專利名稱：生物質(zhì)水解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及方法，所述方法包括再循環(huán)用于含木素纖維素材料預(yù)處理的洗滌溶液。
背景技術(shù)：
由于化石燃料的有限儲(chǔ)備和對(duì)排放溫室氣體的憂慮，人們?cè)絹?lái)越著眼于使用可再生的能源，例如，發(fā)酵產(chǎn)物如生物乙醇。從含木素纖維素材料產(chǎn)生乙醇在本領(lǐng)域是已知的， 并常規(guī)地包括所述含木素纖維素材料的預(yù)處理、水解和發(fā)酵。預(yù)處理導(dǎo)致從所述含木素纖維素材料釋放降解產(chǎn)物，其可不可逆地結(jié)合并抑制在水解和發(fā)酵過(guò)程中添加的酶。在經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中這些抑制劑的濃度可通過(guò)水解之前的洗滌來(lái)減少。然而，所述抑制劑常常具有低溶解度，且由于抑制劑的積聚(build-up)洗滌水的再循環(huán)僅可限于非常有限的程度。因此，洗滌需要大量水。因此，亟需提供將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料加工為適于水解和發(fā)酵的底物的改進(jìn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及方法，所述方法包括通過(guò)洗滌從經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料去除和 /或失活抑制劑，并再循環(huán)用過(guò)的洗滌溶液。所述用過(guò)的洗滌溶液是通過(guò)去除和/或失活酶抑制劑來(lái)再生的，由此改善水解步驟的效率。本發(fā)明還涉及從含木素纖維素材料產(chǎn)生水解物和發(fā)酵產(chǎn)物的方法。因此，本發(fā)明涉及將含木素纖維素材料轉(zhuǎn)化為水解物的方法，包括下述步驟(a) 對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理，(b)在洗滌溶液中洗滌經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料， (c)將用過(guò)的洗滌溶液分離以獲得經(jīng)預(yù)處理和洗滌的含木素纖維素材料，(d)對(duì)經(jīng)預(yù)處理的和洗滌的含木素纖維素材料進(jìn)行處理，導(dǎo)致纖維素和/或半纖維素的至少部分水解，以獲得水解物，和(e)在將步驟(c)的用過(guò)的洗滌溶液再循環(huán)至步驟(b)之前，用木聚糖酶處理該用過(guò)的洗滌溶液。所述方法的優(yōu)點(diǎn)包括因?yàn)榭稍傺h(huán)洗滌溶液而減少水消耗，從預(yù)處理產(chǎn)生的可溶性糖(例如，木糖、寡糖)可濃縮于洗滌溶液，和增加水解的效率。發(fā)明詳述 含木素纖維素材料
術(shù)語(yǔ)“含木素纖維素材料”用于本文中指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的材料。含木素纖維素材料常常被稱作“生物質(zhì)”。木素纖維素的結(jié)構(gòu)使酶水解無(wú)法直接進(jìn)行。因此，必須預(yù)處理木素纖維素例如通過(guò)在足夠的壓力、濕度和溫度條件下進(jìn)行酸水解以打破木質(zhì)素的密封，并破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致半纖維素級(jí)分的溶解和糖化。然后可將纖維素級(jí)分用酶水解，例如通過(guò)纖維素酶酶水解，來(lái)將糖聚合物轉(zhuǎn)化為單糖或寡糖，其可發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。任選地，所述發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)例如蒸餾來(lái)回收。涵蓋了根據(jù)本發(fā)明的任何含木素纖維素材料。含木素纖維素材料可為任何含有木素纖維素的材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料含有至少30wt. %，優(yōu)選至少50wt. %，更優(yōu)選至少70wt. %，甚至更優(yōu)選至少90wt. %木素纖維素。應(yīng)理解的是，所述含木素纖維素材料還可包含其它成分如纖維素材料(包括纖維素和半纖維素)，并還可包含其他成分如蛋白質(zhì)材料、淀粉、糖如可發(fā)酵的糖和/或不可發(fā)酵的糖。含木素纖維素材料通常見(jiàn)于例如植物的莖、葉、殼/莢(hull)、殼/皮/莢/苞 (husk)和穗軸或樹(shù)的葉、枝和木材。含木素纖維素材料可為，但不僅限于草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。在本文中應(yīng)理解的是，含木素纖維素材料可為在混合的基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。所述含木素纖維素材料可包括玉米秸桿、硬木如楊木和樺木、軟木如松木、柳枝稷、谷物秸稈和/或殼如來(lái)自稻、小麥、大麥和黑麥等的稈、城市固體廢物(MSW)、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公室用紙、刨花、甘蔗渣、紙和紙漿加工廢物或其混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述含木素纖維素材料是玉米纖維。預(yù)處理所述含木素纖維素材料可用任何合適的方式進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理在水解和/或發(fā)酵之前進(jìn)行。預(yù)處理的目標(biāo)是分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，這樣增加水解速率。預(yù)處理方法(如濕法氧化和堿性預(yù)處理)靶向木質(zhì)素，而稀酸和自水解 (auto-hydrolysis)靶向半纖維素。蒸汽爆炸是靶向纖維素的預(yù)處理方法的實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理步驟(a)可為使用本領(lǐng)域中公知技術(shù)的常規(guī)預(yù)處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理在水性漿料中進(jìn)行。在預(yù)處理過(guò)程中含木素纖維素材料可以 10-80wt. %的量，優(yōu)選20-70wt. %的量，特別是30-60wt. %的量，如約50wt. %的量存在。所述預(yù)處理在水解和/或發(fā)酵之前進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理的實(shí)例包括用例如稀酸、石灰、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳進(jìn)行處理。此外，濕法氧化和控制PH的水熱解(hydrothermolysis)亦視為化學(xué)預(yù)處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化學(xué)預(yù)處理為酸處理，更優(yōu)選地，為連續(xù)的稀酸和/ 或弱酸(mild acid)處理，例如，用硫酸，或用其它有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、 鹽酸或其混合物處理。也可使用其它酸。弱酸處理意為處理的PH在pH 1-5，優(yōu)選在pH 1-3 的范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述酸濃度在0. 1到2. 酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選為硫酸。 該酸可與所述含木素纖維素材料相接觸，且混合物可保持在160-220°C，如165-195°C范圍內(nèi)的溫度，處理時(shí)間為例如，1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘?？商砑訌?qiáng)酸(如硫酸) 來(lái)移除半纖維素。這增強(qiáng)了纖維素的可消化性。亦涵蓋了其它技術(shù)。已經(jīng)顯示纖維素溶劑處理將約90%的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。 也顯示了當(dāng)木素纖維素結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，能夠極大地增強(qiáng)酶水解。堿、H2O2、臭氧、有機(jī)溶劑 (使用含水醇中的路易斯酸，F(xiàn)eCl3, (Al)2SO4)、甘油、二礎(chǔ)、烷，苯酚或乙二醇屬于已知破壞纖維素結(jié)構(gòu)并促進(jìn)水解的溶劑(Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96:673-686)。本發(fā)明也涵蓋了使用堿，例如NaOH，Na2CO3*/或氨等的堿化學(xué)預(yù)處理。使用氨的預(yù)處理方法描述于例如 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900、WO 2006/110901 (將它們通過(guò)提述并入本文)。濕氧化技術(shù)涉及使用氧化劑，如基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預(yù)處理的實(shí)例包括用DMSO (二甲亞砜)等的處理。化學(xué)預(yù)處理通常進(jìn)行1到60分鐘，如5到30分鐘，但可依賴于待進(jìn)行預(yù)處理的材料進(jìn)行更短或更長(zhǎng)的時(shí)間。其它合適的預(yù)處理方法的實(shí)例描述于khell等，2003，Appl. Biochem and Biotechn. 105-108 :69-85 ；Mosier ^,2005, Bioresource Technology 96 :673-686 ； Ahring 等，WO 2006/032282 和 WO 2001/060752, Foody 等，WO 2006/034590 ；以及 Ballesteros等，美國(guó)公開(kāi)2002/0164730號(hào)，這些參考文獻(xiàn)均在此通過(guò)提述并入本文。術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”指任何機(jī)械的(或物理的)處理，其促進(jìn)纖維素、半纖維素和/ 或木質(zhì)素自含木素纖維素材料的分離和/或釋放。例如，機(jī)械預(yù)處理包括多種類型的磨制、 輻射、汽蒸/蒸汽爆炸(steam explosion)，濕氧化以及其他水熱解處理。機(jī)械預(yù)處理包括粉碎(機(jī)械減小大小)。粉碎包括干磨、濕磨和振動(dòng)球磨 (vibratory ball milling)。機(jī)械預(yù)處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高壓意指壓力在300到600psi，優(yōu)選400到500psi，例如約450psi的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高溫意指溫度在約100到300°C，優(yōu)選約140到235°C的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，機(jī)械預(yù)處理是分批工藝的蒸汽槍水解器系統(tǒng)，其使用如上定義的高壓和高溫。也可為此使用Sunds Hydrolyzer(可由Sunds Defibrator AB(Sweden) 得到)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行了化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理兩者。例如，所述預(yù)處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。所述化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理可根據(jù)需要順序或同時(shí)進(jìn)行。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械兩種預(yù)處理以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，機(jī)械預(yù)處理在蒸汽爆炸預(yù)處理之前進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述預(yù)處理作為稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步驟進(jìn)行。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理作為氨纖維爆炸(ammonia fiber explosion)步驟(或 AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“生物預(yù)處理”如用于本發(fā)明是指促進(jìn)自含木素纖維素材料分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可涉及應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見(jiàn)，例如，Hsu，Τ. -Α.，1996，Pretreatment of biomass，于 Handbook on Bioethanol !Production and Utilization, Wyman, C. 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Eng. /Biotechnol. 42 63-95)。洗滌經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料當(dāng)預(yù)處理含木素纖維素材料時(shí)，產(chǎn)生了抑制酶的降解產(chǎn)物。這些化合物嚴(yán)重地降低了水解率。為了去除酶抑制劑的對(duì)經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的洗滌會(huì)改善酶水解。所述抑制劑為木素纖維素降解產(chǎn)物，其包括木質(zhì)素降解產(chǎn)物，纖維素降解產(chǎn)物和半纖維素降解產(chǎn)物。木質(zhì)素降解產(chǎn)物本質(zhì)上可為酚類。半纖維素降解產(chǎn)物包括來(lái)自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，包括寡糖。 認(rèn)為抑制酶的化合物包括木寡糖(xylooligosaccharideJOO)或X00和可溶性木質(zhì)素的復(fù)合物，其存在于PCS液中。根據(jù)本發(fā)明，抑制酶的可溶化合物是通過(guò)用洗滌溶液從經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中去除的。所述洗滌溶液優(yōu)選為水性洗滌溶液。所述洗滌溶液可為基本上純的水，或具有顯著量的添加劑的水的溶液，例如，如去污劑和/或有機(jī)溶劑，以改進(jìn)抑制酶的化合物的提取和/或溶解性。合適的有機(jī)溶劑是乙醇或甲醇。所述洗滌溶液優(yōu)選地以5至70°C，優(yōu)選10至65°C，且更優(yōu)選20至60°C，例如，在 30至55 °C的溫度施用。當(dāng)用過(guò)的洗滌溶液與經(jīng)洗滌的PCS分離時(shí)，洗滌步驟結(jié)束。用過(guò)的洗滌溶液的分離可通過(guò)任何合適的方法來(lái)完成，所述方法包括但不限于排液(draining)、過(guò)濾、離心和擠壓(pressing)。根據(jù)本發(fā)明，所述用過(guò)的洗滌溶液在再循環(huán)至洗滌步驟之前經(jīng)處理以去除和/或失活酶抑制劑。所述處理再生了用過(guò)的洗滌溶液以構(gòu)建可用的洗滌溶液。所述處理包括將用過(guò)的洗滌溶液與木聚糖酶，且更優(yōu)選固定化的木聚糖酶相接觸。不拘于理論，認(rèn)為本發(fā)明的方法的作用是通過(guò)對(duì)PCS液中存在的可溶性組分，特別是對(duì)木寡糖0(00)或X00和可溶性木質(zhì)素的復(fù)合物的木聚糖酶活性造成的。在一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)所述用過(guò)的洗滌溶液通過(guò)將其與樹(shù)脂或樹(shù)脂的組合相接觸來(lái)進(jìn)行處理。樹(shù)脂的組合可作為兩種或更多種樹(shù)脂的混合物施用和/或可為兩種或更多種樹(shù)脂順次施用。所述樹(shù)脂可為具有極性、弱極性或非極性官能團(tuán)的樹(shù)脂。所述樹(shù)脂可為強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑、弱酸性陽(yáng)離子交換劑，強(qiáng)堿性陰離子交換劑或弱堿性陰離子交換齊U。優(yōu)選的官能團(tuán)包括-S03、-C00H、-N+(CH3)3> -N(CH3)2和_NH2。所述樹(shù)脂亦可為木炭樹(shù)月旨(charcoal resin) 0在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將所述用過(guò)的洗滌溶液與活性炭接觸對(duì)其進(jìn)行處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述用過(guò)的洗滌溶液經(jīng)過(guò)包含所述樹(shù)脂和/或活性炭的柱。
水解在發(fā)酵之前和/或同時(shí)，將經(jīng)預(yù)處理和洗滌的含木素纖維素材料水解以將纖維素和半纖維素降解為糖和/或寡糖。水解過(guò)程中的干固體含量可為5_50wt. %，優(yōu)選10_40wt. %，更優(yōu)選20_35wt. % 的范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解可作為補(bǔ)料分批工藝進(jìn)行，其中將經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料(底物)逐漸加料于例如含有酶的水解溶液。經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料可以以一個(gè)或多個(gè)不同批次，作為一個(gè)或多個(gè)不同的連續(xù)流或作為一個(gè)或多個(gè)不同批次和一個(gè)或多個(gè)不同的連續(xù)流的組合而供予含酶的水解溶液。水解是用酶法進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明，可用一種或多種水解酶(根據(jù)酶命名法為EC3 類)，優(yōu)選一種或多種選自纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶或蛋白酶的糖酶來(lái)水解經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶可存在于水解和/或發(fā)酵過(guò)程中，因?yàn)楹舅乩w維素材料可含有一些淀粉。用于水解的酶能夠直接或間接地將經(jīng)洗滌的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖，所述糖可發(fā)酵為所需的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。合適的酶描述于下文“酶”部分。半纖維素聚合物可由半纖維素酶和/或酸水解降解以釋放其五碳和六碳糖組分。 所述六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，可方便地由包括酵母的合適發(fā)酵生物發(fā)酵為例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、檸檬酸、延胡索酸等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料是使用半纖維素酶， 優(yōu)選木聚糖酶、酯酶、纖維二糖酶或其組合來(lái)水解的。酶水解可在合適的水性環(huán)境中在本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定的條件下實(shí)施。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解在對(duì)所述酶合適的，優(yōu)選為最佳的條件下進(jìn)行。合適的工藝時(shí)間、溫度和ρΗ條件可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，水解在25-70°C，優(yōu)選40-60°C，特別是約50°C的溫度進(jìn)行。所述工藝優(yōu)選在pH3_8，優(yōu)選pH4_6， 特別是約PH 5的ρΗ范圍中進(jìn)行。優(yōu)選地，水解實(shí)施12至144小時(shí)，優(yōu)選16至120小時(shí)， 更優(yōu)選M至96小時(shí)，如32至72小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，步驟(c)中的水解和步驟(d)中的發(fā)酵可同時(shí)進(jìn)行(SHHF方法)或順次進(jìn)行(SHF方法)。發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明，所述經(jīng)預(yù)處理的(和經(jīng)水解的)含木素纖維素材料由至少一種能夠發(fā)酵可發(fā)酵的糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的發(fā)酵生物直接或間接地發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵優(yōu)選持續(xù)進(jìn)行8至96小時(shí)，優(yōu)選12至72小時(shí)，更優(yōu)選M至48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵是在20至40°C，優(yōu)選沈至34°C，特別是32°C左右的溫度進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，PH為ρΗ 3至6，優(yōu)選大約ρΗ 4至5。對(duì)于乙醇發(fā)酵優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種的酵母，優(yōu)選地為對(duì)高水平乙醇即高至例如約10、12或15體積％乙醇或更高如20體積％乙醇具有抗性的株。根據(jù)本發(fā)明涵蓋了同時(shí)水解和發(fā)酵(SHF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于水解無(wú)單獨(dú)的維持階段，意味著水解酶和發(fā)酵生物是一同添加的。當(dāng)發(fā)酵與水解同時(shí)進(jìn)行時(shí)，溫度優(yōu)選為至35°C，更優(yōu)選30°C至34°C，如大約32°C?？筛鶕?jù)本發(fā)明施用包含至少兩個(gè)在不同溫度的維持階段的溫度程序。在所述經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的洗滌過(guò)程中，溶解糖可在經(jīng)再循環(huán)的洗滌水溶液中蓄積。所述溶解糖會(huì)包含來(lái)自半纖維素降解的C5糖，如木糖。這些糖可用合適的能夠?qū)5糖轉(zhuǎn)化為所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物發(fā)酵。該C5發(fā)酵可單獨(dú)進(jìn)行，或可將蓄積于再循環(huán)的洗滌水溶液中的溶解糖添加至經(jīng)水解的含木素纖維素材料以供合并的C6和C5發(fā)酵。此種發(fā)酵優(yōu)選用至少一種能夠發(fā)酵C6糖(例如葡萄糖)和C5糖(例如木糖)兩者的生物來(lái)進(jìn)行?；蛘?，發(fā)酵可用至少兩種不同的生物來(lái)進(jìn)行，其中將每種針對(duì)利用C6或05糖之一優(yōu)化，且所述發(fā)酵或者是在一個(gè)發(fā)酵步驟中在允許兩種生物都發(fā)酵的條件下進(jìn)行，或者作為至少兩個(gè)發(fā)酵步驟，每個(gè)均在允許所述生物之一發(fā)酵的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的方法可作為分批、批次補(bǔ)料或連續(xù)方法進(jìn)行。優(yōu)選地，所述發(fā)酵步驟是作為連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行。Mi^在發(fā)酵之后，可自發(fā)酵液中分離發(fā)酵產(chǎn)物?？烧麴s發(fā)酵液以提取發(fā)酵產(chǎn)物，或可自發(fā)酵液中通過(guò)微濾或膜過(guò)濾技術(shù)提取發(fā)酵產(chǎn)物。或者，可通過(guò)汽提(stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物?；厥辗椒ㄔ诒绢I(lǐng)域?yàn)楸娝苤?。發(fā)酵產(chǎn)物本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生任何發(fā)酵產(chǎn)物。具體涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；以及激素。還涵蓋的產(chǎn)物包括消費(fèi)醇類工業(yè)產(chǎn)物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工業(yè)產(chǎn)物，例如，發(fā)酵的乳制品；皮革工業(yè)產(chǎn)物和煙草工業(yè)產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)可優(yōu)選為燃料醇/乙醇。然而， 對(duì)于乙醇，其亦可用作飲用乙醇。發(fā)酵生物術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”指任何適于產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細(xì)菌和真菌生物。 本發(fā)明特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻侨缙咸烟侵苯踊蜷g接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為所需的發(fā)酵產(chǎn)物。亦合適的是能夠?qū)5糖如木糖發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物。發(fā)酵生物的實(shí)例包括真菌生物，特別是酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬種(Saccharomyces spp.)，特別是釀酒
(Saccharomyces cerevisiae) 5 ! ^(Saccharomyces uvarum) StJliitt 酵母屬(Pichia)的菌株，特別是樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株如樹(shù)干畢赤酵母 CBS 5773 ；假絲酵母屬(Candida)的菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，迪丹氏假絲酵母(Candida diddensii)或博伊丁氏假絲酵母(Candida boidinii)的菌株。其它涵蓋的酵母包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的菌株；漢遜酵母屬(Hansenula)的菌株，特別是異常漢遜酵母(H. anomala)的菌株；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌株，特別是脆壁 (Kluyveromyces fragilis)；禾口(Schizosaccharomyces)白勺胃_， 特別是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
商業(yè)上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL RED 酵母(可由Fermentis/Lesaffre， USA 得到)，F(xiàn)ALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 得到)，SUPERSTART 和 THERM0SACC 新鮮酵母(可由 Ethanol Technology, WI, USA 得到)，BIOFERM AFT 和 XR(可由 NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA 得至Ij )，GERT STRAND (可由 Gert Strand AB, Sweden 得到)，以及 FERMI0L(可由 DSM Specialties 得到)。ANQI YEAST(可由 Anqi yeast (CHIFENG) CO.，LTD, China 得到)。酶在本發(fā)明的方法的上下文中，即使未特別提及，也可理解的是酶(以及其它化合物)是以“有效量”使用的。纖維素酶本文所使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素酶”應(yīng)理解為包括纖維二糖水解酶 (EC 3. 2. 1.91)，例如，纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)和β -葡糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)。纖維素酶在水解步驟(d)中施用。為了有效地消化纖維素和半纖維素，需要幾種類型的酶協(xié)同作用。需要至少三種類型的酶將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)，其隨機(jī)切割纖維素鏈；纖維二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91)，其從纖維素鏈末端切割纖維二糖基單元，和β -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)，其將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在這三種類型的涉及纖維素生物降解的酶中，纖維二糖水解酶是用于天然晶質(zhì)纖維素降解的關(guān)鍵酶。在本文中術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶I”定義為如酶分類EC 3. 2. 1. 91中定義的纖維素1，4-β -纖維二糖苷酶(亦稱作外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶或1，4-β-纖維二糖水解酶)活性，其通過(guò)從鏈的非還原端釋放纖維二糖來(lái)催化纖維素和纖維四糖中1，4-β -D-葡糖苷鍵的水解。 術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶II活性”的定義是相同的，但纖維二糖水解酶II從鏈的還原端攻擊。內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4號(hào))催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-葡糖苷鍵，混合β-1，3葡聚糖如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和其他包含纖維素部分的植物材料中的β_1，4-鍵的內(nèi)水解。正式名稱為內(nèi)切-1，4-β -D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，但縮寫(xiě)形式內(nèi)切葡聚糖酶在本說(shuō)明書(shū)中使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述纖維素酶活性可來(lái)源于真菌來(lái)源，如木霉屬CTrichoderma)的菌株，優(yōu)選里氏木霉CTrichoderma reesei)的菌株；腐質(zhì)霉屬(Humicola)的菌株，如特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的菌株；或金孢子菌屬 (Chrysosporium)的菌株，優(yōu)選 Chrysosporium Iucknowense 的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性 (GH61A)的多肽，優(yōu)選WO 2005/074656中公開(kāi)的多肽。所述纖維素酶制備物還可包括β-葡糖苷酶，如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/832,511號(hào)中公開(kāi)的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中所述纖維素酶制備物還包含CBH II，優(yōu)選土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纖維二糖水解酶II CELBA0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物還包含來(lái)源于里氏木霉的纖維素酶制備物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述纖維素酶制備物是用于實(shí)施例1并在WO 2008/151079中公開(kāi)的纖維素酶制備物A(Cellulase preparation A)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶是商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品CELLUCLAST 1.5L 或 CELLUZYME (Novozymes A/S, Denmark)。所述纖維素酶可在0. 1-100 FPU每克干固體(DS)，優(yōu)選0. 5-50 FPU每克DS，特別是1-20 FPU每克DS的范圍給藥。所述纖維素酶可在0. I-IOOOOmg酶蛋白(EP)/kg干固體(DS)，優(yōu)選0. 5_5000mg EP/kg DS，特別是l-2500mg EP/kg DS的范圍給藥。半纖維素酶半纖維素可由半纖維素酶和/或酸水解降解來(lái)釋放其五碳和六碳糖成分?？墒褂萌魏芜m用于水解半纖維素的半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、 甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯聚糖酶、內(nèi)切或外切半乳聚糖酶及其兩種或更多種的混合物。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的半纖維素酶是外切作用的半纖維素酶，且更優(yōu)選地，所述半纖維素酶是外切作用的半纖維素酶，其在低于PH 7，優(yōu)選pH 3-7的酸性條件下具有水解半纖維素的能力。適用于本發(fā)明的半纖維素組合物的實(shí)例包括VISC0ZYME 和ULTRAFL0 (可從 Novozymes A/S, Denmark 獲得)。用于本發(fā)明的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)優(yōu)選為內(nèi)切_1，4_ β -木聚糖酶，并優(yōu)選為糖苷水解酶家族 10 或 11 (GH10 或 GH11)。GHlO 或 GHll 定義于 Cantarel 等，2008，Nucleic Acids Res. 37 :D233_D238 和互聯(lián)網(wǎng)上(cazy. org)。所述木聚糖酶可為任何來(lái)源，包括哺乳動(dòng)物、植物或動(dòng)物來(lái)源；然而，優(yōu)選所述木聚糖酶是微生物來(lái)源。具體而言，所述木聚糖酶可為可來(lái)源于絲狀真菌或酵母的木聚糖酶。優(yōu)選地，所述木聚糖酶來(lái)源于絲狀真菌如來(lái)自曲霉屬種(Aspergillus sp.)、芽孢桿菌 M禾中(Bacillus sp.)(Humicola sp.)(Myceliophotora sp.) > Poitrasia sp.、根毛霉屬種(Rhizomucor sp.)或木霉屬CTrichoderma)。所述木聚糖酶優(yōu)選為GHlO木聚糖酶。最優(yōu)選的是來(lái)源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)并作為木聚糖酶II公開(kāi)于TO 1994/021785并在該文中為SEQ ID NO 1的木聚糖酶。還優(yōu)選的是與本文中SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列具有至少50%同一性，至少60%同一性，至少70%同一性，至少 80 %同一性，至少90 %同一性，至少95 %同一性或甚至至少99 %同一性的木聚糖酶。適用于本發(fā)明方法以供處理所述用過(guò)的洗滌溶液的木聚糖酶優(yōu)選為固定化的木聚糖酶。若使用非固定化的木聚糖酶，其以0.001-1. 0g/kg DS底物，優(yōu)選0.005-0. 5g/kg DS底物，且最優(yōu)選0. 05-0. 10g/kg DS底物的量添加。木聚糖酶亦可在本發(fā)明的水解步驟中以0. 001-1. 0g/kg DS底物，優(yōu)選 0. 005-0. 5g/kg DS底物，且最優(yōu)選0. 05-0. 10g/kg DS底物的量添加。阿魏酸酯酶(EC 3. 1. 1. 73)催化來(lái)自酯化的糖的4_羥基_3_甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)的水解，所述酯化的糖通常為阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖。合適的阿魏酸酯酶可從絲狀真菌(例如木霉屬、多孔菌屬(Meripilus)、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium)) 或從細(xì)菌(例如芽孢桿菌屬)的菌株獲得，如來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)，例如 Faulds 等 1994，Microbiology, 140，pp. 779-787 所述的 FAEIII 阿魏酸酯酶。阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)催化α _L_阿拉伯糖苷中末端非還原性 α -L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。半乳聚糖酶(EC 3. 2. 1. 89)，阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切_1，4_β -半乳糖苷酶，催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷鍵的內(nèi)水解。
果膠酶(EC 3. 2. 1. 15)催化果膠酸和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中1， 4-α-D-半乳糖苷酸鍵(galactosiduronic linkage)的水解。木葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。半纖維素酶可以以有效水解半纖維素的量，如以約0.001至0.5wt. %干固體 (DS)，更優(yōu)選約0. 05至0. 5wt. % DS的量添加。材料和方法塵包含示于SEQ ID NO 1的木聚糖酶的木聚糖酶組合物。包含來(lái)源于里氏木霉的纖維素分解酶、公開(kāi)于WO 2005/074656的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A)和米曲霉β-葡糖苷酶(W0 2008/057637中公開(kāi)的融合蛋白中的)的纖維素酶制備物Α。纖維素酶制備物A公開(kāi)于W02008/151079。同一件的確定兩種氨基酸序列或兩種核苷酸序列之間的關(guān)系是通過(guò)參數(shù)“同一性”描述的。兩種氨基酸序列之間的同一性程度可通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5 :151-153)使用 LASERGENE MEGALIGN 軟件(DNASTAR，he. ,Madison,WI)用同一性表和下述多重比對(duì)參數(shù)來(lái)確定缺口罰分為10和缺口長(zhǎng)度罰分為10。逐對(duì)比對(duì)參數(shù)(Pairwise alignment parameter)為 Ktuple = 1、缺口罰分(gap penalty) = 3、窗口 (windows) = 5 和對(duì)角線(diagonals) = 5。兩種核苷酸序列之間的同一性程度可通過(guò)Wi Ibur-Lipman方法(Wi Ibur禾口 Lipman,1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 :726-730)使用 LASERGENE MEGALIGN 軟件(DNASTAR，he.，Madison，WI)用同一性表和下述多重比對(duì)參數(shù)來(lái)確定缺口罰分為10和缺口長(zhǎng)度罰分為10。逐對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple = 3、缺口罰分 (gap penalty) = 3 禾口窗口 (windows) = 20。
實(shí)施例實(shí)施例1使用蒸汽爆炸在195°C預(yù)處理玉米秸稈5. 4分鐘。將具有53. 10%干固體含量(DS) 的250g經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)與IL洗滌水溶液(水對(duì)PCS重量比為4 1)混合，并伴隨攪拌在室溫溫育30分鐘。將來(lái)自PCS的用過(guò)的洗滌溶液通過(guò)8層干酪篩網(wǎng)布(cheese cloth)擠出，并通過(guò)32層干酪篩網(wǎng)布過(guò)濾。收集經(jīng)洗滌的PCS，并獲得了約880g用過(guò)的洗滌溶液。將所述用過(guò)的洗滌溶液用8. 8ml木聚糖酶(176mg酶蛋白)在50°C處理90分鐘， 接著在90°C進(jìn)行30分鐘以使酶失活。將880g的用過(guò)的洗滌溶液與220g未洗滌的PCS混合，并伴隨攪拌在室溫溫育30分鐘。將來(lái)自PCS的用過(guò)的洗滌溶液通過(guò)8層干酪篩網(wǎng)布擠出，并通過(guò)32層干酪篩網(wǎng)布過(guò)濾。收集經(jīng)洗滌的PCS，并獲得了約770g用過(guò)的洗滌溶液。將所述用過(guò)的洗滌溶液用7. 7ml木聚糖酶(15%ig酶蛋白)在50°C處理90分鐘，接著在90°C 進(jìn)行30分鐘以使酶失活。將770g的用過(guò)的洗滌溶液與192. 5g未洗滌的PCS混合，并伴隨攪拌在室溫溫育30分鐘。將來(lái)自PCS的用過(guò)的洗滌溶液通過(guò)8層干酪篩網(wǎng)布擠出，并通過(guò) 32層干酪篩網(wǎng)布過(guò)濾。收集經(jīng)洗滌的PCS。獲得了三批經(jīng)洗滌的PCS。將經(jīng)洗滌的PCS分為6%初始DS和20g重量的樣品。添加青霉素以供控制細(xì)菌污染。以6mg EP/g纖維素的濃度添加纖維素酶組合物A，并在50°C和pH 5. 0進(jìn)行水解72小時(shí)。作為對(duì)照，如上所述洗滌所述未洗滌的PCS，但用水代替木聚糖酶溶液。獲得了三批經(jīng)洗滌的PCS。在水解之后，通過(guò)HPLC量化可溶性C6糖。結(jié)果示于表1。
表1.通過(guò)HPLC確定的經(jīng)洗滌的PCS
權(quán)利要求
1.一種將含木素纖維素材料轉(zhuǎn)化為水解物的方法，包括下述步驟(a)對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理，(b)在洗滌溶液中洗滌經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料，(c)將用過(guò)的洗滌溶液分離以獲得經(jīng)預(yù)處理和洗滌的含木素纖維素材料，(d)對(duì)經(jīng)預(yù)處理的和洗滌的含木素纖維素材料進(jìn)行處理，導(dǎo)致纖維素和/或半纖維素的至少部分水解，以獲得水解物，和(e)在將步驟(c)的用過(guò)的洗滌溶液再循環(huán)至步驟(b)之前，用木聚糖酶處理該用過(guò)的洗滌溶液。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括將步驟(d)的水解物與發(fā)酵生物相接觸以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求2的方法，包括同時(shí)水解和發(fā)酵。
4.權(quán)利要求2或3的方法，還包括回收發(fā)酵產(chǎn)物。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述木聚糖酶是GHlO木聚糖酶。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述木聚糖酶經(jīng)固定化。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述含木素纖維素材料來(lái)源于選自下組的材料 玉米秸桿、玉米纖維、硬木如楊木和樺木、軟木、谷物稈如麥稈、柳枝稷、稻殼、城市固體廢物、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公室用紙或其混合物。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)中的含木素纖維素材料經(jīng)化學(xué)和/或機(jī)械預(yù)處理。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)步驟(a)中的含木素纖維素材料使用酸進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)中的預(yù)處理是使用有機(jī)酸，優(yōu)選硫酸、 乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物進(jìn)行的酸預(yù)處理。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)中的含木素纖維素材料是用0.1至 2. Owt. %酸，優(yōu)選硫酸進(jìn)行的酸預(yù)處理。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)步驟(a)中的含木素纖維素材料在高溫和/或高壓進(jìn)行機(jī)械預(yù)處理。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)步驟(a)中的含木素纖維素材料通過(guò)蒸汽爆炸、稀酸蒸汽爆炸和/或濕氧化來(lái)預(yù)處理。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)的洗滌溶液包含水、有機(jī)溶劑或水和有機(jī)溶劑的混合物。
15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中將在再循環(huán)的洗滌水溶液中蓄積的溶解糖(i) 導(dǎo)入發(fā)酵步驟(d)并用C5發(fā)酵生物發(fā)酵，或(ii)分離出來(lái)，并用C5發(fā)酵生物發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物質(zhì)工藝，包括從再循環(huán)的洗滌溶液去除和/或失活酶抑制劑。
文檔編號(hào)C12P7/10GK102471759SQ201080029210
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者D.希金斯, 任海彧, 王云, 黃鴻志 申請(qǐng)人:諾維信公司, 諾維信北美公司