專利名稱：適合將免疫原性分子遞送到細(xì)胞中的突變CyaA多肽及多肽衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合用于將一種或更多種分子遞送到細(xì)胞中的多肽。具體而言，本發(fā)明涉及適合用于將一種或更多種能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的分子，特別是通過表達(dá)⑶lib/⑶18受體的靶向細(xì)胞(在本文也稱為“⑶lib表達(dá)細(xì)胞”)遞送到宿主中的多肽。本發(fā)明更具體而言涉及得自腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)(CyaA)的多肽，腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)以毒素或解毒蛋白質(zhì)或類毒素形式使用，所述多肽為突變多肽。所述突變多肽能夠保留天然CyaA與靶細(xì)胞的結(jié)合活性，且優(yōu)選還能夠保留天然CyaA經(jīng)過其N-端結(jié)構(gòu)域進(jìn)入靶細(xì)胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，該成孔活性與天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或抑制的。本發(fā)明特別涉及所述多肽作為蛋白質(zhì)載體的應(yīng)用。因此，所述突變多肽進(jìn)一步與非-CyaA分子結(jié)合，從而產(chǎn)生多肽衍生物，其中所述分子當(dāng)施用給宿主時具有預(yù)防性疫苗和/或治療益處。本發(fā)明的多肽適合用作蛋白質(zhì)載體，用于將分子，尤其是具有含一個或更多個表位特別是抗原的氨基酸序列的多肽分子遞送到細(xì)胞中，特別是CDllb表達(dá)細(xì)胞中。本發(fā)明因此還涉及多肽衍生物(本發(fā)明的突變多肽的衍生物)，其包含本發(fā)明的突變多肽或由本發(fā)明的突變多肽組成，其中所述突變多肽與一個或更多個分子，尤其是一個或更多個適合引發(fā)免疫應(yīng)答的分子重組，從而構(gòu)成重組多肽或融合多肽。本發(fā)明還涉及通過使所述分子與突變多肽化學(xué)接枝而獲得的多肽衍生物。根據(jù)一個實(shí)施方式，本發(fā)明的多肽衍生物適合用在預(yù)防療法中，并且特別適合疫苗接種以及包括免疫療法的治療中，特別是用于在受試對象中引發(fā)免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的上下文中使用的用于設(shè)計(jì)本發(fā)明多肽的天然CyaA是主要在博德特氏菌屬(Bordetella)生物中，特別是在百日咳博德特氏菌(Bordetella Pertussis)中產(chǎn)生的腺苷酸環(huán)化酶，其具有下述特征和性質(zhì)，其公開的目的是在本發(fā)明的上下文中表征所述蛋白質(zhì)。雙功能RTX腺苷酸環(huán)化酶毒素-溶血素(于此也稱為腺苷酸環(huán)化酶毒素(CyaA、 ACT或AC-Hly)是百日咳博德特氏菌的關(guān)鍵致病因子，其是百日咳(1)的病原體。其1706 個殘基長度的多肽是N-端腺苷酸環(huán)化酶(AC)酶結(jié)構(gòu)域或部分( 400個殘基)與構(gòu)成 C-端部分或結(jié)構(gòu)域O)的 1306個殘基的成孔RTX溶血素(在IoXin溶細(xì)胞素中重復(fù)) 的融合體。后者通過共價翻譯后棕櫚?；疞ys86tl和Lys983的ε _氨基而包含將proCyaA活化為CyaA的位點(diǎn)，以及包含形成 40個鈣結(jié)合部位的眾多RTX重復(fù)，其裝載(loading)是 CyaA(3,4)的細(xì)胞毒素活性所需的。CyaA蛋白質(zhì)實(shí)際上作為無活性原毒素而被合成，其通過翻譯后棕櫚?；瘍蓚€內(nèi)部賴氨酸殘基(賴氨酸860和98 而被轉(zhuǎn)化為活性毒素。這種翻譯后修飾要求與cyaA基因表達(dá)附加基因，即位于百日咳博德特氏菌染色體上的cyaA附近的cyaCo
毒素主要靶向表達(dá)α 32整聯(lián)蛋白受體的宿主骨髓吞噬細(xì)胞，αΜβ2整聯(lián)蛋白受體也稱為⑶lib/⑶18、CR3或Mac-I (5)。所述毒素具體是通過存在于其C-端部分的受體結(jié)合部位而與表達(dá)⑶lib/⑶18受體的細(xì)胞的⑶lib/⑶18受體結(jié)合。這些細(xì)胞因此是天然毒素的靶細(xì)胞，且還是本發(fā)明多肽的靶細(xì)胞。CyaA插入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中并將AC酶結(jié)構(gòu)域易位到所述靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中(6，7)。在細(xì)胞內(nèi)，AC被鈣調(diào)節(jié)蛋白激活并催化不受控制的細(xì)胞ATP向cAMP的轉(zhuǎn)化，cAMP是激發(fā)削弱吞噬細(xì)胞殺菌功能的關(guān)鍵第二信使分子(1)。 在高劑量下(> lOOng/ml)，CyaA-催化的ATP消耗成cAMP變成細(xì)胞毒性的，并且促進(jìn)凋亡甚或迅速的壞死性死亡以及⑶Ilb+單核細(xì)胞的溶解(8，9)。最近，發(fā)明人顯示，CyaA結(jié)合其⑶lib/⑶18受體的N聯(lián)寡糖(10)。這表明與普遍存在的細(xì)胞表面蛋白的葡聚糖或糖脂的低特異性相互作用可解釋雖然降低了大約2個數(shù)量級，但是能夠容易檢測到CyaA也穿透缺乏⑶lib/⑶18的細(xì)胞。的確，由于AC結(jié)構(gòu)域具有極其高的特異性催化活性，發(fā)現(xiàn)CyaA也顯著升高哺乳動物和鳥類紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤CHO或氣管上皮細(xì)胞中的cAMP(l，11)。最近現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提出提供也稱為類毒素的解毒毒素，其中腺苷酸環(huán)化酶的活性減小，特別是基本被抑制。此類CyaA/AC—類毒素可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽的制備。除提高cAMP之外，所述毒素還在哺乳動物和鳥類紅細(xì)胞上顯示出中等溶血活性。 這是由于形成估計(jì)直徑為0. 6至0. Snm的小陽離子選擇性孔的能力，這些孔使細(xì)胞膜透化并最終引發(fā)膠體-滲透細(xì)胞溶解(1 。最近，發(fā)明人及其他人已經(jīng)表明，CyaA的成孔活性與其細(xì)胞入侵AC酶活性協(xié)同作用并有助于⑶Ilb+細(xì)胞上的CyaA總?cè)芗?xì)胞效力(13，14)。由于完整的成孔(溶血)能力，在諸如血清的滲透保護(hù)劑不存在時，無酶促活性的CyaA/AC—類毒素(1 在紅細(xì)胞上仍顯示完整的溶血活性，并且在⑶lib-表達(dá)單核細(xì)胞上顯示殘留的降低約10倍的溶細(xì)胞活性(8)，這對其在治療中的應(yīng)用設(shè)定了限制。早期，發(fā)現(xiàn)CyaA的溶血(成孔)和AC膜易位(細(xì)胞入侵)活性由于低鈣濃度、低溫(16)以及由于CyaA?；某潭群托再|(zhì)(4，12，17)而易分離。此外，兩種活性在對疏水結(jié)構(gòu)域內(nèi)的位置509、516、570和581處的谷氨酸的電荷逆轉(zhuǎn)或中性置換的靈敏度上有很大差異(8，13，18)。CyaA的細(xì)胞入侵和成孔活性因此被認(rèn)為是相互獨(dú)立的而且在靶細(xì)胞膜中平行操作。圖5A圖解的模型表明，兩種不同的CyaA構(gòu)象體平行插入靶細(xì)胞膜中，一個是易位前體，負(fù)責(zé)將AC結(jié)構(gòu)域經(jīng)過具有伴隨鈣離子流入的細(xì)胞膜遞送到細(xì)胞中，另一個是最終形成低聚物孔的孔前體(13，18，19)。發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)測試了這種模型并對其進(jìn)行修整，顯示成孔活性不參與AC結(jié)構(gòu)域經(jīng)過靶細(xì)胞的易位。在本發(fā)明中，發(fā)明人最初設(shè)計(jì)了 CyaA突變多肽，特別是基于百日咳博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶，其處于毒素或類毒素形式，具有在成孔(E570Q)和具?；?K860R)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的置換組合，并且發(fā)明人表明，這些特異性置換組合選擇性破壞CyaA的細(xì)胞透化活性，因此消除了殘留的CyaA/AC-類毒素對CDllb+細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。同時，E570Q+K860R構(gòu)建物保留了將AC結(jié)構(gòu)域易位到細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中以提高細(xì)胞cAMP的完整能力，并且其類毒素完全能夠?qū)⑺鰳?gòu)建物內(nèi)插入的含表位分子遞送至樹突狀細(xì)胞的胞漿途徑，用于體內(nèi)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的MHC類別I-限制呈遞和誘導(dǎo)。由發(fā)明人設(shè)計(jì)的CyaA/2330VA/E570Q+K860R突變體(如在實(shí)施例中所述，OVA抗原肽被插入其中)，是例證CyaA突變體能力的第一構(gòu)建物，即提供顯著降低的透化細(xì)胞的能力，同時保留了越過細(xì)胞膜易位AC結(jié)構(gòu)域的完整能力。發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)設(shè)計(jì)出具體構(gòu)建物，其特別以CyaA/E570Q+K860R/AC_類毒素為例，并且已經(jīng)顯示盡管其細(xì)胞透化(溶細(xì)胞)活性降低很多，但是其保留了將抗原遞送到 ⑶Ilb+APCs中的完整活性。發(fā)明人還表明，說明性CyaA/E570Q+K860R/AC_類毒素的總?cè)芗?xì)胞活性非常低。因此，其在動物或人類宿主中沒有殘留毒性，并且因此非常適合用于治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明因此提供新型多肽，其為類毒素且具有增強(qiáng)的安全特性(profile)，可用作蛋白質(zhì)載體，用于將目標(biāo)分子，特別是免疫原性肽序列遞送到需要治療的患者的細(xì)胞，更具體而言，表達(dá)⑶lib的細(xì)胞中?；谟砂l(fā)明人實(shí)施的實(shí)驗(yàn)，因此能夠定義并提供一種多肽，其為腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)的突變體(突變多肽)，并且其氨基酸序列包含下述序列之一或由下述序列之一組成a)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)或欣氏博德特氏菌(Bordetella hinzii)的腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)的氨基酸序列，其中已經(jīng)進(jìn)行下述突變(i) 570位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基(E570Q)或被保守氨基酸殘基置換，和(ii)860位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基(K860I )或被保守氨基酸殘基置換，或；b)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶片段的氨基酸序列，該片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述片段還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的570位和860位的下述突變氨基酸殘基E570Q和K860R，或c)氨基酸序列，由于一個或更多個氨基酸殘基置換和/或插入，其不同于如在a) 或b)中定義的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述氨基酸序列還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的570位和860 位的下述突變氨基酸殘基E570Q和K860R，或d)支氣管敗血性博德特氏菌(支氣管敗血性博德特氏菌)的腺苷酸環(huán)化酶 (CyaA)的氨基酸序列，其中已經(jīng)進(jìn)行下述突變(i) 569位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基(E569Q)或被保守氨基酸殘基置換，和(ii)859位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基(K859R)或被保守氨基酸殘基置換，或；e)支氣管敗血性博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶片段的氨基酸序列，該片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述片段還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的569位和859位的下述突變氨基酸殘基E569Q和K859R，或f)氨基酸序列，由于一個或更多個氨基酸殘基置換和/或插入，其不同于如在d) 或e)中定義的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述氨基酸序列還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的569位和859 位的下述突變氨基酸殘基E569Q和K859R。為了本發(fā)明的目的，所描述的片段的N-端結(jié)構(gòu)域是下述片段的氨基酸序列，所述片段包括天然CyaA蛋白質(zhì)N-端部分的連續(xù)氨基酸殘基，例如，所述片段的N-端部分是形成百日咳博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)的N-端結(jié)構(gòu)域的400個氨基酸殘基序列的連續(xù)殘基的全部或一部分。本文中，“E570Q”包括百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的天然CyaA的570位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或被另一保守殘基的置換，具體而言是這樣的殘基，其側(cè)鏈尺寸和親水性接近谷氨酸的側(cè)鏈尺寸和親水性。570位的谷氨酸殘基優(yōu)選被選自 Gin、Asn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys, Val、Leu、Cys, lie、Asp 的氨基酸殘基置換。本文中，“K860R”包括百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的天然CyaA的860位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基或被另一保守殘基的置換，具體而言是這樣的殘基，其側(cè)鏈尺寸和親水性接近賴氨酸的側(cè)鏈尺寸和親水性。860位的賴氨酸殘基優(yōu)選被選自 Arg、Asn、Gin、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys, lie 的氨基酸殘基置換。本文中，“E569Q”包括支氣管敗血性博德特氏菌的天然CyaA的569位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或被另一保守殘基的置換，具體而言是這樣的殘基，其側(cè)鏈尺寸和親水性接近谷氨酸的側(cè)鏈尺寸和親水性。569位的谷氨酸殘基優(yōu)選被選自Gin、Asn、Met、Thr, Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、lie、Asp 的氨基酸殘基置換。本文中，“K859R”包括支氣管敗血性博德特氏菌的天然CyaA的的859位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基或被另一保守殘基的置換，具體而言是這樣的殘基，其側(cè)鏈尺寸和親水性接近賴氨酸的側(cè)鏈尺寸和親水性。859位的賴氨酸殘基優(yōu)選被選自Arg、Asn、Gin、Met、 Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys, lie 的氨基酸殘基置換。在下文所述的實(shí)施方式中，攜帶“E570Q”和“K860R”置換的突變百日咳博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段可被攜帶等價“E570Q”和“K860R”置換的突變副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段取代，或者被攜帶等價“E569Q”和 “K859R”置換的突變支氣管敗血性博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段取代。百日咳博德特氏菌的天然CyaA 已經(jīng)被 Glaser，P. et al，1988，19_30Molecular Microbiology 2(1)以氨基酸序列和核苷酸序列進(jìn)行了描述。該序列被稱為SEQ ID N0 1， 如圖6所示。因此，當(dāng)在本發(fā)明中引用百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或序列或核苷酸或核苷酸序列時，其位置相對于在Glaser等1988的所述出版物中公開的序列來確定。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的氨基序列是如SEQ ID N0 1公開的序列。當(dāng)在本文提到SEQ ID N0 1或SEQ ID N0 2時，要特別指出的是，除非技術(shù)上不相關(guān)，所公開的特征將類似地應(yīng)用于通過在SEQ ID N0 1或SEQ ID N0 2中插入殘基以便使CyaA蛋白質(zhì)解毒而修飾的序列。在這種情況下，氨基酸殘基的編號應(yīng)該進(jìn)行修改(特別是在天然序列的位置570和860是受關(guān)注的情況下)。有利地，CyaA蛋白質(zhì)或其片段是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，其是cyaA和cyaC基因在細(xì)胞中，特別是重組細(xì)胞中共表達(dá)的結(jié)果。的確已經(jīng)顯示，為對靶細(xì)胞具有侵入性質(zhì)，CyaA 必須經(jīng)歷翻譯后修飾，這通過cyaA和cyaC基因二者的表達(dá)來得以實(shí)現(xiàn)(W0 93/21324) 0
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，CyaA蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，CyaA 蛋白質(zhì)得自博德特氏菌屬種。在受關(guān)注的博德特氏菌屬種中，根據(jù)本發(fā)明，其中之一為百日咳博德特氏菌。其他受關(guān)注的博德特氏菌屬菌株是副百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或支氣管敗血性博德特氏菌的那些菌株。副百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)的序列已經(jīng)具體以登記號NC 0(^擬8.3(為 1了40 個氨基酸的序列)并在 Parkhill J.等(Nat. Genet. DOI，KK2OO3))中公開，欣氏博德特氏菌在Donato G. M.等(J. Bacteriol. 2005 Nov, 187(22) :7579-88)中公開，以及支氣管敗血性博德特氏菌在Betsou F.等(Gene 1995,August 30 ；162(1) :165-6) 中公開。副百日咳博德特氏菌的序列已經(jīng)具體以登記號CAB76450公開，本文中稱為SEQ ID N0 7，如在圖14中所示。欣氏博德特氏菌的序列已經(jīng)具體以登記號AAY57201公開，本文中稱為SEQ ID N0 8，如在圖15中所示。支氣管敗血性博德特氏菌的序列已經(jīng)具體以登記號CAA8M81公開，本文中稱為SEQ ID N。9，如在圖16中所示。因此，當(dāng)在本發(fā)明中引用副百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或支氣管敗血性博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或序列時，其位置分別相對于在SEQ ID N0 7、8和9中所公開的序列來確定。表述“腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)的多肽突變體”不包括由博德特氏菌屬所表達(dá)的天然腺苷酸環(huán)化酶。如上所述，其特征在于與天然蛋白質(zhì)的主要不同在于兩個特定氨基酸殘基的結(jié)合置換。其可以相對于所述天然蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步修飾，并且其特別可以是如此突變的蛋白質(zhì)的片段，例如，諸如所述突變蛋白質(zhì)的截短變體，其中在任一或兩個末端的殘基被缺失。具體而言，在C-末端的殘基可以被缺失直至缺失程度使之不會影響CDllb/CD18細(xì)胞受體的識別和結(jié)合部位?？蛇x地或另外地，可以在N-末端缺失殘基，條件是其不會影響所得突變多肽的易位能力。其也可以是內(nèi)部缺失天然突變CyaA蛋白質(zhì)的一個或更多個殘基而獲得的片段。在本發(fā)明涉及為本文所述片段的多肽突變體的情況下，必然包含突變殘基E570Q 和K860R(當(dāng)提到百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)的氨基序列時)的所述片段還保留突變的全長CyaA與細(xì)胞結(jié)合以及使其N-端結(jié)構(gòu)域易位到靶細(xì)胞，特別是⑶1 Ib/⑶18表達(dá)細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的能力。本發(fā)明因此提供突變多肽，其適合用于設(shè)計(jì)將一種或更多種分子遞送到細(xì)胞，特別是表達(dá)⑶lib/⑶18受體的靶細(xì)胞中的工具。具體而言，本發(fā)明提供CyaA蛋白質(zhì)的突變多肽，其中所述蛋白質(zhì)得自CyaA毒素或者優(yōu)選得自其類毒素，特別是CyaA/AC—類毒素。所述突變多肽能夠結(jié)合細(xì)胞，特別是結(jié)合靶細(xì)胞，尤其是表達(dá)CDllb/CD18受體的靶細(xì)胞，所述突變多肽能夠?qū)⑵銷-端結(jié)構(gòu)域或插入所述結(jié)構(gòu)域中或在其上接枝的分子易位到所述細(xì)胞中，并且其成孔活性與CyaA毒素或類毒素的成孔活性相比被全部或部分抑制。特別地，可按照EP 03291486. 3 以及 El-Azami-El-Idrissi Μ.等，J. Biol. Chem.， 278 00)38514-21或WO 02/22169中公開的方法，測定突變多肽與靶CDllb/CD18細(xì)胞的能力。此外，通過應(yīng)用WO 02/22169中所述的方法，可以測定突變多肽將表位或含所述表位的多肽易位到靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的能力。
CyaA毒素或類毒素成孔活性或細(xì)胞透化能力的全部或部分抑制應(yīng)當(dāng)被理解為形成孔具體是估計(jì)直徑為0. 6至0. Snm的陽離子選擇孔使得細(xì)胞膜透化并最終引發(fā)膠體_滲透細(xì)胞溶解的能力被全部或部分抑制。成孔活性可利用如在實(shí)施例中所述的單一全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)來測量。CyaA毒素的成孔活性有助于細(xì)胞上的總?cè)芗?xì)胞或溶血活性。實(shí)際上，在本發(fā)明的上下文中，CyaA的總?cè)芗?xì)胞或溶血活性(或其“總細(xì)胞毒活性”)應(yīng)當(dāng)至少被理解為腺苷酸環(huán)化酶和CyaA毒素成孔活性的結(jié)果。因此，CyaA毒素的成孔活性的全部或部分抑制允許至少部分抑制其細(xì)胞溶劑活性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與百日咳博德特氏菌CyaA毒素的總?cè)芗?xì)胞活性相比，本發(fā)明的多肽特別是對表達(dá)CDllb/CD18受體的細(xì)胞的總?cè)芗?xì)胞活性全部或部分降低。如在實(shí)施例中所述，通過測量用測試多肽溫育時細(xì)胞所釋放的血紅蛋白(對于紅細(xì)胞而言)或乳酸脫氫酶(對于單核細(xì)胞而言)的量，可以測定本發(fā)明多肽的溶細(xì)胞活性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與百日咳博德特氏菌CyaA毒素，或者與腺苷酸環(huán)化酶活性被部分或全部抑制的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)(或“CyaA類毒素”)的總?cè)芗?xì)胞活性相比，本發(fā)明的多肽對表達(dá)CDllb/CD18受體的細(xì)胞的總?cè)芗?xì)胞活性要低至少75%，優(yōu)選低至少80%、85%、90%或95%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽對表達(dá)⑶lib/⑶18 受體的細(xì)胞的總?cè)芗?xì)胞活性，相比氨基酸序列示于圖2中的百日咳博德特氏菌CyaA類毒素 (SEQ ID N0 2)，要低至少75%，優(yōu)選低80%或85%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種多肽，其為腺苷酸環(huán)化酶的突變體，并且其氨基酸序列包含下述氨基酸序列或由其組成(i)所述氨基酸序列相對于SEQ ID N0 1中公開的氨基酸序列進(jìn)行突變，所述突變至少包含置換E570Q和K860R，或(ii)其為具有如 SEQ ID N0 1公開的所述氨基酸序列的CyaA蛋白質(zhì)的片段，其片段化程度直至所述片段具有包括置換E570Q和K860R的氨基酸序列，并且其中所述多肽能夠與靶細(xì)胞結(jié)合而且能夠?qū)⑵銷-端結(jié)構(gòu)域易位到所述細(xì)胞中。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，所述片段包括SEQ ID N0 1的570位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基的置換(稱為“E570Q”)以及SEQ ID N0 1的860位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基的置換(稱為“K860R”)，該片段至少包括下述CyaA蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其始于第一 N-端殘基或者從包含在1位與400位之間，優(yōu)選為1位與380位之間的氨基酸殘基之一延伸至形成CDllb/CD18細(xì)胞受體的識別和結(jié)合部位的殘基，并且所述片段含有對應(yīng)于突變E570Q和K860R殘基的殘基或者由所述氨基酸序列組成。在一個具體實(shí)施方式
中，包括 E570Q和K860R置換的片段不包含從SEQ ID N0 1的1位氨基酸延伸至SEQ ID N0 1的 372位氨基酸的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如此制備的片段基本失去了腺苷酸環(huán)化酶酶活性(AC活性)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過編碼具有E570Q和R860R突變的CyaA氨基酸序列的突變基因和cyaC基因在重組細(xì)胞中共表達(dá)，之后回收突變體CyaA的選擇表達(dá)片段，產(chǎn)生本發(fā)明的突變多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變多肽具有賴氨酸殘基，其對應(yīng)于如SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的983位的賴氨酸殘基，并且其被?；?，具體而言，其被棕櫚?；?palmytoylated)或棕櫚油酉先化(palmitoleilated)?？蛇x地，本發(fā)明的突變多肽具有賴氨酸殘基，其對應(yīng)于如SEQ ID N0 1所述的 CyaA氨基酸序列的983位的賴氨酸殘基，其未被?；Ｔ谝粋€具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的突變多肽具有衍生自SEQ ID N0 1中公開的 CyaA氨基酸序列并由于殘基突變而產(chǎn)生E570Q和K860R的氨基酸序列，并且具有下述氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID N0 1所述的序列共享至少50%，優(yōu)選至少60%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或 99% 的同一性。在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的突變多肽具有的氨基酸序列不同于如在SEQ ID N0 1中所述的CyaA氨基酸序列，不同之處在于殘基突變產(chǎn)生E570Q和K860R，以及由于進(jìn)一步的突變產(chǎn)生1至500，具體地1至400、1至300、1至200、1至100、1至50、1至40、1 至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5個氨基酸殘基置換、缺失和/或插入，其中包括E570Q和K860R置換。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的突變多肽與百日咳博德特氏菌CyaA氨基酸序列相比，不攜帶任何除E570Q和K860R置換外的任何氨基酸殘基置換、缺失和/或插入。在一個具體實(shí)施方式
中，突變多肽具有SEQ ID N0 2的氨基酸序列，如在圖7中所示。在另一個具體實(shí)施方式
中，與SEQ ID N0 2的氨基酸序列相比，僅有的進(jìn)一步氨基酸置換、缺失和 /或插入由全部或部分抑制CyaA蛋白質(zhì)的腺苷酸環(huán)化酶酶促活性的氨基酸置換、缺失和/ 或插入組成，具體而言，諸如，二肽的插入，例如，在188位和189位的氨基酸之間的“LQ”或 “GS” 二肽。 在一個具體實(shí)施方式
中，除E570Q和K860R置換外，本發(fā)明的突變多肽由于1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基置換、缺失和/或插入而不同于如SEQ ID N0 1中所述的 CyaA氨基酸序列。在一個具體實(shí)施方式
中，除E570Q和K860R置換外，百日咳博德特氏菌的天然CyaA 蛋白質(zhì)的247位的亮氨酸殘基被谷氨酰胺殘基(L247Q)或被另一氨基酸殘基特別是保守氨
基酸殘基置換。作為如本文公開的SEQ ID N0 1所公開的氨基酸序列的片段的本發(fā)明突變多肽應(yīng)當(dāng)被理解為下述序列，該序列包含一個或更多個片段，所述片段至少具有SEQ ID N0 1氨基酸序列的約350個氨基酸殘基及多達(dá)約1705個氨基酸殘基，具體而言，該序列包含的片段含 SEQ ID N° 1 的至少 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、 1600個氨基酸殘基的連續(xù)部分，包括殘基E570Q和K860R在內(nèi)。本發(fā)明的突變多肽還可被定義為在SEQ ID N0 2中公開的氨基酸序列的片段，其包含一個或更多個片段，所述片段至少具有SEQ ID N0 2氨基酸序列的約350個氨基酸殘基及多達(dá)約1705個氨基酸殘基，具體而言，其包含的片段含 SEQ ID N° 2 的至少 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、1600個氨基酸殘基的連續(xù)部分，包括殘基570和860在內(nèi)。所述片段優(yōu)選保留與CDllb/CD18細(xì)胞受體結(jié)合的能力以及將其N-端結(jié)構(gòu)域易位到靶細(xì)胞中的能力。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變多肽是這樣的片段，該片段具有一段氨基酸殘基，其包含SEQ ID N0 1 的氨基酸殘基570 (為E570Q)至860 (為K860R)或者氨基酸殘基1至860或2至860，直至相對于原始SEQ ID N0 1觀察到E570Q和K860R。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述片段還包含如CyaA蛋白質(zhì)的SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的氨基酸殘基1166至1281或氨基酸殘基1208至1243，用于與⑶lib/⑶18靶細(xì)胞相互作用。具體的片段因此包括全部或部分的天然蛋白質(zhì)C-端部分，該部分負(fù)責(zé)使本發(fā)明的多肽與與靶細(xì)胞膜和/或CDllb/CD18受體結(jié)合，以及負(fù)責(zé)隨后將該多肽的N-端結(jié)構(gòu)域遞送到細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中。本發(fā)明的具體多肽是CyaA蛋白質(zhì)的片段，其含有CyaA蛋白質(zhì)特別是SEQ ID N0 1的氨基酸殘基373至1706，直至殘基570和860被突變?yōu)镋570Q和K860R。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為此種片段的突變多肽包含a)第一氨基酸序列，其對應(yīng)于一段來自SEQ ID N0 1的至少100個連續(xù)氨基酸殘基，包括為E570Q的氨基酸殘基570，并且與SEQ ID N0 1相比還包括0、1、2、3、4或5個缺失、置換或插入，和b)第二氨基酸序列，其對應(yīng)于一段來自SEQ ID N0 1的至少100個連續(xù)氨基酸殘基，包括為K860R的氨基酸殘基860，并且與SEQ ID N0 1相比還包括0、1、2、3、4或5個缺失、置換或插入，和優(yōu)選地c)第三氨基酸序列，其包含如CyaA蛋白質(zhì)的SEQ ID N0 1所述的CyaA氨基酸序列的氨基酸殘基1166至1281或氨基酸殘基1208至1243，用于與⑶lib/⑶18靶細(xì)胞相互作用。本發(fā)明的另一個具體多肽是下述片段，其是對應(yīng)于具有E570Q和K860R突變的 CyaA蛋白質(zhì)的一個片段，其中氨基酸殘基225至234已經(jīng)缺失，因此提供了含突變蛋白質(zhì)的殘基1至2 和235至1706的片段。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為與CDllb/CD18受體特異性結(jié)合的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的多肽片段與表達(dá)所述受體的細(xì)胞結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與百日咳博德特氏菌CyaA毒素的腺苷酸環(huán)化酶活性相比， 所述多肽在細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶活性被部分或完全抑制。如上所述，表述“CyaA蛋白質(zhì)” 涉及蛋白質(zhì)的毒素形式或優(yōu)選涉及其類毒素形式。因此，所涉及的多肽為CyaA蛋白質(zhì)的突變體的本發(fā)明的每個實(shí)施方式適用蛋白質(zhì)的每一種毒素或類毒素形式。CyaA腺苷酸環(huán)化酶或酶促活性的全部或部分抑制應(yīng)當(dāng)被理解為，與由cyaA和 cyaC基因在細(xì)胞中共表達(dá)產(chǎn)生的CyaA毒素的腺苷酸環(huán)化酶或酶促活性相比，在細(xì)胞環(huán)境中將ATP轉(zhuǎn)化成cAMP的能力被全部或部分抑制。如在實(shí)施例中所述，通過測量胞內(nèi)cAMP 水平，可以測定將ATP轉(zhuǎn)化成cAMP的能力。此種全部或部分抑制可以作為遺傳失活的結(jié)果獲得，例如，通過在作為部分催化部位的CyaA氨基酸序列的部位中，即位于SEQ ID N° 1的前400個氨基酸內(nèi)(AC結(jié)構(gòu)域) 的部位中，引入短氨基酸序列，其包含例如1至10個氨基酸，特別是二肽，或者通過對如SEQ ID N0 1所述的對酶促活性必要的CyaA氨基酸序列的一部分進(jìn)行缺失或置換。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過在如SEQ ID N0 1所述的CyaA序列的188位和189位氨基酸之間插入二肽， 例如“LQ”或“GS” 二肽，獲得對CyaA酶促活性的全部或部分抑制。這可以通過在cyaA基因編碼相的564位的EcoRV位點(diǎn)插入寡核苷酸諸如“CTG CAG”或“CGATCC”完成。參見See Ladant等，1992?？蛇x地，酶促活性的全部或部分抑制還可以通過定向突變獲得，例如，通過用Gln殘基取代天然CyaA百日咳博德特氏菌蛋白質(zhì)的58或65位的賴氨酸殘基(Glaser 等，1989)。
根據(jù)本發(fā)明的多肽還可以定義為下述多肽，其可以通過下述從具有根據(jù)SEQ ID N0 1、7、8或9的氨基酸序列的CyaA多肽獲得a)用谷氨酰胺殘基或保守氨基酸殘基置換SEQ ID N0 1、7、8的570位或SEQ ID N0 9的569位的谷氨酸殘基，b)用精氨酸殘基或保守氨基酸殘基置換SEQ ID N0 1、7、8的860位或SEQ ID N0 9的859位的賴氨酸殘基，和c)任選地，在除a)和b)中所述位置外的位置上進(jìn)行一個或更多個氨基酸殘基置換、插入和/或缺失，條件是如此獲得的多肽具有使百日咳博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)與靶細(xì)胞結(jié)合并將其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位到所述細(xì)胞中的能力。優(yōu)選地，在步驟a)中，谷氨酸殘基被選自Gln、Asn、Met、Thr、kr、Gly、Arg、Lys、 Val、Leu、CyS、Ile、ASp的氨基酸殘基置換，最優(yōu)選被Gln置換。優(yōu)選地，在步驟b)中，賴氨酸殘基被選自Arg、Asn、Gln、Met、Thr、kr、Gly、Val、Leu、Cys、Ile的氨基酸殘基置換，最優(yōu)選被Arg置換。在一個具體實(shí)施方式
中，在步驟C)中不進(jìn)行另外的氨基酸殘基置換、插入和/或缺失。具體而言，步驟C)可包含截短任一末端或兩個末端。具體而言，C-末端的殘基可以被缺失，其程度為直至其不影響CDllb/CD18細(xì)胞受體的識別和結(jié)合部位。可選地或另外，殘基可以在N-末端被缺失，條件是其不影響所獲得的突變多肽的易位能力。還可以進(jìn)行位于除步驟a)和b)中所述那些位置外的位置的天然CyaA蛋白質(zhì)的一個或更多個殘基的內(nèi)部缺失。在一個具體實(shí)施方式
中，步驟c)包含在CyaA多肽的N-端氨基酸序列中的多達(dá)380或多個400個氨基酸的缺失，優(yōu)選地，包含從SEQ ID N0 1、7、8或9的1位氨基酸延伸至SEQ ID N0 1、7、8或9的372位氨基酸的氨基酸段的缺失。優(yōu)選地，在進(jìn)行步驟C)后，所得到的多肽包括全部或部分的天然蛋白質(zhì)的C-端部分，該部分負(fù)責(zé)使本發(fā)明多肽與靶細(xì)胞膜和/或CDllb/CD18受體結(jié)合，以及負(fù)責(zé)隨后將該多肽的N-端結(jié)構(gòu)域遞送到細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中。在一個具體實(shí)施方式
中，在步驟c)中，SEQ ID N0 1、7或8的氨基酸殘基373至1706，或SEQ ID N° 9的氨基酸殘基373至1705未被缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中，SEQ ID N。1、7或8的氨基酸殘基1208至1243， 或SEQ ID N0 9的氨基酸殘基1207至1242未被缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟C)包含氨基酸置換、缺失和/或插入，其全部或部分抑制CyaA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的腺苷酸環(huán)化酶酶促活性。此種全部或部分抑制可以如下獲得通過在位于SEQ ID N0 1、7、8或9的前400個氨基酸(AC結(jié)構(gòu)域)內(nèi)的部位中引入短氨基酸序列，其包含例如1至10個氨基酸，特別是二肽；或者通過對如SEQ ID N0 1、7、8或9所述的，對酶促活性必要的CyaA氨基酸序列的一部分進(jìn)行缺失或置換。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 通過在如SEQ ID N。1、7、8或9所述的CyaA序列的188位和189位氨基酸之間插入二肽， 例如“LQ”或“GS” 二肽，獲得對CyaA酶促活性的全部或部分抑制?？蛇x地，酶促活性的全部或部分抑制還可以通過定向突變獲得，例如，通過用Gln殘基取代天然CyaA百日咳博德特氏菌蛋白質(zhì)的58或65位的賴氨酸殘基(Glaser等，1989)。優(yōu)選地，在步驟c)中，如SEQ ID N° 1、7、8所述的CyaA氨基酸序列的983位的或者SEQ ID N0 9中的982位的賴氨酸殘基既未置換也未缺失。在一個實(shí)施方式中，該賴氨酸殘基被?；?，具體而言，其被棕櫚?；蜃貦坝王；??？蛇x地，該賴氨酸殘基未被酰化。優(yōu)選地，在進(jìn)行步驟c)后，所得到的多肽具有與SEQ ID N0 1、7、8或9所述的序列共享至少50%、優(yōu)選至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。仍優(yōu)選地，在進(jìn)行步驟c)后，所得到的多肽具有與SEQ ID N0 1、7、8或9所述的序列不同的氨基酸序列，這是由于源自步驟a)和b)的氨基酸殘基置換，以及由于1至500、 具體而言 1 至 400、1 至 300、1 至 200、1 至 100、1 至 50、1 至 40、1 至 30、1 至 25、1 至 20、1 至15、1至10或1至5另外的氨基酸殘基置換、缺失和/或插入。在一個具體實(shí)施方式
中， 在進(jìn)行步驟c)后，所得到的多肽由于除在步驟a)和b)中進(jìn)行的置換之外的1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10個氨基酸殘基置換、缺失和/或插入而不同于如SEQ ID N0 1、7、8或9所述的 CyaA氨基酸序列。本發(fā)明還涉及多肽衍生物，所述多肽衍生物包含進(jìn)一步與一個或更多個受關(guān)注的分子相結(jié)合的本發(fā)明的突變多肽或由其組成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受關(guān)注的分子當(dāng)單獨(dú)采用時或者當(dāng)與本發(fā)明多肽結(jié)合時，是一種生物活性分子。所述分子尤其可以具有預(yù)防價值或治療價值，即，可以具有預(yù)防或治療活性，或者可以增強(qiáng)預(yù)防或治療活性。在具體實(shí)施方式
中，受關(guān)注的分子選自肽、糖肽、脂肽、多糖、低聚糖、核酸、脂質(zhì)和化學(xué)品。在一個具體實(shí)施方式
中，所述一個或更多個受關(guān)注的分子(molecules of interest)是多肽分子或含多肽分子。其氨基酸序列可包含2至1000個氨基酸殘基，優(yōu)選 5-800,5 至 500、5 至 200、5 至 100、8 至 50、5 至 25、5 至 20 或 8 至 16 或 300-600、400_500
個氨基酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述一個或更多個受關(guān)注的分子是適合引發(fā)免疫應(yīng)答的異源氨基酸序列(也稱為“異種抗原”)，具體而言，是包含表位或由表位組成的氨基酸序列， 其中所述表位包括抗原。如本文所用的，術(shù)語“異源的”指的是其本身用在載體中的除突變多肽之外的抗原。如本文所用的，術(shù)語“表位”指的是異源分子，尤其是當(dāng)呈遞至宿主的免疫系統(tǒng)時，能引發(fā)免疫應(yīng)答的異源肽。具體而言，此類表位可包含或由8、9、10、11、12、13、14、 15或16個氨基酸殘基的段組成。其可以可選地由全長抗原組成或者由抗原片段組成。在一個具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以由下述質(zhì)粒編碼，該質(zhì)粒對應(yīng)于以登記號CNCM 1-4137(圖12)保藏的0VA_QR_AC_質(zhì)粒，其中編碼“OVA”抗原序列的DNA序列被編碼包含一個或更多個表位的抗原序列的DNA序列取代。特別地，適合引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽分子是引發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的多肽分子，舉例而言包括CTL應(yīng)答。適合引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽分子也可以是引發(fā)B-細(xì)胞免疫應(yīng)答的多肽分子。在具體實(shí)施方式
中，異種抗原選自細(xì)菌性病原體的抗原、腫瘤細(xì)胞抗原、病毒抗原、逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原、真菌抗原或寄生蟲細(xì)胞抗原。特別地，受關(guān)注的分子可以是選自下述的抗原=Chlamidia抗原、支原體抗原、肝炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗原、腫瘤抗原，或者至少包含表位的任意這些抗原的一部分。
在本發(fā)明的多肽衍生物的優(yōu)選實(shí)施方式中，適合引發(fā)免疫應(yīng)答的每一個所述分子的氨基酸序列包含下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列組成抗原、支原體抗原、肝炎病毒抗原、脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脈絡(luò)叢腦膜炎病毒序列、腫瘤抗原；或者包含包括至少一個表位的任意這些抗原的氨基酸序列的一部分或由其組成。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，受關(guān)注的分子是腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。腫瘤相關(guān)抗原已經(jīng)為很多腫瘤所表征，諸如例如黑素瘤，特別是轉(zhuǎn)移性黑素瘤；肺癌；頭頸癌；子宮頸癌、 食道癌；膀胱癌，特別是浸潤膀胱癌；前列腺癌；乳腺癌；結(jié)腸直腸癌；腎細(xì)胞癌；肉瘤；白細(xì)胞；骨髓瘤。對于這些不同的癌癥組織學(xué)類型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗原肽在腫瘤樣品上特異性表達(dá)，并被T細(xì)胞識別，特別是被⑶8+T細(xì)胞或⑶4+T細(xì)胞。Van der Bruggen P.等(Immunological Reviews, 2002, vol 188 :51-64)對發(fā)現(xiàn)可作為這些類型腫瘤中的腫瘤相關(guān)抗原的肽進(jìn)行了綜述。特別地，所述綜述表3中所包含的肽的公開內(nèi)容在本文中被稱為提供了此類腫瘤相關(guān)抗原的實(shí)例，并且所述表3作為參考被引入本申請。根據(jù)Kawakami Y.等(Cancer Sci, October 2004，vol. 95, no. 10，p784_791)的出版物，該出版物也提供了篩選這些抗原或另外一個抗原的方法，下述抗原被引用作為由 T細(xì)胞識別的腫瘤相關(guān)抗原的實(shí)例由各種癌癥共享的抗原，包括MAGE(特別是在黑素瘤中)、NY-ES0-1、Her2/neu、WTl、Survivin, hTERT、CEA, AFP、SART3、GnT-V,對一些特定癌癥具有特異性的抗原，諸如黑素瘤的日-聯(lián)蛋白、^1(4、嫩肌-2、1^0、gp 100、MART-I，酪氨酸酶；非白血性白血病的bcr-abl、TEL-AMLl ；前列腺癌的PSA、PAP、PSM、PSMA ；髓細(xì)胞性白血病的蛋白酶3 ；乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌的MUC-I ；淋巴瘤、ATL或子宮頸癌的EBV-EBNA、 HTLV-I tax ；腎細(xì)胞癌的圖標(biāo)HLA-A2 ；非白血性白血病/淋巴瘤的HAl。也已經(jīng)描述了動物中的腫瘤相關(guān)抗原，諸如影響貓或狗的腫瘤中的環(huán)化素Dl和環(huán)化素D2。由T細(xì)胞識別的腫瘤相關(guān)抗原也已經(jīng)在Novellino L.等(Immunol Immunother 2004,54 :187-207)中公開。更通常地，本發(fā)明中受關(guān)注的TAA是對應(yīng)于突變抗原，或?qū)?yīng)于在腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的抗原、對應(yīng)于共享抗原、組織特異性分化抗原或?qū)?yīng)于病毒抗原的那些。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，腫瘤相關(guān)抗原是乳頭瘤病毒屬(HPV)的抗原或者是酪氨酸酶。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
，包含表位或由表位組成的多肽分子的氨基酸序列已經(jīng)相對于其天然氨基酸序列進(jìn)行了修飾，例如，以便減少該序列內(nèi)帶負(fù)電氨基酸殘基的數(shù)目。通過去除這些帶負(fù)電氨基酸殘基中的一些，或者還通過添加一些帶正電的氨基酸殘基，特別是作為表位的側(cè)翼殘基，可以獲得此類修飾。因此包含較少帶負(fù)電殘基的多肽可能有利于將本發(fā)明的多肽衍生物的催化結(jié)構(gòu)域易位到靶細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。包含表位或抗原或由其組成的多肽分子的氨基酸序列還可以以下述途徑設(shè)計(jì)，當(dāng)其被插入本發(fā)明的多肽衍生物中時其是展開的，這改進(jìn)了根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)分子內(nèi)化進(jìn)入靶細(xì)胞中的效率。在作為其氨基酸含量而經(jīng)歷折疊的多肽中，這種展開例如可通過去除或置換半胱氨酸殘基以便避免形成二硫鍵獲得，二硫鍵可參與多肽的折疊。在一些情況中，通過在還原劑的存在下制備多肽能夠防止其折疊，還原劑能夠避免在體內(nèi)重折疊。在一個具體實(shí)施方式
中，氨基酸序列特別是抗原可包含隱蔽表位或由隱蔽表位組成。發(fā)明人實(shí)際已經(jīng)確定，多肽衍生物構(gòu)建物，作為其在構(gòu)建物中呈遞的結(jié)果，能夠使所述抗原的隱蔽表位變成免疫原性的，所述多肽衍生物構(gòu)建物包含(i)本發(fā)明的多肽，其為根據(jù)本文所公開的定義的CyaA蛋白質(zhì)的突變體(多肽突變體)，和(ii)具有下述氨基酸序列的多肽分子，所述氨基酸序列含一種或數(shù)種抗原的一個或幾個抗原片段。特別地，在靶細(xì)胞中加工所述構(gòu)建物，其包括如在本發(fā)明中定義的突變多肽，包含得自受關(guān)注的抗原的多肽分子，特別用于預(yù)防或治療應(yīng)用，包括免疫治療接種目的，其中作為突變多肽的N-端結(jié)構(gòu)域易位的結(jié)果，使多肽分子內(nèi)化。此種加工能夠通過靶細(xì)胞的I類MHC分子實(shí)施表位呈遞，并且所述表位可包含抗原的隱蔽表位，其被允許變成免疫原性的，并且具體而言被允許提高宿主中的T-細(xì)胞應(yīng)答，特別是CTL應(yīng)答。本發(fā)明因此還涉及多肽衍生物，特別是包含一種或幾種多肽分子的重組蛋白質(zhì)， 所述多肽分子具有氨基酸序列，該氨基酸序列含一種或數(shù)種抗原的一個或多個表位，或含所述抗原，所述多肽分子的所述氨基酸序列被插入相同或不同的部位中，特別是根據(jù)本發(fā)明的突變多肽的不同許可位點(diǎn)中，所述重組蛋白質(zhì)保留CyaA毒素靶向抗原呈遞細(xì)胞(APC) 的性質(zhì)，其中所述表位中的至少一個是亞優(yōu)勢隱蔽T-細(xì)胞表位，并且其中所述多肽衍生物，特別是所述重組蛋白質(zhì)，能夠引發(fā)針對所述多肽分子的抗原特異性應(yīng)答。在根據(jù)本發(fā)明的多肽衍生物的具體實(shí)施方式
中，一個或更多個氨基酸序列被插入一個或更多個位點(diǎn)中，特別是許可位點(diǎn)中。對于本發(fā)明，“許可位點(diǎn)，，是CyaA蛋白質(zhì)序列中的位點(diǎn)，多肽可被插入該位點(diǎn)，而不會實(shí)質(zhì)上影響需要的CyaA蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，特別是不會實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞的靶向，具體是 CyaA的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的靶向，包括不會實(shí)質(zhì)上影響與CDllb/CD18受體的特異性結(jié)合，以及有利地不會實(shí)質(zhì)上影響參與使CyaA N-端結(jié)構(gòu)域進(jìn)入靶細(xì)胞中的易位過程的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。選擇許可位點(diǎn)的方法呈現(xiàn)在例如W093/213 (Ladant等、1992)以及Osicka等、 2000 (Infection and Immunity,2000,68 (1) :247-256)中。具體而言，利用雙選擇的方法 (抗生素抗性以及通過互補(bǔ)在比色皿上的比色測試)使得能夠在編碼毒素的N-端催化結(jié)構(gòu)域的基因部分容易地鑒定寡核苷酸插入(其保存了閱讀框)?？扇菀椎胤治鲞@些突變對所述毒素的催化活性的功能結(jié)果，包括遺傳學(xué)方面的(大腸桿菌cya—菌株的功能互補(bǔ)) 以及生物化學(xué)方面的(表征修飾腺苷酸環(huán)化酶的穩(wěn)定性、其酶促活性、其與caM的相互作用等)。該方法使得能夠篩選大量突變，以便鑒定對抗原決定簇的插入潛在有利的部位。允許CyaA催化結(jié)構(gòu)域易位并因此允許被插入許可位點(diǎn)中的氨基酸序列易位的百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的許可位點(diǎn)包括但不限于殘基137-138 (Val-Ala)、 殘基 224-225(Arg-Ala)、殘基 228-229(Glu-Ala)、殘基 235-236(Arg-Glu)和殘基 317-318 (Ser-Ala) (Sebo等，1995)。下述另外的許可位點(diǎn)也包括在本發(fā)明的實(shí)施方式中殘基 107-108(Gly-His)、殘基 132-133(Met-Ala)、殘基 232-233(Gly-Leu)和 335-336 (Gly-Gln)與336-337。然而，在本發(fā)明中可以使用其他許可位點(diǎn)，其可通過例如應(yīng)用上面所述的方法鑒定，特別是CyaA蛋白質(zhì)的殘基400與1700之間的位點(diǎn)。對于其他博德特氏菌屬種，通過序列比較并測定相應(yīng)的殘基，可定義相應(yīng)的許可位點(diǎn)。
根據(jù)另一個實(shí)施方式，所述一個或更多個氨基酸序列多肽此外或可選地可被插入本發(fā)明多肽的一個和/或另一末端(端部)，優(yōu)選插入缺乏百日咳博德特氏菌CyaA蛋白質(zhì)的全部或部分N-端催化結(jié)構(gòu)域且更優(yōu)選缺乏殘基1-373的突變CyaA多肽的N-末端。根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，所述適合引發(fā)免疫應(yīng)答的一個或更多個氨基酸序列被接枝到所述多肽的氨基酸殘基上。根據(jù)本發(fā)明，氨基酸序列與CyaA突變多肽的“結(jié)合”(或插入)以提供所謂的多肽衍生物，也稱為“重組蛋白質(zhì)”或“雜合蛋白質(zhì)”，包括特別是通過可用的DNA技術(shù)進(jìn)行的基因插入?？蛇x地，“結(jié)合”還包括非基因插入，包括化學(xué)插入，例如特別是在氨基酸序列的一個末端進(jìn)行的共價偶聯(lián)，或者非共價偶聯(lián)。當(dāng)待被插入的氨基酸序列是合成或半合成時，非基因插入是特別受關(guān)注的。用于使藥物與多肽偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括例如通過使用N-吡啶基磺酰-活化的巰基的二硫鍵。具體而言，通過化學(xué)鍵或基因插入能夠使分子與本發(fā)明的多肽接枝，用于體內(nèi)靶向CyaA靶細(xì)胞，諸如APC，例如CDllb/CD18正細(xì)胞(positive cells)，以及特別是所述細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠。的確，當(dāng)使對應(yīng)于特定CD8+T-細(xì)胞表位的分子與解毒CyaA的催化結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)時，或者通過二硫鍵或者通過基因插入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基因工程分子能夠引發(fā)體內(nèi)特異性 CTL應(yīng)答，從而顯示所述⑶8+T-細(xì)胞表位被易位到⑶lib-表達(dá)細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，突變CyaA多肽被用于制造蛋白質(zhì)載體，或用于制備組合物，所述組合物具體設(shè)計(jì)為在⑶8+細(xì)胞毒T-細(xì)胞應(yīng)答(CTL應(yīng)答)遵循受關(guān)注的分子修飾的(特別是重組的或綴合的)突變CyaA多肽靶向CDllb表達(dá)細(xì)胞時，引發(fā)所述應(yīng)答， 之后使受關(guān)注的分子易位到所述CDllb表達(dá)細(xì)胞具體而言骨髓樹枝狀細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠。就此而論，受關(guān)注的分子優(yōu)選為表位或抗原或包含表位或抗原。在本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，突變CyaA多肽被用于制造蛋白質(zhì)載體，或用于制備組合物，所述組合物具體設(shè)計(jì)為在⑶4+細(xì)胞毒T-細(xì)胞應(yīng)答(CTL應(yīng)答)遵循受關(guān)注的分子修飾的(特別是重組的或綴合的)腺苷酸環(huán)化酶靶向⑶lib表達(dá)細(xì)胞具體而言骨髓樹枝狀細(xì)胞時，引發(fā)所述應(yīng)答。就此而論，受關(guān)注的分子優(yōu)選為表位或抗原或包含表位或抗原。突變多肽還可以用于制造用于使預(yù)防或治療性化合物靶向⑶lib表達(dá)細(xì)胞的蛋白質(zhì)載體。就此而論，在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，所謂的受關(guān)注的分子具有預(yù)防或治療價值，并且具體而言為藥物。所述預(yù)防或治療性化合物以及具體而言所述藥物可以與突變多肽化學(xué)或基因偶聯(lián)。使化合物與多肽偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括例如通過使用N-吡啶基磺?；罨膸€基的二硫鍵。在一個實(shí)施方式中，受關(guān)注的分子是消炎化合物，所述消炎化合物當(dāng)與突變多肽偶聯(lián)時，特異性靶向參與炎癥應(yīng)答的細(xì)胞的表面，諸如樹枝狀細(xì)胞或中性白細(xì)胞。更具體而言，選擇性CD8+細(xì)胞毒性細(xì)胞引發(fā)的抗原呈遞主要由骨髓樹枝狀細(xì)胞進(jìn)行。因此，在一個具體實(shí)施方式
中，用于制造蛋白質(zhì)載體的突變CyaA多肽是基因修飾腺苷酸環(huán)化酶，其含有一個或多個通過二硫鍵化學(xué)偶聯(lián)于位于突變CyaA多肽催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的基因插入半胱氨酸殘基的分子。實(shí)際上，通過與位于催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同許可位點(diǎn)處的不同半胱氨酸殘基的二硫鍵，多個分子可以與突變CyaA多肽化學(xué)偶聯(lián)。
本發(fā)明的突變多肽或多肽衍生物適合用于治療或預(yù)防。治療或預(yù)防效果意圖指對患者的狀況有益的任何效果，只要其是治療性或或者足以限制病理狀態(tài)的癥狀或后果，包括限制病理狀態(tài)的進(jìn)展。治療或預(yù)防效果也包括預(yù)防病理狀態(tài)的發(fā)作。本發(fā)明的突變多肽或多肽衍生物特別適合在需要其的宿主中引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答諸如T-細(xì)胞免疫應(yīng)答或B-細(xì)胞免疫應(yīng)答。其包括CTL和Th，特別是Thl應(yīng)答，包括 ⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答和/或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。源自CyaA蛋白質(zhì)的多肽引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力在動物中足以預(yù)防體內(nèi)腫瘤生長，甚或能夠腫瘤退化。其還可通過經(jīng)由TLR激活而激活免疫應(yīng)答的先天成分以及通過使用化學(xué)治療劑向下激活免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)成分得以增強(qiáng)。本發(fā)明提供下述方法，該方法作為已經(jīng)被選擇的結(jié)合突變E570Q和K860R的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)能夠使此類結(jié)果以改進(jìn)的安全狀態(tài)獲得。本發(fā)明因此還涉及治療方法，該方法包括向動物或人類患者施用根據(jù)本發(fā)明的突變多肽或多肽衍生物，以在需要其的宿主中引發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答或B-細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的突變多肽或多肽衍生物可特別用于預(yù)防或治療選自瘤形成、癌癥和傳染病的疾病，所述傳染病選自病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)菌或真菌誘發(fā)的疾病。具體而言，多肽衍生物可以用于在患者中治療HIV感染。特別提供的是，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，按照公認(rèn)的腫瘤分類臨床標(biāo)準(zhǔn)，CyaA 突變多肽或多肽衍生物相比表面腫瘤(superficial tumors)更適合治療浸潤或血管化腫瘤，或者相比原發(fā)性腫瘤更適合治療轉(zhuǎn)移性腫瘤，。實(shí)體瘤尤其是通過使用本發(fā)明的多肽衍生物來治療的靶標(biāo)。在可以作為用本發(fā)明的多肽衍生物進(jìn)行治療的候選物的腫瘤中，描述了下述作為實(shí)例，其腫瘤相關(guān)抗原已被表征黑素瘤，特別是轉(zhuǎn)移性黑素瘤；肺癌；頭頸癌；子宮頸癌、食道癌；膀胱癌，特別是浸潤膀胱癌；前列腺癌；乳腺癌；結(jié)腸直腸癌；腎細(xì)胞癌；肉瘤；白血病；骨髓瘤。對于這些各種組織性類型的癌癥，已經(jīng)顯示，抗原肽在腫瘤樣品上特異性表達(dá)而且被T細(xì)胞識別，特別是被⑶8+T細(xì)胞或⑶4+T細(xì)胞識別。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽衍生物在制備用于治療選自瘤形成、癌癥和傳染病(所述傳染病選自病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)的疾病)的疾病的治療在組合物中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多肽或多肽衍生物可與佐劑結(jié)合和/或與另一治療活性分子或藥劑結(jié)合施用給患者。在本發(fā)明的上下文中，所述“另一治療活性分子或藥劑”是可能對其所施用的患者的狀況有益的物質(zhì)。其尤其是適合用于制造藥物的有效成分。其可以是適合加強(qiáng)增加或調(diào)節(jié)治療有效成分的效果的化合物。突變CyaA多肽或其多肽衍生物可以與治療活性分子或藥劑一起施用，特別適合在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的治療活性分子或藥劑。具體而言，突變CyaA多肽或其多肽衍生物可以與治療活性分子一起施用，該治療活性分子適合特別是通過降低或阻斷調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫抑制能力來調(diào)節(jié)患者中的細(xì)胞應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，在調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答上的此類效應(yīng)可以借助調(diào)節(jié)T細(xì)胞和/或調(diào)節(jié)另一細(xì)胞抑制應(yīng)答諸如骨髓抑制細(xì)胞應(yīng)答的藥劑獲得，所述藥劑通過下述行為靶向所述調(diào)節(jié)細(xì)胞特別是T細(xì)胞排除或鈍化這些細(xì)胞(諸如利用CD25-特異性抗體，或環(huán)磷酰胺)、更改所述細(xì)胞特別是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的運(yùn)輸(諸如CCL22-特異性抗體)或更改所述細(xì)胞的分化和發(fā)信號(諸如通過阻斷F0XP3(forid!ead box P3)信號)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，調(diào)整調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答的藥劑靶向抑制分子，特別是存在于APCs上的此類分子(諸如B7-H1、B7-H4、ID0(吲哚胺2，3_ 二氧酶)或精氨酸酶)或存在于T細(xì)胞(諸如CTLA4 (細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞-相關(guān)抗原4)或PDl (程序性細(xì)胞死亡 1))上的此類分子，或者靶向可溶性免疫抑制分子(諸如TGF beta(轉(zhuǎn)化生長因子)、IL-10、 VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)、C0X2 (環(huán)氧化酶2))。作為對調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答具有影響的藥劑的實(shí)例，提出細(xì)胞毒劑，其能殺死調(diào)節(jié)T細(xì)胞或其他免疫抑制細(xì)胞，或者其能阻斷它們的活性和/或發(fā)育和/或積聚。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，調(diào)整調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答特別是調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的藥劑是化學(xué)治療劑。特別地，其選自已知作為抗癌劑并用在化學(xué)治療中的化學(xué)治療劑。此類藥劑包括有助于降低腫瘤負(fù)荷的那些藥劑、通過增加腫瘤細(xì)胞對治療的靈敏度而作用的那些藥劑，或者能夠殺死或鈍化免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的那些藥劑。在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的化學(xué)治療劑因此增強(qiáng)抗腫瘤免疫。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，化學(xué)治療劑是烷化劑。特別地，其為環(huán)磷酰胺(CTX) (Sigma, Steinheim, Germany)。環(huán)磷酰胺能夠排除或鈍化調(diào)節(jié)T細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
中，化學(xué)治療劑是嵌入劑。在一個具體實(shí)施方式
中，化學(xué)治療劑是阿霉素(DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)?；瘜W(xué)治療劑有利地以低劑量施用。突變CyaA多肽或其多肽衍生物還可以與佐劑組分一起施用，該佐劑組分適合激活由患者中的腫瘤引發(fā)的先天免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述佐劑組分選自核酸、肽聚糖、糖類、肽、細(xì)胞因子、激素和小分子，其中所述佐劑組分能夠經(jīng)過圖式識別受體(PRR)發(fā)信號。已知PRRs通過識別來自病原體的所謂的進(jìn)化保守標(biāo)記(病原體相關(guān)性分子圖式、 PAMPs)而介導(dǎo)對病原體以及對腫瘤的先天免疫應(yīng)答。PRR存在于多種免疫細(xì)胞上，所述免疫細(xì)胞包括樹枝狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞，以及還存在于一些非免疫細(xì)胞諸如上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上。PRR及其參與先天免疫應(yīng)答描述于I^ashine A.等中(Nature medicine supplement volume 11, N° 4, April 2005)。具體而言，用于激活先天免疫應(yīng)答的佐劑組分可以靶向PRR并因此通過PRR激活發(fā)信號，其中所述PRR包括Toll-樣受體或核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)或C型凝集素。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述佐劑組分是Toll-樣受體(TLR)激動劑。所述 Toll-樣受體激動劑特別被配制為有效激活患者的先天免疫系統(tǒng)。所述TLR激動劑能夠結(jié)合TLR，即，其為TLR的配體，并且還能夠增強(qiáng)在所述TLR的控制下引發(fā)的免疫應(yīng)答。為了說明起見，TLR激動劑選自TLR-9、TLR-8、TLR-3和TLR-7激動劑。然而，其他 TLR受體的激動劑可用于實(shí)施本發(fā)明，諸如TLR2、TLR4、TLR5受體的激動劑。在本發(fā)明中所用的TLR激動劑可以是天然或合成的激動劑。其可以是相同或不同toll-樣受體的不同激動劑的組合。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，所述TLR激動劑是免疫刺激核苷酸序列，特別是穩(wěn)定的核苷酸序列，例如作為結(jié)構(gòu)修飾諸如硫代磷酸修飾的結(jié)果進(jìn)行的穩(wěn)定化。核苷酸序列還可以被保護(hù)免于特定配制物引起的降解。特別地，其脂質(zhì)體配制物，例如脂質(zhì)體混懸液， 對有效施用免疫刺激核苷酸序列可以是有利的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，免疫刺激核酸序列是單鏈RNA。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，免疫刺激核苷酸序列包括CpG基序，而且特別是CpG 寡核苷酸(CpG ODNs) 0作為合適的CpG寡核苷酸的實(shí)例，本發(fā)明提供TLR-9配體，諸如A型 CpG 0DN，S卩，具有核苷酸序列 5，-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3，的 CpG 2216，或 B 型 CpG 0DN, 即，具有核苷酸序列 5，-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3，的 CpG 1 擬6。CpG寡核苷酸可以在與DOTAP (Roche Manheim, Germany)復(fù)合之后使用，以便保護(hù)其免于降解以及促進(jìn)其吸收。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
，所述TLR激動劑是小分子。適合作為TLR激動劑的小分子例如是咪唑并喹啉胺衍生物，諸如命名為R848(瑞喹莫德)的咪唑并喹啉胺衍生物，即，4-氨基-2-乙氧甲基_a，a、二甲基-I-H-咪唑并W，5c]喹啉乙醇，得自 hvivogen，，其為TLR-7配體，或者命名為R837 (imiqimod)的咪唑并喹啉胺衍生物，得自 Aldara，其為TLR-7激動劑。適合作為TLR激動劑的其他分子是作為TLR-3配體的聚尿苷(pU)或者作為TLR-7 配體的聚胞苷酸(PIC)。這些分子可被配制成促進(jìn)其吸收和/或保護(hù)其免于降解。這些分子還可以作為脂質(zhì)體配制物制得，特別是作為脂質(zhì)體混懸液，用于適用給患者。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
，所述佐劑組分可以是細(xì)胞類佐劑組分。其實(shí)例為樹枝狀細(xì)胞，該樹枝狀細(xì)胞抑制能夠引發(fā)淋巴細(xì)胞應(yīng)答，此類樹枝狀細(xì)胞在其施用之前能夠先體外后體內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便增加其T細(xì)胞應(yīng)答刺激活性。樹枝狀細(xì)胞因此能夠用與 PRR相互作用的佐劑來刺激，包括TLR配體或激動劑(Pashine A. et al Nature Medicine Supplement Volume 11, N° 4, April 2005 ρ S63-S68)?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的多肽或多肽衍生物可在無佐劑時施用給患者。事實(shí)上，發(fā)明人之前已經(jīng)表明，在單次靜脈注射重組毒素之后，可以體內(nèi)引發(fā)對載體化抗原(vectorized antigen)特異性的CTL，特別是無需提供異源佐劑。這些結(jié)果，特別是表位對骨髓樹枝狀細(xì)胞的特異性靶向?qū)崿F(xiàn)了無需佐劑和CD4+T細(xì)胞協(xié)助。因此，本發(fā)明還涉及與分子特別是受關(guān)注的肽相重組的突變CyaA多肽制備組合物的應(yīng)用，該組合物配制用于靜脈施用并且能夠體內(nèi)實(shí)施CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，所述組合物不含異源佐劑。本發(fā)明同樣還涉及這種組合物。本發(fā)明還涉及治療方法，包括向患有選自瘤形成、癌癥和傳染病的疾病的動物或人類患者施用根據(jù)本發(fā)明的突變多肽或多肽衍生物，所述傳染病選自病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)菌或真菌誘發(fā)的疾病。突變多肽或多肽衍生物具體而言可以與治療活性分子和/或佐劑一起施用。突變CyaA多肽或多肽衍生物、治療活性分子和/或佐劑可以作為藥物組合物的一部分一起施用，該藥物組合物不含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
可選地，本文所述的實(shí)施本發(fā)明的各種分子類型在時間上可以同時施用(特別是對于突變CyaA多肽或多肽衍生物和佐劑)或者在時間上分開施用(特別是對于突變CyaA 多肽)。在施用突變CyaA多肽或多肽衍生物和/或佐劑之前和之后，可以可選地實(shí)施治療活性分子的施用。其在時間上可以是順序的?？梢圆杉{的具體療法是重復(fù)施用方案，特別是這樣的方案，其包括兩輪或更多輪施用至少一種選自突變CyaA多肽或多肽衍生物、治療活性劑和/或佐劑的化合物。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的突變CyaA多肽或多肽衍生物、藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑以及任選的佐劑和/或另一種治療活性分子。本發(fā)明還涉及組分的試劑盒，其包含突變CyaA多肽或多肽衍生物、治療活性分子和/或佐劑。本發(fā)明組分試劑盒或組合物的化合物尤其可通過靜脈施用、瘤內(nèi)施用或皮下施用而被給予患者。本發(fā)明的組分試劑盒或組合物具有下述能力(i)通過本申請公開的突變CyaA多肽或多肽衍生物靶向適應(yīng)性免疫應(yīng)答，(ii)通過治療活性劑下調(diào)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，以及如果佐劑存在的話，(iii)通過經(jīng)佐劑激活所述先天應(yīng)答而靶向免疫應(yīng)答的先天成分。本發(fā)明還涉及治療需要本文所公開的組分試劑盒或組合物的組分的患者的方法， 所述患者為人類或動物患者，包括施用本文所公開的組分試劑盒或組合物的組分的步驟。本發(fā)明具體而言還涉及新型免疫原性組合物，其被配制為在動物或人類宿主中施用，特別是靜脈施用，特征在于其包含重組CyaA多肽衍生物，該衍生物包括插入催化結(jié)構(gòu)域中的抗原。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在人類或動物中施用的藥物組合物，其配制為使受關(guān)注的分子特異性靶向CDllb表達(dá)細(xì)胞，特征在于所述關(guān)注分子如本文所述與突變CyaA多肽偶聯(lián)。在另一個具體實(shí)施方式
中，所述藥物或免疫原性組合物包含編碼重組CyaA多肽衍生物的核酸構(gòu)建物，所述重組CyaA多肽衍生物包含如本文定義的、與關(guān)注分子偶聯(lián)的 CyaA突變多肽。此外，本發(fā)明還涉及如上所定義的免疫原性組合物在制備用于施用給動物或人類宿主的疫苗或免疫治療組合物方面的應(yīng)用。如本文所用的，術(shù)語“免疫治療組合物”涉及下述組合物，其導(dǎo)致免疫應(yīng)答，而且其與治療性治療相關(guān)，諸如對抗瘤形成、癌癥、病毒感染、真菌感染、寄生蟲感染或細(xì)菌感染的治療。本發(fā)明還涉及使動物或人類宿主免疫的方法，其中所述方法包括下述步驟a)提供如上定義的免疫原性組合物；b)向所述宿主施用所述免疫原性組合物，優(yōu)選經(jīng)由靜脈內(nèi)途徑，以便促進(jìn)免疫應(yīng)答。具體而言，本發(fā)明的免疫原性組合物能夠體內(nèi)或體外誘導(dǎo)或刺激涉及特異性樹枝狀細(xì)胞的免疫細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物具體而言可用于對患者的預(yù)防或治療接種。
因此，在一個具體實(shí)施方式
中，所述免疫原性或藥物組合物有利地不含本領(lǐng)域中常用的引發(fā)助劑(priming adjuvant)，諸如氫氧化鋁。本發(fā)明還涉及制備適合將目標(biāo)分子遞送到細(xì)胞中的蛋白質(zhì)載體的方法，包括使目標(biāo)分子與如本文定義的CyaA突變多肽結(jié)合。本發(fā)明還涉及核酸分子，具體而言DNA或RNA分子，其編碼如上定義的多肽或多肽衍生物。本發(fā)明還涉及真核或原核細(xì)胞，其包含如上所定義的核酸分子。本發(fā)明也涉及真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，其包含如上所定義的突變CyaA多肽或多肽衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。本發(fā)明還涉及真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，其用如上所定義的蛋白質(zhì)載體轉(zhuǎn)化。


圖1.在成孔和?；Y(jié)構(gòu)域中的置換協(xié)同作用減小CyaA的特異性溶血活性。㈧ 將TNC緩沖液中的綿羊紅細(xì)胞(5x107ml)用5 μ g/ml酶促活性CyaA蛋白質(zhì)在37°C溫育。 30min后，將等分試樣的細(xì)胞懸液反復(fù)洗滌以去除未結(jié)合CyaA，并用來測定細(xì)胞伴隨和細(xì)胞浸入AC活性。在溫育5小時后測量溶血活性，其為光度測定(A541)的已釋放血紅蛋白的量。完整CyaA的活性取為100%。(B)如上用所示濃度的酶促活性CyaA衍生蛋白質(zhì)溫育紅細(xì)胞30分鐘，洗滌，測定細(xì)胞結(jié)合AC酶活性的量。(C)具有K860R置換的蛋白質(zhì)與細(xì)胞結(jié)合活性的降低通過使其濃度從5 μ g/ml增至25 μ g/ml來補(bǔ)償。所存在的CyaA/2330VA(CyaA/ OVA)的活性取值為100%。結(jié)果表示來自重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行的至少三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。 星號表示來自CyaA活性(圖1A)或CyaA/0VA(圖1C)活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(**，ρ < 0. 001)。圖 2. CyaA/0VA/E570Q+K860R 結(jié)合并易位到 CDl Ib+單核細(xì)胞中。(A) J774A. 1 細(xì)胞 (106/ml)在D-MEM中在4°C用2. 5 μ g/ml CyaA溫育30分鐘，反復(fù)洗滌，并在細(xì)胞溶解物中測定細(xì)胞結(jié)合AC活性的量。為封閉⑶lib/⑶18受體，將細(xì)胞用10 μ g/ml終濃度的⑶lib-特異性抗體 Ml/70(Exbio、Czech Republic)溫育 30 分鐘，之后添加 CyaA(**，ρ < 0. 001)。 (B)構(gòu)建物的AC結(jié)構(gòu)域易位能力被評價為穿透細(xì)胞并將胞質(zhì)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP的能力。在 37°C, J774A. 1細(xì)胞用CyaA構(gòu)建物溫育30分鐘，測定在細(xì)胞溶解物中累積的cAMP的量 01)。作為對照，如上用抗-⑶lib抗體M1/70封閉⑶lib/⑶18受體。通過使用雙重突變 CyaA/E570K+E581P變體，控制CDl lb/CD 18-結(jié)合且內(nèi)吞毒素的膜穿透，所述雙重突變CyaA/ E570K+E581P變體對于受體結(jié)合而言是完整的，但是不能將AC結(jié)構(gòu)域跨過細(xì)胞膜易位以及升高胞質(zhì) cAMP 濃度(Vojtova-Vodolanova 等，2009)。(C)在 Pluronic F-127
的存在下，J774A. 1細(xì)胞用K+敏感性熒光探針PBFI/AM以9.5 4 11最終外濃度于25°〇裝載45min。在HBSS中洗滌細(xì)胞，之后添加3 μ g ml—1所示毒素。每1 記錄反映胞內(nèi)K+濃度的PBFI熒光強(qiáng)度比(激發(fā)波長340，發(fā)射波長450和510nm)。右側(cè)標(biāo)尺顯示得自校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的胞內(nèi)[K+]值(參見實(shí)驗(yàn)步驟)。在測定的時間間隔內(nèi)沒有觀察到細(xì)胞溶解，其以乳酸脫氫酶釋放評價。顯示了代表重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行的獨(dú)立測定的結(jié)果。圖3. E570Q+K860R類毒素不透化J774A. 1細(xì)胞。(A) J774A. 1細(xì)胞的溶解測定為用3、10和30 μ g πιΓ1所示蛋白質(zhì)以37%在無血清的DMEM中溫育3小時后從IO5細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶的量。所述結(jié)果表示在以重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行兩個實(shí)驗(yàn)中獲得的值的平均數(shù)。(B) 如在材料和方法中所述，在室溫下暴露于1或10 ii g/ml CyaA/2330VA/AC_或CyaA/2330VA/ E570Q+K860R/AC_蛋白質(zhì)的單J774A. 1細(xì)胞上，進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗測量。所示的曲線代表3 個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的六個測定。圖4.含E570Q+K860R置換的類毒素遞送OVA T細(xì)胞表位，用于呈遞MHC類別 I分子的呈遞以及⑶8+CTLs的誘導(dǎo)。㈧在所示濃度(0至60nM)的、包埋OVA表位或 具有模擬CyaA/AC_的類毒素的存在下，溫育用作APCs的BMDC(3xl05細(xì)胞/孔)。在與 B3Z T細(xì)胞(IxlO5細(xì)胞/孔)共培養(yǎng)M小時后，通過CTLL增殖方法測定由刺激B3Z細(xì) 胞引發(fā)的IL-2分泌。結(jié)果表達(dá)為所引入的[3H]胸苷的Acpm(類毒素存在時的cpm-毒 素不存在時的cpm) 士SD，并且其代表五個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(B)分析通過體內(nèi)殺傷測定誘導(dǎo)的 OVA (SIINFEKL)-特異性CTL應(yīng)答。在第0天，小鼠接受50mg靜脈注射的模擬AC_或OVA/ AC_類毒素，在第7天，對小鼠靜脈注射OVA (SIINFEKL)肽加載的CFSEs和未加載的CFSEte 脾細(xì)胞混合物(1 1)。通過FACS分析，測定20小時后脾臟中保留的CFSE-正細(xì)胞數(shù)目， 如在上圖曲線集合中一個代表性體內(nèi)殺傷測定所記錄的，其中指出了在出口(gate)中的 細(xì)胞百分比。下圖顯示三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)殺傷測定的匯集結(jié)果。斯氏t檢驗(yàn)測定統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著性(0VA/ACT 對 0VA/E570Q+K860R/ACT，p = 0. 75)。圖5. CyaA對膜作用的模型。(A)所述模型預(yù)測在溶液中兩種CyaA構(gòu)象體之間的 平衡，其中每一個以不同構(gòu)型被插入細(xì)胞膜中。一個將產(chǎn)生單體CyaA易位前體，將AC結(jié)構(gòu) 域遞送到胞質(zhì)溶膠中并使鈣離子伴隨流入細(xì)胞中。所述構(gòu)象體將作為孔前體寡聚化插入 CyaA孔中。(B) E570Q和K860R置換的協(xié)同效應(yīng)將選擇性阻斷CyaA孔前體寡聚進(jìn)入孔中的 能力，而越過膜遞送AC結(jié)構(gòu)域的易位前體的能力保持不受影響。圖6.百日咳博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(SEQ ID N。1)。圖7.百日咳博德特氏菌CyaA/E570Q+K860R突變體的氨基酸序列(SEQ ID N0 2)。圖8.百日咳博德特氏菌CyaA/E570Q+K860R/AC_突變體的氨基酸序列(SEQ ID N° 3)。圖9.百日咳博德特氏菌CyaA/2330VA/E570Q+K860R/AC_突變體的氨基酸序列 (SEQ ID N° 4)。圖 10.編碼 CyaA/E570Q+K860R/A(T 突變體的質(zhì)粒 ^R-A(T)。圖 11 編碼 CyaA/E570Q+K860R/A(T 突變體的 QR-ACT 質(zhì)粒的 DNA 序列(SEQ ID
N° 5)。圖 12.編碼 CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突變體的質(zhì)粒(OVA-QR-ACT)。圖 13.編碼 CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突變體的 OVA-QR-ACT 質(zhì)粒的 DNA 序列 (SEQ ID N° 6)。圖14.副百日咳博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登記號CAB76450、SEQ ID
N° 7)。圖15.欣氏博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登記號AAY57201、SEQ ID N° 8)。圖16.支氣管敗血性博德特氏菌CyaA毒素的氨基酸序列(登記號CAA85481、SEQ ID N° 鍆。實(shí)施例腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶毒素越過靶細(xì)胞膜易位而不形成孔材料和方法CyaA蛋白質(zhì)的構(gòu)建、生產(chǎn)和純化。先前描述了產(chǎn)生CyaA/AC_、CyaA/2330VA、 CyaA/E570Q和CyaA/K860R構(gòu)建物的修飾(13、20、21)，并且這些修飾被單獨(dú)或組合地引入 CyaA/2330VA/AC_中。CyaA-衍生蛋白質(zhì)在大腸桿菌XL-I Blue中生產(chǎn)并純化接近均質(zhì)，如前所述09)。在疏水色譜法期間，將帶有結(jié)合毒素的樹脂用60%異丙醇反復(fù)洗滌(30)，以降低CyaA樣品的內(nèi)毒素含量至低于100IU/mg蛋白質(zhì)，如通過LAL assay QCL-1000 (Cambrex) 所測。含編碼CyaA/E570Q+K860R/AC_突變體的QR-AC—質(zhì)粒(圖10)的大腸桿菌 XLl-Blue菌株(Stratagene)于2009年3月18日以登記號CNCM 1-4136(圖10)保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)。QR-ACT質(zhì)粒的 DNA序列(SEQ ID N。5)公開在圖11中。含編碼CyaA/2330VA/E570Q+K860R/A(T 突變體的 OVA-QR-ACT 質(zhì)粒(圖 12)的大腸桿菌XLl-Blue菌株(Stratagene)于2009年3月18日以登記號CNCM 1-4137(圖10)保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)。 OVA-QR-ACT質(zhì)粒的DNA序列(SEQ ID N0 6)公開在圖13中。在綿羊紅細(xì)胞上的細(xì)胞結(jié)合和紅外溶血活性。將在50mM Tris pH 7. 4、150mM NaCl和2mM CaCl2 (TNC緩沖液)中的5xl08已洗綿羊紅細(xì)胞在370Cffi 5 μ g/ml CyaA蛋白質(zhì)溫育，并如先前詳細(xì)所述測定CyaA的細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞入侵AC溶血活性(13)。利用單向方 WMfi^ (ANOVA) UR Bonferroni post-test (SigmaStat v. 3. ll>Systat>San Jose>CA) 分析活性值的差異顯著性。CyaA的巨噬細(xì)胞結(jié)合、cAMP提高以及溶細(xì)胞能力。使J774. Al鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(ATCC、編號TIB-67)在濕潤空氣/0)2(19 1)氣氛中在補(bǔ)充有10% (ν/ν)熱滅活胎牛血清、青霉素(100IU ml—1)、鏈霉素(100 μ g ml—1)和兩性霉素B(250ng ml—1)的RPMl培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在測定前，用不含F(xiàn)CS的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (1.9mM Ca2+)代替RPM1，并使細(xì)胞在DMEM中于37°C在濕潤5% CO2氣氛(8)中保持lh。使J774A. 1巨噬細(xì)胞(106)在D-MEM中用2. 5 μ g/ml CyaA變體在4°C溫育30min，之后通過在D-MEM洗三次去除未結(jié)合的毒素。將細(xì)胞用0. 1% Triton X_100溶化，測定細(xì)胞結(jié)合AC活性。對于胞內(nèi)cAMP測定，使IO5細(xì)胞用CyaA在含100 μ M IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)的D-MEM 中溫育30分鐘，通過添加在IOOmM HCl中的0. 2% Tween-20終止反應(yīng)，使樣品在100°C煮沸15min，通過添加150mM未緩沖咪唑中和，并入所述測量cAMPQ9)。為封閉⑶lib/⑶18 受體，將細(xì)胞在冰上用CDl Ib-特異性封閉MAb Ml/70(Exbio、Czech Republic)以IOyg/ ml的終濃度預(yù)溫育30分鐘，之后添加CyaA。利用CytoTox 96試劑盒檢驗(yàn)(ftOmega)測定毒素誘導(dǎo)的J774A. 1細(xì)胞，其為用10 μ g/ml適宜蛋白質(zhì)在37°C在D-MEM中溫育3小時時從 IO5細(xì)胞中所釋放的乳酸脫氫酶的量，如所述(8)。如上分析活性值的差異顯著性。膜片鉗測量。在浸入HBSS(140mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、3mM MgCl2UOmM H印eS-Na、50mM葡萄糖；pH 7. 4)中的J774A. 1細(xì)胞上進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗測量。使外徑約3口111的燒邊玻璃微量加液器填充1251111葡萄糖酸鉀、151111 KC1、0. 5mM CaCl2UmM MgCl2、5mM EGTAUOmM HEPES-KOH pH 7. 2的溶液。所得到的微電極的電阻是3至5ΜΩ。在-40mV夾細(xì)胞，在IkHz濾過數(shù)據(jù)，在2kHz利用Axopatch 200A放大器、Digidata 1320A數(shù)字轉(zhuǎn)換器和 PClamp-9 軟件包(Axon Instruments, Foster City、CA)使數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)化。胞質(zhì)K+濃度降低的測定。在HBSS中洗滌在蓋玻片上生長的細(xì)胞，并在0.05% (w/ w)Pluronic F-127 (Sigma、St. Louis、MO)的存在下在 25°C加載 9. 5 μ M PFBI 乙酰氧基甲酯(PBFI/AM、Molecular Probes、Eugene、OR、USA) 30min。在 25°C利用裝備有 DataMax 軟件的FluoroMax-3熒光分光光度計(jì)(Jobin Yvon Horriba,France)進(jìn)行放射測量。每15s 記錄PBFl的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長340，發(fā)射波長450和510nm)，并且每個波長的積分時間是3s。顯示450/510nm波長比。所觀察到的安裝在Icm小池中的蓋玻片面積是約10mm2， 對應(yīng)于約IO4細(xì)胞。在分別含各種濃度的醋酸鉀(10、30、60或140mM)和醋酸鈉(135、115、 85或5mM)的50mM HEPES、pH 7. 2中，在用3pM真菌霉素或尼日利亞菌素透化30分鐘的細(xì)胞上，在進(jìn)行校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)。最終的強(qiáng)度比G50/510nm)示于繪圖的右側(cè)垂直軸上。小鼠和細(xì)胞系。使得自Charles River Laboratories的雌性C57BL/6保持在無特異性抗原條件下并根據(jù)慣例指導(dǎo)處理。CTLL-2細(xì)胞得自ATCC.B3Z，對Kb限制 OVA(SIINFEKL)表位具有特異性的CD8+特異性T細(xì)胞雜交瘤由N. Shastri (University of California, Berkeley)提供，并在 lmg/ml G418 和 400 μ g/ml 潮霉素 B 的存在下，在含 10% 熱滅活FCS、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和2-ME的完全RPMI 1640培養(yǎng)基 (Invitrogen Life Technologies)中保存?？乖蔬f研究。使用作APC的骨髓樹枝狀細(xì)胞(BMDC，3xl05/孔)在攜帶 OVA(SIINFEKL)表位或模擬CyaA/AC_的各種濃度(O至60nM)的重組CyaA/0VA/AC_的存在下溫育，并與選擇性識別OVA SIINFEKL/H-2Kb MHC類別I復(fù)合物的B3Z T細(xì)胞(IxlO5/孔) 共培養(yǎng)M小時。在培養(yǎng)1 之后，使上清液在_80°C冷凍至少池。然后通過CTLL增殖方法測定由刺激B3Z細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2的量。簡言之，將IO4細(xì)胞的IL-2-依賴性CTLL系/ 孔用100 μ 1上清液培養(yǎng)，終體積為200 μ 1。24小時后，添加[3H]-胸苷(5(^以/孔)，611 后用自動化細(xì)胞收集器收集細(xì)胞。通過閃爍計(jì)數(shù)檢測所引入的[3H]-胸苷。每個點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行，并使實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。結(jié)果以所引入[3H]-胸苷的Acpm表達(dá)(類毒素存在下的cpm-類毒素不存在下的cpm)。體內(nèi)殺傷測定。對于CTL引發(fā)，通過靜脈注射50yg攜帶OVA(SIINFEKL)表位或模擬CyaA/AC—的重組CyaA/OVA/AC—使小鼠免疫。免疫接種后7天，幼稚同源脾細(xì)胞被脈沖 OVA(SIINFEKL)肽(10 μ g/ml) (30min、37°C )，充分洗滌，并用高濃度(1.25μΜ)羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE ；Molecular Probes、Eugene、OR)標(biāo)記。非脈沖對照群體用低濃度 (0. 125 μ M)CFSE標(biāo)記。CFSE髙-和CFSEffi-標(biāo)記細(xì)胞以1 1比例混合(每個種群5χ106 個細(xì)胞)，并靜脈注射到小鼠中。20h后收集脾細(xì)胞，洗滌，并再懸浮于FACS緩沖液(補(bǔ)充有1 % BSA和0. 1 % NaN3的PBS)中。通過FACS測定20h后保留在脾中的CFSE-正細(xì)胞的數(shù)目。如下計(jì)算特異性溶解的百分比特異性溶解百分比=100-[100X((%CFSE 免疫小鼠 /% CFSEte免疫小鼠)/(% CFSEs初次接受試驗(yàn)小鼠1% CFSEte初次接受試驗(yàn)小鼠)]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用單向方差分析法(ANOVA)以及Bonferroni post-test (SigmaStat ν· 3. 11、Systat、San Jose、CA)分析值的差異顯著性。
結(jié)果負(fù)電荷谷氨酸570和?；嚢彼?60的聯(lián)合消除破壞了 CyaA的細(xì)胞透化能力。 CyaA作用的工作模型預(yù)測，可對CyaA進(jìn)行修飾，以失去其成孔(溶血)活性，同時保留其將AC結(jié)構(gòu)域遞送到靶細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的能力。為測試這種假設(shè)，基于先前的觀察，即CyaA/ AC—類毒素溶解細(xì)胞的能力可以通過在成孔結(jié)構(gòu)域內(nèi)的刺激而進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，發(fā)明人尋求生產(chǎn)可展示盡可能低溶血和溶細(xì)胞活性的CyaA構(gòu)建物(8、12-14、18)。同時為了能夠評價CyaA/AC—類毒素的靶細(xì)胞穿透，發(fā)明人從之前通過從卵清蛋白(OVA)插入SIINFEKL肽而被標(biāo)記的CyaA/2330VA毒素得到此類突變體。選擇這種CyaA變體是因?yàn)樵跉埢?33處插入報(bào)道基因Kb-限制CD8+T-細(xì)胞表位不影響AC活性，并將0VA/AC酶進(jìn)入細(xì)胞中的易位量化為胞質(zhì)cAMP的提高。更重要的是，OVA表位的存在還允許評價酶促無活性CyaA/2330VA/ 八(7類毒素將其^^/^(7結(jié)構(gòu)域遞送到001113+抗原呈遞細(xì)胞(APC)的胞質(zhì)溶膠中的能力，因?yàn)槟軌蜻M(jìn)行蛋白酶體加工以及OVA表位在MHC類別I糖蛋白上的細(xì)胞表面呈遞，其可被測定為對OVA-特異性CD8+T細(xì)胞的體外及體內(nèi)刺激00)。為產(chǎn)生可能缺乏溶細(xì)胞活性的CyaA/AC_類毒素，發(fā)明人組合了先前所示的E570Q 和K860R置換，以降低CyaA對綿羊紅細(xì)胞的特異性溶血活性，其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E570Q置換也降低CyaA/AC_對⑶llb+J774A. 1單核細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(8、1；3)。使這些置換單獨(dú)及組合地基因工程進(jìn)入CyaA/^SOVA/ACT中，并比較所得到的類毒素的特異性溶血和溶細(xì)胞活性， 利用綿羊紅細(xì)胞作為模型⑶llb_靶以及利用J774A. 1作為平行的模型⑶Ilb+靶(表I)。 與先前利用缺乏OVA表位的類毒素觀察到的結(jié)果0、8、13、21) —致，在所用的條件下，與 0VA/AC—相比，單獨(dú)攜帶E570Q和K860R置換的0VA/AC—類毒素在紅細(xì)胞上分別顯示降低兩倍(55士8)和零(1 士 1)相對溶血活性，而且E570Q類毒素對⑶lib-表達(dá)J774A. 1細(xì)胞的相對溶細(xì)胞活性也降低(37士 10)。進(jìn)而，如根據(jù)利用酶促活性K860R構(gòu)建物所獲得的結(jié)果所預(yù)期的，盡管在⑶1 lb_紅細(xì)胞上的溶血活性低，但是K860R類毒素在⑶1 lb+J774A. 1細(xì)胞上僅顯示稍微降低的相對溶細(xì)胞活性(72士22%)，這證實(shí)由K860R置換引起的結(jié)構(gòu)缺陷由于與⑶lib/⑶18受體相互作用而得以補(bǔ)救0)。然而，當(dāng)與E570Q組合時，K860R置換在降低E570Q+K860R構(gòu)建物對J774A. 1細(xì)胞的相對溶細(xì)胞活性上顯示出明確的協(xié)同效應(yīng)，低至 14 士 7%。表I :0VA/AC_和衍生物對綿羊紅細(xì)胞和J774A. 1巨噬細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其為腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)的突變體(突變多肽)，并且其氨基酸序列包含下述序列之一或由下述序列之一組成a)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶 (CyaA)的氨基酸序列，其中已經(jīng)進(jìn)行下述突變(i)570位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基(E570Q)或被保守氨基酸殘基置換，和(ii)860位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基(K860I )或被保守氨基酸殘基置換，或；b)百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或欣氏博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶片段的氨基酸序列，該片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其 N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述片段還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的570位和860位的下述突變氨基酸殘基E570Q和K860R，或c)氨基酸序列，由于一個或更多個氨基酸殘基置換和/或插入，其不同于如在a)或b) 中定義的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述氨基酸序列還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的570位和860位的下述突變氨基酸殘基E570Q和K860R，或d)支氣管敗血性博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)的氨基酸序列，其中已經(jīng)進(jìn)行下述突變(i)569位的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基(E569Q)或被保守氨基酸殘基置換，和(ii)859位的賴氨酸殘基被精氨酸殘基(K859R)或被保守氨基酸殘基置換，或；e)支氣管敗血性博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶片段的氨基酸序列，該片段具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述 N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述片段還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的569位和859位的下述突變氨基酸殘基E569Q和K859R，或f)氨基酸序列，由于一個或更多個氨基酸殘基置換和/或插入，其不同于如在d)或e) 中定義的氨基酸序列，并且其具有百日咳博德特氏菌的CyaA蛋白質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞的能力以及使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域或所述N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域的部分易位進(jìn)入所述細(xì)胞中的能力，其中所述氨基酸序列還含有位于所述腺苷酸環(huán)化酶的569位和859位的下述突變氨基酸殘基E569Q和K859R。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的腺苷酸環(huán)化酶氨基酸序列如SEQ ID N0 1所公開。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由于1至200個氨基酸置換、缺失和/或插入而不同于SEQ ID N0 1的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其能夠與細(xì)胞結(jié)合并使其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域易位到所述細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞表達(dá)CDllb/CD18受體并且其中與所述細(xì)胞的結(jié)合通過與所述⑶lib/⑶18受體的結(jié)合而發(fā)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的多肽，其是腺苷酸環(huán)化酶類毒素的突變體，其在細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶活性與百日咳博德特氏菌CyaA毒素的腺苷酸環(huán)化酶活性相比被部分或完全抑制。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述腺苷酸環(huán)化酶活性的部分或完全抑制是通過具體是在SEQ ID N0 1的百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶的188和189位的氨基酸殘基之間插入二肽而達(dá)到的。
7.一種多肽衍生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的多肽或由根據(jù)權(quán)利要求 1至6任一項(xiàng)所述的多肽組成，并且其還與一種或更多種受關(guān)注的分子結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽衍生物，其中所述一種或更多種受關(guān)注的分子中的每一種由適合引發(fā)免疫應(yīng)答的氨基酸序列組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽衍生物，其中所述適合引發(fā)免疫應(yīng)答的分子中的每一種的氨基酸序列由5至300、特別是300至600或者400至500個氨基酸殘基組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多肽衍生物，其中所述適合引發(fā)免疫應(yīng)答的分子中的每一種的氨基酸序列包含下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列組成脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原、HIV病毒抗原、流感病毒抗原、脈絡(luò)叢腦膜炎病毒序列、腫瘤抗原，或者包含任意這些含至少一種表位的抗原的氨基酸序列的一部分或由任意這些含至少一種表位的抗原的氨基酸序列的一部分組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10所述的多肽衍生物，其是重組多肽，其中所述適合引發(fā)免疫應(yīng)答的分子中的每一種的氨基酸序列被插入到所述突變多肽的腺苷酸環(huán)化酶氨基酸序列的許可位點(diǎn)中，從而保留了所述突變多肽將其N-端腺苷酸環(huán)化酶酶結(jié)構(gòu)域易位到靶細(xì)胞中的能力。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多肽衍生物，其中每一種所述適合引發(fā)免疫應(yīng)答的氨基酸序列被接枝特別是化學(xué)接枝到所述突變多肽的氨基酸殘基上。
13.在治療中應(yīng)用的根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的多肽衍生物。
14.在治療中應(yīng)用以在需要其的宿主中引發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或B-細(xì)胞免疫應(yīng)答的根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的多肽衍生物。
15.用于預(yù)防或治療選自瘤形成、癌癥和傳染病的疾病的根據(jù)權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)所述的多肽衍生物，其中所述傳染病選自病毒誘發(fā)疾病、逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)疾病、細(xì)菌誘發(fā)疾病、寄生蟲誘發(fā)疾病或真菌誘發(fā)疾病。
16.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15所述的多肽或多衍生物，其中所述多肽與佐劑聯(lián)合和/ 或與另一種治療活性分子聯(lián)合施用。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的多肽或多衍生物，其中所述多肽不與佐劑聯(lián)合施用。
18.—種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求 7至17中任一項(xiàng)所述的多肽衍生物、藥學(xué)上可接受的載體以及任選的佐劑和/或治療活性分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的多肽衍生物在制備用于治療選自瘤形成、癌癥和傳染病的疾病的治療組合物中的應(yīng)用，所述傳染病選自病毒誘發(fā)疾病或逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)疾病。
20.一種用于制備適合將分子遞送到細(xì)胞中的蛋白質(zhì)載體的方法，所述方法包括使所述分子與根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽相結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變CyaA/E570Q+K860多肽，其適合用作蛋白質(zhì)載體將一種或更多種受關(guān)注的分子遞送到細(xì)胞，特別是表達(dá)CD11b受體的細(xì)胞中。本發(fā)明還涉及適合引發(fā)宿主中的免疫應(yīng)答的多肽衍生物。本發(fā)明更具體而言涉及得自毒素或類毒素形式下的腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)(CyaA)的多肽，其為突變多肽。所述突變多肽能夠保留天然CyaA與靶細(xì)胞的結(jié)合活性，且優(yōu)選還能夠保留天然CyaA經(jīng)過其N-端結(jié)構(gòu)域進(jìn)入靶細(xì)胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，該成孔活性與天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或受抑制的。
文檔編號C12N9/88GK102439146SQ201080022547
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者A.奧西科瓦, C.法約爾, C.萊克勒克, J.克魯塞克, J.馬辛, M.巴斯勒, P.塞博, R.奧西卡 申請人:巴斯德研究院, 捷克微生物研究所, 捷克生理學(xué)研究所