專利名稱：雙鏈核糖核酸的聚離子復合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸的聚離子復合物，具體涉及核糖核酸的體內(nèi)遞送，更具體地涉及用于核糖核酸藥物的藥物遞送系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
由于其強有力的基因沉默能力，利用雙鏈短干擾RNA (siRNA)的RNA干擾不僅作為研究工具、而且作為治療對策也是非常有前途的(非專利文獻1至4)。然而，在體內(nèi)應用siRNA 仍然局限于局部遞送(非專利文獻5至8)。該局限性可歸因于由于體內(nèi)的酶促降解造成的 siRNA的低穩(wěn)定性，和/或細胞膜的低滲透性。雖然開發(fā)遞送載體將可能使siRNA能夠明確地通過全身性施用而導入靶組織內(nèi)，但是關(guān)于利用siRNA對腎臟疾病的功效的遞送系統(tǒng)僅可獲得極少數(shù)報道。脂類接合的siRNA (非專利文獻9)或脂質(zhì)體封裝的siRNA (非專利文獻10)已表現(xiàn)出在肝臟中積累，并沉默靶基因；然而，siRNA的腎臟分布被認為不過是觀察到腎小管細胞中的降解過程、或者向管腔中的排泄過程。以固有細胞(resident cell)響應血液動力學或免疫學紊亂而分泌多種病原性因子為特征的腎小球是用于分子治療的合理靶標。然而， 單獨的siRNA (若干納米長的小分子)被快速排泄到尿液中，而上述脂類接合的siRNA或脂質(zhì)體封裝的siRNA由于其尺寸(數(shù)百納米)和特征難以遞送至作為腎小球中結(jié)締組織的系膜細胞等。針對對于腎臟疾病的有效藥物的低可得性這一背景，需要開發(fā)適于腎小球靶向的利用siRNA的基因沉默的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明人之前報道了與嵌段共聚物的聚離子復合物可用作帶電蛋白質(zhì)和DNA的遞送系統(tǒng)(專利文獻1)。本發(fā)明人還研究了嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)、和制備特別適合遞送雙鏈寡核酸的聚離子復合物的方法，并報道了攜帶形式為高分子膠束的雙鏈寡核酸的嵌段共聚物 (專利文獻2)。還報道了具有以梳狀形式與聚陽離子化合物結(jié)合的親水基作為側(cè)鏈的載體 (接枝共聚物)和RNA的復合物改善RNA在血液中的穩(wěn)定性和保留性(專利文獻3)。專利文獻1和2中描述的核酸遞送系統(tǒng)預期確保在體內(nèi)向各種組織穩(wěn)定的遞送，并且是具有數(shù)十至數(shù)百納米的尺寸分布的高分子膠束。專利文獻3中描述的復合物表現(xiàn)出強效地抑制肝臟中的基因表達，但未描述向腎臟區(qū)域的遞送。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻
專利文獻 1 JP-B-2690276 專利文獻 2 :W02005/078084 專利文獻 3 JP-A-2008-201673。非專利文獻
非專利文獻 1 :Gewirtz, A.M. 2007. J. Clin. Invest. 117:3612-3614 非專利文獻2 :Akhtar, S·，和Benter, I. F. 2007. J Clin. Invest. 117:3623-3632 非專利文獻 3:Blow, N. 2007. Nature. 450:1117-1120
非專利文獻 4:Kim, D. H.，和 Rossi, J. J. 2007. Nat. Rev. Genet. 8:173-184非專利文獻 5 Savaskan, N. E.，等人，2008. Nat. Med. 14:629-632 非專利文獻 6 :Palliser, D·，等人，2006. Nature. 439:89-94 非專利文獻 7 :Thakker, D. R.，等人，2004. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 101:17270-17275
非專利文獻 8 =Bitko, V.，Musiyenko, Α.，Shulyayeva, 0.，和 Barik, S. 2005. Nat. Med. 11:50-55
非專利文獻 9 :Soutschek, J.，等人 2004. Nature. 432:173-178 非專利文獻 10 :Zimmermann, Τ. S.，等人 2006. Nature. 441:111-114。發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明是考慮上述問題而開發(fā)的，并且意在提供用于向組織或細胞遞送雙鏈核糖核酸的遞送系統(tǒng)等，所述核糖核酸在腎小球、特別是系膜細胞等中的基因沉默中發(fā)揮作用。解決向題的手段
本申請發(fā)明人進行了廣泛的研究，以解決上述問題，并發(fā)現(xiàn)通過在規(guī)定條件下混合雙鏈核糖核酸和具有特定聚陽離子結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物，在不形成高分子膠束的情況下產(chǎn)生平均粒徑小于100 nm的更小尺寸的聚離子復合物，然后，使用此類聚離子復合物，第一次成功地將雙鏈核糖核酸有效遞送至腎小球細胞，從而開發(fā)了本發(fā)明。因此，本發(fā)明如下
(1)非高分子膠束形式的聚離子復合物，所述復合物由靜電結(jié)合在一起的雙鏈核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物組成，其中，如通過動態(tài)光散射測量方法測量的， 聚離子復合物具有小于100 nm的平均粒徑
權(quán)利要求
1.非高分子膠束形式的聚離子復合物，所述復合物由靜電結(jié)合在一起的雙鏈核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物組成，其中，如通過動態(tài)光散射測量方法測量的， 所述聚離子復合物具有小于100 nm的平均粒徑
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚離子復合物，其中所述雙鏈核糖核酸是siRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的聚離子復合物，其具有小于50nm的平均粒徑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項的聚離子復合物，其具有10nm至小于20 nm的平均粒徑。
5.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項的聚離子復合物和藥學上可接受的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其被遞送至腎小球或系膜細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的藥物組合物，其用于治療或預防病理狀況主要發(fā)生在系膜中的腎臟疾病。
8.用于制備聚離子復合物納米載體的試劑盒，所述納米載體用于遞送雙鏈核糖核酸， 所述試劑盒由容納在分開容器中的下列通式(I)或(II)表示的嵌段共聚物、和用于溶解所述嵌段聚合物和/或雙鏈核糖核酸的試劑組成
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其進一步包括容納雙鏈核糖核酸的容器。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的試劑盒，其進一步包括說明書，所述說明書陳述所述嵌段共聚物和所述雙鏈核糖核酸按Ν/Ρ = 1. 2至1. 5的比例混合，N表示所述嵌段共聚物中的陽離子總數(shù)，P表示所述雙鏈核糖核酸中的磷酸酯鍵或等價鍵的總數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10的任一項的試劑盒，其用于遞送至腎小球或系膜細胞。
12.用于治療或預防腎臟疾病的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求5至7的任一項的藥物組合物施用至需要的對象的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述腎臟疾病是主要由系膜病理學表征的腎臟疾
全文摘要
本發(fā)明提供了用于遞送雙鏈核糖核酸到組織或細胞等中的遞送系統(tǒng)，所述雙鏈核糖核酸在腎小球、特別是在系膜細胞等中發(fā)揮基因沉默功能。非高分子膠束形式的聚離子復合物由靜電結(jié)合在一起的雙鏈核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物組成，其中，如通過動態(tài)光散射測量方法測量的，所述聚離子復合物具有小于100nm的平均粒徑，其中每個符號如說明書中所定義。
文檔編號C12N15/09GK102449152SQ20108002394
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者堀雄一, 大庭誠, 宮田完二郎, 松本悟, 清水英樹, 片岡一則, 藤田敏郎, 西山伸宏, 要伸也 申請人:國立大學法人東京大學