專利名稱：用于防治植物病原性真菌的生物殺真菌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌毒性細(xì)菌(特別是普城沙雷菌(Serratia plymuthica) CCGG2742野生型菌株)及其分泌的真菌毒性分子，其作為植物病原性真菌(特別是在收獲前后導(dǎo)致果實灰腐的灰霉菌(Botrytis cinerea)真菌)的生物防治劑。該細(xì)菌可在收獲前后以活菌形式使用，這是因為其是一種對動植物均不顯示致病性的野生腐生微生物。同時，也可以使用所分泌分子的濃縮物或者單獨使用純的真菌毒性分子制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了表征為普城沙雷菌CCGG2742的野生型細(xì)菌菌株及其作為生物殺真菌劑的用途。所述細(xì)菌菌株已保藏于西班牙瓦倫西亞大學(xué)的西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Coleccion Espafiolade Cultivos Tipo，CECT))。國際保藏機(jī)構(gòu)指定的登錄號為CECT7404 (參見所附文件)。這種源自智利的野生型細(xì)菌從葡萄皮中分離出來，并具有殺死 植物病原性真菌灰霉菌之不同分離株和野生型菌株的能力。該細(xì)菌的殺真菌能力是由于其 分泌真菌毒性分子所致，所述真菌毒性分子與真菌相互作用、破壞真菌并因此抑制分生孢子萌發(fā)以及真菌菌絲體增殖。許多目前使用的生物殺真菌劑對于人和植物具有潛在的致病性。相反，普城沙雷菌CCGG2742對于植物或果實不具有致病性也不具有毒性，并且還發(fā)現(xiàn)其對于動物和人也不具有致病性。實驗室研究表明，在僅含有I. 5% (重量/體積)瓊脂(用以維持適當(dāng)水平的濕度)的培養(yǎng)皿中，在20°C接種7天后觀察，發(fā)現(xiàn)將其接種到豆類和葡萄植物葉子中不會造成這些宿主任何可見的變化。以同樣的方式，當(dāng)將高水平的細(xì)菌菌株接種物(2 X IO10Cfu (菌落形成單位)/葡萄衆(zhòng)果)加至健康或有傷口的葡萄中，在如上述同樣的條件下接種7天后未觀察到任何影響。目前的細(xì)菌生物殺真菌劑存在的另一個問題是其在需要保護(hù)免受植物病原性真菌侵害的植物和果實表面的存活時間短。實驗室研究表明，將CCGG2742菌株以IO6 108cfU/cm2劑量接種于葡萄上，在果皮表面達(dá)到IO3 105cfU/cm2的水平，并且如果葡萄有傷口，則菌群在20°C接種24小時后生長至IO5 107cfu/cm2，當(dāng)將果實保存在4°C，則維持同樣的水平達(dá)5 7天，保護(hù)免受灰霉菌的感染。本發(fā)明的生物學(xué)試劑對應(yīng)于從田間(一般在葡萄皮上)分離的并且已通過生物化學(xué)、微生物學(xué)，電子顯微鏡和16S rDNA測序技術(shù)鑒定的野生細(xì)菌。普城沙雷菌CCGG2742是源于智利的菌株，其對應(yīng)于腐生生物，對動植物無致病性，因此其活細(xì)胞適于用作抗灰霉菌的生物殺真菌劑。此外，本發(fā)明涉及含有所述細(xì)菌菌株或含有所述細(xì)菌菌株之提取物的組合物，或者涉及含有從其衍生之化合物(例如，所述細(xì)菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有這些都能夠保護(hù)植物及其果實在收獲前后期間免受植物病原性微生物的侵害。本發(fā)明還包括從野生型菌株衍生的、具有基本相同之特征的突變體。同樣地，本發(fā)明涉及獲得所述細(xì)菌菌株或其衍生物的方法，并且涉及其在保護(hù)植物(尤其是果實)中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明提供了使用純的普城沙雷菌CCGG2742細(xì)菌菌株防治植物中真菌病害的制劑。使用該細(xì)菌作為化學(xué)合成之殺真菌劑的天然替代物，從而為實現(xiàn)植物病原性真菌病害的防治或消除確保了更安全的環(huán)境。最后，本發(fā)明提供了含有生物學(xué)活性之合適形式和量的所述細(xì)菌菌株的組合物。該混合物含有能夠使細(xì)菌粘附到其所接種之植物上的無毒試劑、植物營養(yǎng)物和防腐劑。該混合物以液體懸液或凍干粉末的形式存在。
背景技術(shù)：
由植物病原性真菌導(dǎo)致的病害被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最有害且傳播較廣的病害。目前，這些病害的防治主要基于化學(xué)殺真菌劑的使用。由于缺乏有效的和環(huán)境更安全的替代物，盡管化學(xué)殺真菌劑對于植物和操作者和/或在噴灑區(qū)域工作的人具有高毒性，并且其幾乎不被生物所降解，但是因為其對抗真菌病害相對有效的活性所以仍在大量使用。
灰霉菌是一種感染很多重要經(jīng)濟(jì)作物品種(包括果樹、觀賞植物和蔬菜)的植物病原性真菌。該真菌導(dǎo)致稱為“灰霉病”的病害，造成草莓、覆盆子、蘋果、梨、栗子、獼猴桃和葡萄等收獲前后的主要問題。在葡萄中該真菌導(dǎo)致葡萄腐爛病(pudrici0n delracimo)，這被認(rèn)為是目前在智利的水果出口市場上影響生產(chǎn)水平的最嚴(yán)重病害之一，因為其不僅在田間而且在儲存和運輸過程中均可造成巨大的損失(van Kan J. A. 2006.Licensed to kill the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen，Trends PlantSci. 11，247-253 ;Elad，Y. ,Williamson,B.，Tudzynski，P.和DeIen，N.編· 2007. Botrytis Biology, Pathology and Control. The Netherlands Kluwer Academic Publishers)。目前，這種重要的植物病原菌的防治主要通過化學(xué)殺真菌劑來實現(xiàn)。但是，在過去幾年中，已描述了一些具有抗灰霉菌之抗真菌活性的微生物。一些最有前景的實例有Serenade⑩ 其活性原理是稱為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)QST 713的細(xì)菌，其由加州戴維新的AgraQuest Inc,公司在菜園土壤樣本中發(fā)現(xiàn)。這種殺真菌劑在多個國家(包括智利)注冊。其具有低毒性，并且其作為商品在美國用于病害(例如粉孢子(葡萄白粉菌(Uncinula necator)),灰霉菌導(dǎo)致的灰腐和葡萄中的酸腐)防治。美國專利No. 5,869，038 描述了突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、液化沙雷菌(Serratia Iiquefaciens)、普城沙雷菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)和多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)的細(xì)菌分離株,其有效地抑制導(dǎo)致白菜收獲后病害的灰霉菌和甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternaria brassicicola)真菌的發(fā)生。該專利所述的普城沙雷菌對應(yīng)于菌株CL43，其不同于本發(fā)明中的細(xì)菌菌株，并且為了具有合適的抑制真菌發(fā)生的效果，其通常與先前提及的細(xì)菌混合使用。相反，細(xì)菌菌株CCGG2742作為純培養(yǎng)物，有效地抑制灰霉菌，并且不必為了用作殺真菌劑而與其它細(xì)菌混合。美國專利No. 6，004, 774公開了抑制致病性植物真菌和細(xì)菌發(fā)生的枯草芽孢桿菌菌株，并描述了治療或保護(hù)植物免受真菌和細(xì)菌感染的方法。美國專利No. 6，077，506涉及一種新的顯示廣譜抗真菌和抗細(xì)菌能力的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)菌菌株。此外還描述了使用該蘇云金芽孢桿菌細(xì)菌菌株或其產(chǎn)生的抗生素防治廣譜的植物病原性細(xì)菌和真菌。WO 00/57706公開了成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)細(xì)菌菌株基本上純的生物培養(yǎng)物，其用作生物防治造成果實腐爛之真菌的拮抗劑。這些拮抗劑具有非常高的效力，并且與那些最常使用的合成抗真菌劑相當(dāng)。該拮抗劑有效地對抗由灰霉菌、指狀青霉菌(Penicillimn digitatum)、擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)、意大利青霉菌(Penicillium i tali cum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)導(dǎo)致的腐爛。WO 02/072795公開了一組細(xì)菌，其為抗御植物病原性真菌和細(xì)菌的拮抗劑。這些分離的細(xì)菌有多粘芽孢桿菌、綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、普城沙雷菌、和枯草芽孢桿菌菌種。在該情形中，所述細(xì)菌菌株普城沙雷菌VKPM B-7957也不同于本發(fā)明的細(xì)菌菌株，因為當(dāng)作為純培養(yǎng)物使用時，此細(xì)菌抗植物病原性真菌的效力很低，并且其必須與其它具有殺真菌活性的細(xì)菌混合使用以增強(qiáng)其效果。WO 03/000051 公開了一種地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)細(xì)菌菌株SB3086的生物學(xué)純培養(yǎng)物用作生物殺真菌劑。將活生物體用作生物防治劑具有一些局限性，例如抗植物病原體的有效范圍窄，隨時間不穩(wěn)定，這造成活生物體在環(huán)境中的存在時間短，因而導(dǎo)致非常低的生物殺蟲劑活性。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)儲存條件時，很多所使用的細(xì)菌菌株在幾周內(nèi)死亡，或者在田間使用典型條件(具有較高的溫度和對于活躍生長之微生物有害的紫外線)下幾小時內(nèi)死亡。在應(yīng)使用所述微生物的同樣位置培養(yǎng)所述微生物的嘗試已取得一些效果。但是，培養(yǎng)物污染的嚴(yán)重問題以及生物防治劑需在晚間施用(以防紫外線和溫度影響)的需要使系統(tǒng)復(fù)雜，并且造價昂貴。這表明目前尚沒有設(shè)計出能夠抑制真菌病害造成之植物損害的有效的且環(huán)境友好的生物防治方法，因此，減少目前大量使用的合成化學(xué)殺真菌劑的使用向科學(xué)家提出了巨大的挑戰(zhàn)，也是農(nóng)業(yè)的巨大需求。因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有生物殺真菌活性的有效的、環(huán)境安全的生物學(xué)試劑，用于防治由植物病原性真菌和微生物(特別是灰霉菌)造成的植物病害。


圖I是普城沙雷菌CCGG2742細(xì)胞的掃描電鏡照片。左下角的短線表示I μ m。圖2是普城沙雷菌CCGG2742的顯微鏡照片。用1%磷鎢酸鉀進(jìn)行負(fù)染。圖3是普城沙雷菌CCGG2742超薄切片的顯微鏡照片。圖4示意普城沙雷菌CCGG2742在不同溫度下的生長圖示。圖5示意普城沙雷菌CCGG2742在不同pH值緩沖的培養(yǎng)基中的生長圖示。圖6顯示生物殺真菌劑細(xì)菌對灰霉菌菌絲體的作用。圖7顯示普城沙雷菌CCGG2742的16S rDNA的部分核苷酸序列。圖8顯示作為生物防治劑的細(xì)菌于20°C在果實中孵育的效果。圖9顯示作為生物防治劑的細(xì)菌于4°C在果實中孵育的效果。發(fā)明詳述所述細(xì)菌菌株CCGG2742對應(yīng)于普城沙雷菌菌種。通過微生物測定和生化測定得出的其特征示于表I、2和3中。其在Luria Bertani (LB)瓊脂中以及在補(bǔ)充有麥芽提取物(20g/L)的瓊脂中產(chǎn)生無色/白色菌落，無色素沉著。
表I.普城沙雷菌CCGG2742的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征
權(quán)利要求
1.普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株是CCGG2742，其由國際保藏機(jī)構(gòu)西班牙瓦倫西亞大學(xué)西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Colecci0n Espanolade Cultivos Tipo, CECT))指定的登錄號為 7404。
2.生物殺真菌劑組合物，其包含權(quán)利要求I的細(xì)菌菌株或從其衍生的具有同樣生物學(xué)特性的活性提取物以及農(nóng)業(yè)可接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，當(dāng)將所述細(xì)菌菌株以IO6 IO8Cfu(菌落形成單位)/cm2劑量接種葡萄時，其存活為IO3 105cfU/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，其在4°C 40°C溫度范圍內(nèi)生長。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，其在pH3 10的范圍內(nèi)生長。
6.根據(jù)權(quán)利要求2 5中任一項的生物殺真菌劑組合物用于防治由植物病原性真菌在植物或果實中造成之真菌感染的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述植物病原性真菌屬于灰霉菌屬(Botrytis)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中IO5 108cfu/mL的有效劑量的細(xì)菌菌株CCGG2742或從其衍生的提取物用于防治灰霉菌Ootrytis cinerea)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8的用途，其用于保護(hù)收獲前或收獲后狀態(tài)、儲存、運輸和保存期間的果實。
10.防止果實腐爛的方法，其中向所述果實噴灑權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中通過噴灑液體培養(yǎng)物或用水溶液懸浮的凍干粉末來施加所述生物殺真菌劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物殺真菌劑組合物，其來自從葡萄皮獲得的智利細(xì)菌分離株(對應(yīng)于普城沙雷菌(Serratia plymuthica)CCGG2742)的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其用作防治真菌植物病害(尤其是果實易被灰霉菌(Botrytis cinerea)感染)的環(huán)境友好型生物防治劑，有效抑制所述植物病原性真菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲體增殖。所述生物殺真菌劑組合物還保護(hù)植物葉子和果實免受所述真菌的感染，并且可以潛在地用于其它植物病原性真菌和微生物的生物防治中。
文檔編號C12R1/425GK102884173SQ201080025988
公開日2013年1月16日 申請日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月16日
發(fā)明者安東尼奧·卡斯蒂略納拉 申請人:智利圣地亞哥大學(xué)