)或多個(gè)的組合，以及可選地使所述壓縮的凝膠經(jīng)受下述中的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)循環(huán)的方法來(lái)產(chǎn)生(a)沿著所述凝膠的軸施加單軸負(fù)荷，以及(b)去除所述負(fù)荷。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，將(i)-(iv)中的一個(gè)或多個(gè)與將隙間-液體吸收物質(zhì)施加到所述凝膠中的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣進(jìn)行組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底為 l-60mm 長(zhǎng)，優(yōu)選 20_40mm 長(zhǎng)，和 / 或 0. 5-60mm 寬，優(yōu)選 20-40mm 寬。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底為 10-1000 μ m 厚，優(yōu)選 20-100 μ m 厚。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底中的所述膠原原纖維的直徑為lO-lOOnm，和/或所述原纖維的間距為l-200nm。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底的膠原含量為3-4%。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述壓縮的膠原凝膠的至少一個(gè)表面用層粘連蛋白或一個(gè)或多個(gè)層粘連蛋白域涂覆，并且所述角膜干細(xì)胞或組合物在所述層粘連蛋白/層粘連蛋白域表面上培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求2至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述壓縮的膠原凝膠包含捕獲在所述凝膠內(nèi)的間質(zhì)祖細(xì)胞，優(yōu)選角膜成纖維細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求2至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使所述壓縮的膠原凝膠中的所述膠原已進(jìn)行交聯(lián)，優(yōu)選利用核黃素和暴露于UV進(jìn)行交聯(lián)。
15.根據(jù)權(quán)利要求2至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述塑性-壓縮的膠原凝膠壓縮到防止所述角膜干細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)到所述凝膠中的程度。
16.根據(jù)權(quán)利要求2至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠為柔性和非剛性的。
17.根據(jù)權(quán)利要求2或4至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，隨后將所述人造眼上皮保留在所述基底上，由此形成人造眼組織。
18.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求2至16中任一項(xiàng)所述的方法獲得或可獲得的人造眼上皮。
19.一種人造眼上皮，包含表達(dá)CK3分化標(biāo)記物和CK14未分化標(biāo)記物兩者的3-7個(gè)細(xì)胞層的連續(xù)復(fù)層上皮，其中基膜成分位于基細(xì)胞內(nèi)和基細(xì)胞下，所述人造眼上皮優(yōu)選通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求2至16中任一項(xiàng)所述的方法獲得或可獲得。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的人造眼上皮，其中，半橋粒存在于一些或所有基細(xì)胞中和/或一些或所有鄰近上皮細(xì)胞經(jīng)由橋粒結(jié)構(gòu)相互連接。
21.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法獲得或可獲得的人造眼組織。
22.一種人造眼組織，包含(i)根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮；以及( )根據(jù)權(quán)利要求2至16中任一項(xiàng)所定義的塑性-壓縮的膠原凝膠基底。
23.一種評(píng)估試驗(yàn)化合物對(duì)人造眼上皮或人造眼組織的作用的方法，包含以下步驟(a)提供根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的人造眼組織；(b)將所述人造眼上皮或人造眼組織與一定量的所述試驗(yàn)化合物接觸；以及(c)評(píng)估所述化合物對(duì)所述人造眼上皮或人造眼組織的作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求 22所述的人造眼組織在提供試驗(yàn)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物角膜的毒性的指征中的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求 22所述的人造眼組織作為人造角膜的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求 22所述的人造眼組織作為用于將細(xì)胞遞送到需要其的組織的試劑的應(yīng)用。
27.一種處理眼外傷的方法，包括(a)提供根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的人造眼組織；(b)將所述眼外傷與所述人造眼上皮或人造眼組織接觸；以及可選地(c)將所述人造眼上皮或人造眼組織固定在所述眼外傷的部位。
28.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求 22所述的人造眼組織，用于治療方法中，優(yōu)選用于處理眼外傷的方法中。
29.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的人造眼組織在制造用于治療方法，優(yōu)選用于處理眼外傷的方法的組合物中的應(yīng)用。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求28所述的人造眼上皮或組織或根據(jù)權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中，所述眼外傷為涉及不足的間質(zhì)微環(huán)境以支持干細(xì)胞功能的眼外傷，如無(wú)虹膜、角膜炎、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病變和慢性Iimbitis ；或者涉及破壞緣干細(xì)胞的外在因素的眼外傷，如化學(xué)或熱傷、史蒂文斯-約翰遜綜合征、眼瘢痕類天皰瘡、接觸鏡佩戴并發(fā)癥、或廣泛的微生物感染。
31.一種替換哺乳動(dòng)物受試者中的角膜的方法，包括(a)提供根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的人造眼組織；(b)用所述人造眼上皮或組織替換所述哺乳動(dòng)物受試者的角膜。
32.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的人造眼組織，用于手術(shù)方法中，優(yōu)選其中哺乳動(dòng)物受試者的所述角膜被所述人造眼上皮或組織替換。
33.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的人造眼上皮或根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求 22所述的人造眼組織在制造用于手術(shù)方法的組合物中的應(yīng)用，優(yōu)選其中哺乳動(dòng)物受試者的所述角膜被所述人造眼上皮或組織替換。
34.塑性-壓縮的膠原凝膠作為用于角膜細(xì)胞生長(zhǎng)的基底的應(yīng)用。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底通過(guò)提供在隙間液體中包含膠原原纖維的基質(zhì)的膠原凝膠并隨后通過(guò)下述對(duì)所述凝膠進(jìn)行塑性-壓縮(i)將壓縮力施加到所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣；( )將脫水力施加到所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣；(iii)在一個(gè)或兩個(gè)平面中拉伸所述凝膠；或(iv)(i)-(iii)中的一個(gè)或多個(gè)的組合，以及可選地使所述壓縮的凝膠經(jīng)受下述中的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)循環(huán)的方法來(lái)產(chǎn)生(a)沿著所述凝膠的軸施加單軸負(fù)荷，以及(b)去除所述負(fù)荷。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其中，將(i)-(iv)中的一個(gè)或多個(gè)與將隙間-液體吸收物質(zhì)施加到所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)表面或邊緣進(jìn)行組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底為l-60mm長(zhǎng)，優(yōu)選20-40mm長(zhǎng)，和/或0. 5-60mm寬，優(yōu)選20-40mm寬。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底為 10-1000 μ m 厚，優(yōu)選 20-100 μ m 厚。
39.根據(jù)權(quán)利要求34至38中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底中的所述膠原原纖維的直徑為lO-lOOnm，和/或所述原纖維的間距為l-200nm。
40.根據(jù)權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述塑性-壓縮的膠原凝膠基底的膠原含量為3-4%。
41.根據(jù)權(quán)利要求34至40中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述膠原凝膠的至少一個(gè)表面用層粘連蛋白涂覆。
42.根據(jù)權(quán)利要求34至41中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述膠原凝膠是交聯(lián)的，優(yōu)選利用核黃素/UV交聯(lián)。
43.一種塑性-壓縮的膠原凝膠，其中，所述膠原纖維通過(guò)用核黃素處理，優(yōu)選利用UV光而已被交聯(lián)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的塑性-壓縮的膠原凝膠，其中，所述凝膠是根據(jù)權(quán)利要求2 至14中任一項(xiàng)所定義的。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的塑性-壓縮的膠原凝膠作為用于生長(zhǎng)人造眼上皮的基底的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及塑性-壓縮的膠原凝膠作為用于角膜細(xì)胞，尤其是角膜緣上皮干細(xì)胞的生長(zhǎng)的基底的應(yīng)用。在這樣的基底上生長(zhǎng)的細(xì)胞可以被培養(yǎng)以產(chǎn)生可以在眼毒性試驗(yàn)中使用或用于移植的人造眼上皮細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/079GK102449142SQ201080022192
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者切·康諾恩 申請(qǐng)人:雷丁大學(xué)