專利名稱：有用物質(zhì)生產(chǎn)方法和該生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法和該生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑。詳細地說， 涉及在表面活性劑的存在下利用細菌進行有用物質(zhì)的分泌生產(chǎn)的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法以及在該有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑。
背景技術(shù)：
細菌被廣泛用于生產(chǎn)氨基酸、蛋白質(zhì)等有用物質(zhì)。特別是近年來，已知一種使用通過基因工程學(xué)技術(shù)導(dǎo)入醫(yī)藥上/工業(yè)上有用的蛋白質(zhì)的基因而進行了轉(zhuǎn)化的細菌來有效地生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)的技術(shù)。作為用于蛋白質(zhì)表達的細菌，作為革蘭氏陰性菌的一種的大腸桿菌是通用的。將大腸桿菌用于蛋白質(zhì)表達的技術(shù)的開發(fā)在逐漸發(fā)展，該技術(shù)被廣泛用于工業(yè)用蛋白質(zhì)、食品加工用蛋白質(zhì)和醫(yī)藥品用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中。作為提取使用大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)的方法，可列舉出超聲波、高壓均質(zhì)器和弗氏壓碎器(French press)等物理破碎法，這些方法被廣泛實用化。這些物理破碎法在取出蛋白質(zhì)的同時會使大腸桿菌的細胞死亡。因此，為了增加所得到的蛋白質(zhì)量，以下方法是有效的。1. 1增加單位細胞所表達的重組蛋白量的方法。2.增加細胞數(shù)的方法。但是，破壞大腸桿菌并從大腸桿菌中提取重組蛋白的物理破碎法等具有以下缺
點ο1.需要用于破碎大腸桿菌的設(shè)備。2.以同時被提取的基因組DNA為代表的核酸成分會使蛋白質(zhì)提取液的增稠，因此為了使純化過程進行，需要從蛋白質(zhì)提取液中除去核酸成分。3.來自大腸桿菌的蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)大量混入到蛋白質(zhì)提取液中，會導(dǎo)致毒性、 免疫原性。4.需要將大量混入的來自大腸桿菌的蛋白質(zhì)從重組蛋白中分離的純化工序。5.由于重組蛋白在大腸桿菌內(nèi)蓄積，因而生產(chǎn)量受限。6.細菌的細胞內(nèi)形成包涵體。7.重組蛋白被細胞內(nèi)的蛋白酶分解，因此無法表達所需量的重組蛋白。為了消除這些缺點，需要一種大腸桿菌將重組蛋白分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中的方法。通常，為了使用大腸桿菌將重組蛋白表達到細胞質(zhì)外，通過將內(nèi)膜移動所需要的信號肽序列與目標重組蛋白融合來進行。作為內(nèi)膜移動所需要的信號肽序列，可列舉出來自 PelB、OmpA, StII, PhoA, OmpF, PhoE, MalE, OmpC, Lpp、LamB, OmpT, LTB 和 TorA 等的信號肽序列或來自芽孢桿菌屬(Bacillus)來源的木聚糖內(nèi)切酶等的信號肽序列。融合了這些信號肽序列的重組蛋白通過大腸桿菌所具有的內(nèi)膜移動機構(gòu)％(3途徑或TAT途徑等被移動到周質(zhì)。但是，由于由于大腸桿菌在內(nèi)膜的外側(cè)具有肽聚糖層、外膜，因而通常重組蛋白不會被分泌到培養(yǎng)液中。因此，為了將重組蛋白分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中，公開了一系列方法(非專利文獻1 7)。上述現(xiàn)有技術(shù)中記載的方法具有以下缺點中的至少一種。1.大腸桿菌容易死亡，因此不適于高密度或連續(xù)生產(chǎn)。2.只能適用于特定的重組蛋白的生產(chǎn)。3.由于重組蛋白以與膜蛋白等的融合蛋白的形式進行表達，因此融合蛋白可能會對活性的表達造成影響。因而，需要切斷融合蛋白的工序，要花費費用。4.重組蛋白的表達量不充分?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻1 Jang 等，Bioproc. Eng.，21 (1999) 453-458非專利文獻2 =Yang 等，Appl. Environ. Microbiol.，64 (1998) 2669-2874非專利文獻3 Jeong 等，Appl. Environ. Microbiol.，68 (2002) 4979-4985非專利文獻4 :Van der Wal 等，Appl. Environ. Microbiol.，64 (1998) 392-398非專利文獻5 =Wan 等，Protein Expr. Purif.，14 (1998) 13-22非專利文獻6 =Fernandez 等，Appl. Environ. Microbiol. ,66(2000)5024-5029非專利文獻7 :Li 等，Gene, 25 (2002) 437-44
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種在表面活性劑的存在下使用大腸桿菌等細菌在工業(yè)規(guī)模下生產(chǎn)有用物質(zhì)(蛋白質(zhì)等)的生產(chǎn)方法以及在該有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑。用于解決課題的方案本發(fā)明人為了解決上述課題進行了深入研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及一種有用物質(zhì)生產(chǎn)方法和在該有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑，所述有用物質(zhì)生產(chǎn)方法為通過培養(yǎng)液中所含的細菌將有用物質(zhì)分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中在培養(yǎng)液中含有表面活性劑(A)，以培養(yǎng)液的體積為基準的干燥菌體密度為1. 5g/L 500g/L。發(fā)明的效果本發(fā)明可實現(xiàn)以下效果。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法能夠?qū)崿F(xiàn)有用物質(zhì)的高生產(chǎn)量。另外，通過在使用細菌生產(chǎn)有用物質(zhì)(蛋白質(zhì)等)時添加本發(fā)明的表面活性劑，能夠增大生產(chǎn)量和分泌量。


圖1是關(guān)于比較例1和實施例1的結(jié)果，曲線圖表示隨時間推移的每Ig菌體的蛋
白質(zhì)生產(chǎn)量。
圖2是關(guān)于實施例7的結(jié)果，曲線圖表示隨時間推移的培養(yǎng)液中的干燥菌體密度和所生產(chǎn)的重組蛋白濃度。圖3是表示培養(yǎng)液的濁度和干燥菌體密度的比例關(guān)系的曲線圖，用于導(dǎo)出由培養(yǎng)液的濁度計算出干燥菌體密度的公式。
具體實施例方式本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法為通過培養(yǎng)液中所含的細菌將有用物質(zhì)分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法，培養(yǎng)液中含有表面活性劑(A)，以培養(yǎng)液的體積為基準的干燥菌體密度為1. 5g/L 500g/L。作為本發(fā)明中的細菌，可列舉出以下細菌，但不限定于此。細菌包含真細菌和古細菌。真細菌包含革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。作為革蘭氏陰性細菌，可列舉出埃希氏菌屬(Escherichia)、棲熱菌屬(Thermus)、根瘤菌屬(Iihizobium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella) > iH|iiM (Vibrio)、沙門氏菌屬(Salmonella)、 醋菌屬(AcetcAacter)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)等。作為革蘭氏陽性菌，可列舉出芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Str印tmyces)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短芽 ？包桿菌屬(Brevibacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)禾口鏈霉菌屬 (Streptomyces)等中所含的細菌。其中，從有用物質(zhì)的生產(chǎn)率的方面來看，優(yōu)選為革蘭氏陰性菌，進一步優(yōu)選為埃希氏菌屬，更優(yōu)選為大腸桿菌。本發(fā)明中的有用物質(zhì)沒有特別限定，包含蛋白質(zhì)(酶、激素蛋白、抗體和肽等)、寡糖和核酸等。作為蛋白質(zhì)，可列舉出酶{氧化還原酶(膽固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、抗壞血酸氧化酶和過氧化物酶等)、水解酶(溶菌酶、蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶和葡糖淀粉酶等)、異構(gòu)化酶(葡萄糖異構(gòu)酶等)、轉(zhuǎn)移酶(脂酰基轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶等)、合成酶(脂肪酸合成酶、磷酸合成酶和檸檬酸合成酶等)和裂解酶(果膠裂解酶等) 等}、激素蛋白{骨形態(tài)生成蛋白(BMP)、干擾素α、干擾素β、白細胞介素1 12、生長激素、促紅細胞生成素、胰島素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、 利鈉肽、凝血因子VIII、生長調(diào)節(jié)素、胰高血糖素、生長激素釋放因子、血清白蛋白和降鈣素等}、抗體{單鏈抗體、IgG大亞基、IgG小亞基等}、抗原蛋白{乙型肝炎表面抗原等}、功能性蛋白IPr0Nectin(注冊商標)、抗凍肽、抗菌肽等}、熒光蛋白(GFP等)、發(fā)光蛋白(熒光素酶( >〉工，一)等)和肽(不特別限定氨基酸組成，寡肽、二肽和三肽等)等。作為寡糖，可列舉出蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、棉子糖、潘糖、環(huán)糊精、低聚半乳糖和低聚果糖等。作為核酸，可列舉出肌苷一磷酸、腺苷一磷酸和鳥苷一磷酸等。這些有用物質(zhì)中，從制備有用物質(zhì)的容易性的方面來看，優(yōu)選為蛋白質(zhì)，進一步優(yōu)選為酶和激素蛋白。有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)時，優(yōu)選蛋白質(zhì)具有以下性質(zhì)蛋白質(zhì)在細菌內(nèi)表達后，一部分或全部向周質(zhì)移動。進一步優(yōu)選為向周質(zhì)移動所需要的信號肽序列在ORF中編碼的蛋白質(zhì)。周質(zhì)是指細菌的細胞質(zhì)膜的外側(cè)至細菌的最表面的空間。作為向周質(zhì)移動所需要的信號肽序列，可列舉出Sec分泌信號肽序列、TAT分泌信號肽序列等。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑(A)為選自由兩性表面活性劑(Al)、陰離子型表面活性劑(A2)、非離子型表面活性劑(A3)和陽離子表面活性劑(A4) 組成的組中的至少1種表面活性劑。作為兩性表面活性劑(Al)，包含羧酸鹽型兩性表面活性劑(Al-I)、硫酸酯鹽型兩性表面活性劑(Al-幻、磺酸鹽型兩性表面活性劑(AH)和磷酸酯鹽型兩性表面活性劑 (Al-4)等。作為羧酸鹽型兩性表面活性劑(Al-I)，可列舉出氨基酸型兩性表面活性劑 (A1-1-1)、甜菜堿型兩性表面活性劑(A1-1-2)和咪唑啉型兩性表面活性劑(A1-1-3)等。作為氨基酸型兩性表面活性劑(A1-1-1)，為分子內(nèi)具有氨基和羧基的兩性表面活性劑，可列舉出下述通式(1)所示的化合物等。[R-NH- (CH2)n-COOlmM (1)通式(1)中，R是碳原子數(shù)為1 20的1價烴基。η是1以上的整數(shù)。m是1以上的整數(shù)。M是質(zhì)子；或是堿金屬、堿土金屬、銨(包括來自胺和烷醇胺等的陽離子)和季銨等1價或2價的陽離子。另外，作為(A1-1-1)，具體地說，可列舉出烷基氨基丙酸型兩性表面活性劑(椰油基氨基丙酸鈉、硬脂基氨基丙酸鈉和月桂基氨基丙酸鈉等)；烷基氨基乙酸型兩性表面活性劑(月桂基氨基乙酸鈉等)和N-月桂酰-N’ -羧甲基-N’ -羥乙基乙二胺鈉等。甜菜堿型兩性表面活性劑(Al-1-幻是分子內(nèi)具有季銨鹽型的陽離子部分和羧酸型的陰離子部分的兩性表面活性劑。(A1-1-2)可列舉出下述通式(2)所示的化合物。作為(Al-1-幻，具體地說，可列舉出烷基二甲基甜菜堿(十八烷基二甲基氨基乙酸甜菜堿和十二烷基二甲基氨基乙酸甜菜堿等)、酰胺甜菜堿(椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿等(椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜堿等)和月桂酰胺丙基甜菜堿等)和烷基二羥基烷基甜菜堿(月桂基二羥基乙基甜菜堿等)、氫化椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜堿等。R-N+(CH3)2-CH2COCT(2)通式(2)中，R是碳原子數(shù)為1 20的1價烴基。作為咪唑啉型兩性表面活性劑(A1-1-3)，可列舉出2-烷基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉鐺甜菜堿等。作為其他兩性表面活性劑，包含月桂酰甘氨酸鈉、月桂基二氨基乙基甘氨酸鈉、月桂基二氨基乙基甘氨酸鹽酸鹽和二辛基二氨基乙基甘氨酸鹽酸鹽等甘氨酸型兩性表面活性劑；十五烷基磺基?；撬岬然腔鸩藟A型兩性表面活性劑；膽酰胺丙基二甲氨基丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、膽酰胺丙基二甲氨基-2-羥基丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPSO)；月桂基二甲基氧化胺等烷基氧化胺型兩性表面活性劑等。作為陰離子型表面活性劑(A》，可列舉出醚羧酸(A2-1)及其鹽、硫酸酯(A2-2)或其鹽、醚硫酸酯(A2-》及其鹽、磺酸鹽(A2-4)、磺基琥珀酸鹽(A2-5)、磷酸酯(A2-6)及其鹽、醚磷酸酯(A2-7)及其鹽、脂肪酸鹽(A2-8)、酰化氨基酸鹽以及天然來源的羧酸及其鹽(鵝去氧膽酸、膽酸和脫氧膽酸等)等。作為醚羧酸(A2-1)或其鹽，包含具有烴基(碳原子數(shù)為8 的醚羧酸及其鹽。作為(A2-1)或其鹽，具體地說，可列舉出聚氧乙烯月桂基醚乙酸、聚氧乙烯月桂基醚乙酸鈉鹽、聚氧乙烯十三烷基醚乙酸鈉鹽、聚氧乙烯辛基醚乙酸鈉鹽和月桂基乙二醇乙酸鈉
^Tt. ο作為硫酸酯(A2D及其鹽，包含具有烴基(碳原子數(shù)為8 的硫酸酯及其鹽。作為(A2-2~)及其鹽，具體地說，可列舉出十二烷基硫酸鈉鹽和十二烷基硫酸三乙醇胺
^Tt.O作為醚硫酸酯(A2-;3)及其鹽，包含具有烴基(碳原子數(shù)為8 24)的醚硫酸酯及其鹽。作為(A2-》及其鹽，具體地說，可列舉出聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉鹽和聚氧乙烯月桂基醚硫酸三乙醇胺鹽等。作為磺酸鹽(A2-4)，可列舉出十二烷基二苯基醚二磺酸鈉鹽、十二烷基苯磺酸鈉鹽和萘磺酸鈉鹽等。作為磺基琥珀酸鹽(A2-5)，可列舉出聚氧乙烯月桂基磺基琥珀酸二鈉鹽、月桂基磺基琥珀酸二鈉鹽和聚氧乙烯月桂酰乙醇酰胺磺基琥珀酸二鈉鹽等。作為磷酸酯(A2-6)，可列舉出辛基磷酸二鈉鹽和月桂基磷酸二鈉鹽等。作為醚磷酸酯(A2-7)，可列舉出聚氧乙烯辛基醚磷酸二鈉鹽和聚氧乙烯月桂基醚磷酸二鈉鹽等。作為脂肪酸鹽(A2-8)，可列舉出辛酸鈉鹽、月桂酸鈉鹽和硬脂酸鈉鹽等。作為非離子型表面活性劑(A3)，包含醇環(huán)氧烷烴(以下，將環(huán)氧烷烴簡稱為AO)加成物(A3-1)、烷基苯酚AO加成物(A31)、脂肪酸AO加成物(A3_;3)和多元醇型非離子型表面活性劑(A3-4)等。作為表示非離子型表面活性劑的親水性和疏水性的標準，已知HLB。HLB的值越高，表示親水性越高。本發(fā)明中的HLB是指利用下述式(1)計算而得到的數(shù)值(藤本武彥著、表面活性劑入門、142頁、三洋化成工業(yè)株式會社發(fā)行)。HLB = 20X {親水基團的分子量/表面活性劑的分子量} (1)從分泌效率的方面來看，非離子型表面活性劑(Α； )的HLB優(yōu)選為0 13，進一步優(yōu)選為5 12，更進一步優(yōu)選為8 12。作為醇AO加成物(A3-1)，包含聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚。作為(A3-1)，具體地說，包含碳原子數(shù)為8 M的高級醇(癸醇、十二烷醇、椰油烷基醇、十八烷醇和油醇等)的環(huán)氧乙烷(以下，環(huán)氧乙烷簡稱為E0) 0 20摩爾和/或環(huán)氧丙烷(以下，環(huán)氧丙烷簡稱為P0) 1 20摩爾加成物(包含嵌段加成物和/或無規(guī)加成物。以下相同)[例如，癸醇的EO 8摩爾/PO 7摩爾嵌段加成物]。作為(A3-1)，更具體地說，可列舉出月桂醇EO 7 摩爾加成物(HLB = 12. 4)、油醇EO 5摩爾加成物(HLB = 9. 0)、油醇E06摩爾加成物(HLB =10. 2)、油醇EO 7摩爾加成物(HLB= 11.0)和油醇EO 10摩爾加成物(HLB = 12. 4)、1， 2-十二烷二醇單氧乙烯加成物等。作為烷基苯酚AO加成物(A3-2)，包含具有碳原子數(shù)為6 M的烷基的烷基苯酚 AO加成物。作為(A3-2)，具體地說，可列舉出辛基苯酚的EO 1 20摩爾和/或PO 1 20摩爾加成物以及壬基苯酚的EO 1 20摩爾和/或PO 1 20摩爾加成物等。另外，TRITONtmX-I 14 (HLB = 12. 4)、ig印al CA_520 (HLB = 10. 0)和 ig印al CA_630 (HLB = 13. 0) 等能夠容易從市場獲得。作為脂肪酸AO加成物(A3-3)，包含碳原子數(shù)為8 對的脂肪酸(癸酸、月桂酸、 肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和椰油脂肪酸等)的EO 1 20摩爾和/或POl 20摩爾加成物。作為(A3-3)，具體地說，可列舉出油酸EO 9摩爾加成物(HLB= 11. 8)、二油酸EO 12摩爾加成物(HLB = 10. 4)、二油酸EO 20摩爾加成物(HLB = 12. 9)和硬脂酸EO 9摩爾加成物(HLB = 11.9)等。作為多元醇型非離子型表面活性劑(A3-4)，包含碳原子數(shù)為3 36的2 8元多元醇(甘油、三羥甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨聚糖等)的EO和/或PO加成物；所述多元醇的脂肪酸酯及其EO加成物、以及蔗糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺(椰油脂肪酸二乙醇酰胺等)和它們的AO加成物。作為(A3-4)，具體地說，可列舉出山梨聚糖四油酸酯 EO加成物(HLB = 11.4)和山梨聚糖六油酸酯EO加成物(HLB = 10. 2)等。作為陽離子表面活性劑(A4)，包含胺鹽型陽離子表面活性劑(A4-1)和季銨鹽型陽離子表面活性劑(A4-2)等。作為胺鹽型陽離子表面活性劑(A4-1)，包含將伯 叔胺用無機酸(鹽酸、硝酸、硫酸、氫碘酸等)或有機酸(乙酸、甲酸、草酸、乳酸、葡糖酸、己二酸、烷基磷酸等)中和而得到的物質(zhì)。例如，作為伯胺鹽型的陽離子表面活性劑，可列舉出脂肪族高級胺(月桂胺、硬脂胺、鯨蠟基胺、氫化牛脂胺、松香胺等高級胺)的無機酸鹽或有機酸鹽；低級胺類的高級脂肪酸(硬脂酸、油酸等)鹽等。作為仲胺鹽型的陽離子表面活性劑，可列舉出例如脂肪族胺的環(huán)氧乙烷加成物等的無機酸鹽或有機酸鹽。另外，作為叔胺鹽型的陽離子表面活性劑， 可列舉出例如脂肪族胺(三乙胺、乙基二甲基胺、N, N, N’，N’ -四甲基乙二胺等)、脂肪族胺的環(huán)氧乙烷0摩爾以上)加成物、脂環(huán)式胺(N-甲基吡咯烷、N-甲基哌啶、N-甲基環(huán)己亞胺、N-甲基嗎啉、1，8_ 二氮雜雙環(huán)(5，4，0)-7_十一碳烯等)、含氮雜環(huán)芳香族胺(4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑、4，4’ -聯(lián)吡啶等)的無機酸鹽或有機酸鹽；三乙醇胺單硬脂酸酯、硬脂酰胺乙基二乙基甲基乙醇胺等叔胺類的無機酸鹽或有機酸鹽等。作為季銨鹽型陽離子表面活性劑(A41)，包含通過叔胺類與季銨化劑(氯甲烷、 溴甲烷、氯乙烷、氯化芐、二甲基硫酸等烷基化劑；環(huán)氧乙烷等)的反應(yīng)而得到的物質(zhì)。例如，可列舉出月桂基三甲基氯化銨、二癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基溴化銨、硬脂基三甲基溴化銨、月桂基二甲基芐基氯化銨(苯扎氯銨)、氯化十六烷基吡啶鐺、聚氧乙烯三甲基氯化銨、硬脂酰胺乙基二乙基甲基甲硫酸銨等。作為表面活性劑(A)，從分泌效率的方面來看，優(yōu)選為兩性表面活性劑、陰離子型表面活性劑和HLB為0 13的非離子型表面活性劑，進一步優(yōu)選為羧酸鹽型兩性表面活性劑(Al-I)、醚羧酸(A2-1)、磺酸鹽(A2-4)、高級醇AO加成物(A3-1)和多元醇型非離子型表面活性劑(A3-4)，特別優(yōu)選為聚氧乙烯十三烷基醚乙酸鈉鹽(聚氧乙烯十三烷基醚乙酸(A2-1)的鈉鹽)、椰油脂肪酸二乙醇酰胺(A3-4)、椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜堿(Al-H)、l，2-十二烷二醇單氧乙烯加成物(A3-1)、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜堿 (A1-1-2)、氫化椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜堿(A1-1-2)、椰油基氨基丙酸鈉 (A1-1-1)、十二烷基二苯基醚二磺酸鈉鹽(A2-4)、聚氧乙烯月桂基醚乙酸鈉鹽(聚氧乙烯月桂基醚乙酸(A2-1)的鈉鹽)、高級醇EO加成物(A3-1)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉鹽(聚氧乙烯月桂基醚硫酸(A2-3)的鈉鹽)、癸醇EO加成物(A3-1)。本發(fā)明中，關(guān)于表面活性劑(A)，可以直接使用表面活性劑(A)，也可以根據(jù)需要與水混合，作為水性稀釋液(水溶液狀或水分散液狀)使用。水性稀釋液中的表面活性劑㈧的總濃度根據(jù)對象微生物、生理活性物質(zhì)的種類和提取方法的種類適當(dāng)選擇，從有用物質(zhì)的分泌性和操作性的方面來看，以水性稀釋液的重量為基準計，優(yōu)選為0. 1重量％ 99重量％，更優(yōu)選為1重量％ 50重量％。從生產(chǎn)率的方面來看，使用本發(fā)明的表面活性劑進行有用物質(zhì)的生產(chǎn)時的分泌效率(％ )優(yōu)選為1 100，進一步優(yōu)選為5 100，更進一步優(yōu)選為10 100，特別優(yōu)選為 50 100。表面活性劑的分泌效率表示通過表面活性劑而使細菌內(nèi)的有用物質(zhì)分泌到細菌外(培養(yǎng)液中)。需要說明的是，本發(fā)明中，分泌效率由下式定義。分泌效率(%) = 100X {(X/Y)-Z}X 利用離心分離除去菌體后殘留的培養(yǎng)液中的有用物質(zhì)Y 培養(yǎng)液中的全部有用物質(zhì)Z 表示溶菌的細菌的比例，由下式定義。Z = Ζ1/Ζ2Zl 利用離心分離除去菌體后殘留的培養(yǎng)液中的細胞質(zhì)內(nèi)存在物質(zhì)Ζ2 培養(yǎng)液中的全部細胞質(zhì)內(nèi)存在物質(zhì)需要說明的是，細胞質(zhì)內(nèi)存在物質(zhì)是指存在于細胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)，指通過溶菌而溶解到培養(yǎng)液中的物質(zhì)。關(guān)于分泌效率，例如若使在細菌內(nèi)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)更加向周質(zhì)移動，則分泌效率提高，若更加不使蛋白質(zhì)向周質(zhì)移動，則分泌效率降低。另外，通過篩選來選擇分泌效率高的表面活性劑，能夠提高分泌效率。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑(A)的用量(重量％ )根據(jù)對象微生物、所生產(chǎn)的有用物質(zhì)的種類和提取方法的種類適當(dāng)選擇，從分泌效率和難以使蛋白質(zhì)變性的方面來看，以培養(yǎng)液的重量為基準計，優(yōu)選為0.0001 10，進一步優(yōu)選為 0. 005 10，更進一步優(yōu)選為0. 1 5。表面活性劑(A)除了預(yù)先與培養(yǎng)液混合后使用以外，也可以之后添加到懸浮有微生物的培養(yǎng)液中。與培養(yǎng)液的混合可以通過以下方式進行在4°C 99°C下向培養(yǎng)液中添加表面活性劑(A)，用攪拌槳或攪拌子等進行攪拌。之后混合時，可以一邊用攪拌槳等攪拌一邊添加，從而進行混合。使用表面活性劑(A)時，除了單獨使用上述表面活性劑以外，也可以將多種混合使用。本發(fā)明中干燥菌體密度表示，在有用物質(zhì)的分泌生產(chǎn)中，從培養(yǎng)開始時至培養(yǎng)結(jié)束時為止的任意時刻在IL培養(yǎng)液中所含有的細菌的重量。需要說明的是，該細菌的重量是指干燥狀態(tài)的細菌的重量。干燥菌體密度由下述步驟(1) (5)求得。步驟(1):預(yù)先測定容器(離心管)的重量。
步驟O)將IOOml培養(yǎng)液加入到步驟(1)中測定了重量的容器中，進行離心分離 (4，000G、15分鐘、4°C )，除去上清，收集細菌。步驟(3)利用0. 9重量％ NaCl水溶液[與步驟⑵中使用的培養(yǎng)液相同體積] 清洗容器中的收集的細菌，再次離心分離0，0006、15分鐘、4°0，除去上清，收集細菌。步驟⑷將步驟(3)中得到的細菌以裝入容器中的狀態(tài)在105°C下干燥10小時后，測定容器和細菌的總重量。步驟(5)在步驟(4)之后再在105°C下干燥2小時，然后測定容器和細菌的總重量，確認無重量變化。進而若重量減少，則在105°C下持續(xù)干燥至無重量變化。將步驟( 和步驟(1)的測定值與步驟( 中使用的培養(yǎng)液的體積(L)代入下式， 由此求得干燥菌體密度。干燥菌體密度(g/L)=([步驟(5)的測定值]-[步驟(1)的測定值])/0. 1以培養(yǎng)液的體積為基準計，本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中的干燥菌體密度為 1. 5g/L 500g/L，優(yōu)選為3g/L 200g/L，進一步優(yōu)選為4g/L 100g/L。干燥菌體密度小于1. 5g/L時，有用物質(zhì)的生產(chǎn)量差，若該值超過500g/L，則難以實施有用物質(zhì)的生產(chǎn)。從能夠?qū)嵤┯杏梦镔|(zhì)的生產(chǎn)的方面來看，以培養(yǎng)液的體積為基準計，細菌為大腸桿菌時的干燥菌體密度為1. 5g/L 500g/L，優(yōu)選為3g/L 100g/L，進一步優(yōu)選為10g/L 50g/L，最優(yōu)選為 12g/L 27g/L。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中，若干燥菌體密度在上述范圍內(nèi)，則干燥菌體密度越大，有用物質(zhì)的生產(chǎn)量越增加。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中，從有用物質(zhì)的生產(chǎn)量的方面來看，干燥菌體密度在上述范圍內(nèi)的時間優(yōu)選為分泌有用物質(zhì)的工序所需要的時間的10%以上，進一步優(yōu)選為50%以上。關(guān)于干燥菌體密度，例如通過在充分的通氣條件下使用半分批培養(yǎng)法以適當(dāng)?shù)乃俣冗M行流加，能夠增加干燥菌體密度，通過在受限的通氣條件下進行分批培養(yǎng)，能夠減少干燥菌體密度。另外，通過延長從培養(yǎng)開始至加入表面活性劑為止的時間，能夠增加干燥菌體密度，通過縮短從培養(yǎng)開始至加入表面活性劑為止的時間，能夠減少干燥菌體密度。另外， 若減緩表面活性劑的投入速度，則能夠增加干燥菌體密度，若加快表面活性劑的投入速度， 則能夠減少干燥菌體密度。本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中，進行有用物質(zhì)的分泌生產(chǎn)的生產(chǎn)方法含有包括下述工序(a)和(b)的細胞外分泌生產(chǎn)方法。下述工序中，分泌生產(chǎn)有用物質(zhì)的工序為工序(a)。工序(a)使培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的細菌(革蘭氏陰性細菌等)的培養(yǎng)液和表面活性劑同時存在，將有用物質(zhì)分泌到細胞外(培養(yǎng)液中)的工序。工序(b):在工序(a)后，從培養(yǎng)液分離有用物質(zhì)的工序。以下，示出本發(fā)明的使用表面活性劑的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法的一個例子。(i)基因重組(i-1)從表達目標蛋白質(zhì)的細胞分離信使RNA (mRNA)，由該mRNA合成單鏈的cDNA， 接著合成雙鏈DNA，將該雙鏈DNA重組到噬菌體DNA或質(zhì)粒中。將所得到的重組噬菌體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌中，制作cDNA文庫。
(i-2)作為篩選含有目標DNA的噬菌體DNA或質(zhì)粒的方法，可列舉出噬菌體DNA或質(zhì)粒與編碼目標蛋白質(zhì)基因或互補序列的一部分的DNA探針的雜交法。(i-3)從篩選后的噬菌體或質(zhì)粒切出作為目標的克隆化DNA或其一部分，將該克隆化DNA或其一部分連接到表達載體中的啟動子的下游，從而能夠制作目標基因的表達載體。也可以同時連接編碼進行內(nèi)膜移動的信號肽序列(在周質(zhì)表達目標物質(zhì)的信號肽序列)的DNA。(ii)培養(yǎng)(ii-Ι)用表達載體轉(zhuǎn)化宿主細菌，制作重組細菌，并對重組細菌進行前培養(yǎng)。關(guān)于前培養(yǎng)，在瓊脂培養(yǎng)基上、通常15°C 43°C下進行3小時 72小時。(ii-2)對于用于有用物質(zhì)的生產(chǎn)的培養(yǎng)液，在121°C下進行20分鐘高壓釜滅菌， 在其中培養(yǎng)用瓊脂培養(yǎng)基進行了前培養(yǎng)的重組細菌。培養(yǎng)通常在15°C 43°C下進行12小時 72小時。需要說明的是，與培養(yǎng)開始同時使用表面活性劑(A)的情況下，將表面活性劑 (A)和培養(yǎng)液混合并均勻化，將所得到的物質(zhì)用作培養(yǎng)液并進行相同的操作。另外，在培養(yǎng)后6小時至72小時后加入表面活性劑(A)的情況下，加入表面活性劑后繼續(xù)培養(yǎng)1小時 1000小時。(iii)純化(iii-1)對于分泌到培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，利用離心分離、中空纖維分離、過濾等分離微生物和微生物殘留。(iii-2)對于含有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液，反復(fù)進行離子交換柱、凝膠過濾柱、疏水柱、親和柱和超濾柱等柱處理，根據(jù)需要適當(dāng)進行乙醇沉淀、硫酸銨沉淀和聚乙二醇沉淀等沉淀處理，從而分離純化。對于(iii-Ι)中分離的宿主細胞，之后供給新的培養(yǎng)液，從而能夠進一步培養(yǎng)。將其培養(yǎng)液等進一步供給到(iii)的工序進行純化，反復(fù)培養(yǎng)，從而能夠進行有用物質(zhì)的連
續(xù)生產(chǎn)。作為上述(iii)的蛋白質(zhì)的分離/取出工序中的柱色譜法中使用的填充劑，可列舉出氧化硅、葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、丙烯酰胺和乙烯基聚合物等，市售品系列、S印hacryl系列、S印harose系列(以上由Pharmacia公司制造)、Bio_Gel系列(Bio-Rad 公司制造)等。通過使用本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法，能夠在短時間內(nèi)獲得高收量，因此能夠?qū)崿F(xiàn)高生產(chǎn)量。另外，本發(fā)明的有用物質(zhì)的生產(chǎn)方法中，有用物質(zhì)被分泌到培養(yǎng)液中，因此有用物質(zhì)的純化容易。由本發(fā)明的生產(chǎn)方法得到的有用物質(zhì)是通過上述方法獲得的，因此與以往相比， 其比活性高。本發(fā)明的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法包括以下工序使表面活性劑和細菌同時存在，將有用物質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中。該工序中，推測只要細菌存活，則細菌能夠制作有用物質(zhì)并將其分泌到培養(yǎng)液中。此外推測，只要細菌具有制備有用物質(zhì)的能力，則無論所制備的有用物質(zhì)的種類如何，均能夠使用本發(fā)明的生產(chǎn)方法。在細菌內(nèi)制作的有用物質(zhì)移動到細菌的周質(zhì)時，本發(fā)明的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法特別有效。通過有用物質(zhì)移動到周質(zhì)，有用物質(zhì)容易被分泌到培養(yǎng)液中。
本發(fā)明的另一方式為本發(fā)明的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑。本發(fā)明的表面活性劑在使用細菌生產(chǎn)有用物質(zhì)(蛋白質(zhì)等)時添加。本發(fā)明的表面活性劑難以破壞細菌，細菌能夠連續(xù)地生產(chǎn)有用物質(zhì)，能夠飛躍性
地提高生產(chǎn)量。通過使用本發(fā)明的表面活性劑進行細菌的培養(yǎng)，能夠不使細菌死亡地培養(yǎng)，因此能夠達到足夠工業(yè)水平的生產(chǎn)的菌體密度，并且能夠進行有用物質(zhì)的分泌生產(chǎn)。其結(jié)果，純化容易且能夠達到高生產(chǎn)量。作為本發(fā)明的表面活性劑，為上述表面活性劑(A)。實施例通過以下的實施例、比較例對本發(fā)明進行進一步的說明，但本發(fā)明并不限定于此。 需要說明的是，只要沒有特別記載，則份表示重量份。菌株的制作、菌體重量的測定、ELISA測定和SDS-PAGE等根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所進行的標準方法來進行?！粗圃炖?>使用引物1和2 (表4)，通過PCR法擴增大腸桿菌株W3110的堿性磷酸酶(phoA) 基因。利用限制酶NdeI和BamHI處理PCR片斷后，連接到pET_2^質(zhì)粒(Novagen公司)的 NdeI限制酶切位點和BamHI限制酶切位點。之后使用λ DE3溶源化試劑盒(Novagen公司制造)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到對大腸桿菌株AGl (ToYoBo (東洋紡績株式會社制造)進行修飾而制作的AG1(DE3)大腸桿菌株中，制作堿性磷酸酶表達株(α)。根據(jù)METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121頁的方法分析并確認所表達的堿性磷酸酶存在于周質(zhì)部分。〈制造例2>使用引物3和4 (表4)，通過PCR法擴增大腸桿菌株W3110的torA基因。利用限制酶NdeI和BamHI處理PCR片斷后，連接到pET_2^質(zhì)粒(Novagen公司制造)的NdeI限制酶切位點和BamHI限制酶切位點。之后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到AGl (DE3)大腸桿菌株中，制作 TorA表達株(β )。根據(jù)METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121頁的方法分析并確認所表達的TorA存在于周質(zhì)部分?！粗圃炖?>使用引物5和6(表4)，通過PCR法擴增大腸桿菌株W3110的pdxA基因。利用限制酶NdeI和BamHI處理PCR片斷后，連接到pET_2^質(zhì)粒(Novagen公司制造)的NdeI限制酶切位點和BamHI限制酶切位點。之后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到AGl (DE3)大腸桿菌株中，制作 PdxA表達株(Y )。根據(jù)METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121頁的方法分析并確認所表達的PdxA存在于細胞質(zhì)部分?！捶置谛实暮Y選〉<A-0>根據(jù)下述(1) G)，求出不使用表面活性劑時的大腸桿菌(α)和(β)的分泌效率。(1)將制造例1 3中得到的大腸桿菌(α )、( β )和(γ )分別接種到ImL LB培養(yǎng)液(細菌用胰化蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、NaCl 10g/L、氯霉素30mg/L)中，在37°C 下振蕩培養(yǎng)一晚，制作培養(yǎng)液。
(2)使用離心機進行菌體收集(4，000G、4°C、15分鐘)，重懸浮于ImL TB培養(yǎng)液 (Difco公司制造)中，加入氯霉素(30mg/L)和IPTG(100 μ M)，在37°C下振蕩培養(yǎng)3小時， 從而進行phoA、torA或pdxA的表達誘導(dǎo)。(3)之后再次使用離心機進行菌體收集(4，000G、4°C、15分鐘)，重懸浮于2. 5mL 的 Tris-NaCl 緩沖液(50mM Tris (pH7. 5) UOOmM NaCl)中，進行 25 μ L 分注，與 25 μ L 的 Tris-NaCl緩沖液混合。(4)之后在37度保溫1小時。取出上清液，用Tris-NaCl緩沖液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛群螅ㄟ^使用了抗His標簽抗體的ELISA測定進行重組蛋白量的定量。對于(3)的離心分離前的樣品，也在超聲波處理O00WU0分鐘)后同樣地進行ELISA測定，對重組蛋白進行定量。使用大腸桿菌(Y)計算出溶菌的細菌的比例，通過下式計算出大腸桿菌(α)和大腸桿菌(β)的重組蛋白的分泌效率，歸納于表1。需要說明的是，表1中，“0”表示分泌效率為0%，“_”表示沒有進行分泌效率的測定。分泌效率(％) = 100Χ {(Χ/Υ)-Ζ}X 使用大腸桿菌(α )或(β )的情況下通過離心分離除去菌體后殘留的培養(yǎng)液中的重組蛋白的量Y:使用大腸桿菌(α)或(β)的情況下培養(yǎng)液中的全部重組蛋白的量Z 通過大腸桿菌(Y)求出的溶菌的細菌的比例Z = Ζ1/Ζ2Zl 使用大腸桿菌(Y)的情況下通過離心分離除去菌體后殘留的培養(yǎng)液中的重組蛋白的量Ζ2 使用大腸桿菌(Y)的情況下培養(yǎng)液中的全部重組蛋白的量<大腸桿菌(α )的分泌效率的測定>“X”是使用大腸桿菌(α )進行上述⑴ ⑷時的重組蛋白量的測定值，為0. 0， 其通過取出上述的上清液并用Tris-NaCl緩沖液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛群罄檬褂昧丝?His標簽抗體的ELISA測定(利用分光光度計“SUNRISE THERMO”、Wako (和光純藥工業(yè)株式會社制造)進行了定量)求得?！癥”是使用大腸桿菌(α )進行上述⑴ ⑷時的重組蛋白量的測定值，為2. 5， 其通過對進行上述(3)的離心分離前的樣品進行超聲波處理(200W、10分鐘)后，進行與 “X”中的操作相同的ELISA測定而求得?！唉?”是使用大腸桿菌(Y)進行上述⑴ (4)時的重組蛋白量的測定值，為0.0， 其通過取出上述的上清液并用Tris-NaCl緩沖液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛群筮M行與“X”中的操作相同的ELISA測定而求得?！唉?”是使用大腸桿菌(Y)進行上述⑴ (4)時的重組蛋白量的測定值，為1. 1， 其通過對進行上述(3)的離心分離前的樣品進行超聲波處理O00WU0分鐘)后，進行與 “X”中的操作相同的ELISA測定而求得。由ELISA測定求得的測定值在與蛋白質(zhì)量成比例的濃度范圍內(nèi)進行測定。還能夠由ELISA測定的測定值求出蛋白質(zhì)量的定量值。由這些蛋白質(zhì)量的測定值求出未使用表面活性劑時的大腸桿菌(α)的分泌效率。
大腸桿菌(α)的分泌效率=100Χ{(0. 0/2. 5)-(0. 0/1. 1)} =0<A-1>對于大腸桿菌(α)和大腸桿菌(β )，分別在A-O的(3)中將大腸桿菌重懸浮于緩沖液中后，立即加入以菌體懸浮液的重量為基準計為1重量％的聚氧乙烯(3摩爾)十三烷基醚乙酸鈉作為表面活性劑(A)，除此之外與上述同樣地進行培養(yǎng)，根據(jù)上述定義計算出分泌效率，歸納于表1。<Α-2 Α-82>對于大腸桿菌(α)和大腸桿菌(β)，在A-I中將聚氧乙烯(3摩爾)十三烷基醚乙酸鈉變更為表1所述的表面活性劑和量，除此之外與A-I同樣地計算出分泌效率，歸納于表1 3。需要說明的是，表2和表3中，“0”表示分泌效率為0%，“_”表示未進行分泌效率的測定。另外，測定大腸桿菌(β)的分泌效率是為了確認即使大腸桿菌生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的種類發(fā)生變化，通過表面活性劑(A)的添加，大腸桿菌也表現(xiàn)出同樣的分泌效率的傾向。對于大腸桿菌(β)的分泌效率，分別對使用Α-1、Α-3或Α-6的表面活性劑作為表面活性劑 (A)的情況進行了測定。[表1]
權(quán)利要求
1.一種有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，所述有用物質(zhì)生產(chǎn)方法通過培養(yǎng)液中所含的細菌將有用物質(zhì)分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中，其中培養(yǎng)液中含有表面活性劑(A)；以培養(yǎng)液的體積為基準的干燥菌體密度為1. 5g/L 500g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，表面活性劑(A)為選自由兩性表面活性劑、陰離子型表面活性劑和HLB為0 13的非離子型表面活性劑組成的組中的至少1 種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，在細菌內(nèi)表達的蛋白質(zhì)為具有向周質(zhì)移動的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1 4的任一項所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，細菌為大腸桿菌。
6.如權(quán)利要求1 5的任一項所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，以培養(yǎng)液的重量為基準計，表面活性劑的用量為0. 0001重量％ 10重量％。
7.如權(quán)利要求1 6的任一項所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法，其中，表面活性劑的分泌效率為 100%。
8.一種表面活性劑，其在權(quán)利要求1所述的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用。
9.如權(quán)利要求8所述的表面活性劑，其中，表面活性劑(A)為選自由兩性表面活性劑、 陰離子型表面活性劑、HLB為0 13的非離子型表面活性劑組成的組中的至少1種。
10.如權(quán)利要求8或9所述的表面活性劑，其中，有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求8 10的任一項所述的表面活性劑，其中，細菌為大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種在表面活性劑的存在下使用大腸桿菌等細菌在工業(yè)規(guī)模下生產(chǎn)有用物質(zhì)(蛋白質(zhì)等)的生產(chǎn)方法以及在該有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑。本發(fā)明所涉及的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法和在該有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中使用的表面活性劑中，所述有用物質(zhì)生產(chǎn)方法通過培養(yǎng)液中所含的細菌將有用物質(zhì)分泌生產(chǎn)到培養(yǎng)液中，所述培養(yǎng)液中含有表面活性劑(A)，以培養(yǎng)液的體積為基準的干燥菌體密度為1.5g/L～500g/L。進一步優(yōu)選的有用物質(zhì)生產(chǎn)方法中，表面活性劑(A)為選自由兩性表面活性劑、陰離子型表面活性劑和HLB為0～13的非離子型表面活性劑組成的組中的至少1種。
文檔編號C12P21/02GK102449160SQ20108002278
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日
發(fā)明者山口俊一郎, 柳原芳充 申請人:三洋化成工業(yè)株式會社