專利名稱：Dig-3殺蟲cry毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的殺蟲Cry毒素以及它們用于控制昆蟲的用途。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis (B. t.))是土傳細(xì)菌，其產(chǎn)生稱為δ 內(nèi)毒素或Cry蛋白的殺蟲晶體蛋白質(zhì)。Cry蛋白是口服毒物，其通過作用于易感昆蟲的中腸細(xì)胞而發(fā)揮功能。S內(nèi)毒素的擴(kuò)充列表在http://www. lifesci. sussex. ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/intro. html中得以維持和定期更新。歐洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis (Hubner))是對(duì)整個(gè)美國(guó)和加拿大的玉米的損害最大的蟲害，并且每年造成由于作物產(chǎn)量損失和昆蟲控制消費(fèi)所導(dǎo)致的估計(jì)為10 億美元的收益損失(Witkowski等，200 。表達(dá)編碼Cry蛋白(最顯著的是CrylAb、CrylAc 或CrylF)的基因的轉(zhuǎn)基因玉米提供了商業(yè)水平的抗ECB功效。盡管抗ECB轉(zhuǎn)基因玉米的成功，但產(chǎn)生抗性昆蟲群體的可能性威脅著Cry蛋白在ECB控制中的長(zhǎng)期持久性，并且產(chǎn)生了發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新Cry蛋白以控制ECB和其他害蟲的需求。對(duì)B. t. Cry蛋白的昆蟲抗性可通過若干種機(jī)制產(chǎn)生(Heckel等，2007，Pigott and Ellar，2007)。已在昆蟲中鑒定了 Cry蛋白的多個(gè)受體蛋白質(zhì)類型，并且在每一受體類型中存在多個(gè)實(shí)例。例如，對(duì)特定Cry蛋白的抗性可通過受體蛋白的鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域的毒素結(jié)合部分的突變而產(chǎn)生?？剐缘钠渌绞娇赏ㄟ^原毒素加工蛋白酶介導(dǎo)。因此，鱗翅目 (Lepidoptera)物種對(duì)Cry毒素的抗性具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，涉及至少4個(gè)不同的主要抗性基因。對(duì)Cry蛋白有抗性的鱗翅目昆蟲已在田間在物種小菜蛾(Plutella xylostella) (Tabashnik，1994)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) (Janmaat 和 Myers 2003，2005)以及美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zeae) (Tabashnik等，2008)中產(chǎn)生。開發(fā)新的高效力Cry蛋白質(zhì)將能夠提供控制ECB和其他蟲害的其他工具。在轉(zhuǎn)基因玉米中組合產(chǎn)生的具有不同作用模式的Cry蛋白能夠預(yù)防ECB昆蟲抗性的產(chǎn)生，并且保護(hù)B. t.技術(shù)用于害蟲控制的長(zhǎng)期有用性。發(fā)明概述本發(fā)明提供了殺蟲Cry毒素，包括本文稱為DIG-3的毒素以及DIG-3的變體，編碼這些毒素的核酸，應(yīng)用該毒素控制害蟲的方法，在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中產(chǎn)生該毒素的方法，以及產(chǎn)生該毒素的轉(zhuǎn)基因植物。野生型DIG-3毒素的預(yù)測(cè)氨基酸序列在SEQ ID NO :2中給出ο如實(shí)施例1中所述，從Dow AgroSciences LLC內(nèi)部稱為PS46L的B. t.菌株中分離到了編碼DIG-3蛋白的核酸。確定了全長(zhǎng)編碼區(qū)的核酸序列，并從該核酸序列推導(dǎo)了全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。DIG-3毒素與CrylBII (Genbank Accession No. AAM93496)及其他蘇云金芽抱桿菌 CrylB-型蛋白(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ intro. html)具有某些相似性。在本文中還描述了 DIG-3毒素的殺蟲活性變體，并將其統(tǒng)稱為DIG-3毒素。DIG-3毒素也可與用于控制其他蟲害的RNAi方法聯(lián)合使用。例如，DIG-3可與抑制玉米根蟲關(guān)鍵基因或蟲害關(guān)鍵基因的dsRNA聯(lián)合用于轉(zhuǎn)基因植物中。此類靶基因例如包括，液泡ATP酶、ARF-U Act42A、CHD3、EF-I α和TFIIB。合適的靶基因的實(shí)例是液泡ATP 酶，如WO 2007/035650中所公開的那樣。本文報(bào)告的出人意料的發(fā)現(xiàn)是DIG-3毒素對(duì)歐洲玉米螟及小菜蛾的抗CrylF和 CrylA毒素的群體也是有活性的。因此，DIG-3毒素是用于控制鱗翅目害蟲的理想候選者。 該毒素可單獨(dú)使用，或與諸如CrylF、CrylAb和CrylAc的其他Cry毒素聯(lián)合使用，以控制抗性昆蟲群的產(chǎn)生。SEQ ID NO :2的殺蟲活性片段，以及編碼此類片段的核苷酸是本發(fā)明的另一方面。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的DIG-3毒素多肽，其包含選自下組的核心毒素片段(a)包含SEQ ID NO 2的殘基113至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO :2的殘基113至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQ ID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基113至643的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的DIG-3毒素多肽，其包含選自以下的核心毒素片段(a)包含SEQ ID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQ ID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的DIG-3毒素多肽，其包含選自以下的 DIG-3核心毒素片段(a)包含SEQ ID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQ ID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列的多肽。通過“分離的”，申請(qǐng)人的意思是多肽或DNA分子已通過人工從它們的天然環(huán)境中移出，并被置于不同的環(huán)境當(dāng)中。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含DIG-3毒素的植物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了控制害蟲群體的方法，包括使所述群體與殺蟲有效量的DIG-3毒素接觸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼DIG-3毒素的分離的核酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 DNA構(gòu)建體，其包含與非衍生自蘇云金芽孢桿菌的、并能夠在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接的編碼DIG-3毒素的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物，其包含穩(wěn)定地?fù)饺肫浠蚪M的該DNA構(gòu)建體，以及用于保護(hù)植物免遭害蟲的方法，包括將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO 1 編碼全長(zhǎng) DIG-3 毒素的 DNA 序列；377Int。SEQ ID NO 2 全長(zhǎng) DIG-3 蛋白序列；1256aa。SEQ ID NO 3 植物優(yōu)化的全長(zhǎng) DIG-3DNA 序列；3771nt。SEQ ID NO :4CrylAb 原毒素片段；545aa。SEQ ID NO 5嵌合毒素DIG_3核心毒素片段/CrylAb原毒素片段；1188aa。SEQ ID NO :6針對(duì)雙子葉植物優(yōu)化的編碼CrylAb原毒素片段的DNA序列；1635nt。SEQ ID NO 7針對(duì)玉米優(yōu)化的編碼CrylAb原毒素片段的DNA序列；1635nt。發(fā)明詳述DIG-3毒素以及殺蟲活件變體。除了 SEQ ID NO 2的全長(zhǎng)DIG-3毒素之外，本發(fā)明還包括了殺蟲活性變體。通過術(shù)語“變體”，發(fā)明人意圖包括片段、某些缺失和插入突變體、 以及某些融合蛋白。DIG-3是經(jīng)典的三結(jié)構(gòu)域Cry毒素。作為描述包括在本發(fā)明中的DIG-3 毒素變體的前言，簡(jiǎn)要地綜述一般的三結(jié)構(gòu)域Cry毒素和具體的DIG-3蛋白毒素的結(jié)構(gòu)是有用的。多數(shù)蘇云金芽孢桿菌δ -內(nèi)毒素晶體蛋白分子包括兩個(gè)功能片段。蛋白酶抗性核心毒素是第一個(gè)片段，并相應(yīng)于該蛋白質(zhì)分子的約前一半。該完整的 130kDa的原毒素分子在昆蟲消化道中被蛋白酶迅速地加工為抗性核心片段。通過這一加工消除掉的片段在本文中稱為“原毒素片段”。相信該原毒素片段參與了毒素的晶體形成(Arvidson等，1989)。 該原毒素片段因此可能通過減少毒素分子的蛋白酶加工(Haider等，1986)或通過降低毒素可溶性(Aronson等，1991)，以限制核心對(duì)昆蟲的可接近性，從而表達(dá)出部分對(duì)該毒素的昆蟲特異性。即使在某類型之中，B. t.毒素在長(zhǎng)度上，以及在從核心毒素片段至原毒素片段的轉(zhuǎn)換的精確位置上也有某些程度的差異。從核心毒素片段至原毒素片段的轉(zhuǎn)換通常會(huì)出現(xiàn)在全長(zhǎng)毒素的約50%至約60%之間。SEQ ID NO 2公開了全長(zhǎng)DIG-3多肽的1256個(gè)氨基酸的序列，其中N-端643個(gè)氨基酸包含DIG-3核心毒素片段。SEQ ID N0:1的5，-端 1929個(gè)核苷酸包含該核心毒素片段的編碼區(qū)。已確定了 CrylAal、Cry2AaU Cry3AaU Cry3BbU Cry4Aa, Cry4Ba 和 Cry8Eal 的三維晶體結(jié)構(gòu)。這些核心毒素的結(jié)構(gòu)是非常相似的，并且包含具有下述特征的三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(de Maagd等，2003中綜述)。結(jié)構(gòu)域I是7個(gè)α螺旋的叢，其中α -螺旋5由6個(gè)兩親螺旋環(huán)繞。這一結(jié)構(gòu)域涉及孔形成，并且與包括溶血素和大腸桿菌素在內(nèi)的其他孔形成蛋白共享同源性。DIG-3蛋白的結(jié)構(gòu)域I包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基56至278。結(jié)構(gòu)域II由一起包裝為β棱柱的三個(gè)反向平行的β片層形成。這一結(jié)構(gòu)域的環(huán)在結(jié)合昆蟲中腸受體當(dāng)中起著重要作用。在CrylA蛋白中，位于結(jié)構(gòu)域II β片層頂點(diǎn)的暴露于表面的環(huán)(surface exposed loop)參與了與鱗翅目昆蟲鈣粘蛋白的結(jié)合。Cry3Aa結(jié)構(gòu)域Π的環(huán)以類似的方式與馬鈴薯葉甲蟲(L印tinotarsa decemlineata) (Say)(馬鈴薯甲蟲(Corolado potato beetle))的膜相關(guān)金屬蛋白酶結(jié)合(Ochoa-Campuzano 等，2007)。 結(jié)構(gòu)域II與包括卵黃和jacaline在內(nèi)的某些糖結(jié)合蛋白共享同源性。DIG-3蛋白的結(jié)構(gòu)域II包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基283至493。結(jié)構(gòu)域III是兩個(gè)反向平行β片層的β夾心(sandwich)。這一結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)，諸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶和唾液酸酶等。結(jié)構(gòu)域 III結(jié)合某些類型的受體蛋白，并且可能參與和第二類受體相互作用的寡聚毒素前-孔的插入，在CrylA蛋白的情況下，所述第二類受體的實(shí)例是氨肽酶和堿性磷酸酶(Pigott和 Ellar, 2007).已在鞘翅目(Coleopetera)中鑒定了類似的Cry結(jié)構(gòu)域III受體。保守的 B. t.序列區(qū)段2和3分別位于結(jié)構(gòu)域2的N端和C端附近。因此，這些保守的序列區(qū)段2 和3是所述三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域之間的近似邊界區(qū)域。這些具有保守的DNA和蛋白質(zhì)同源性的區(qū)域已被開發(fā)用于工程化重組B. t.毒素(US專利號(hào)6090931、W0 91/01087,WO 95/06730、 W01998022595)。DIG-3蛋白的結(jié)構(gòu)域III包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基503至641?，F(xiàn)已報(bào)道結(jié)構(gòu)域I的α -螺旋1在受體結(jié)合后即被移除。Aronson等(1999)證實(shí)了與BBMV結(jié)合的CrylAc受到保護(hù)不被蛋白酶K從殘基59開始(正在α -螺旋1之后)切割；CryIAb引證了類似的結(jié)果。Gomez等Q002)發(fā)現(xiàn)，在與BBMV受體結(jié)合后形成的CrylAb 寡聚物缺乏結(jié)構(gòu)域I的α -螺旋1。而且，Soberon等Q007)顯示，CrylAb和CrylAc的缺乏包含三維Cry結(jié)構(gòu)上的α -螺旋1的約60個(gè)氨基酸的N-端缺失突變體能夠在缺乏鈣粘蛋白結(jié)合的情況下組裝分子量約60kDa的單體至前孔中。已報(bào)道這些N-端缺失突變體對(duì) Cry-抗性昆蟲幼蟲有活性。此外，Diaz-Mendoza等Q007)描述了保持了對(duì)地中海玉米螟 (西非蛀莖夜蛾(Sesamia nonagrioides))的活性的CrylAb的43kDa和46kDa片段。已證實(shí)這些片段包括氨基酸殘基116至423 ；然而，未說明精確的氨基酸序列，并且這些蛋白水解片段的活性機(jī)制也是未知的。Gomez等Q002)、Soberon等Q007)和Diaz-Mendoza等 (2007)的結(jié)果與Hofte等(1986)的不同，Hofte等報(bào)道了從CrylAb的N端缺失36個(gè)氨基酸導(dǎo)致殺蟲活性的喪失。我們通過比較DIG-3蛋白序列和結(jié)構(gòu)已知的CrySEal的蛋白質(zhì)序列，推導(dǎo)了 DIG-3 毒素的結(jié)構(gòu)域I中α -螺旋1、α -螺旋2Α、α -螺旋2Β和α -螺旋3的起點(diǎn)和終點(diǎn)，以及它們之間間隔子區(qū)域的位置。這些位置描述于表1中。表 1投影的DIG-3蛋白α -螺旋的氨基酸坐標(biāo)
權(quán)利要求
1.包含選自下組的核心毒素片段的分離的多肽(a)包含SEQID NO 2的殘基113至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID NO 2的殘基113至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基113至643的氨基酸序列的多肽；或其殺蟲活性片段。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其包含選自下組的核心毒素片段(a)包含SEQID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基73至643的氨基酸序列的多肽；或其殺蟲活性片段。
3.權(quán)利要求1的分離的多肽，其包含選自下組的核心毒素片段(a)包含SEQID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含具有至多20個(gè)不會(huì)不利地影響由SEQID NO :2編碼的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO 2的殘基1至643的氨基酸序列的多肽；或其殺蟲活性片段。
4.包含權(quán)利要求1的多肽的植物。
5.控制害蟲群體的方法，包括使所述群體與殺蟲有效量的權(quán)利要求1的多肽接觸。
6.
7.編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的核酸。
8.SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的權(quán)利要求7的分離的核酸。
9.SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 5的權(quán)利要求1的多肽。
10.DNA構(gòu)建體，其包含與非衍生自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的、并能夠在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接的權(quán)利要求1的核苷酸序列。
11.轉(zhuǎn)基因植物，其包含穩(wěn)定地?fù)饺肫浠蚪M的權(quán)利要求10的DNA構(gòu)建體。
12.保護(hù)植物免遭害蟲的方法，包括將權(quán)利要求10的構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物。
13.權(quán)利要求1的多肽，其具有抗歐洲玉米螟(Europeancorn borer)的活性。
全文摘要
DIG-3Cry毒素、編碼該毒素的多核苷酸、以及產(chǎn)生該毒素的轉(zhuǎn)基因植物，可用于控制植物害蟲。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102459315SQ201080027268
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者D.史密斯, H.巴特勒, J.利拉, K.納瓦, T.米德 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司