專(zhuān)利名稱(chēng)：聚合酶的編碼基因和制備聚合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
這本發(fā)明涉及一種聚合酶以及編碼這種酶的基因。特別是，本發(fā)明提供了一種編碼這種聚合酶的功能性基因，一種含有這種基因的重組載體，一類(lèi)通過(guò)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)化子，以及一個(gè)制備聚合酶的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程涉及到用轉(zhuǎn)化子來(lái)合成塑狀高分子聚合物。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(PHA)是存在于微生物體內(nèi)的聚合物，它具有與主要商用塑料材料十分接近的性質(zhì)。大多數(shù)PHA是具有人工添加生物降級(jí)附加優(yōu)勢(shì)的熱塑性塑料，并且可以通過(guò)類(lèi)似于從石油化工產(chǎn)品中提取制成的合成塑料的方法熱加工得到。PHA本質(zhì)上也是可再生的，因?yàn)樗麄兛梢杂商穷?lèi)、植物油和二氧化碳這些可再生資源制備得到。聚3-羥基丁酸是最早被發(fā)現(xiàn)的PHA類(lèi)型，也是自然界中最為普遍存在的PHA。PHA可以通過(guò)調(diào)控次級(jí)單位結(jié)構(gòu)的合成或構(gòu)成來(lái)修飾其性質(zhì)以應(yīng)用于廣泛的領(lǐng)域當(dāng)中。用于聚合物合成的微生物可以被分成兩組，一組是利用3個(gè)到5個(gè)碳單位進(jìn)行聚合物合成的微生物，另一組是利用6個(gè)到14個(gè)碳單位進(jìn)行聚合物合成的微生物。這些具有特征性的微生物體內(nèi)具有底物特異性聚合酶。這些至少由6個(gè)碳單位組成的聚合物是具有彈性的軟性聚合材料。以往通過(guò)研究PHA所獲得的以及仍在不斷增長(zhǎng)的利益價(jià)值，驅(qū)使著人們向新的細(xì)菌菌株領(lǐng)域展開(kāi)研究攻勢(shì)，以從中獲得優(yōu)良新穎的聚合體產(chǎn)品。通過(guò)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性微生物的調(diào)查研究所獲得的PHA產(chǎn)品則是一個(gè)良好的證明。有關(guān)于PHA生物合成的基因，包括其關(guān)鍵酶，即從這些微生物中提取得到的PHA合酶，已經(jīng)被鑒定和定性了。目前有一些專(zhuān)利技術(shù)要比先前涉及聚合酶和基因編碼的研究更好的技術(shù)，如美國(guó)專(zhuān)利No. US6812013是對(duì)在一些制備過(guò)程中一種有用的PHA合酶的相關(guān)研究，其中有的制備過(guò)程是對(duì)一個(gè)PHA，一個(gè)編碼這種酶的基因，一個(gè)包含有這種基因的聚合載體，以及一個(gè)通過(guò)這種載體進(jìn)行轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)化子的準(zhǔn)備事項(xiàng)，有的制備過(guò)程與利用轉(zhuǎn)化子制備PHA合酶有關(guān)，還有的制備過(guò)程與利用轉(zhuǎn)化子準(zhǔn)備PHA有關(guān)。通過(guò)把從惡臭假單胞菌中提取得到的一種PHA合酶引入到另一種用于制備PHA合酶或者PHA的宿主微生物中，而得到的轉(zhuǎn)化子，使這門(mén)技術(shù)得到了證實(shí)和描述。另一項(xiàng)美國(guó)專(zhuān)利No. US2004146998對(duì)于轉(zhuǎn)化子和使用同樣方法制備聚合酶的過(guò)程也有相關(guān)涉及。這門(mén)技術(shù)揭示了一種用于編碼共聚體合成酶的基因，一種微生物以及以這種微生物為研究目標(biāo)而進(jìn)行聚合體制備的一個(gè)途徑。其中該種微生物利用聚合體的基因進(jìn)行發(fā)酵合成。這門(mén)技術(shù)著重于對(duì)這種轉(zhuǎn)化子的結(jié)構(gòu)組成的研究。這種轉(zhuǎn)化子含有一個(gè)聚酯合成交聯(lián)合酶的基因，一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子，并且已被引入用于酵母的制備。—個(gè)優(yōu)良的轉(zhuǎn)化子和使用相同方法制備聚合體的過(guò)程已在美國(guó)專(zhuān)利 No. EP1626087中被揭示出來(lái)。這門(mén)技術(shù)提供了一個(gè)由一類(lèi)編碼由PHA合酶中推斷得到的豚鼠氣單胞菌的基因組成的基因表達(dá)盒。酵母也被用作為一種宿主和一種已經(jīng)被引入啟動(dòng)子和終止子的突變體，因此這種基因盒可以在酵母上發(fā)揮作用。
有些專(zhuān)利技術(shù)揭示了聚合酶的編碼基因與其他基因之間的聯(lián)系。美國(guó)專(zhuān)利 No. US2008233620中涉及到一種轉(zhuǎn)化子和一個(gè)在酵母上制備基因表達(dá)產(chǎn)品的過(guò)程的研究。 這種轉(zhuǎn)化子是通過(guò)引入幾個(gè)酶基因獲得的，這些酶基因是從PHA合酶中分離的，例如PHA合酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶基因的組合體。在另一項(xiàng)美國(guó)專(zhuān)利NO.US2003146703中揭示了一種表達(dá)PHA合酶和細(xì)胞內(nèi)的PHA解聚酶的重組微生物。這門(mén)技術(shù)使PHA的合成與降解能同步進(jìn)行。大多數(shù)的專(zhuān)利技術(shù)涉及到一類(lèi)轉(zhuǎn)化子和一個(gè)制備聚合物或通過(guò)使用已被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子來(lái)制備PHA的制備過(guò)程。但是，這些專(zhuān)利技術(shù)都與從不同種類(lèi)微生物的不同基因區(qū)中提取得到的PHA合酶基因有關(guān)。迄今為止，還沒(méi)有任何一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)是揭示了在某一聚合酶的合成過(guò)程中用3個(gè)碳到7個(gè)碳單位進(jìn)行聚合。因此，就提供一個(gè)聚合酶基因的改良 DNA片段來(lái)制造一個(gè)重組載體和一類(lèi)在活力水平增長(zhǎng)的情況下，對(duì)于聚合酶的供給有較大幫助的轉(zhuǎn)化子來(lái)說(shuō)，這門(mén)技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用是十分理想的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目標(biāo)是要提供一種從不同種類(lèi)細(xì)菌中提取的聚合酶基因和一個(gè)聚合酶合成的制備方法，且這種被基因標(biāo)記過(guò)的聚合酶是由有效的單體單位組合得到的。另一個(gè)研究目標(biāo)是要提供一個(gè)聚合酶的新型DNA結(jié)晶片段，然后把這種DNA結(jié)晶片段能夠連接到一個(gè)合適的載體上，從而得到一個(gè)重組載體，最終提供一個(gè)含有聚合酶的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種具有不斷增長(zhǎng)的酶活性的聚合酶。此外還有一個(gè)目標(biāo)是創(chuàng)造發(fā)展一個(gè)制備聚合物更有效率的途徑，利用轉(zhuǎn)化子來(lái)制備聚合物，包括聚合酶。通過(guò)本發(fā)明，上述所說(shuō)的目標(biāo)中，至少已有一個(gè)目標(biāo)或多或少得以實(shí)現(xiàn)。其中某一技術(shù)實(shí)施例是描述了一個(gè)有酶活的分離的多核苷酸用于形成一個(gè)由氨基酸序列組成的多肽的編碼過(guò)程，且這個(gè)氨基酸序列源于SEQ ID NO :1排列得到。另一技術(shù)的實(shí)施例也是在一個(gè)分離的多核苷酸用于合成一個(gè)含有一個(gè)氨基酸序列的多肽的編碼過(guò)程中，且這個(gè)氨基酸序列也是源于SEQ ID NO :1排列得到，但是其中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被替換，刪除，取代或者添加，因而這個(gè)多肽具有聚合酶活性。根據(jù)本發(fā)明的最佳實(shí)施例，分離的多核苷酸由一個(gè)通過(guò)SEQ ID NO 2排列得到的核苷酸序列或其中的補(bǔ)充序列組成。本發(fā)明另一個(gè)最佳實(shí)施例是一個(gè)分離的多核苷酸，它是由通過(guò)SEQ ID N0:2排列得到的核苷酸序列或其中的補(bǔ)充序列組成的，但其中T被U或其補(bǔ)充序列所替代。還有一個(gè)實(shí)施例是一個(gè)由一種分離的多核苷酸組成的重組載體，但是這個(gè)分離的多核苷酸是用于編碼另一種具有酶活性的多肽，此多肽是由源于SEQ IDNO 1排列得到的氨基酸序列組成的，或是由一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、刪除、替換或添加的并源于SEQ ID NO 1排列得到的氨基酸序列組成的具有聚合酶活性的多肽。此外，這個(gè)重組載體是質(zhì)粒。本發(fā)明深層體現(xiàn)的實(shí)施例，如前所述實(shí)施例，是對(duì)于一個(gè)通過(guò)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)深層體現(xiàn)實(shí)施例，是一種用于制備聚合物組成的過(guò)程在一個(gè)含有聚合材料的介質(zhì)中，培養(yǎng)一個(gè)由以上所述的任何一種實(shí)施例中分離的轉(zhuǎn)化子，然后從培養(yǎng)過(guò)的介質(zhì)中使聚合物復(fù)原。最佳情況下的聚合物是PHA。對(duì)于這項(xiàng)技術(shù)十分熟悉的人來(lái)說(shuō)，不難看出，本發(fā)明已經(jīng)很好地實(shí)現(xiàn)了發(fā)明目的， 獲得上述所提及的以及其本身?yè)碛械慕Y(jié)果與優(yōu)點(diǎn)。此處所述的實(shí)施例，并不是為了局限發(fā)明的范圍。


為了幫助理解該發(fā)明，有說(shuō)明所附的繪圖的首選實(shí)施例，其中考慮與下面的介紹和發(fā)明的檢查的相關(guān)聯(lián)，其構(gòu)成與操作以及其他一些優(yōu)點(diǎn)會(huì)很容易被懂得和欣賞。圖1是氨基酸序列的多肽聚合物合成酶，如在本發(fā)明的最佳實(shí)施方案之一中所述。圖2是標(biāo)有聚合物合成酶編碼的多聚核苷酸，如在本發(fā)明的最佳實(shí)施方案之一所述。圖3是用于PCR擴(kuò)增的聚合物合成酶的擴(kuò)增核苷酸序列，如在本發(fā)明的最佳實(shí)施方案之一中所述。圖4是H-NMR譜(3_羥基丁酸酯_C0_3-羥基_C0_3-羥基丁酸)，是所述的首選實(shí)施例之一轉(zhuǎn)化子合成的共聚物的例子。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種高分子合成酶和編碼這種酶的基因。更詳細(xì)的說(shuō)，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼聚合酶的功能性基因，一個(gè)含有這種基因的重組載體，一個(gè)通過(guò)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子，一個(gè)為了制備聚合酶的過(guò)程，該過(guò)程與運(yùn)用轉(zhuǎn)化子制備塑狀聚合物有關(guān)。以下簡(jiǎn)述發(fā)明應(yīng)根據(jù)本發(fā)明的最佳實(shí)施方案和所附的說(shuō)明書(shū)和附圖描述。然而， 可以理解的是，限制發(fā)明的首選實(shí)施方案和圖紙的說(shuō)明，僅僅是為了方便討論本發(fā)明設(shè)想， 可以想象本領(lǐng)域技術(shù)人員作出的各種修改均不偏離權(quán)利要求所保護(hù)的范圍。本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)分離的一種編碼多肽的多聚核苷酸，它是由從SEQ IDNO=I中排列得到的氨基酸序列組成的，具有聚合酶的活性。SEQ ID N0:1如圖1所示。根據(jù)本發(fā)明的首選實(shí)施例，分離的多聚核苷酸是一種高分子合成酶基因。此外，這種聚合物合成酶基因可以編碼一個(gè)含有SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽，或是一個(gè)經(jīng)過(guò)先 SEQ ID NO :1中得到，后進(jìn)行刪除、替換或添加的氨基酸序列。即使一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列 SEQ ID NO :1，可能已經(jīng)發(fā)生了突變，如刪除，更換或添加，用于編碼含有的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸是包含在本發(fā)明的基因范圍內(nèi)的，如果多肽具有聚合酶的活性。例如，編碼含有從SEQID NO 1中排列得到的氨基酸序列的多聚核苷酸，其中在第一個(gè)位置上的蛋氨酸被刪除，它也屬于本發(fā)明的基因。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的基因不僅包括編碼從SEQ ID NO 2排列得到的氨基酸序列的核苷酸序列，而且它的退化，除了簡(jiǎn)并密碼子，也編碼相同的多肽。上述的突變?nèi)鐒h除，更換或增補(bǔ)可以由已知的定點(diǎn)突變引起。在本發(fā)明的首選實(shí)施例中，揭示了一個(gè)由SEQ ID NO 2核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成的分離的多核苷酸。SEQ ID NO :2如圖2所示。盡管如此，本發(fā)明的另一實(shí)施例是一個(gè)由SEQ ID NO :2的核苷酸序列組成的分離的多聚核苷酸，但其中T是由U或其互補(bǔ)序列取代。這些多核苷酸用來(lái)編碼具有高分子合成酶活性的多肽的。這種聚合物合成酶基因最好是從一個(gè)合適的微生物中克隆得到。在按照本發(fā)明的首選實(shí)施例，高分子合成酶基因是從一個(gè)由淡水中分離出的屬于色素細(xì)菌屬的微生物中分離出來(lái)的。本發(fā)明的基因可通過(guò)化學(xué)合成或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，使用基因組DNA為模板，或使用DNA片段的核苷酸序列作為探針進(jìn)行雜交。本發(fā)明的基因可通過(guò)化學(xué)合成或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，使用基因組DNA為模板，或使用DNA片段的核苷酸序列作為探針雜交。在按照本發(fā)明的首選實(shí)施例，應(yīng)用PCR檢測(cè)方法是為了獲得聚合物合成酶基因的 DNA片段，使用色素細(xì)菌屬SP基因組的DNA為模板。最初，基因組DNA由色素細(xì)菌屬SP鏈所分離。在工藝中應(yīng)該知道，任何合適的介質(zhì)，例如，一種營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，可用于基因組 DNA的制備。要獲得含有色素細(xì)菌屬SP的聚合物合成酶基因的DNA片段，最好準(zhǔn)備一個(gè)探針。聚合酶基因的保守區(qū)域從已知的氨基酸序列，或?yàn)樗麄冞M(jìn)行編碼的核苷酸序列中挑選得到，這些核苷酸序列可被估計(jì)用來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸。這個(gè)目的是要通過(guò)一對(duì)引物擴(kuò)增核苷酸來(lái)達(dá)到。擴(kuò)增核苷酸的一個(gè)例子是如圖3所示，其中SEQ ID NO :3為正向引物，SEQ ID NO :4為反向引物。擴(kuò)增的DNA片段，可以用合適的限制性?xún)?nèi)切酶消化，例如氨基青霉烷酸-I和沙丁胺醇-I。然后DNA片段由堿性磷酸酶去磷酸化。它被連接在一個(gè)事前用限制性?xún)?nèi)切酶切割過(guò)的載體上，載體可以是氨基青霉烷酸-I和沙丁胺醇-I。本發(fā)明的另一實(shí)施例是一個(gè)由分離的多聚核苷酸組成的重組載體，其中分離出的分離的多聚核苷酸是用來(lái)編碼由SEQ ID NO :1排列得到的氨基酸序列組成的具有高分子合成酶活性多肽，或是用來(lái)編碼由SEQ ID NO :1排列得到的氨基酸序列組成，但其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除、更換或添加，且具有高分子合成酶活性的多肽。根據(jù)本發(fā)明的最佳實(shí)施例，能夠在宿主微生物中進(jìn)行自主復(fù)制的質(zhì)?；蚴删w可以用來(lái)作為載體?？蓱?yīng)用的質(zhì)粒載體包括pBR322，pUC18，pBluescriptll，而可應(yīng)用的噬菌體載體包括EMBL3，M13，Xgtll。這些載體可以在商業(yè)上獲得。擁有在2個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞例如大腸桿菌和短芽孢桿菌中自我復(fù)制能力的載體，就像是各種穿梭載體也可被應(yīng)用。這種載體使他們也可以被限制性?xún)?nèi)切酶切割為片段。因此，傳統(tǒng)的DNA連接酶是作用于將DNA片段連接到載體片段上。DNA片段和載體片段退火后，連接產(chǎn)生一種重組載體。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例是通過(guò)將本發(fā)明的重組載體引入到一個(gè)具有表達(dá)性的，用于結(jié)構(gòu)組成的，宿主兼容性載體上，也被稱(chēng)為重組載體，從而產(chǎn)生得到的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的目的不是要限制特定宿主的使用，只要它具有表達(dá)目的基因的能力。比較恰當(dāng)?shù)睦邮菍?duì)屬于菌屬的微生物的利用，如假單胞菌和芽孢桿菌；或者是來(lái)源于酵母屬或念珠菌屬的酵母；或者如COS或者膽固醇細(xì)胞系的動(dòng)物細(xì)胞。如果是像屬于菌屬或是假單細(xì)胞菌屬的微生物的細(xì)菌被用作宿主的話(huà)，那么本發(fā)明的重組DNA最好是由像是含有啟動(dòng)子的，本發(fā)明的DNA碎片的，以及序列轉(zhuǎn)錄終止所構(gòu)成的。這是為了保證宿主中自發(fā)復(fù)制的產(chǎn)生。最好是含有但沒(méi)有限制PGEM-T和pBBRlMCS-2 衍生物的表達(dá)載體。同樣地，啟動(dòng)子可以是任何可以在宿主中表達(dá)的類(lèi)型。啟動(dòng)子的例子是像來(lái)源于大腸桿菌或者噬菌體的包括色氨酸啟動(dòng)子，乳酸啟動(dòng)子，PL啟動(dòng)子，pR啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子。為了將重組載體引入宿主微生物中，任何已知的方法都可以利用。例如，如果宿主微生物是大腸桿菌，鈣離子法和電穿孔法可以使用。如果使用了噬菌體DNA，那么體外包裝方法就可以被采納。如果將酵母作為宿主，那么像如？13或者YCp50這樣的表達(dá)載體會(huì)被使用。因此，啟動(dòng)子可以是1加侖的啟動(dòng)子或是10加侖的啟動(dòng)子；并且將重組DNA引入酵母中的方法包括電穿孔法，原生質(zhì)球法和醋酸鋰法。如果將動(dòng)物細(xì)胞作為宿主，那么像PcDNAI或者 pcDNAI/Amp這樣的表達(dá)載體會(huì)被使用。因此，將重組DNA引入至動(dòng)物細(xì)胞的方法可以是電穿孔法或者磷酸鉀法。若要將引入主機(jī)微生物載體，可以使用任何已知的方法。例如，如果主機(jī)微生物是大腸桿菌，鈣法與電穿孔法可以使用。如果使用噬菌體DNA，則可以通過(guò)體外的包裝方法。如果酵母用作主機(jī)采用表達(dá)載體(例如，Y印13或YCp50。因此，發(fā)起人可以是gal 1啟動(dòng)子或啟動(dòng)子gal 10 ；和重組DNA導(dǎo)入酵母的方法包括電穿孔法、原生質(zhì)球法及醋酸鋰方法。如果動(dòng)物細(xì)胞用作主機(jī)，則使用(例如，PcDNAI或pcDNAI/Amp表達(dá)載體。因此，引入動(dòng)物細(xì)胞的基因重組的方法可以是電穿孔法或磷酸鉀方法。本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有培養(yǎng)包括如之前所述的，在包含可聚物質(zhì)媒介的任何先前的實(shí)施例中所述的，在含有聚合原料的介質(zhì)中，分離的聚核苷酸組成的轉(zhuǎn)化子，以及從培養(yǎng)介質(zhì)中復(fù)原為聚合體的各個(gè)步驟。此聚合體可以在轉(zhuǎn)化子中形成與累積。用于培養(yǎng)宿主的傳統(tǒng)的方法也被用來(lái)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子。用于先從一種作為宿主的屬于菌屬或假單胞菌屬的微生物中準(zhǔn)備得到轉(zhuǎn)化子的介質(zhì)包括一種含有可被微生物吸收利用的碳源的介質(zhì)，該介質(zhì)中的氮源、無(wú)機(jī)鹽或者其他的有機(jī)氮源是被限制了的，例如，某一介質(zhì)中的氮源重量被限制在介質(zhì)重量的0. 01 %到0. 1 %以?xún)?nèi)。碳源是微生物生長(zhǎng)的必須原料，同時(shí)也是聚合物的起始材料。使用的碳源可源自碳?xì)浠衔锶缙咸烟恰⒐?、蔗糖和麥芽糖。此外，有兩個(gè)或多個(gè)碳原子的脂肪和油相關(guān)物質(zhì)也可以用作碳源。這些脂肪和油相關(guān)的物質(zhì)包括天然脂肪和油，如玉米油、豆油、紅花油、 葵花籽油、橄欖油、椰子油、棕櫚油、菜籽油、深海魚(yú)油、鯨油、豬油和牛油；脂肪酸如醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸和肉豆蔻酸以及酯如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、乙酯、丁辛醇、月桂醇、油醇酯酒精和棕櫚醇以及其酯醇。與此同時(shí)，氮源可以從氨、銨鹽、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物或玉米漿中提取。無(wú)機(jī)物質(zhì)包括磷酸二氫鉀、磷酸、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉。培養(yǎng)最好是在有氧條件下，在30°C至34°C左右，培養(yǎng)超過(guò)M小時(shí)，最好1到3天之后誘導(dǎo)表達(dá)，。在培養(yǎng)中，抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、安替比林或四環(huán)素可添加到培養(yǎng)中。因此，聚合物可在微生物中積累，然后復(fù)原。若要培養(yǎng)使用誘導(dǎo)催化劑，即誘導(dǎo)物例如異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)或吲哚-3-乙酸(IAA)所誘導(dǎo)的表達(dá)載體而轉(zhuǎn)化的微生物，也可以添加到介質(zhì)中。 若要培養(yǎng)來(lái)自于動(dòng)物細(xì)胞作為宿主的轉(zhuǎn)化子，則像RPMI-1640或是DMEM由牛胎血清補(bǔ)充的介質(zhì)也可以使用。根據(jù)本發(fā)明的首選實(shí)施例，通常的培養(yǎng)是在30°C至37°C的含有5% CO2 存在的情況下14至觀(guān)天。在培養(yǎng)過(guò)程中，卡那霉素或青霉素等抗生素可添加到介質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的最佳實(shí)施例，聚合物分離純化也是可以進(jìn)行。轉(zhuǎn)化株最好通過(guò)離心分離從培養(yǎng)中重新獲得，然后用蒸餾水和己烷清洗，并干燥。此后，干燥的轉(zhuǎn)化株懸浮法在氯仿中，并加熱從中提取聚合物。殘留物可以在過(guò)濾中清除。最好在氯仿中加入甲醇使聚合物沉淀。通過(guò)過(guò)濾和離心分離上清液后，干燥的沉淀便可以得到聚合物了。按常規(guī)手段， 例如，通過(guò)氣相色譜分析，核磁共振或其他方法，可以證明生成的聚合物便是希望得到的產(chǎn)物。這聚合物合酶可以合成由單體單位3-羥基烴酸，見(jiàn)結(jié)構(gòu)式一，所組成的共聚物 (聚合物)，其中R代表氫原子或Cl到C4烷基組。
權(quán)利要求
1.編碼由氨基酸序列組成的多肽鏈的分離的且具有聚合物合成酶活性的多核苷酸，在 SEQ ID NO 1 中提出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，包含核苷酸序列的分離的多核苷酸，在SEQID NO :2或其互補(bǔ)序列提出ο
3.核苷酸序列組成的權(quán)利要求1中的分離的多核苷酸，在SEQID NO :2中提出，S卩T被 U或它的互補(bǔ)序列替代。
4.權(quán)利要求1中的分離的多核苷酸組成重組載體。
5.權(quán)利要求4中的重組載體是質(zhì)?；蚴删w。
6.轉(zhuǎn)化子被權(quán)利要求5中的載體轉(zhuǎn)化。
7.制備聚合物的方法包括在包含聚合原料的培養(yǎng)基中，根據(jù)權(quán)利要求6培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子；從培養(yǎng)基中獲得聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的制備方法，制備的聚合物是聚羥基脂肪酸酯。
9.在SEQID NO :1中提出，包含核苷酸序列的分離的多核苷酸，替換、刪除或添加其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸時(shí)，多肽表現(xiàn)出聚合物合成酶活性。
10.權(quán)利要求9中的分離的多核苷酸組成重組載體。
11.權(quán)利要求10中的重組載體是質(zhì)?；蚴删w。
12.轉(zhuǎn)化子被權(quán)利要求11中的載體轉(zhuǎn)化。
13.制備聚合物的方法包括在包含聚合原料的培養(yǎng)基中，根據(jù)權(quán)利要求12培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子；從培養(yǎng)基中獲得聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的制備方法，制備的聚合物是聚羥基脂肪酸酯。
全文摘要
聚羥基脂肪酸酯(PHA)合酶基因(SEQ ID NO2)從淡水色桿菌屬分離得到，它的氨基酸序列(SEQ ID NO1)以及制備以C3和C7為單體聚合而成的多聚體，包括聚(3-羥基丁酸酯-CO-3-羥基)隨機(jī)共聚物(聚(3HB-co-3HV))和聚(3-羥基丁酸酯-CO-3-羥基丁酸)隨機(jī)共聚物[P(3HB-co-3HHx)]以及P(3HB-co-3HHx)共聚物。通過(guò)在例如貪銅菌屬以及假單孢菌等微生物的重組宿主中表達(dá)SEQ ID NO2的序列來(lái)制備多聚體。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102459601SQ201080025435
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者K·蘇德士·庫(kù)馬爾·A/L·C·卡納帕蒂·皮萊, 柯薩文·A/L·布巴蘭, 阿米魯·阿爾-阿什拉夫·巴拉克里斯南·賓·阿卜杜拉, 默罕默德·拉西卜·賓·薩米安 申請(qǐng)人:馬來(lái)西亞理科大學(xué)