專利名稱：使用非內(nèi)源pol I啟動子的反向遺傳的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反向遺傳領(lǐng)域。此外，其涉及制造用于保護(hù)抵御各種病毒的疫苗。
背景技術(shù)：
反向遺傳可在細(xì)胞培養(yǎng)中重組表達(dá)和操作RNA病毒。它是病毒學(xué)和疫苗制造的有效工具，因為能快速生產(chǎn)重組病毒(包括重排列)和/或其突變型。所述方法涉及用一種或多種編碼所述病毒基因組的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和從所述細(xì)胞中分離所述病毒。例如，參考文獻(xiàn)1和2描述了在犬細(xì)胞中用犬pol I啟動子表達(dá)流感基因組RNA的方法。其他來源報道了在人細(xì)胞中用人pol I啟動子表達(dá)流感基因組RNA。本方法現(xiàn)有技術(shù)的一個顯著缺點是pol I啟動子高度物種特異。例如，已報道人pol I啟動子僅在靈長目細(xì)胞中起作用[3]，而相似地，在犬細(xì)胞中表達(dá)需要犬pol I啟動子。因此，需要在所述內(nèi)源pol I啟動子未被識別的細(xì)胞系中生長病毒時，必須使用兩種不同的細(xì)胞型以拯救和培養(yǎng)所述病毒。然而，需要避免使用多重細(xì)胞系，因為這樣具有例如避免競爭培養(yǎng)物選擇壓力的優(yōu)勢。疫苗生產(chǎn)中所有步驟使用單一細(xì)胞系還有助于監(jiān)管的批準(zhǔn)。因此本領(lǐng)域一直需要提供實施反向遺傳的替代方法。優(yōu)選實施方式概述現(xiàn)在本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)可在宿主細(xì)胞中用pol I啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)，所述啟動子對與所述宿主細(xì)胞相同分類學(xué)目的生物中是非內(nèi)源的。在一種實施方式中，本發(fā)明提供含一種或多種表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體的RNA分子表達(dá)受所述宿主細(xì)胞目的非內(nèi)源pol I啟動子控制。這些宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供宿主細(xì)胞中RNA表達(dá)的方法，包括步驟(i)制備由第一生物的polI啟動子驅(qū)動表達(dá)感興趣轉(zhuǎn)基因的表達(dá)構(gòu)建體和(ii)將步驟(i)的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞與所述第一生物的分類學(xué)目不同。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供生產(chǎn)重組病毒的方法，其中用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述病毒。本發(fā)明還提供制備病毒(如，用于配制成疫苗)的方法，包括步驟(i)用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組病毒，(ii)用步驟(i)獲得的所述病毒感染培養(yǎng)宿主，(iii)培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)宿主以生產(chǎn)病毒；和(iv)純化步驟(iii)獲得的所述病毒。為提供制備疫苗的方法，本方法隨后可進(jìn)一步包括步驟(ν)將所述病毒配制成疫苗。 除了如上所述導(dǎo)入的非內(nèi)源pol I啟動子，所述宿主細(xì)胞將包括內(nèi)源poll啟動子。所述非內(nèi)源pol I啟動子在細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動非內(nèi)源RNA的表達(dá)，尤其是所述病毒RNA。因此本發(fā)明提供具有至少一種控制內(nèi)源rRNA表達(dá)的內(nèi)源pol I啟動子和至少一種控制病毒RNA或其互補(bǔ)物表達(dá)的非內(nèi)源pol I啟動子的細(xì)胞。本發(fā)明還提供編碼蛋白編碼mRNA和病毒RNA的DNA表達(dá)構(gòu)建體，其中(i)所述DNA中用于蛋白編碼mRNA的密碼子針對犬細(xì)胞優(yōu)化且(ii)所述病毒RNA受到靈長目polI啟動子的控制。所述犬細(xì)胞理想地為MDCK細(xì)胞且所述靈長目啟動子理想地為人pol I啟動子。所述蛋白編碼mRNA的表達(dá)可在針對犬細(xì)胞優(yōu)化的pol I啟動子的控制下。表達(dá)構(gòu)建體本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)可在細(xì)胞中用來自與所述細(xì)胞不同分類學(xué)目的生物的pol I啟動子驅(qū)動RNA表達(dá)。因此所述pol I啟動子對于來自衍生所述細(xì)胞的同一分類學(xué)目的生物中是非內(nèi)源的。術(shù)語“目，，指常規(guī)分類學(xué)分級，目的示例為靈長目、嚙齒目、食肉目、有袋目、
鯨目等。人和大猩猩在同一分類學(xué)目中(靈長目)，但人和狗在不同的目中(靈長目與食肉目)。因此在第一方面，本發(fā)明提供含一種或多種表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體的RNA分子表達(dá)由所述宿主細(xì)胞目的非內(nèi)源pol I啟動子驅(qū)動。在一種實施方式中，所述宿主細(xì)胞是非靈長目細(xì)胞且所述pol I啟動子為靈長目pol I啟動子。在具體的實施方式中，所述宿主細(xì)胞是非靈長目細(xì)胞且所述啟動子為人啟動子。在進(jìn)一步的實施方式中，所述宿主細(xì)胞是非人細(xì)胞且所述pol I啟動子為人pol I啟動子。在另一個實施方式中，所述pol I啟動子為非犬pol I啟動子且所述宿主細(xì)胞是犬細(xì)胞。在優(yōu)選實施方式中，所述宿主細(xì)胞是犬細(xì)胞且所述啟動子為靈長目pol I啟動子。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，所述pol I啟動子為人啟動子且所述宿主細(xì)胞是犬細(xì)胞(如MDCK細(xì)胞)。優(yōu)選這個實施方式是因為人pol I啟動子已充分鑒定且犬細(xì)胞常用于生產(chǎn)疫
田ο用在所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體可為單向或雙向表達(dá)構(gòu)建體。宿主細(xì)胞表達(dá)多于一種轉(zhuǎn)基因時(不論在相同或不同表達(dá)構(gòu)建體上)可能使用單向和/或雙向表達(dá)。雙向表達(dá)構(gòu)建體含從同一構(gòu)建體中的不同方向(即5'到3'和3'到5')驅(qū)動表達(dá)的至少兩種啟動子。所述啟動子至少其一為如本文所述的非內(nèi)源poll啟動子。所述兩種啟動子可操作性連接同一雙鏈DNA的不同鏈。優(yōu)選所述啟動子之一非內(nèi)源pol I啟動子且至少一種其他啟動子為pol II啟動子。這是有利的，因為所述pol I啟動子可用于表達(dá)非加帽的cRNA而所述pol II啟動子可用于轉(zhuǎn)錄隨后翻譯為蛋白質(zhì)的mRNA，因此同一構(gòu)建體能同時表達(dá)RNA和蛋白質(zhì)。所述pol II啟動子可為內(nèi)源或非內(nèi)源。表達(dá)系統(tǒng)中使用多于一種表達(dá)構(gòu)建體時，若至少一種所述啟動子為可在所述宿主細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的非內(nèi)源pol I啟動子，所述啟動子可為內(nèi)源和非內(nèi)源啟動子的混合物。所述表達(dá)構(gòu)建體通常包括RNA轉(zhuǎn)錄終止序列。所述終止序列可為內(nèi)源終止序列或?qū)λ鏊拗骷?xì)胞非內(nèi)源的終止序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚合適的終止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列、和核酶。此外，所述表達(dá)構(gòu)建體可包括針對mRNA的一種或多種聚腺苷酸化信號，尤其在表達(dá)受pol II啟動子控制的基因的末端。表達(dá)系統(tǒng)可包括至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種或至少12種表達(dá)構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體可為載體，如質(zhì)?；蚱渌坞x構(gòu)建體。此類載體通常包括至少一種細(xì)菌和/或真核的復(fù)制起點。此外，所述載體可包括可在原核和/或真核細(xì)胞中篩選的選擇性標(biāo)記。此類選擇性標(biāo)記的示例為對抗生素產(chǎn)生抗性的基因，如氨芐青霉素或卡那霉素。所述載體還可包括一個或多個多克隆位點以方便DNA序列克隆。或者，表達(dá)構(gòu)建體可為線性表達(dá)構(gòu)建體。該線性表達(dá)構(gòu)建體通常不含任何氨芐青霉素和/或選擇序列。但是，包含該氨芐青霉素和/或選自序列的線性構(gòu)建體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。使用該線性表達(dá)構(gòu)建體以表達(dá)流感病毒的方法示在參考文獻(xiàn)4中描述。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。例如，參考文獻(xiàn)5中描述了此類方法。所述表達(dá)構(gòu)建體為線性表達(dá)構(gòu)建體時，可在導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞前利用單個限制性酶位點使之線性化?；蛘?，可用至少兩種限制性酶位點從載體中切下所述表達(dá)構(gòu)建體。此外，也可通過用核酸擴(kuò)增技術(shù)(如用PCR)擴(kuò)增獲得線性表達(dá)構(gòu)建體?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，可通過使用電穿孔、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體、微注射、微粒轟擊將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。表達(dá)宿主為犬細(xì)胞如MDCK細(xì)胞系時，蛋白編碼區(qū)可針對犬表達(dá)優(yōu)化，如使用來自野生型犬基因或來自犬病毒的啟動子，和/或比起人細(xì)胞更適于犬細(xì)胞的密碼子用法。例如，人基因較偏好將UUC用作Phe的密碼子( % )，在犬細(xì)胞中該偏好更強(qiáng)(59% )相似地，Ile密碼子在人細(xì)胞中沒有多數(shù)偏好，而53%的犬密碼子將AUC用于lie。犬病毒，如犬細(xì)小病毒(ssDNA病毒)也可為密碼子優(yōu)化提供指導(dǎo)，如犬細(xì)小病毒序列中95%的Phe密碼子為UUU (對比犬基因組中的41 % )，68 %的11 e密碼子為AUU (對比32 % )，46 %的Val密碼子為GUU (對比14 % )，72 %的Pro密碼子為CCA (對比25 % )，87 %的Tyr密碼子為UAU (對比40 % )，87 %的His密碼子為CAU (對比39 % )，92 %的Gln密碼子為CAA (對比25% )，81%的Glu密碼子為GAA(對比40% )，94%的Cys密碼子為UGU(對比42% )，僅
的Ser密碼子為U⑶(對比)，CCC從不用于Phe且UAG從不用作終止密碼子。因此蛋白編碼基因可做得更像已為在犬細(xì)胞中表達(dá)而自然優(yōu)化的基因，從而方便表達(dá)。反向遺傳上述表達(dá)構(gòu)建體和宿主細(xì)胞尤其適于通過反向遺傳技術(shù)生產(chǎn)重組病毒株。所述技術(shù)可用于生產(chǎn)各種RNA病毒，包括正鏈RNA病毒W(wǎng)，7]，負(fù)鏈RNA病毒[8，9]和雙鏈RNA病毒[10]。因此，本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)重組病毒的方法，其中所述病毒是用上述表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的。已知反向遺傳系統(tǒng)包括用pol I啟動子、細(xì)菌RNA聚合酶啟動子、噬菌體聚合酶啟動子等表達(dá)編碼所需病毒RNA (vRNA)分子的DNA分子。此外，病毒需要特定蛋白以形成感染病毒時，系統(tǒng)還提供這些蛋白，例如所述系統(tǒng)還包括編碼病毒蛋白的DNA分子從而兩種DNA的表達(dá)導(dǎo)致完整感染病毒的組裝。反向遺傳用于vRNA表達(dá)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚所述序列元素參照彼此的精確間隔對于所述聚合酶啟動復(fù)制至關(guān)重要。因此編碼所述病毒RNA的DNA分子正確位于所述pol I啟動子和所述終止序列之間很重要，但該定位在反向遺傳系統(tǒng)操作人員的能力范圍內(nèi)。通常，反向遺傳適合于表達(dá)需要在生命周期中生產(chǎn)基因組RNA的任何病毒。此類病毒包括但不限于正鏈和負(fù)鏈RNA病毒，如下文所述病毒。所述病毒優(yōu)選正粘病毒如流感病毒。本發(fā)明的方法還適合非節(jié)段以及分節(jié)段病毒。所述病毒為正鏈RNA病毒時，用含所述病毒基因的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞通常已足夠。例如，轉(zhuǎn)染含脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的質(zhì)粒引起傳染性脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)蘇W，7]。負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳更具挑戰(zhàn)性，因為所述反義病毒RNA通常無感染性且需要RNA聚合酶來完成生命周期。因此，必須以蛋白或用于原位蛋白表達(dá)的基因形式提供所述病毒聚合酶。所述病毒的傳染性需要蛋白質(zhì)時，通常優(yōu)選使用雙向表達(dá)構(gòu)建體，因為這能減少所述宿主細(xì)胞需要的表達(dá)構(gòu)建體總數(shù)。因此，本發(fā)明方法可利用至少一種雙向表達(dá)構(gòu)建體，其中基因或cDNA位于上游pol II啟動子和下游非內(nèi)源pol I啟動子之間。從所述polII啟動子轉(zhuǎn)錄所述基因或cDNA產(chǎn)生可翻譯為蛋白質(zhì)的加帽正義病毒mRNA，而從所述非內(nèi)源pol I啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)義vRNA。所述雙向表達(dá)構(gòu)建體可為雙向表達(dá)載體。為了生產(chǎn)重組病毒，細(xì)胞必須表達(dá)組裝病毒粒子所需病毒基因組的所有片段，克隆到本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)的DNA優(yōu)選提供所述病毒所有RNA和蛋白，但也可使用輔助病毒以提供一些所述病毒和蛋白，盡管優(yōu)選不使用輔助病毒的系統(tǒng)。所述病毒為非節(jié)段病毒時，通常可通過利用本發(fā)明方法中的單一表達(dá)構(gòu)建體實現(xiàn)該系統(tǒng)，但使用多于一種表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)非節(jié)段病毒的病毒基因組也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述病毒為分節(jié)段病毒時，通常用本發(fā)明方法的多于一種表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)所述病毒基因組。然而，還考慮在單一表達(dá)構(gòu)建體上組合所述病毒基因組的一種或多種片段或甚至所有片段。本發(fā)明方法尤其適于生產(chǎn)重配病毒株。所述技術(shù)可用質(zhì)粒的體外操控以產(chǎn)生病毒片段的組合、以便于操控病毒片段中的編碼序列或非編碼序列、以引入突變等。優(yōu)選使用所述表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重配病毒株，因為這樣可顯著減少獲得重配種病毒所需的時間，這在需要快速生產(chǎn)疫苗以抵抗流行病的情況中尤其有用。因此本發(fā)明本方面的方法優(yōu)選使用表達(dá)來自或源自至少兩種不同野生型毒株的病毒基因的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體。一些實施方式中也可包括導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)輔助蛋白的表達(dá)構(gòu)建體。例如，反向遺傳系統(tǒng)部分表達(dá)非病毒絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有優(yōu)勢。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體用于表達(dá)A型流感病毒片段時，可通過將A型流感病毒片段導(dǎo)入含負(fù)選擇標(biāo)記(例如ccdB)和高度保守的A型流感病毒基因末端的表達(dá)構(gòu)建體中產(chǎn)生所述表達(dá)構(gòu)建體[11]。其優(yōu)勢在于無需限制性位點且可克隆任何A型流感病毒片段，只要其末端與所述表達(dá)構(gòu)建體上的基因末端互補(bǔ)。細(xì)胞本發(fā)明可用能生產(chǎn)感興趣病毒的任何原核或真核細(xì)胞實施。本發(fā)明通常使用細(xì)胞系，但例如原代細(xì)胞可用作替代細(xì)胞。所述細(xì)胞通常為哺乳動物細(xì)胞。合適的哺乳動物細(xì)胞包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)，以及犬細(xì)胞。可使用各種細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適倉鼠細(xì)胞的例子是名為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞例如，非洲綠猴細(xì)胞，如Vero細(xì)胞系中的腎細(xì)胞[12-14]。合適的犬細(xì)胞為例如腎細(xì)胞，如CLDK和MDCK細(xì)胞系。其他合適的細(xì)胞包括但不限于CH0；293T ；BHK ；MRC 5 ；PER. C6 [15] ；FRhL2 ；WI-38;等。合適的細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) [16]、Coriell細(xì)胞庫[17]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各種不同Vero
6細(xì)胞，目錄號為CCL81、CCL81. 2、CRL1586和CRL-1587，并提供目錄號為CCLiM的MDCK細(xì)胞。PER. C6可獲自ECACC，保藏號為9602^40。本發(fā)明使用的細(xì)胞優(yōu)選源自馬達(dá)二氏(Madin Darby)犬腎的MDCK細(xì)胞[18-20]。原始MDCK細(xì)胞可以CCL 34獲自ATCC。優(yōu)選使用這些細(xì)胞的衍生細(xì)胞或其他MDCK細(xì)胞。此類衍生細(xì)胞如參考文獻(xiàn)18所述，其公開了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞(‘MDCK 33016'或‘33016-PF，，保藏號DSMACC 2219，也可參見參考文獻(xiàn)18)。此外，參考文獻(xiàn)21公開了在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞(’B-702'，保藏號FERM BP-7449)。在一些實施方式中，所用MDCK細(xì)胞系可為致瘤性的。也考慮使用非致瘤性MDCK細(xì)胞。例如，參考文獻(xiàn)22 公開了非致瘤性 MDCK 細(xì)胞，包括'MDCK-S' (ATCC PTA-6500)、’ MDCK-SF101' (ATCCPTA-6501)、' MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103' (PTA-6503)。參考文獻(xiàn)23公開了具有高度易感性的MDCK細(xì)胞，包括‘MDCK. 5F1，細(xì)胞(ATCC CRL 12042)?？墒褂枚嘤谝环N細(xì)胞類型的混合物以實施本發(fā)明的方法。但本發(fā)明的方法優(yōu)選用單一細(xì)胞類型如用單克隆細(xì)胞實施。本發(fā)明方法所用細(xì)胞優(yōu)選來自單一細(xì)胞系。此外，同一細(xì)胞系可用于拯救所述病毒和所述病毒的任何后續(xù)繁殖。所述細(xì)胞優(yōu)選在無血清中培養(yǎng)以避免常見污染源。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的各種無血清培養(yǎng)基(如伊可夫氏(Iscove' s)培養(yǎng)基、超CHO培養(yǎng)基(BW公司(BioWhittaker) )、EX-CELL (JRH 生物科學(xué)公司(JRH Biosciences)))。此外，可用無蛋白培養(yǎng)基(如PF-CHO(JRH生物科學(xué)公司))。另外，用于復(fù)制的細(xì)胞也可在常規(guī)含血清培養(yǎng)基中(如含0. 5% -10%胎牛血清的MEM或DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)。所述細(xì)胞可貼壁培養(yǎng)或懸浮。篩選合適細(xì)胞系依本發(fā)明使用的合適細(xì)胞廣泛可得。此外，可用本領(lǐng)域周知的技術(shù)篩選其他細(xì)胞。例如，鑒定新pol I啟動子和需要尋找支持所述新啟動子表達(dá)的細(xì)胞系時可能需要篩選合適的細(xì)胞。同樣，分離出新細(xì)胞時，可能需要確定哪種pol I啟動子可以在其內(nèi)驅(qū)動表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚篩選細(xì)胞的合適技術(shù)。例如，可將報告基因克隆在感興趣的pol I啟動子控制下且所述構(gòu)建體可轉(zhuǎn)染入待篩選的細(xì)胞系中。在此類實驗中，轉(zhuǎn)染有含所述報告基因但缺少啟動子序列的構(gòu)建體的細(xì)胞可用作對照。因此，測試樣品(如，所含轉(zhuǎn)基因受感興趣pol I啟動子控制的細(xì)胞)中所述基因的表達(dá)顯著高于對照(如，含與所述測試樣品相同轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，但所述轉(zhuǎn)基因不含驅(qū)動其表達(dá)的啟動子)時，所述細(xì)胞系適于使用本發(fā)明所述啟動子。例如，可通過反向轉(zhuǎn)錄所述轉(zhuǎn)基因RNA和對所得的cDNA進(jìn)行實時PCR來測量所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)?；蛘撸部稍谒鰌oll啟動子控制下以反義方向克隆報告基因(如GFP、YFP、Iuc等)。該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄物之后可通過病毒聚合酶轉(zhuǎn)錄為mRNA并隨后翻譯為蛋白。因此，表達(dá)所述報告基因的任何細(xì)胞可由存在報告基因產(chǎn)物而容易地鑒定。還可調(diào)整外源pol I通常不驅(qū)動表達(dá)的細(xì)胞以獲得所述pol I啟動子可驅(qū)動表達(dá)的細(xì)胞。例如，這可通過將細(xì)胞置于其通常不適合的生長條件下實現(xiàn)。例如，通常僅貼壁生長的細(xì)胞系可人工置于懸浮中且可進(jìn)一步繁殖在這些條件下持續(xù)生長的細(xì)胞。或者，可貼壁培養(yǎng)通常懸浮生長的細(xì)胞，如通過使用高結(jié)合塑料培養(yǎng)管或通過向所述培養(yǎng)物中添加血清。相似地，可在無血清條件下培養(yǎng)通常需要血清用于其生長的細(xì)胞，或相反地，將適于無血清生長的細(xì)胞暴露于血清中。然后可如前所述檢測所選細(xì)胞分析所述pol I啟動子活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可以此方式改變的其他合適生長參數(shù)，包括但不限于溫度、pH、p02、血清濃度等。此外，所述細(xì)胞可經(jīng)過物理或化學(xué)處理，如UV輻射或化學(xué)突變。同樣，可篩選細(xì)胞的新特性，所述細(xì)胞僅在正常培養(yǎng)條件下傳代。例如，參考文獻(xiàn)18描述將MDCK細(xì)胞(通常貼壁)調(diào)整為在無血清條件下懸浮培養(yǎng)的方法。起始細(xì)胞在通常用于培養(yǎng)懸浮生長細(xì)胞的條件下，在滾瓶中培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中。在這些選擇的條件下傳數(shù)代后，獲得可在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的數(shù)種細(xì)胞系。一個示例為33016細(xì)胞系(保藏號DSM ACC 2219)。本發(fā)明人已證明人pol I啟動子可在這些MDCK細(xì)胞中驅(qū)動報告基因表達(dá)。RNA聚合酶I啟動子大多數(shù)反向遺傳方法使用含RNA聚合酶I (RNA pol I)啟動子驅(qū)動病毒基因組RNA轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體。所述pol I啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物具有許多病毒如流感病毒完全感染性所必須的未修飾5'和3'末端。天然pol I啟動子為二分式，具有兩個分離的區(qū)域核心啟動子和上游啟動子元件(UPE)。盡管大多數(shù)物種的pol I啟動子都常見該常規(guī)結(jié)構(gòu)，但是啟動子的實際序列有很大不同。所述核心啟動子圍繞轉(zhuǎn)錄起始點，從約-45延伸至+20，且足以起始轉(zhuǎn)錄。所述核心啟動子通常富含GC。盡管所述核心啟動子單獨足以起始轉(zhuǎn)錄，但UPE能大幅提高所述啟動子的效率。所述UPE通常從約-180延伸至-107且也富含GC。所述啟動子的活性可由遠(yuǎn)端存在的增強(qiáng)子樣序列進(jìn)一步增強(qiáng)，所述增強(qiáng)子樣序列可通過穩(wěn)定預(yù)啟動復(fù)合物來行使功能。已在各物種包括人、狗和雞中鑒定所述pol I啟動子的序列。本發(fā)明所用的pol I啟動子對所述宿主細(xì)胞同一分類學(xué)目的生物是非內(nèi)源的。因此術(shù)語“內(nèi)源”和“非內(nèi)源”用于指所述宿主細(xì)胞和存在于表達(dá)構(gòu)建體中的poll啟動子。pol I啟動子的物種間序列變化意味著容易確定細(xì)胞內(nèi)任何特定pol I啟動子是內(nèi)源還是非內(nèi)源。因此本發(fā)明可將人、狗或雞pol I啟動子用于宿主細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)，所述細(xì)胞不是源于所述pol I啟動子的同一分類學(xué)目(如靈長類pol I啟動子用于犬宿主細(xì)胞中)?？捎糜嬎銠C(jī)或?qū)嶒灥男蛄斜葘Υ_定任何特定的pol I啟動子源于哪種生物，如

圖10顯示犬和人pol啟動子直到轉(zhuǎn)錄起始位點的比對，其序列同一性< 60 %。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體包括至少一種核心啟動子；優(yōu)選還包括至少一種UPE，且還可包括一種或多種增強(qiáng)子元件。也可用天然啟動子的片段，只要這些片段可以起始轉(zhuǎn)錄。例如，圖3顯示全長犬pol I啟動子的序列(SEQID NO 3)和足夠驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)的各種片段(也可參見圖4和SEQ ID N0:4和5)。此外，圖2顯示人pol I啟動子序列(SEQ ID N0:1)和其能單獨在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的片段(也參見圖5和SEQ ID NO 2)?？梢辣景l(fā)明使用的人pol I啟動子可包括SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示序列或其變體。依本發(fā)明使用犬啟動子時，其可包括SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ IDNO 5所示序列或其變體。所述pol I啟動子可包括⑴具有與SEQ ID NO :1_5中任一項的序列同一性至少為的序列，和/或(ii)SEQ ID NO :1-5中任一項的片段，只要在感興趣的宿主細(xì)胞內(nèi)所述啟動子能起始并驅(qū)動轉(zhuǎn)錄操作性連接的RNA編碼序列。ρ值可為75、80、85、90、95、96、97、98、99或更多。所述片段自身可具有足夠的長度以驅(qū)動表達(dá)(如SEQ ID NO :4是SEQID N0:3的片段)或所述片段可連接其他序列且這種組合會驅(qū)動表達(dá)。此類pol I啟動子在感興趣的宿主細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動表達(dá)的能力可容易地評估，如用上述試驗使用所述啟動子控制下的反義報告基因。病毒制備另一方面，本發(fā)明提供疫苗制造所用病毒的制備方法，包括步驟(i)如本文所述生產(chǎn)重組病毒(ii)用步驟(i)獲得的所述病毒感染培養(yǎng)宿主，(iii)培養(yǎng)步驟(ii)的宿主以生產(chǎn)病毒；和(iv)純化步驟(iii)獲得的所述病毒和(任選地)(ν)將所述病毒配制入疫苗。本發(fā)明此方面中用細(xì)胞作培養(yǎng)宿主時，已知細(xì)胞培養(yǎng)條件(如溫度、細(xì)胞密度、PH值等)根據(jù)所用細(xì)胞系和病毒在較寬的范圍內(nèi)變化且可根據(jù)應(yīng)用需求調(diào)整。因此下述信息僅代表指南。如上所述，細(xì)胞優(yōu)選培養(yǎng)在無血清或無蛋白的培養(yǎng)基中。所述細(xì)胞的繁殖可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。例如，所述細(xì)胞可在使用常規(guī)支持方法如離心或過濾的灌注系統(tǒng)中培養(yǎng)。而且，所述細(xì)胞可按照本發(fā)明于感染前在分批進(jìn)料系統(tǒng)中繁殖。在本發(fā)明的內(nèi)容中，培養(yǎng)系統(tǒng)指分批進(jìn)料系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞初始培養(yǎng)于分批系統(tǒng)中且通過控制濃縮營養(yǎng)的補(bǔ)料來補(bǔ)償培養(yǎng)基中營養(yǎng)的消耗(或部分消耗)。在感染前的細(xì)胞繁殖期間將培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)在pH 6.6-pH 7. 8之間，特別是pH7. 2-pH 7. 3之間是有利的。細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選在30-40°C的溫度進(jìn)行。在步驟(iii)中，所述細(xì)胞優(yōu)選在30°C -36°C或32°C _34°C或33°C培養(yǎng)。這在使用本方法生產(chǎn)流感病毒時特別優(yōu)選，因為已顯示在此溫度范圍內(nèi)孵育感染細(xì)胞能生產(chǎn)配入疫苗時功效改善的病毒[24]。感染前培養(yǎng)期的氧分壓優(yōu)選調(diào)節(jié)為25% -95%且特別為35% _60%。本發(fā)明內(nèi)容中的氧分壓值基于空氣飽和度。在分批系統(tǒng)中細(xì)胞濃度優(yōu)選約8-25xl05細(xì)胞/mL時或在灌注系統(tǒng)中優(yōu)選約5-20xl06細(xì)胞/mL時進(jìn)行細(xì)胞感染。所述細(xì)胞可用10_8_10，優(yōu)選0. 0001-0. 5的病毒劑量(Μ0Ι值，“感染復(fù)數(shù)”，相當(dāng)于感染時每細(xì)胞的病毒單位數(shù)量)感染?？梢栽谫N壁或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)病毒?？刹捎梦⑤d體培養(yǎng)。在一些實施方式中，細(xì)胞可能適合懸浮培養(yǎng)。本發(fā)明所述方法還包括收獲和分離病毒或其產(chǎn)生的蛋白。分離病毒或蛋白期間，通過標(biāo)準(zhǔn)方法如分離、過濾或超過濾從所述培養(yǎng)基中分離所述細(xì)胞。之后按照本領(lǐng)域技術(shù)人員充分已知的方法如梯度離心、過濾、沉淀、層析等濃縮所述病毒或所述蛋白，然后純化。按照本發(fā)明優(yōu)選在純化期間和之后滅活所述病毒?？稍谒黾兓^程中任何點用例如β-丙內(nèi)酯或甲醛進(jìn)行病毒滅活。步驟(i)中分離的病毒也可在步驟(ii)中在蛋上培養(yǎng)。目前培養(yǎng)疫苗用流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法采用含胚的SPF雞蛋，由雞蛋內(nèi)容物(尿囊液)純化病毒。也可用蛋傳代病毒并隨后在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖。病毒本發(fā)明方法可用能在細(xì)胞中通過反向遺傳表達(dá)的任何病毒實施。所述病毒可是分節(jié)段或非分段的病毒。此外，所述病毒可為正鏈RNA病毒或負(fù)鏈病毒。在進(jìn)一步實施方式中，所述病毒也可為雙鏈RNA病毒。
所述病毒為負(fù)鏈RNA病毒時，所述病毒可來自選自下組的科副粘病毒科(Paramyxoviridae)、月市炎病毒亞禾斗(Pneumovirinae)、彈狀病毒禾斗(Rhabdoviridae)、纖絲病毒禾斗(Filoviridae)、博爾納病毒禾斗(Bornaviridae)、正粘病毒禾斗(Orthomyxoviridae)、本揚病毒科(Bunyaviridae)、或沙粒病毒科(Arenaviridae)。此外，所述病毒可來自選自下組的屬副粘病毒屬(Paramyxovirus)、正粘病毒屬(Orthomyxovirus)、呼吸道病毒屬(Respirovirus)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)、亨尼病_M (Henipaviras)^f # M (Avulavirus)、月市(Pneumovirus)、 月市；) 毒屬(Metapneumovirus)、7jC泡病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus) >短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)、核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus)、粒夕卜彈狀病毒屬(Novirhabdovirus)、馬堡病毒屬(Marburgvirus)、±矣博拉病毒屬(Ebolavirus)、博爾納病毒屬(Bornavirus)、A型流感病毒(InfluenzavirusA)、B型流感病毒(Influenzavirus B)、C型流感病毒(Influenzavirus C)、托高土病毒屬(Thogotovirus)、娃傳貧病毒屬(Isavirus)、正本雅病毒屬(Orthobunyavirus)、、漢坦病毒屬(Hantavirus)、內(nèi)羅病毒屬(Nairovirus)、白蛉病毒屬(Phlebovirus)、番茄斑萎病毒屬CTospovirus)、沙粒病毒屬(Arenavirus)、蛇形病毒屬(Ophiovirus)、纖細(xì)病毒屬CTenuivirus)、或δ病毒屬(Deltavirus)。在具體實施方式
中，所述負(fù)鏈RNA病毒選自下組仙臺病毒(Sendai virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus)、禽月市病毒(Avian pneumovirus)、7jC泡性口炎印第安 β 病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、牛暫時熱病毒(Bovine ephemeral fever virus)、萵苣壞死黃化病毒(Lettuce necroticyellows virus)、馬鈴薯黃矮病毒(Potato yellow dwarf virus)、傳染性造血組織壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus)、維多禾Ij亞湖馬爾堡病毒(LakeVictoria marburgvirus)、扎伊爾埃波拉病毒(Zaire ebolavirus)、博納病病毒(Bornadisease virus)、、流感病毒(Influenza virus)、托高土病毒(Thogoto virus)、娃傳染個生貧血病毒(Infectious salmon anemia virus)、布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)、漢坦病毒(Hantaan virus)、達(dá)格畢病毒(Dugbe virus)、裂谷熱病毒(Rift Valley fevervirus)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)、柑桔麟皮病毒(Citrus psorosis virus)、7jC禾S條紋病毒(Rice stripe virus)、和丁型肝炎病毒Ofepatitis delta virus)。在優(yōu)選實施方式中，所述病毒為流感病毒(如下)。所述病毒為正鏈RNA病毒時，所述病毒可來自選自下組的科動脈炎病毒科(Arteriviridae)、冠狀病毒禾斗(Coronaviridae)、小核糖核酸病毒禾斗(Picornaviridae)和桿套病毒科(Roniviridae)。此外，所述病毒可為選自下組的屬的病毒動脈炎病毒屬(Arterivirius)、冠狀病毒屬(Coronavirus)、腸道病毒屬(Enterovirus)、環(huán)曲病毒屬(Torovirus)、頭甲病毒屬(Okavirus)、鼻病毒屬(Rhinovirus)、月干病毒屬(Hepatovirus)、
(Cardiovirus) >(Aphthovirus)(Parechovirus) >
g # _ _ M (Erbovirus)、！If _ _ M (Kobuvirus)禾口 ■ _ _ _ M (Teschovirus)。 $具體實施方式
中，所述病毒選自下組嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病毒(severe acuterespiratory syndrome (SARS) virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)、A 型人腸病毒(Human enterovirus A) (HEV-A)、B M入(Human enterovirus B) (HEV-B)、 C 型人
(Human enterovirus C)、D M入(Human enterovirus D)、A M月干(Hepatitis A)和 A 型與 B 型人鼻病毒(Human rhinovirus)。所述病毒為雙鏈RNA病毒時，所述病毒可來自選自下組的科雙核糖核酸病毒禾斗(Birnaviridae)、囊病毒禾斗(Cystoviridae)、減毒病毒禾斗(Hypoviridae)、分體病毒科(Partitiviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)和整體病毒科(Totiviridae)。此外，所述病毒可為選自下組的屬的病毒水生雙RNA病毒屬(Aquabirnavirus)、禽雙RNA ^f # M (Avibirnavirus)、 ^ ) RNA ^f # M (Entomobirnavirus)、■ # _ _ M(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)、α 潛隱病毒屬(Alphacryptovirus) > β 潛隱病毒屬(Betacryptovirus)、水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)、科羅拉多壁虱熱病毒屬(Coltivirus)、質(zhì)型多角體病毒屬(Cypovirus)、斐濟(jì)病毒屬(Fi jivirus)、蟲源呼腸孤病毒屬(Idnoreovirus)、蒼蠅呼腸病毒屬(Mycoreovirus)、環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)、正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、水稻病毒屬(Oryzavirus)、植物呼腸病毒屬(Phytoreovirus)(Rotavirus)禾口二 RNA(Seadorngivirus)。本發(fā)明特別適于經(jīng)歷快速突變的病毒和所述重組方法使所述病毒更快分離的情況，所述病毒然后可進(jìn)一步繁殖以獲得合適的疫苗。因此，在優(yōu)選的實施方式中所述病毒為流感病毒。流感病毒流感病毒特別適于在本發(fā)明方法中使用，尤其是A型流感病毒和B型流感病毒，因為該病毒的反向遺傳已被充分鑒定。流感病毒為分段負(fù)鏈RNA病毒。A型和B型流感病毒具有8個片段，而C型流感病毒有7個。所述病毒需要至少4種病毒蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)來起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。A型和B型流感病毒的反向遺傳可用12種質(zhì)粒實施以表達(dá)所需的4種蛋白和所有八種基因組片段。然而為減少所需的構(gòu)建體數(shù)量，將多個RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)包含入單一質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感vRNA片段的序列)上，并且將多個蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動子包含入另一個質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)上[25]。也可將一種或多種流感vRNA片段納入pol I啟動子的控制下并將一種或多種流感蛋白編碼區(qū)納入同一質(zhì)粒的另一啟動子控制下，特別是pol II啟動子。如上所述，這優(yōu)選通過使用雙向質(zhì)粒完成。參考文獻(xiàn)25方法的優(yōu)選方面包括(a)在單一質(zhì)粒上的PBl、PB2和PA mRNA編碼區(qū)域；和(b)在單一質(zhì)粒上的所有8種vRNA編碼片段。特別優(yōu)選在一種質(zhì)粒上包括神經(jīng)氨酸酶(NA)和細(xì)胞凝集素(HA)片段并在另一質(zhì)粒上包括六種其他片段，因為新出現(xiàn)的流感病毒株系通常在所述NA和/或HA片段具有突變。因此，在此實施方式中，只需替換包含所述HA和NA序列的載體。優(yōu)選A型流感病毒的表達(dá)系統(tǒng)編碼衍生自多種不同野生型株系的基因組片段。所述系統(tǒng)可編碼PR/8/34株系(A/Puerto Rico/8/34)的1或多個(如1、2、3、4、5或6個)基因組片段，但通常這/這些片段不包括所述PR/8/34HA片段且通常不包括PR/8/34NA片段。因此所述系統(tǒng)可編碼PR/8/34的NP、M、NS、PA、PB 1和/或PB2中至少一個片段(可能全部六個)。
A型流感病毒的其他有用的表達(dá)系統(tǒng)可編碼AA/6/60流感病毒(A/ArmArbor/6/60)的1或多個(如1、2、3、4、5或6個)基因組片段，但通常這/這些片段不包括所述AA/6/60HA片段且通常不包括AA/6/34NA片段。因此所述系統(tǒng)可編碼AA/6/60的NP、M、NS、PA、PBl和/或PB2中至少一個片段(可能全部六個)。所述系統(tǒng)可編碼A/California/4/09株系的一或多個基因組片段，如所述HA片段和/或所述NA片段。因此例如HA基因片段可編碼Hl血凝素，所述血凝素與SEQ ID NO 6比與SEQ ID NO :7更緊密相關(guān)(即使用相同算法和參數(shù)，與SEQ ID NO :6相比的序列相同性比與SEQ ID N0:7相比更高)。SEQ ID NO :6和7有80%同一性。相似地，所述NA基因可編碼附神經(jīng)氨酸苷酶，其與SEQ ID NO 8比與SEQ ID NO :9更緊密相關(guān)。SEQ IDNO 8和9有82%同一性。B型流感病毒的表達(dá)系統(tǒng)可編碼衍生自多種不同野生型株系的基因組片段。所述系統(tǒng)可編碼AA/1/66流感株系(B/Ann Arbor/1/66)的1個或多個(如1、2、3、4、5或6個)基因組片段，但通常這/這些片段不包括所述AA/1/66HA片段且通常不包括AA/1/66NA片段。因此所述系統(tǒng)可編碼AA/1/66的NP、M、NS、PA、PBl和/或PB2中至少一個片段。A/PR/8/34、AA/6/60、AA/l/66、A/Chile/l/83 和 A/California/04/09 株系的病毒片段和序列廣泛可得。其序列可在公共數(shù)據(jù)庫上獲得，如GI :89779337, GI :89779334, GI 89779332、GI :89779320, GI :89779327, GI :89779325, GI :89779322, GI :89779329。流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)可包括導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞中表達(dá)輔助蛋白的表達(dá)構(gòu)建體。例如，表達(dá)非病毒絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有優(yōu)勢。疫苗 本發(fā)明第三方面的方法利用本方法生產(chǎn)的病毒制備疫苗。疫苗(特別是流感病毒)通?；诨畈《净驕缁畈《尽缁钜呙缈苫谌《绢w粒、裂解病毒顆?；蚧诩兓谋砻婵乖??？乖部梢圆《倔w形式存在。可使用本發(fā)明制造任意這些類型的疫苗。采用滅活病毒時，所述疫苗可包含完整的病毒顆粒、裂解病毒顆粒或純化的表面抗原(對于流感，包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種試劑處理去污劑、甲醛、丙內(nèi)酯、亞甲基藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亞胺或其組合。本領(lǐng)域已知病毒滅活的非化學(xué)方法，例如UV射線或Y射線輻射。可通過各種方法由含病毒液體如尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清收獲病毒顆粒。例如，純化方法可包括用含有去污劑以破壞病毒顆粒的線性蔗糖梯度溶液進(jìn)行區(qū)帶離心。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用去污劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通Χ100、曲通Ν101、溴化十六烷基三甲銨、特吉托ΝΡ9等)處理純化的病毒顆粒以獲得裂解病毒顆粒，從而產(chǎn)生亞病毒顆粒制品，包括‘吐溫-醚’裂解方法。例如本領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，參見參考文獻(xiàn)沈-31等。一般使用破壞濃度的裂解劑破壞或片段化完整病毒來裂解所述病毒，無論該病毒有無感染性。這種破壞導(dǎo)致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽離子)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、?；?、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N- 二烷基-葡糖酰胺、Hecameg,烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季銨化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Iipofectamine)和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性劑，如曲通XlOO或曲通moi)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，并且裂解可在病毒顆粒初始純化期間(例如在蔗糖密度梯度溶液中)進(jìn)行。因此，裂解過程可包括澄清含病毒顆粒的材料(以去除非病毒顆粒物質(zhì))，濃縮所收獲的病毒顆粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，從將全病毒顆粒與非病毒顆粒材料分離，用裂解劑在密度梯度離心步驟中裂解病毒顆粒(例如，用含有裂解劑如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度)，然后過濾(例如超濾)以去除不需要的物質(zhì)?？蓪⒘呀獾牟《绢w粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。裂解流感疫苗的示例有 BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZONE 和 FLUS HIELD 產(chǎn)品。本發(fā)明的方法也可用于生產(chǎn)活疫苗。此類疫苗通常通過從含病毒顆粒的液體中純化病毒顆粒來制備。例如，所述液體可通過離心澄清并用緩沖液(例如含蔗糖、磷酸鉀和谷氨酸單鈉)穩(wěn)定。目前可以獲得各種形式的流感病毒疫苗(例如參見參考文獻(xiàn)32的第17和18章)?；畈《疽呙绨ㄡt(yī)學(xué)免疫公司(Medlmmune)的FLUMIST 產(chǎn)品(三價活病毒疫苗)。純化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。制備這些蛋白質(zhì)純化形式的方法是本領(lǐng)域熟知的。FLUWRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是流感亞基疫苗。另一種形式的滅活抗原是病毒體[33](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)。病毒體可通過用去污劑溶解病毒，然后去除核衣殼和重建含病毒糖蛋白的膜來制備。另一種制備病毒體的方法包括加入病毒膜糖蛋白至磷脂過量，得到膜中具有病毒蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。所述病毒可被減毒。所述病毒可為溫度敏感型。所述病毒可為冷適應(yīng)性病毒。使用活病毒作為抗原時這三種特征特別有用。HA是現(xiàn)有滅活流感疫苗中的主要免疫原，且參照一般由SRID測定的HA水平來標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量?，F(xiàn)有的疫苗一般含有約15 μ g HA/毒株，但也可使用更低的劑量，例如兒童或大流行情況下，或者是使用佐劑時。分?jǐn)?shù)劑量如1/2 (即7. 5 μ g HA/毒株)、1/4和1/8已有應(yīng)用，更高劑量的(如3x或虹劑量也有使用[34，35])。因此，疫苗可包含0. 1-150 μ gHA/ 流感毒株，優(yōu)選 0. 1-50 μ g,例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g等。具體劑量包括例如，每株約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約3. 75、約 1. 9、約 1. 5 等。對于活疫苗，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID5tl)而非HA含量來衡量劑量，且TCID50—般為 106_108(優(yōu)選為 IO6 5-IO7'5)/毒株。本發(fā)明所用的流感株系可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修飾HA。例如，已知修飾HA以去除使病毒在禽類動物中具有高致病性的決定簇(如HA1/HA2切割位點周圍的超堿性區(qū)域Oiyper-basic region)).反向遺傳學(xué)的應(yīng)用促進(jìn)這類修飾。用于疫苗的流感病毒株隨季節(jié)而變。在大流行間期，疫苗一般包括兩種A型流感株系(Hmi和H3N》和一種B型流感株系，且一般為三價疫苗。本發(fā)明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群沒有與其發(fā)生過免疫接觸的毒株，特別是A型流感病毒)，如H2、H5、H7或H9亞型毒株，且大流行株系的流感疫苗可以是單價疫苗或者可以基于補(bǔ)充有大流行株系的正常三價疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)和疫苗中所含抗原的特性，本發(fā)明可保護(hù)抵御HA 亞型 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 中的一種或多種。本發(fā)明可保護(hù)抵御A型流感病毒NA亞型Ni、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的一種或多種。與針對大流行間期株系的免疫相同，本發(fā)明組合物特別有助于免疫抵御大流行或潛在大流行株系?？赡芤鸫罅餍斜l(fā)的流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年來在人群中未見的血凝素(如擬)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥群體中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它對人有致病性。優(yōu)選用含H5血凝素類型的病毒免疫以抵御大流行流感，如H5W毒株。其它可能的株系包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行株系。本發(fā)明特別適于保護(hù)抵御可或已經(jīng)從非人動物群體傳播給人類的潛在大流行毒株，如豬源Hmi流感株系。因此本發(fā)明適于給人類以及非人動物接種疫苗。其抗原可有用地包含在所述組合物中的其它株系是對抗病毒治療有抗性(例如對奧塞米韋[36]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[37]。本發(fā)明組合物可包含來自一種或多種(如1、2、3、4或更多)流感病毒株系，包括A型流感病毒和/或B型流感病毒的抗原。疫苗包含一種以上流感毒株時，一般單獨培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒后將它們混合在一起，然后制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。通常為三價疫苗，其包含來自兩種A型流感病毒毒株和一種B型流感病毒毒株的抗原。也可用四價疫苗[38]，其包含來自2種A型流感病毒毒株和2種B型流感病毒毒株、或者3種A型流感病毒毒株和一種B型流感病毒毒株的抗原。藥物組合物如本發(fā)明所述制備的疫苗組合物是藥學(xué)上可接受的。它們通常還包含抗原外的其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。如下所述，也可包含佐劑。對這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)39。疫苗組合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可為干燥形式，如可注射固體或貼片上的干燥或聚合制品的形式。疫苗組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗應(yīng)優(yōu)選基本不含(即小于5yg/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[30，40]。更優(yōu)選無汞的疫苗?？砂晁幡?生育酚以替代含汞化合物[30]。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。為了控制張度，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為l-20mg/ml。可存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。疫苗組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg，優(yōu)選M0-360m0sm/kg，更優(yōu)選^K)-310m0sm/kg。雖然以前報道過滲透壓對疫苗接種引起的疼痛無影響[41]，但仍優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。疫苗組合物可含有一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(特別是具有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。
疫苗組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更一般為6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整散裝疫苗pH的步驟。所述疫苗組合物優(yōu)選無菌。所述疫苗組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含有< 1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量< 0. IEU0所述疫苗組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明疫苗組合物可包含去污劑，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為‘吐溫’)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲銨(‘CTAB’ )或脫氧膽酸鈉，特別用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污劑可僅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于lmg/ml。其它痕量殘留組分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。疫苗組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或補(bǔ)充方案)，所述組合物可包含在裝有無菌接頭以取出物質(zhì)的容器中。流感疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量(即約0. 25ml)給予兒里。組合物和藥盒優(yōu)選儲存于2°C _8°C。其不應(yīng)冷凍。理想地，其應(yīng)避直射光保存。宿主細(xì)胞DNA用細(xì)胞系分離和/或培養(yǎng)病毒時，標(biāo)準(zhǔn)實踐是最小化最終疫苗中殘留的細(xì)胞系DNA含量，以最小化該DNA的致癌活性。因此，按照本發(fā)明制備的疫苗組合物優(yōu)選含有每劑量低于IOng (優(yōu)選低于lng，更優(yōu)選低于IOOpg)殘留的宿主細(xì)胞DNA，但可能存在痕量宿主細(xì)胞DNA。任何殘留宿主細(xì)胞DNA的平均長度優(yōu)選小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于IOObp等。在疫苗制備過程中可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，如層析法等去除污染的DNA?？赏ㄟ^核酸酶處理，例如DNA酶處理來提高對殘留宿主細(xì)胞DNA的清除效果。參考文獻(xiàn)42和43公開了一種減少宿主細(xì)胞DNA污染的方便方法，該方法包括兩步處理，先使用DNA酶(如Benzonase)處理，這一步可以在病毒生長過程中使用，然后使用陽離子去污劑(如CTAB)處理，這一步可以在病毒顆粒破壞過程中使用。也可利用烷化劑如β-丙內(nèi)酯處理來去除宿主細(xì)胞DNA，其也可宜用于滅活病毒顆粒W4]。佐劑本發(fā)明組合物宜包含佐劑，其作用是增強(qiáng)在接受組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。優(yōu)選的佐劑包含水包油乳液。已知各種這類乳液，其通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小于5 μ m,理想情況下具有亞微米直徑，通過微流化床實現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因為其可進(jìn)行過濾滅菌。所述乳液可以包含如動物(如魚)或植物來源的油。植物油的來源包括堅果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的代表例子?？梢允褂美绔@自霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草(teff)、黑小麥(triticale)等。可從堅果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產(chǎn)生。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實施本發(fā)明。獲得動物來源純油所必需的分離、 純化、皂化和其它方法的過程在本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如， 鱈魚肝油、鯊魚肝油和如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的代表例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯，其為本文特別優(yōu)選。角鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。魚油，包括鯊烯和鯊?fù)?，易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。其他優(yōu)選的油為α-生育酚(如下)?？梢允褂糜偷幕旌衔铩１砻婊钚詣┛梢酝ㄟ^其‘HLB’ (親水/親脂平衡)來分類本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯 20和聚山梨酯80;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(Ε0)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton)X-IOO,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(芐澤30)；以及脫水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤8 和脫水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。乳液中包含的表面活性劑優(yōu)選吐溫80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔铮缤聹?0/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 (曲通X-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％ )為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫 80)0. 01-1%,特別是約0. 1 %；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 優(yōu)選0. 1-10%，特別是0. 1-1%或約0. 5%。所述疫苗含裂解病毒時，其水相中優(yōu)選不含表面活性劑。這是有益的，因為無表面活性劑可在所述抗原上產(chǎn)生‘切割效果’，因此破壞否則可能存在的任何未切割病毒顆粒和 /或病毒顆粒聚集體。這可改善切割比高濃度疫苗的安全性W5]。乳液優(yōu)選平均液滴大小為< Ιμπι，例如彡750nm、彡500nm、彡400nm、彡300nm、 (250nm、< 220nm、< 200nm或更小。可通過諸如微流化等技術(shù)方便地獲得這些液滴尺寸。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于 角鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%司盤85。以重量計，這些比例為4. 3%角鯊烯、0. 5% 聚山梨酯80和0.48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59，W6-48]，參考文獻(xiàn)49的第10章和參考文獻(xiàn)50的第12章有更詳細(xì)的描述。所述MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，例如IOmM
16檸檬酸鈉緩沖液。 鯊烯、DL α生育酚和聚山梨酯80 (吐溫80)的乳液。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有司盤85 (如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，且鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選< 1，因為這能使乳液更穩(wěn)定。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為11 5。可通過下述方法制備一種此類乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與5g 01^-0-生育酚和5!111 鯊烯的混合物混合，然后微流體化該混合物。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm， 優(yōu)選約ISOnm的亞微米油滴。所述乳液也可含有3-脫-0-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3d-MPL)。此種類型的另一有用乳液可包含(每人劑量)0. 5-10mg鯊烯、0. 5-1 Img生育酚和0. l-4mg聚山梨酯80 [51]。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d_MPL (見下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75 11 10(如 750 μ g/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，且這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含角鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。 鯊?fù)椤⒕凵嚼骢?0和泊洛沙姆401 ("Pluronic L121”)的乳液。所述乳液可用 PH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與“SAF-I” 佐劑(0. 05-1% Thr-MDP、5%鯊烯、2. 5%普流羅尼克(Pluronic)L121和0. 2%聚山梨酸酯 80)中的蘇氨?；?MDP [52] —起使用。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用“AF”佐劑(5% 鯊烯、1. 25%普流羅尼克L121和0. 2%聚山梨酸酯80) [53]。優(yōu)選微流體化?！ず絮徬?、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯 (12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳劑優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90% 油滴(以體積計)小于200nm[54]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。 該乳液可包含TLR4激動劑[55]。這類乳液可凍干。 角鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[56]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5 %鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼多元醇)和2 % Abil-Care 85 (雙-PEG/ PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)?！ず?. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)57述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、 磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸?！げ豢纱x油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫酰基皂苷上而產(chǎn)生的GPI-0100，如參考文獻(xiàn)58 所述)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。
皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[59]?！ぐV物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如， 乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液W0]。·包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液W0]。在一些實施方式中，可在遞送時臨時將乳液與抗原混合，因此所述佐劑和抗原可單獨地保存在包裝或分銷的疫苗中，以便在使用時配制成最終制劑。在其它實施方式中， 在生產(chǎn)過程中將乳液與抗原混合，因此所述組合物以液體佐劑形式包裝。所述抗原通常是水性形式，從而最終通過混合兩種液體制備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如 5:1-1: 5)，但通常約為1 1。上述對具體乳液的說明給出組分濃度時，這些濃度通常用于非稀釋組合物，因此與抗原溶液混合后濃度降低。包裝疫苗組合物適用于本發(fā)明組合物(或藥盒組分)的容器包括藥瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻噴霧等。這些容器應(yīng)無菌。組合物/組分裝在藥瓶中時，藥瓶優(yōu)選由玻璃或塑料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過敏患者的問題，藥瓶優(yōu)選用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。所述藥瓶可包含單一劑量的疫苗，或者可以包含一個以上劑量(‘多劑量’藥瓶)，如10個劑量。藥瓶優(yōu)選由無色玻璃制成。 藥瓶可以有適合的帽(如Luer鎖)，從而預(yù)填裝注射器可插入該帽，可以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中復(fù)溶凍干物質(zhì))，并可以將藥瓶的內(nèi)容物吸回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子打開后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶可裝有允許無菌地取出其內(nèi)含物的瓶帽。某組分包裝到注射器中時，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。優(yōu)選安全性針頭。一般是ι-英寸23-號、1-英寸25-號和5/8-英寸25-號針頭。可提供有剝離標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號、流感季節(jié)和過期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，所述頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選的注射器是以商品名“Tip-Lok” 銷售的注射器。容器可標(biāo)注顯示半劑量體積，例如以利于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可標(biāo)有0. 25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器?？蓪⑺幒谢蚪M合物與宣傳頁包裝在一起(在同一個盒子中)，所述宣傳頁包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說明書也可包含警告，例如準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以防疫苗接種后發(fā)生過敏反應(yīng)等。治療方法和所述疫苗給予
本發(fā)明提供按本發(fā)明制備的疫苗。這些疫苗組合物適合給予人類或非人動物對象如豬，且本發(fā)明提供了引起對象免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予所述對象的步驟。本發(fā)明還將本發(fā)明組合物用作藥物，并提供本發(fā)明組合物在生產(chǎn)引起對象免疫應(yīng)答藥物的應(yīng)用。這些方法和應(yīng)用引起的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評價接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)水平的方法為本領(lǐng)域熟知。人類研究表明， 對人流感病毒血凝素的抗體效價與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)-抑制效價給出對同源病毒感染產(chǎn)生約50%保護(hù)作用)Wl]。一般通過血凝反應(yīng)抑制、微量中和、 單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單徑向溶血(SRH)來測定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測定技術(shù)?？梢愿鞣N方式給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)W2-64]、口服[65]、皮內(nèi)W6，67]、經(jīng)皮、透皮[68]等?？捎冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡大于6個月的兒童和成年人免疫。因此，人類對象可以小于1歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選對象是老年人(例如> 50歲、> 60歲，優(yōu)選> 65歲)、年輕人(如< 5歲)、住院對象、健康護(hù)理工作人員、軍隊服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病對象、免疫缺陷對象、在接受該疫苗前7天接受過抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見下)的對象、對雞蛋過敏的人和出國旅行者。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，可用于更廣泛的人群。對于大流行株系，優(yōu)選給予所有年齡的人。本發(fā)明優(yōu)選組合物滿足1、2或3級CPMP功效標(biāo)準(zhǔn)。在成年人(18_60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡70%血清保護(hù)；(2)彡40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加彡2.5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡60%血清保護(hù)；( 彡30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3) GMT增加彡2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的開放標(biāo)記研究?？赏ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑如胃腸道外起始、粘膜加強(qiáng)，粘膜起始、胃腸道外加強(qiáng)等給予多個劑量。給予一個以上劑量(一般是兩個劑量)特別可用于免疫未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于免疫接種新的HA亞型(如大流行爆發(fā)中的亞型)。一般以至少1周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約 8周、約10周、約12周、約16周等)的間隔給予多個劑量?？蓪⒈景l(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(在健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一用藥咨詢或訪問期間)給予患者，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、 MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌(H. influenzae)疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等基本同時給藥。在老年患者中特別有用的是與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本同時給藥。相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時給予患者(在對健康護(hù)理專業(yè)人員進(jìn)行的同一用藥咨詢或訪問期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R， 4R,5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(1-乙基丙氧基)環(huán)己烯羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亞氨基甲基)_氨基]-2，6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括其酯(如乙酯)和其鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R， 4R,5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(1-乙基丙氧基)環(huán)己烯羧酸，乙酯和磷酸鹽 (1 1)，也稱為磷酸奧塞米韋(TAMIFLU )。概述術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含” X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語“基本”不排除“完全”，如“基本不含” Y的組合物可能完全不含Y。必要時， 可以從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語“基本”。與數(shù)值χ相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的并表示例如x± 10%。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的過程不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。在有三種組分時，可將兩種組分相互合并，然后可將合并組分再與第三種組分合并等。將動物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病 (TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傊瑑?yōu)選在完全不含動物來源物質(zhì)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在將化合物作為組合物的一部分給予人體時，該化合物可被合適的前藥所替代。附圖簡要說明圖1顯示用螢光素酶報告基因分析pol I啟動子活性所用的表達(dá)構(gòu)建體。圖2顯示全長(FL)人pol I啟動子序列(SEQ ID NO :1)。所述全長序列中的 PHW2000人Pol I啟動子序列(SEQ ID NO 2 ；“短”人pol I啟動子)用下劃線字體表示。 箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點。圖3顯示全長(FL)犬pol I啟動子序列(NW_878945 ；SEQ ID NO 3)。所述全長啟動子內(nèi)的SHORT啟動子序列用下劃線大寫字體表示(SEQ IDNO 5)；所述全長啟動子序列內(nèi)的MID啟動子用下劃線大寫字體和粗體小寫字體表示(SEQ ID NO 4)；圖4顯示MDCK細(xì)胞中的犬pol I啟動子活性。實心灰色柱顯示所述FL犬pol I 啟動子的結(jié)果，斜紋柱顯示所述MID犬啟動子的結(jié)果，點柱顯示所述SHORT犬pol I啟動子的結(jié)果?！癆”表示LUC和病毒聚合酶，“B”表示LUC和感染(Μ0Ι = 0. 05)，“C”表示LUC， “D”為無DNA。y軸表示相對光單位(RLU)。圖5顯示MDCK 33016細(xì)胞中的人pol I啟動子活性。實心灰色柱顯示所述人pol I啟動子的結(jié)果，斜紋柱顯示所述FL犬pol I啟動子的結(jié)果，點柱顯示所述MID犬pol I啟動子的結(jié)果，直條柱顯示SHORT犬pol I啟動子的結(jié)果?！癆”表示LUC和病毒聚合酶，“B” 表示LUC和感染(Μ0Ι = 0. 05)，“C”表示LUC。y軸表示相對光單位(RLU)。圖6顯示MDCK細(xì)胞33016細(xì)胞中所述FL和SHORT人pol I啟動子和所述全長犬 pol I啟動子的活性對比。實心灰色柱顯示所述全長人啟動子的結(jié)果，斜紋柱顯示所述全長犬啟動子的結(jié)果，點柱顯示所述人pol I短啟動子的結(jié)果。A表示LUC+聚合酶，B表示LUC+ 感染，C顯示僅LUC。y軸表示相對光單位(RLU)。
圖7顯示MDCK 33016細(xì)胞中(圖7A)和MDCK ATCC細(xì)胞中(圖7B)人pol I啟動子(點柱)和犬pol I啟動子(斜線柱)的活性。A表示LUC+聚合酶，B表示LUC+感染， C顯示僅LUC。y軸表示相對光單位(RLU)。圖8顯示病毒拯救后細(xì)胞裂解物中M和NP蛋白的western印跡分析。圖9顯示用感染反向遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞的上清進(jìn)行的集落形成試驗。圖10顯示人和犬pol I啟動子(分別為SEQ ID NO 1和3)的DNA序列比對。圖 IlA 顯示在 MDCK ATCC、MDCK 33016-PF 和 293T 細(xì)胞中人 pol I(hPolI)啟動子或犬pol I(cPolI)啟動子控制下報道轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。黑色柱代表細(xì)胞的結(jié)果， 白色柱顯示MDCK 33016-PF的結(jié)果，斜線柱代表MDCK ATCC細(xì)胞的結(jié)果；圖IlB比較了人和犬細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。兩圖中的y軸都表示相對光單位(RLU)。圖12顯示存在(白色柱)和不存在(黑色柱)TMPRSS2輔助質(zhì)粒時以及添加(黑色柱)和不添加(白色柱)飼養(yǎng)細(xì)胞(12B)時在MDCK ATCC, MDCK 33016-PF和細(xì)胞中通過基于人pol I啟動子的反向遺傳對A/Puerto Rico/8/34流感株系的拯救。y軸代表病毒效價(ffu/mL)圖13比較MDCK 33016-PF細(xì)胞中人或犬pol I驅(qū)動的反向遺傳對A/Puerto Rico/8/34流感株系的拯救。黑色柱顯示沒有TMPRSS2輔助質(zhì)粒的結(jié)果，白色柱顯示存在 TMPRSS2輔助質(zhì)粒的結(jié)果。y軸代表病毒效價(ffu/mL)序列表簡沭
SEQIDNO ；1為全長(FL)人pol I啟動子序列
SEQIDNO ；2為pHW2000人Pol I啟動子序列
SEQIDNO ；3為全長(FL)犬pol I啟動子序列
SEQIDNO ；為MID犬pol I啟動子序列
SEQIDNO ；:5為SHORT犬pol I啟動子序列
SEQIDNO ；6 為來自 A/California/04/09 的 HA 序列。
SEQIDNO ；7 為來自 A/Chile/1/1983 的 HA 序列。
SEQIDNO ；8 為來自 A/California/04/09 的 NA 序列。
SEQIDNO ；9 為來自 A/Chile/1/1983 的 NA 序列。
實施本發(fā)明的方式
人polI啟動子在人以及犬細(xì)胞中激活。
為了評估pol I啟動子在非內(nèi)源宿主細(xì)胞中的活性，用487bp人pol
段或犬pol I啟動子的各種片段(如圖3所示)控制下反義表達(dá)螢光素酶(Iuc)RNA的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。表達(dá)的RNA可被病毒聚合酶轉(zhuǎn)錄為mRNA并隨后被翻譯為Iuc蛋白。因此，表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞可通過檢測熒光素酶活性而被容易的鑒別。為使所述試驗發(fā)揮作用，需要提供病毒聚合酶。這可通過用編碼所述病毒聚合酶的表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞或用輔助病毒感染所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來實現(xiàn)。所述試驗如圖1所示。
圖IlA顯示人pol I啟動子能犬pol I啟動子的相同效率驅(qū)動MDCKATCC細(xì)胞和 MDCK 33016-PF細(xì)胞中所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在MDCK ATCC細(xì)胞中用人pol I啟動子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平甚至高于人細(xì)胞中所觀察到的水平。為證實所測細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，用含CMV啟動子控制下的熒光素酶基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。測量熒光素酶活性水平。結(jié)果見圖IlB且證實所測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)。圖4顯示犬pol I啟動子的所有檢測片段都可驅(qū)動所述Iuc轉(zhuǎn)基因在MDCK細(xì)胞中表達(dá)。此外，圖5證明所述全長人pol I啟動子能驅(qū)動所述轉(zhuǎn)基因在MDCK細(xì)胞中表達(dá)且比犬pol I啟動子更有效。為進(jìn)一步限定驅(qū)動所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)必需的人pol I啟動子區(qū)域，用圖2所示的人 pol I啟動子片段(“短” pol I)重復(fù)所述實驗。發(fā)現(xiàn)盡管全長poll啟動子更活躍，但是所述全長以及所述短的人pol I啟動子在MDCK細(xì)胞中都活躍(圖6)。含人和犬pol I啟動子序列的構(gòu)建體還轉(zhuǎn)染到ATCC的MDCK和MDCK 33016細(xì)胞 [18]中以檢測人pol I啟動子的活性是否局限于特定細(xì)胞系。如圖7所示，人pol I啟動子能在兩種細(xì)胞類型中驅(qū)動所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，但該表達(dá)在MDCK 33016細(xì)胞中更有效。用人pol I啟動子從MDCK細(xì)胞拯救流感病毒在MDCK和四31~細(xì)胞中比較用人pol I啟動子拯救流感病毒的效率。將所述流感病毒基因組克隆到PHW2000表達(dá)載體中W9]。該載體含在MDCK細(xì)胞中顯示有活性的人 pol I啟動子片段(見圖5)。具體地，使用以下載體pHW-WSN PA (0. 534 μ g/μ 1) ；pHW-ffSN PBl(0. 432 μ g/μ 1) ；pHW-WSN PB2(0. 357 μ g/μ 1) ；pHW-ffSN NP(0. 284 μ g/μ 1) ；pHW-ffSN NS (0. 217 μ g/μ 1) ； pHW-WSN M (0· 232 μ g/μ 1) ； pHff-ffSN HA (0. 169 μ g/μ 1) ； pHff-ffSN NA (0. 280 μ g/μ 1)和pcDNA-TMPRSS (0. 775 μ g/μ 1 ；編碼絲氨酸蛋白酶)。蛋白編碼基因由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子控制。為拯救所述病毒，將細(xì)胞以切106細(xì)胞/孔的密度接種在含2ml加有10% FCS的Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的6孔板中。MDCK細(xì)胞以0. 3xl06細(xì)胞/孔接種入含2ml培養(yǎng)基的6孔板中。所述細(xì)胞在37°C孵育過夜并在其融合度達(dá)到50-80%時轉(zhuǎn)
^fe ο分別用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑(羅氏公司(Roche)目錄號11988387001)和 Lipofectamine LTX Plus (英杰公司(Invitrogen)目錄號 15338-100)試劑轉(zhuǎn)染和 MDCK細(xì)胞。用Iyg各載體按以下實驗方案轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。對于FuGENE 6，將試劑(3 μ 1 FuGENE/ μ g DNA)稀釋到73 μ 1無血清培養(yǎng)基(無抗生素)中，溫和混合并在室溫孵育5 分鐘。然后將所述DNA加入稀釋的FuGENE中，溫和混合并在室溫孵育至少15分鐘。所述 DNA/FuGENE復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞中而不移除生長培養(yǎng)基，并將所述細(xì)胞在37°C孵育 24小時。對于用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑的轉(zhuǎn)染，所述試劑(25μ 1)稀釋入500 μ 1無血清培養(yǎng)基中并在室溫孵育5分鐘。添加所述DNA并將該混合物在室溫孵育30分鐘。孵育后，在細(xì)胞脫離生長培養(yǎng)基后將500 μ 1無血清培養(yǎng)基逐滴加入轉(zhuǎn)染試劑。隨后37°C孵育該細(xì)胞M小時。轉(zhuǎn)染M小時后，更換培養(yǎng)基。感染兩天后，IOOOrpm離心5分鐘收集所述細(xì)胞的上清。所述上清中收集的病毒用于集落形成試驗。此外，裂解所述感染細(xì)胞并用于Western印跡分析。Western 印跡分析裂解和MDCK細(xì)胞并按照標(biāo)準(zhǔn)實驗方案進(jìn)行Wfestern印跡分析。用抗M和NP 蛋白的抗體檢測膜上的這些蛋白?？筍6的抗體用作加樣對照。標(biāo)記為‘WSN’的泳道加有來自所述拯救病毒的蛋白。標(biāo)記‘Μ’和‘ΝΡ’的泳道含重組M和NP蛋白作為對照。由于這
22些重組蛋白表達(dá)自不同基因，它們在凝膠中遷移較慢。所述分析結(jié)果見圖8，其表明人pol I啟動子控制下的表達(dá)構(gòu)建體可在以及 MDCK細(xì)胞中拯救病毒。集落形成試驗未感染的MDCK細(xì)胞以6. 25χ104細(xì)胞/孔的密度接種入含500 μ 1加有10% FCS 的DMEM的48孔板中。第二天用病毒在100-150 μ 1體積中37°C感染細(xì)胞2小時。從而所述細(xì)胞被各種稀釋度的所述病毒感染。感染2小時后吸棄培養(yǎng)基并每孔加入含10% FCS的 500 μ 1 DMEM。細(xì)胞37°C孵育到第二天。感染M小時后，吸棄培養(yǎng)基并用PBS清洗所述細(xì)胞一次。每孔加入500 μ 1冰冷的溶于PBS的80%丙酮然后4°C孵育30分鐘。吸棄丙酮混合物并用PBST(PBS+0. 吐溫) 清洗所述細(xì)胞一次。每孔加入500 μ 1溶于PBS的2% BSA然后室溫(RT)孵育30分鐘。將 500μ1 1 6000稀釋的抗NP加入封閉緩沖液然后室溫孵育2小時。吸棄抗體溶液并用 PBST清洗所述細(xì)胞兩次。二抗(山羊抗小鼠)以1 2000稀釋在500 μ 1封閉緩沖液中， 并將所述板RT孵育2小時。吸棄抗體溶液并用PBST清洗所述細(xì)胞三次。每孔加入500 μ 1 KPL True Blue并孵育10分鐘。通過吸棄True-Blue停止反應(yīng)并用dH20清洗一次。吸棄水并晾干所述細(xì)胞。所述試驗結(jié)果見圖9，清楚證明從細(xì)胞以及MDCK細(xì)胞獲得感染性病毒。如參考文獻(xiàn)70所述還在MDCK ATCC、MDCK 33016-PF和細(xì)胞中測試使用人 pol I反向遺傳系統(tǒng)的A/Puerto Rico/8/34流感株系的病毒拯救。進(jìn)行存在或不存在編碼絲氨酸蛋白酶的輔助質(zhì)粒TMPRSS2時拯救所述病毒的實驗。此外，在病毒診救M小時后， 添加或不添加飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救。結(jié)果見圖12所示，證明可在MDCK細(xì)胞中用人pol I 啟動子在各種條件下實現(xiàn)有效的病毒拯救。為比較用人pol I啟動子在MDCK 33016-PF中病毒拯救的效率是否與用犬pol I 啟動子的所述拯救相當(dāng)，如參考文獻(xiàn)70所述用人pol I RG系統(tǒng)或犬pol I RG系統(tǒng)轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。在存在和不存在所述TMPRSS輔助質(zhì)粒時進(jìn)行所述實驗。結(jié)果(圖13)證明使用人pol I系統(tǒng)時，A/Puerto Rico/8/34株系的拯救效率與犬pol I系統(tǒng)相當(dāng)。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。參考文獻(xiàn)[l]W02007/002008[2]W02007/124327[3]Koudstaal 等.Q009)Vaccine 272588-2593[4]W02009/000891[5]Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2ed.(〈〈分子克隆 實驗室手冊，第二版》)，1989，冷泉港出版社，紐約冷泉港[6] Racaniello 禾口 Baltimore (1981) Science 214:916—919[7]Kaplan 等· (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82 :8424-8428[8]Fodor 等· (1999) J. Virol 73(11) :9679-9682[9]Hoffmann 等· (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99 :11411-11416
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1.含至少一種編碼病毒RNA分子的表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體的所述病毒RNA分子的表達(dá)由所述宿主細(xì)胞分類學(xué)目的非內(nèi)源pol I啟動子控制。
2.一種具有至少一種內(nèi)源pol I啟動子和至少一種非內(nèi)源pol I啟動子的細(xì)胞，所述細(xì)胞內(nèi)源pol I啟動子控制內(nèi)源rRNA的表達(dá)，所述非內(nèi)源poll啟動子控制病毒RNA或其互補(bǔ)物的表達(dá)。
3.—種生產(chǎn)重組病毒的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞在表達(dá)所述病毒RNA分子的條件下培養(yǎng)以生產(chǎn)病毒的步驟。
4.一種制備病毒的方法，所述方法包括步驟(i)如權(quán)利要求3所述的方法生產(chǎn)重組病毒；(ii)用獲自步驟(i)的病毒感染培養(yǎng)宿主；(iii)培養(yǎng)來自步驟(ii)的宿主以生產(chǎn)更多病毒；和(iv)純化獲自步驟(iii)的病毒。
5.一種制備疫苗的方法，包括步驟(a)用權(quán)利要求4所述的方法制備病毒和(b)從所述病毒制備疫苗。
6.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述polI啟動子為靈長類pol I啟動子且所述細(xì)胞為非靈長類細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述polI啟動子為非犬pol I啟動子且所述細(xì)胞為犬細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述polI啟動子為人pol I啟動子且所述細(xì)胞為犬細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述細(xì)胞是MDCK細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述MDCK細(xì)胞為細(xì)胞系MDCK33016(DSM ACC2219)。
11.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括至少一種雙向表達(dá)構(gòu)建體。
12.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述表達(dá)構(gòu)建體為表達(dá)載體或線性表達(dá)構(gòu)建體。
13.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述病毒為分節(jié)段病
14.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述病毒為非分段病
15.如上述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述病毒為負(fù)鏈RNA病
16.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞或方法，其特征在于，所述病毒為流感病毒。
全文摘要
在宿主細(xì)胞中用pol I啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)，所述啟動子對和衍生所述宿主細(xì)胞的分類學(xué)目相同的生物是非內(nèi)源的。
文檔編號C12N15/85GK102597246SQ201080027545
公開日2012年7月18日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者B·基納, M·弗蘭蒂, P·蘇帕菲帕特, P·道米策, P·馬森, S·克羅塔 申請人:諾華有限公司