專利名稱：包含與中樞神經細胞的增殖和分化相關的核因子的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療大腦皮質疾病等的藥物組合物，以及向非人動物施用該藥物組合物，誘導該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞的增殖、向神經細胞的分化的方法， 還涉及大腦皮質疾病等的治療藥的篩選方法。
背景技術：
由于近年來關于神經細胞的研究的進展，出現(xiàn)了可以使因阿爾茨海默病、外傷等而失去的腦再生的可能性。在這樣的腦的再生中，闡明向神經細胞分化的誘導因子是重要的。關于向神經細胞的分化誘導，最近，Mangale等人報告了，被稱為Lhx2的蛋白質誘導神經干細胞或神經前體細胞成為皮質，而抑制誘導成海馬(非專利文獻1)。非專利文獻1 =Mangale, V. S. et al.，Science, Vol. 319，No. 5861，304-309，2008

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題如上所述，如果可以新發(fā)現(xiàn)誘導向神經細胞的分化的因子，則可以使神經細胞再生，用于治療阿爾茨海默病等大腦皮質疾病。本發(fā)明是在上述技術背景下做出的，提供誘導向神經細胞的分化的新的因子。用于解決課題的方法本發(fā)明人為了解決上述課題而進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，1)被稱為 CRBN(cereblon)的蛋白質具有使干細胞向神經干細胞或神經前體細胞分化，進而向神經細胞分化的功能；2)CRBN誘導中樞神經干細胞或神經前體細胞的增殖，和3)CRBN位于已知的作為大腦皮質選擇因子的Lhx2的功能下游。CRBN是形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質，其氨基酸序列也是公知的，但是到目前為止完全不知道其具有誘導中樞神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化的功能。關于CRBN 與腦的關系，有 Higgins 等人的報告(J.J. Higgins et al.，(2004) Neurology 63，1927-1931)。Higgins等人報告了，在具有輕度的精神發(fā)育遲緩的家族中可見crbn基因的變異。然而，該報告并未暗示CRBN存在上述那樣的功能。本發(fā)明是基于以上認識而完成的。即，本發(fā)明提供以下的〔1〕 〔11〕?！?〕一種藥物組合物，其特征在于，含有1)CRBN、2)編碼CRBN的核酸、或3)表達 CRBN的干細胞或神經前體細胞?！?〕根據〔1〕所述的藥物組合物，其特征在于，編碼CRBN的核酸被插入到病毒載體中。
〔3〕根據〔1〕所述的藥物組合物，其特征在于，除了含有CRBN以外，還含有與CRBN 一起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質?！?〕根據〔1〕或〔2〕所述的藥物組合物，其特征在于，除了含有編碼CRBN的核酸以外，還含有編碼與CRBN —起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的核酸?！?〕根據〔1〕所述的藥物組合物，其特征在于，含有除了表達CRBN以外，還表達了與CRBN —起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的干細胞或神經前體細胞?！?〕根據〔1〕 〔5〕的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用于治療大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷。〔7〕根據〔1〕 〔5〕的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用于再生大腦皮質?！?〕向非人動物施用〔1〕 〔7〕的任一項所述的藥物組合物，使該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞增殖的方法?！?〕向非人動物施用〔1〕 〔7〕的任一項所述的藥物組合物，使該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞向神經細胞分化的方法。〔10〕一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于，包括下述工序使被驗物質與包含CRBN的泛蛋白連接酶復合體接觸的工序；和測定所述泛蛋白連接酶復合體的泛蛋白連接酶活性，選擇使泛蛋白連接酶活性提高的被驗物質的工序。〔11〕一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于，包括下述工序在被驗物質的存在下培養(yǎng)神經干細胞或神經前體細胞的工序；和測定神經干細胞或神經前體細胞中的CRBN的表達量，選擇使CRBN的表達量增大的被驗物質的工序。發(fā)明的效果本發(fā)明的藥物組合物中所含的CRBN誘導中樞神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化。因此，本發(fā)明的藥物組合物作為阿爾茨海默病等大腦皮質疾病的治療藥是有用的。此外，CRBN作為用于開發(fā)大腦皮質疾病的新治療藥的靶標物質也是有用的。


圖1是斑馬魚(zebrafish)的胚的熒光顯微鏡照片。左上圖顯示正常胚，右上圖顯示過量表達crbn基因的胚，左下圖顯示敲除了 lhx2基因的胚，右下圖顯示敲除了 lhx2 基因并過量表達crbn基因的胚。圖2是斑馬魚的胚的顯微鏡照片。右圖顯示過量表達crbn基因的胚，左圖顯示未處理的胚。兩者的拍攝倍率相同。圖3是移植有過量表達crbn基因的細胞(用羅丹明熒光標記)的斑馬魚的顯微鏡照片。上行是以200倍拍攝的照片，下行是以100倍拍攝的照片。此外，左列是明視場像， 右列是熒光像。圖4是使用了體外反應體系的用于檢測CRBN復合體(FH-CRBN complex)的泛蛋白連接酶活性的電泳照片。左圖是用免疫印跡法檢測泛蛋白，中央圖是用免疫印跡法檢測作為CRBN復合體形成因子的Cul4A，右圖是用免疫印跡法檢測CRBN的泛蛋白化。Mock顯示使用了對照實驗用的樣品的情況。
圖5是使用了活細胞的用于檢測CRBN復合體的泛蛋白連接酶活性的電泳照片。圖6是將神經膠質細胞熒光染色后的斑馬魚的頭部的放大照片。左側是前端部。 左圖是通常個體的照片，右圖是CRBN過量表達個體的照片。圖7是將5-羥色胺產生細胞熒光染色后的斑馬魚的頭部的放大照片。從腦的背側拍攝。上側是前端部。左圖是通常個體的照片，右圖是CRBN過量表達個體的照片。圖中的1顯示松果體，2顯示腹側后方結節(jié)，3顯示中縫核。圖8是將未分化細胞移植到腦室后的斑馬魚的照片。A D顯示移植了不表達 CRBN的細胞的情況，E H顯示移植了表達CRBN的細胞的情況。A和E是明視場圖像，B和 E是Alexa Fluor (注冊商標)的熒光圖像(顯示微管蛋白的分布)，C和G是羅丹明的熒光圖像(顯示供體細胞的分布)，D和H是Alexa Fluor (注冊商標)和羅丹明的熒光圖像。
具體實施例方式以下詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明的藥物組合物的特征在于，含有1)CRBN、2)編碼CRBN的核酸、或3)表達 CRBN的干細胞或神經前體細胞。CRBN是已知的蛋白質，編碼CRBN的基因(crbn基因)的堿基序列也在數(shù)據庫上公開了。例如，來源于人的crbn基因的堿基序列、來源于小鼠的crbn基因的堿基序列、來源于大鼠的crbn基因的堿基序列、和來源于斑馬魚的crbn基因的堿基序列分別以GeneID 51185,GeneID :58799,GeneID :297498、和 GeneID :445491 登錄在 Entrez Gene 中。所使用的CRBN和/或crbn基因可以是天然的，也可以使用包含在天然的CRBN的氨基酸序列中缺失、替換或添加1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列、并能夠形成具有活性的泛蛋白連接酶復合體的修飾型CRBN，或者編碼該修飾型CRBN的基因。本發(fā)明的藥物組合物可以以CRBN、編碼CRBN的核酸、表達CRBN的干細胞或神經前體細胞的任一種作為有效成分。以它們作為有效成分的藥物組合物的調制和使用可以與以蛋白質、核酸、干細胞、前體細胞作為有效成分的已知藥物同樣地進行。編碼CRBN的核酸可以是DNA、RNA的任一種。核酸優(yōu)選以可以作用于腦內的神經干細胞的方式插入到適當載體中。作為這樣的載體，可以列舉病毒載體。作為病毒載體的具體例，可以列舉腺病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。作為用于表達CRBN的干細胞，為了避免排斥反應，優(yōu)選來源于患者的iPS細胞，但是也可以是其它干細胞，例如，ES細胞、成體干細胞、臍帶血干細胞等。只要使CRBN在干細胞中表達即可，優(yōu)選過量表達。表達或過量表達CRBN的方法可以按照例如安藤等人的方法 (Ando and Okamoto，Mar Biotechnol 8(3) :295-303. 2006)等進行，也可以通過其它方法來進行，所述其它方法例如，其它的顯微注射法、籠形RNA(Caged RNA)法(安藤等人，Nat Genet 28 =317-325, 2001)、電穿孔法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、病毒法、聲致穿孔法、轉座子法等。對本發(fā)明的藥物組合物的施用方法沒有特別限定，可以根據有效成分的種類等適當確定。在以CRBN、編碼CRBN的核酸作為有效成分的情況下，可以通過向腦室內、皮內、腹腔內、靜脈、動脈或脊髓液注射或點滴等來施用。CRBN對腦內的神經干細胞或神經前體細胞進行作用，因此除了向腦室內施用的情況以外，優(yōu)選進行可以通過血腦屏障那樣的處理。作為那樣的處理，可以考慮與被主動攝入的必需內源性物質結合、進行避免排出轉運蛋白 (efflux transporter)的識別的結構修飾、僅含最低限度的功能域的低分子量化等方法。 在以干細胞或神經前體細胞作為有效成分的情況下，向腦室內直接施用。對本發(fā)明的藥物組合物的施用量沒有特別限定，可以根據有效成分的種類等適當確定。關于對成人的每1天的施用量，在施用CRBN的情況下優(yōu)選施用0. 5mg IOOmg左右， 在施用編碼CRBN的核酸的情況下優(yōu)選施用Img 200mg左右，在施用表達CRBN的干細胞或神經前體細胞的情況下優(yōu)選施用50 μ 1 500 μ 1左右的500細胞 5000細胞。在通過注射或點滴施用本發(fā)明的藥物組合物的情況下，可以包含注射液、點滴液中通常包含的成分。作為這樣的成分，可以例示液體載體(例如磷酸鉀緩沖液、生理鹽水、 林格氏溶液、蒸餾水、聚乙二醇、植物性油脂、乙醇、甘油、二甲基亞砜、丙二醇等)、抗菌劑、 局部麻醉劑(例如鹽酸普魯卡因、鹽酸地布卡因等)、緩沖液(例如Tris-鹽酸緩沖液、 HEPES(赫佩斯)緩沖液等)、滲透壓調節(jié)劑(例如葡萄糖、山梨糖醇、氯化鈉等)。本發(fā)明的藥物組合物中，1)可以除了包含CRBN以外，還包含與CRBN—起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質，2)可以除了包含編碼CRBN的核酸以外，還包含編碼與CRBN—起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的核酸，幻可以包含除了表達CRBN以外，還表達與CRBN 一起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的干細胞或神經前體細胞。作為與CRBN —起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質，可以例示DDBl (損傷DNA結合蛋白，Damaged DNA Binding protein), Cul4A(Cullin 4A)、Cul4B (Cullin 4B), Rocl (RBXl)等。這些蛋白質與 CRBN 同樣是已知的蛋白質，編碼它們的基因(ddbl基因、cuWa基因、cul4b基因、rocl基因)的堿基序列也在數(shù)據庫上公開了。例如，來源于人的ddbl基因的堿基序列、來源于小鼠的ddbl 基因的堿基序列、來源于大鼠的ddbl基因的堿基序列、和來源于斑馬魚的ddbl基因的堿基序列分別以 GeneID :1642,GeneID 13194,GeneID :64470、和 GeneID :393599 登錄在 Entrez Gene中，來源于人的cuWa基因的堿基序列、來源于小鼠的cuWa基因的堿基序列、來源于大鼠的cuWa基因的堿基序列、和來源于斑馬魚的cuWa基因的堿基序列分別以GeneID 8451、GeneID :99375, GeneID :361181、和 GeneID :394002 登錄在 Entrez Gene 中，來源于人的cul4b基因的堿基序列、來源于小鼠的cul4b基因的堿基序列、來源于大鼠的cul4b 基因的堿基序列、和來源于斑馬魚的cul4b基因的堿基序列分別以GeneID :8450、GeneID 72584、GeneID :302502、和 GeneID :560313 登記在 Entrez Gene 中，來源于人的 rocl 基因的堿基序列、來源于小鼠的rocl基因的堿基序列、來源于大鼠的rocl基因的堿基序列、和來源于來源于斑馬魚的rocl基因的堿基序列分別以GeneID :9978,GeneID :56438,GeneID 300084、和GeneID :449846登錄在Entrez Gene中。各蛋白質、基因可以是天然的，也可以使用包含在天然蛋白質的氨基酸序列中缺失、替換或添加1個或數(shù)個氨基酸后的氨基酸序列，并能夠形成具有活性的泛蛋白連接酶復合體的修飾型蛋白質，或者編碼該蛋白質的基因。泛蛋白連接酶復合體中，除了包含CRBN以外，還可包含DDBl、CuL4A、Rocl這3種蛋白質，或DDBl、CuL4B、Rocl這3種蛋白質。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選包含(或表達)全部這 3種蛋白質(或編碼這些蛋白質的核酸)，也可以僅包含它們中的一部分。本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷和/或再生大腦皮質。作為大腦皮質疾病，可以列舉例如，阿爾茨海默病、帕金森病、克雅二氏病 (Creutzfe 1 dt-Jakob disease),亨廷頓病、進行性核上性麻痹、大腦皮質基底節(jié)變性癥等。
本發(fā)明的藥物組合物是用于人的，也可以對人以外的動物施用，誘導該動物的神經干細胞或神經前體細胞的增殖、向神經細胞的分化。作為對象的動物主要是脊椎動物，例如是小鼠、大鼠、猴、犬、雪貂、倉鼠、雞、爪蟾、斑馬魚、青鏘魚等。如實施例所記載，僅在斑馬魚中確認了 CRBN誘導神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化。然而，在人和斑馬魚之間，基因組同線性被70 80%保存 (Nature Reviews Genetics 8，353-367 (May 2007))。因此，預測 CRBN 在包括人的其它脊椎動物中也顯示與在斑馬魚中所確認的作用同樣的作用。由于CRBN誘導神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化，因此可以利用該蛋白質進行大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選。具體而言，可以例示以下的㈧和⑶的方法。(A) 一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于， 包括下述工序使被驗物質與包含CRBN的泛蛋白連接酶復合體接觸的工序；和測定所述泛蛋白連接酶復合體的泛蛋白連接酶活性，選擇使泛蛋白連接酶活性提高的被驗物質的工序。(B) 一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于， 包括下述工序在被驗物質的存在下培養(yǎng)神經干細胞或神經前體細胞的工序；和測定神經干細胞或神經前體細胞中的CRBN的表達量，選擇使CRBN的表達量增大的被驗物質的工序。在(A)的方法中，泛蛋白連接酶活性的測定可以按照例如Angers等人(Nature 443，590-593，2006)、Groismanden 等人(Cell 113，357-367，2003)的方法進行。在(A)的方法中，被驗物質是否使泛蛋白連接酶活性提高可以如下判定在不與被驗物質接觸的情況下測定包含CRBN的復合體的泛蛋白連接酶活性，與其值進行比較。通過(A)的方法而選擇的物質具有使生物體內的神經干細胞或神經前體細胞中存在的包含CRBN的復合體的泛蛋白連接酶活性提高的作用。認為利用CRBN的神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化是介由該復合體所具有的泛蛋白連接酶活性而進行的。因此，認為通過(A)的方法而選擇的物質促進利用CRBN的神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化，對大腦皮質疾病、大腦皮質的外科損傷具有治療效果。在(B)的方法中，作為所使用的神經干細胞，基本使用對ES細胞、iPS細胞、成體干細胞進行了神經分化誘導而得的神經干細胞等?；蚩梢允褂脕碓从诔赡晷∈竽X室管膜下區(qū)或來源于成年大鼠海馬的神經干細胞等。在⑶的方法中，作為測定CRBN的表達量的方法，可以通過使用針對CRBN的抗體的方法、原位雜交(in situ hybridization)法、RT-PCR法、RNA印跡法等進行。在⑶的方法中，被驗物質是否使CRBN的表達量增大可以如下判定在不存在被驗物質的條件下培養(yǎng)神經干細胞或神經前體細胞，測定CRBN的表達量，與其值進行比較， 從而判定。通過(B)的方法而選擇的物質具有使生物體內的神經干細胞或神經前體細胞的 CRBN的表達量增大的作用。因此，認為通過⑶的方法而選擇的物質促進利用CRBN的神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化，對大腦皮質疾病、大腦皮質的外科損傷具有治療效果。實施例
以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明。(實驗方法)(1)斑馬魚胚的全身的基因過量表達成魚通常在觀.5°C下飼養(yǎng)，以照明開啟14小時/關閉10小時的晝夜循環(huán)傳代，培育。由雄性和雌性的自然交配來確保受精卵，在首次卵裂開始前(1細胞期)的胚中，將體外合成的籠形RNA水溶液以eOOng/μ 1的濃度在氮氣壓30psi、閥門開啟時間30msec (毫秒)的條件下注入到細胞質中。除lhx2基因以外的全部基因(crbn基因、six3.2基因、編碼構成crbn和E3泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的基因)的表達即使是全身表達對胚胎發(fā)育的影響也較少，因而通過該方法得到了最初的數(shù)據。(2)局限于斑馬魚胚的頭部的基因過量表達在進行專門研究在全身的表達中顯示非特異性的胚的背側化的lhx2基因和對腦容積的影響的精密實驗時，對胚的預定頭部區(qū)域進行生物體內RNA脂質轉染。方法完全按照由安藤等人開發(fā)、發(fā)表的技術(Ando and Okamoto, Efficient transfection strategy for the spatiotemporal control of gene expression in zebrafish. Mar Biotechnol 8(3) :295-303. 2006)來進行。(3)使用了斑馬魚胚的基因敲除在1細胞期的胚中注入與要敲除的基因的cDNA序列的翻譯起始密碼子周圍對應的25-mer的反義嗎啉代寡核苷酸(ΑΜ0，Gene Tools社)水溶液(700ng/μ 1，注入條件與 RNA相同)。crbn基因的敲除所使用的AMO的序列為5，AGAGCTGTAGCTGGTTCCCCATTTC 3，， lhx2 基因的敲除的情況下為 5，TCTGCAACCCAAGATTTCCGTGAGA3，。(4)使用了斑馬魚的基因功能層次性的確定除了以下過程以外，全部按照安藤等人(Ando et al.，Lhx2 mediates the activity of Six3 in zebrafish forebrain growth. Dev Biol. 287(2) :456-68. 2005)的方法進行。頭部特異性基因表達使用上述O)的方法的生物體內脂質轉染法來代替RNA I ^ Ijji (RNA uncaging) ( H JF 2002-315576, Ando et al. , Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat. Genet. 28,317-325, 2001)?；驹硎牵瑢⒉捎蒙鲜?3)的方法敲除了暗示出功能相關的2種基因的一種(A) 后的胚進行培養(yǎng)直至受精后6小時(原腸胚期)，在其預定前腦區(qū)域通過上述( 的方法的生物體內脂質轉染誘導另一種基因(B)的表達。如果在受精后M小時期間A的敲除效果被救濟、在A和B的相反組合中B的敲除效果不被救濟，則確定為A位于B的功能上位。(5)免疫組織化學斑馬魚的初期神經元的抗體染色采用以下方法進行。將受精后M-觀小時的胚用 4%低聚甲醛/磷酸緩沖液(pH 8.0)在4°C下固定12小時。用磷酸緩沖液洗滌15分鐘，將該洗滌進行4次，然后在溶解于0. 5% TritonX-IOO/磷酸緩沖液的5%新生山羊血清中常溫下進行1小時封閉。在相同溶液中，用稀釋1000倍后的含抗乙?；⒐艿鞍讍慰寺】贵w的溶液在4°C下進行一次抗體反應12小時，同樣地用磷酸緩沖液洗滌，然后在與一次抗體反應相同條件下用偶聯(lián)了 Alexa Fluoro 488 (Molecular ftx)bes社)的抗小鼠抗體進行二次抗體反應。將用磷酸緩沖液洗滌后的胚在30% /50% /70%甘油(溶解于磷酸緩沖液) 中透明化，以488nm激發(fā)，用熒光顯微鏡觀察。
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(6)整體原位雜交基本上按照Thisse等人的方法(Nat. Protcol. 3 (1) 59-69，2008)進行。不同點在于，探針的雜交溶液的封閉劑(blocker)使用了 5mg/ml的圓酵母RNA，而且作為抗體反應液中的封閉劑使用了 0.5%的Blocking reagent (Roche社)。探針所使用的基因的 cDNA(six3. 2基因、emxl基因、pax2. 1基因、foxgl基因、otx2基因)分別由原始的提供者贈與。lhx2基因的探針最初使用了克隆化后的安藤的探針。crbn基因和相關基因的探針從斑馬魚的EST數(shù)據庫設計引物，從cDNA文庫克隆化。(7)細胞移植在上述(1)的方法的條件下在1細胞期的斑馬魚胚中注入溶解了適當濃度的羅丹明葡聚糖(分子量10，000)和最終濃度600ng/ μ 1的crbn RNA的無核酸酶水，制成供體(給予體)。在供體受精后3-4小時的時期，在熒光顯微鏡觀察下用玻璃制微毛細管吸引10-50 個細胞，移植到同時期的宿主(host)胚的動物極中。直接將宿主胚培養(yǎng)2天，然后用熒光顯微鏡觀察表達CRBN的來源于供體的細胞的分化的局部存在性。此外，作為陰性對照，也在相同條件下移植被認為對胚胎發(fā)育沒有影響的表達綠色熒光蛋白質(GFP)的細胞，將該分化的局部存在性進行比較。(8)使用了體外反應體系的CRBN的泛蛋白連接酶活性的檢測、測量基本上按照Groisman等人的方法來進行。首先，使用M2FLAG瓊脂糖珠(SIGMA社) 從表達融合有FLAG表位標簽的CRBN的哺乳類細胞的破碎液中純化CRBN和結合蛋白質(稱為CRBN復合體)。接下來，將純化后的CRBN復合體與含有W^al (El)、UbcH5b (E2)、GST融合泛蛋白( )重組蛋白質的水溶液混合，加入ATP，然后在30-37度下靜置2小時。然后用 SDS使反應停止，通過進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡，使自身泛蛋白化和結合蛋白質的泛蛋白化可視化，從而檢測、測量泛蛋白連接酶活性。(9)利用了活細胞的CRBN泛蛋白連接酶活性的檢測、測量基本上按照Ohtake等人的方法進行。向表達融合有FLAG表位標簽的CRBN的哺乳類細胞施用作為蛋白酶體抑制劑的MG132，靜置。然后，破碎細胞，與上述同樣地但在更嚴格的條件下進行FLAG純化，從該溶解液中提取CRBN，進行免疫印跡，從而檢測、測量該自身泛蛋白化。(10)神經膠質細胞和5-羥色胺產生細胞的熒光染色使用2日齡(神經膠質細胞染色使用受精后56小時的斑馬魚，5-羥色胺產生細胞染色使用受精后49小時的斑馬魚。)的斑馬魚。將斑馬魚用4%用低聚甲醛(PFA)固定，然后用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，接著用10yg/ml的蛋白酶K處理，將表皮部分消化。消化反應后用PBST(PBS+0. 5%I~ritonX-100)洗滌20分鐘，用PFA再固定。將其用PBST在室溫下洗滌1小時，然后用PBST+5%山羊血清封閉。將該標本用抗神經膠質單克隆抗體(zrf-1/ zrf-2)或兔抗5-羥色胺抗體在4°C下反應過夜(12 18小時)。然后，用PBST+5%山羊血清在室溫下洗滌1小時，置換成山羊抗小鼠IgG抗體(Cy-2偶聯(lián)。神經膠質細胞染色) 或山羊抗兔IgG抗體(Cy-5偶聯(lián)。5-羥色胺產生細胞染色)，進行二次抗體反應。在4°C下反應過夜(12 18小時)，然后用PBST室溫洗滌1小時。洗滌后用30%、50%、70%甘油 /PBS置換，將全身放在載玻片上，制作標本。在Cy-2和Cy-5的激發(fā)波長下觀察熒光，記錄神經膠質細胞或5-羥色胺產生細胞的分布。另外，神經膠質細胞的觀察從斑馬魚的側面拍攝，對于5-羥色胺產生細胞，為了觀察沿著它們的正中線的分布而從背側拍攝。(Il)CRBN表達細胞向間腦室的移植在剛受精后的1細胞期胚中注入編碼CRBN的RNA(700ng/μ 1)與2%羅丹明葡聚糖的混合液。進行培養(yǎng)直到受精后4小時，然后使用吸引毛細管采集細胞10 20個左右， 向受精后30小時胚的間腦室注入進行移植。將移植后的魚在斑馬魚生理鹽水(Ε3林格氏溶液)中飼養(yǎng)到受精后3天，然后用4%低聚甲醛固定。按照常規(guī)方法，用抗乙?；⒐艿鞍讍慰寺】贵w進行一次抗體反應并用Alexa Fluor (注冊商標)抗小鼠IgGGSSnm激發(fā))抗體進行二次抗體反應，將神經細胞軸突進行熒光標記，邊觀察邊研究用羅丹明葡聚糖(543nm 激發(fā))標記了的移植細胞的分布。(實驗結果)(1) Lhx2和CRBN的功能層次性的確定敲除了 lhx2基因的斑馬魚的胚(圖1左下)，與正常胚(圖1左上)比較，可見腦的縮小。另一方面，敲除了 lhx2基因并使crbn基因過量表達的胚(圖1右下)，與過量表達crbn基因的胚(圖1右上)同樣地，可見腦的擴大。因此認為，CRBN位于Lhx2的功能下游，直接誘導中樞神經干細胞的增殖和向神經細胞的分化。O) CRBN的過量表達實驗為了驗證CRBN在大腦中誘導向神經干細胞分化，使用斑馬魚胚進行了前腦和中腦中的CRBN的過量表達實驗。其結果是，兩腦在保持形態(tài)的狀態(tài)下擴大至約1. 5倍的容積 (圖2右)。并且腦的神經元網絡在形態(tài)上是正常的(圖2右)。(3)過量表達CRBN的細胞的移植實驗首先，在給予體(供體)胚中與熒光物質(羅丹明)一起注入編碼CRBN的信使 RNA并使其過量表達。將該胚泡移植至另一個體，用熒光顯微鏡觀察分布在腦室內的來源于供體的細胞的分化。其結果是，移植的來源于供體的細胞顯著地分化成作為魚類的端腦組織的嗅球(圖3箭頭)。這顯示出，在表達CRBN的細胞被分配在腦室內的情況下，分化成神經干細胞，沿著被稱為喙側遷移流(Rostral Migratory Stream, RMS)的細胞遷移路徑，在哺乳動物中在發(fā)生大腦皮質的端腦背側部分化成腦組織。(4)使用了體外反應體系的CRBN的泛蛋白連接酶活性的檢測、測量在包含W^al (泛蛋白激活酶)、W^cffib (泛蛋白轉移酶)、和GST融合泛蛋白重組蛋白質的水溶液⑴b/El/E2)中加入CRBN(FH-CRBN復合物)的情況下，檢測到了在不加入 CRBN的情況下未檢測到的蛋白質(圖4的左圖、中央圖、右圖的道2)。蛋白質的泛蛋白化中，除了泛蛋白以外，需要泛蛋白激活酶、泛蛋白轉移酶、泛蛋白連接酶這3種酶。在左圖、 中央圖、右圖的道1中，由于不存在泛蛋白連接酶，因此未產生泛蛋白化的蛋白質，與此相對，左圖、中央圖、右圖的道2中，認為由于CRBN作為泛蛋白連接酶發(fā)揮作用，因而產生了泛蛋白化的蛋白質，該蛋白質通過電泳而被檢測到。(5)利用了活細胞的CRBN泛蛋白連接酶活性的檢測、測量在加入了 MG132的情況下，檢測到了大量包含CRBN的蛋白質的條帶(圖5的右道)。另一方面，在不加入MG132的情況下，幾乎檢測不到包含CRBN的蛋白質的條帶(圖5 的左道)。認為活細胞內的CRBN與其它因子協(xié)同地進行自身泛蛋白化，產生各種分子量的泛蛋白化蛋白質。然而認為其中多數(shù)被活細胞內的蛋白酶體分解。認為圖5的左道中，蛋白酶體被MG132抑制，因而通過自身泛蛋白化而產生的蛋白質殘存，從而檢測到了多條條帶。另一方面，認為圖5的右道中，產生的蛋白質多數(shù)被蛋白酶體分解，因此幾乎檢測不到條帶。(6)神經膠質細胞和5-羥色胺產生細胞的熒光染色過量表達CRBN的個體中，在保持正常的空間分布的同時神經膠質細胞(圖6左圖)、5_羥色胺產生細胞(圖7左圖)增加了。這意味著CRBN在正常地識別腦的空間圖案的同時使細胞增殖、分化。(7) CRBN表達細胞向間腦室的移植在移植不表達CRBN的細胞的情況下，該細胞不分化成腦組織(圖8A D)，與此相對，在移植表達CRBN的細胞的情況下，該細胞分化成腦組織(圖8E H)。產業(yè)可利用性本發(fā)明作為阿爾茨海默病等大腦皮質疾病的治療藥是有用的。此外，對于開發(fā)大腦皮質疾病的新的治療藥也是有用的。
權利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，含有1)CRBNJ)編碼CRBN的核酸、或；3)表達CRBN 的干細胞或神經前體細胞。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，編碼CRBN的核酸被插入到病毒載體中。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，除了含有CRBN以外，還含有與 CRBN 一起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質。
4.根據權利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，除了含有編碼CRBN的核酸以外，還含有編碼與CRBN —起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的核酸。
5.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，含有除了表達CRBN以外，還表達與 CRBN 一起形成泛蛋白連接酶復合體的蛋白質的干細胞或神經前體細胞。
6.根據權利要求1 5的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用于治療大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷。
7.根據權利要求1 5的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用于再生大腦皮質。
8.向非人動物施用權利要求1 7的任一項所述的藥物組合物，使該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞增殖的方法。
9.向非人動物施用權利要求1 7的任一項所述的藥物組合物，使該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞向神經細胞分化的方法。
10.一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于，包括下述工序使被驗物質與包含CRBN的泛蛋白連接酶復合體接觸的工序；和測定所述泛蛋白連接酶復合體的泛蛋白連接酶活性，選擇使泛蛋白連接酶活性提高的被驗物質的工序。
11.一種大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法，其特征在于，包括下述工序在被驗物質的存在下培養(yǎng)神經干細胞或神經前體細胞的工序；和測定神經干細胞或神經前體細胞中的CRBN的表達量，選擇使CRBN的表達量增大的被驗物質的工序。
全文摘要
為了提供誘導神經干細胞的增殖和向神經細胞的分化的新的因子，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其特征在于，含有1)CRBN、2)編碼CRBN的核酸、或3)表達CRBN的干細胞或神經前體細胞；本發(fā)明還提供向非人動物施用該藥物組合物，誘導該非人動物的神經干細胞或神經前體細胞的增殖和向神經細胞的分化的方法；并且，本發(fā)明提供利用CRBN進行的大腦皮質疾病或大腦皮質的外科損傷的治療藥的篩選方法。
文檔編號C12Q1/02GK102448472SQ20108002289
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權日2009年5月25日
發(fā)明者伊藤拓水, 半田宏, 堀田健太郎, 安藤秀樹 申請人:國立大學法人東京工業(yè)大學