專利名稱：使用短干擾核酸(siNA)的RNA干擾介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)基因表達(dá)的抑制的制作方法
使用短干擾核酸(siNA)的RNA干擾介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附分子 1 (ICAM-1)基因表達(dá)的抑制序列表
本申請(qǐng)要求于2009年3月27日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/164，314的利益。上文列出的申請(qǐng)包括附圖
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背景技術(shù)：
細(xì)胞間粘附分子1 (ICAM-1，CM4)參與白細(xì)胞粘附介導(dǎo)的炎性功能。它屬于細(xì)胞粘附分子的免疫球蛋白超家族。人ICAM-I具有五個(gè)“Ig-樣”胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短C-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ICAM-I在白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表面上表達(dá)。I CAM-1表達(dá)在炎癥位點(diǎn)上調(diào)。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)-1 (LFA-1，⑶Ila/⑶18)抗原是ICAM-I的配體。LFA-I是細(xì)胞-表面受體整聯(lián)蛋白家族的成員。LFA-I在所有白細(xì)胞的表面上表達(dá)并且對(duì)于它們的抗原-特定應(yīng)答和歸巢至關(guān)重要。LFA-I介導(dǎo)基于溶細(xì)胞偶聯(lián)物形成的白細(xì)胞粘附反應(yīng)、輔助 T-細(xì)胞相互作用和由天然殺傷細(xì)胞和粒細(xì)胞導(dǎo)致的抗體-依賴性殺傷。LFA-1/ICAM-1相互作用對(duì)于淋巴細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮以及作為正常免疫應(yīng)答的一部分它們后續(xù)外滲到周圍組織是重要的。LFA-I和ICAM-I的相互作用也涉及炎性病理學(xué)和自發(fā)免疫疾病。在與干燥綜合征(Sjogren syndrome)相關(guān)具有干眼的患者中，在人結(jié)膜上皮中ICAM-I的表達(dá)上調(diào)。哮喘惡化是常見的，并且與哮喘相關(guān)的主要發(fā)病率、死亡率和保健費(fèi)用與惡化相關(guān)。大多數(shù)惡化與病毒感染相關(guān)，雖然惡化也可由非典型的細(xì)菌感染或暴露于過敏原或其它環(huán)境刺激引起。惡化的特征在于氣道炎癥，其可在類型上不同，取決于在來源上主要是感染性還是過敏性。大約80%的惡化與呼吸道病毒感染相關(guān)，其中鼻病毒感染引起所有惡化的大約50%。除了它引發(fā)細(xì)胞間粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常功能，ICAM-I還被人病原體使用并且是人鼻病毒(HRV)主要組的細(xì)胞受體。HRV組成小核糖核酸病毒科(picoraaririi/ae)鼻病毒屬irhinovirus、的大部分。存在超過100種獨(dú)特血清型的HRV，并且這已阻礙了有效疫苗的發(fā)展?；谒鼈冞M(jìn)入細(xì)胞使用的細(xì)胞受體，HRV血清型可分為兩組。大約10%的HRV血清型組成次要受體組并利用低密度脂蛋白受體(LDLr)進(jìn)入細(xì)胞。其余90%的HRV血清型包含主要受體組并利用人細(xì)胞間粘附分子1 (ICAM-I)。人ICAM 1的兩個(gè)氨基-末端Ig-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合病毒衣殼的二十面體五倍軸周圍的“峽谷”(“canyon”)。人鼻病毒引起大約三分之二的上呼吸道感染(常見感冒)。最近更多的研究已確立了鼻病毒也可在下呼吸道(LRT)中復(fù)制。哮喘受試者比非哮喘受試者具有嚴(yán)重得多的鼻病毒LRT疾病，具有增加的支氣管超應(yīng)答和降低的肺功能。HRV可引起哮喘惡化的確切機(jī)理不清楚。在哮喘患者中，ICAM-I的表達(dá)上調(diào)，并且這可能增加哮喘患者在上呼吸道和下呼吸道中對(duì)HRV感染的易感性。感染HRV的哮喘患者的LRT癥狀的嚴(yán)重性已歸因于哮喘患者中TH2的優(yōu)勢和增強(qiáng)的Th2輔助應(yīng)答。在上呼吸道中HRV感染的上皮細(xì)胞引起可介導(dǎo)下呼吸道癥狀的多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。用可溶ICAM-I或ICAM-I特異性抗體靶向ICAM-I已顯示在體外和體內(nèi)模型中抑制HRV感染。鼻病毒感染與哮喘惡化的強(qiáng)烈相關(guān)表明預(yù)防或治療鼻病毒感染可能是預(yù)防哮喘惡化的有效途徑。因此，存在對(duì)治療鼻病毒感染的其他治療法的需要。通過RNA干擾(下文“RNAi”)改變基因表達(dá)具體而言ICAM-I基因表達(dá)是用于滿足這個(gè)需要的一種方法。RNAi通過短雙鏈RNA(“dsRNA”)分子誘導(dǎo)。短dsRNA分子稱為“短干擾RNA”或“siRNA”或“RNAi抑制劑”，沉默與siRNA共享序列同源性的信使RNAs (“mRNAs”) 的表達(dá)。這可以經(jīng)由通過包含siRNA的內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱為RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)介導(dǎo)的mRNA切割發(fā)生。靶RNA的切割一般發(fā)生于與siRNA雙鏈體的引導(dǎo)序列互補(bǔ)的區(qū)域中部(Elbashir等人，2001，Dev. , 15,188)0此外，RNA干擾還可以涉及小 RNA(例如微小RNA或miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，推測通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)且從而阻止靶基因序列的轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制(參見例如，Allshire, 2002, Science, 297，1818-1819 ；Volpe等人， 2002，Science, 297，1833-1837 Jenuwein, 2002，Science, 297，2215-2218 ；和 Hall 等人， 2002，Science, 297,2232-2237)。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了使用小核酸分子通過RNA干擾(RNAi)用于調(diào)節(jié)ICAM-I基因表達(dá)的化合物、組合物和方法，所述ICAM-I基因特別是與炎性和/或呼吸性疾病或狀況的發(fā)展或維持相關(guān)的那些ICAM-I基因。特別地，本發(fā)明的特征在于小核酸分子，即短干擾核酸(SiNA)分子，包括但不限于短干擾 RNA (siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、微小 RNA (miRNA)、短發(fā)夾 RNA (shRNA)和環(huán)狀 RNA 分子，以及用于調(diào)節(jié)ICAM-I基因和/或涉及ICAM-I基因表達(dá)和/或活性的途徑的其他基因表達(dá)的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括彼此具有互補(bǔ)性的第一條鏈和第二條鏈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中至少一條鏈包括下述的至少15個(gè)核苷酸
權(quán)利要求
1. 一種包括彼此具有互補(bǔ)性的第一條鏈和第二條鏈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子， 其中至少一條鏈包括下述的至少15個(gè)核苷酸其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸是任選化學(xué)修飾的。
2.權(quán)利要求1的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所有所述核苷酸是未修飾的。
3.權(quán)利要求1的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中至少一個(gè)核苷酸是化學(xué)修飾的核苷酸。
4.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-脫氧-2’-氟核苷酸。
5.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-脫氧核苷酸。
6.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-0-烷基核苷酸。
7.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括具有有義鏈和反義鏈的式(A)
8.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a) N5i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；(I3)^i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；(c) Nx3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；和(Cl)^i3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a) N5i4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；(I3)N5i4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中X5是3。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中Xl是2，并且X2是2。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中X5是3，Xl是2，并且X2是2。
16.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 1、2或3 ;X1和X2各自 =1 或2;X3 = 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30，和 X4 = 15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
17.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 1 ;X1和X2各自=2 ； X3 = 19，和 X4 = 18。
18.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 2 ;X1和X2各自=2 ； X3 = 19，和 X4 = 17。
19.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5是3，Xl是2，X2是2，X3 是19，并且X4是16。
20.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是 其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’ -脫氧鳥苷； T是胸苷； G是鳥苷； U是尿苷； A是腺苷；A是2’ -0-甲基-腺苷； Q是2’-0_甲基-鳥苷；Π是2’ -0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
22.—種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中siNA是
23.根據(jù)權(quán)利要求22的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
24.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
25.根據(jù)權(quán)利要求M的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
26.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
28.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
29.根據(jù)權(quán)利要求觀的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
30.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是5' 3 βΛ c Λ u Λ c ΛΛ c U G·'Λ ι; Λ T T B J ' ( I 丨義)丨 M : ι 丨 u ι m i HM“:、其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’ -脫氧鳥苷； T是胸苷； A是腺苷； U是尿苷；Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
32.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’ -脫氧鳥苷； T是胸苷； C是胞苷； G是鳥苷； U是尿苷；A是2’ -0-甲基-腺苷； S是2’-0_甲基-鳥苷；π是2’ -0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
34.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
35.根據(jù)權(quán)利要求34的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
36.一種藥物組合物，其包括在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的權(quán)利要求1、7、20、 22、24、洸、28、30、32或；34中任一項(xiàng)的雙鏈短干擾核酸(siNA)。
37.一種藥物組合物，其包括在氣溶膠制劑中的權(quán)利要求1、7、20、22、對(duì)、26、觀、30、32 或34的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子。
38.一種治療患有狀況的人受試者的方法，所述狀況通過ICAM-I的作用或通過ICAM-I 作用的喪失介導(dǎo)，所述方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸 (siNA)分子。
39.一種治療患有狀況的人受試者的方法，所述狀況通過ICAM-I的作用或通過ICAM-I 作用的喪失介導(dǎo)，所述方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求20、22、對(duì)、26、觀、30、 32或34的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述狀況是呼吸性疾病。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述狀況是呼吸性疾病。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述呼吸性疾病選自C0PD、囊性纖維化、哮喘、嗜酸粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、肉瘤樣病、肺纖維化、鼻炎和竇炎。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述呼吸性疾病選自C0PD、囊性纖維化、哮喘、嗜酸粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、肉瘤樣病、肺纖維化、鼻炎和竇炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)ICAM-1基因表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)和/或調(diào)節(jié)ICAM-1基因表達(dá)途徑的性狀、疾病和病狀的化合物、組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及能夠介導(dǎo)針對(duì)ICAM-1基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)或介導(dǎo)針對(duì)ICAM-1基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)的雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102439152SQ201080022572
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者沙 J., 皮克林 V., 斯特拉普斯 W. 申請(qǐng)人:默沙東公司