專利名稱：用于獲得具有增強的草甘膦耐受性的植物的方法和手段的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及除草劑耐受性植物(更具體地植物如蕓薹屬油料種子植物)領域，這些植物包括指導耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ的定量和定性表達的嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子從而對所述植物賦予增強的對于抑制所述EPSPS的除草劑的耐受性。
背景技術：
N-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種熟知的在廣譜的植物種類上具有活性的除草劑。由于它對莽草酸途徑的抑制作用，草甘膦是植物毒性的，該途經提供了用于合成芳香族氨基酸的前體。草甘膦抑制發(fā)現(xiàn)于植物和一些細菌中的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ。在植物中的草甘膦耐受性可以通過表達修飾的I型EPSPS來實現(xiàn)，該修飾的I型EPSPS對于草甘膦具有較低的親和力而在草甘膦存在下仍然保留它的催化活性。耐草甘膦的EPSPS酶的編碼基因在本領域是熟知的，例如在專利申請EP 0 837944 和美國專利6，566，587中。在植物中的草甘膦耐受性還可以通過表達對草甘膦展現(xiàn)出耐受性的EPSPS酶類(包括II型或III型EPSPS酶類)來實現(xiàn)。在植物中的草甘膦耐受的程度實質上是基于EPSPS酶表達的質量和數(shù)量，即在處于適當發(fā)育階段的適當組織中的足夠數(shù)量的EPSPS表達。這些表達質量和數(shù)量的參數(shù)通過引入到指導EPSPS表達的表達盒中的調控元件來部分地進行控制。一種表達盒必需的調控元件包括啟動子調控序列和終止子調控序列。為了進一步增強表達，表達盒還可以含有以下元件的一種或多種或全部，這些元件選自引導序列或5’ UTR、信號肽或轉運肽、或轉錄激活元件或增強子。在本領域中已經描述了不同的用來提高植物(特別是作物植物，如油菜)中草甘膦耐受嵌合基因的表達的方法。W097/004114描述了一種用于轉化植物的嵌合基因。該基因包括在轉錄方向的至少一個啟動子區(qū)、一個轉基因以及一個調控區(qū)，該調控區(qū)的組成為植物組蛋白基因的非編碼5’區(qū)的至少一個內含子1，它使得能夠在快速生長區(qū)(rapid growth region)中表達蛋白質。WOO1/44457披露了含有不同肌動蛋白內含子序列連同PeFMV啟動子的多種植物表達構建體，用于增強轉基因表達(包括EPSPS)。在WO 07/098042中，描述了單子葉植物啟動子與來自EFl、Act以及ASP基因的雙子葉植物內含子的組合，除了 EPSPS以外，這些基因指導草甘膦氧化還原酶(GOX)和草甘膦乙酰轉移酶的表達。由Chen等人報道了通過CaMV 35S啟動子與EFl α內含子的組合在棉花中增強了 CP4 EPSPS 的表達(2006, Plant Biotechnol J. 4(5) :477-87)。然而，進一步改進在作物植物特別是油菜植物中的草甘膦耐受性是所希望的，并且賦予耐受性增加的可替代嵌合基因或它們的組合是仍然需要的。本發(fā)明通過提供包含組成型啟動子與置換型組蛋白內含子的組合的植物而對本領域作出重要貢獻，該組蛋白內含子指導來自EPSPS編碼區(qū)(如在其中已經優(yōu)化密碼子使用以反映油菜中的密碼子使用的EPSPS編碼區(qū))的耐草甘膦EPSPS酶的表達。包含在這些耐草甘膦嵌合基因中的組蛋白內含子，特別是與如在此所述的密碼子使用優(yōu)化的EPSPS 編碼區(qū)的組合，提供了獲得有效的在作物植物特別是油菜植物中的草甘膦耐受性的替代方法。如在下文在不同的實施方案、實例以及權利要求書中所述解決了這一問題。 發(fā)明概述本發(fā)明總體上涉及通過增加耐草甘膦的EPSPS酶的表達質量和數(shù)量而具有增強的草甘膦耐受性的植物，該表達是由一種植物可表達的組成型啟動子和一種置換型組蛋白基因的內含子1指導的。本發(fā)明還提供了用來產生耐草甘膦的植物的嵌合DNA分子或基因、 以及處理本發(fā)明的這些植物的方法。在一個第一實施方案中，提供了包含嵌合DNA分子的多種植物，其中該嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段
a)一種植物可表達的組成型啟動子；
b)一個編碼5，UTR的DNA區(qū)；
c)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區(qū)；
d)一個編碼轉運肽的DNA區(qū)；
e)一個編碼耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ的DNA區(qū)；以及
f)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該植物可表達的組成型啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子。在又另一個第一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這些植物另外地包括一種第二嵌合 DNA分子，所述第二嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段
a)一個擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子序列；
b)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區(qū)；
c)一個編碼轉運肽的DNA區(qū)；
d)一個編碼耐草甘膦的EPSPS的DNA區(qū)；以及
e)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)。在一個另外的實施方案中，該組蛋白H4啟動子序列包含全長H4A748啟動子，更具體地是來自SEQ ID no. 6的從6166至7087位的核苷酸(nt)序列。根據(jù)另一個實施方案，該內含子1編碼DNA區(qū)包含選自下組的一個核苷酸序列，該組由基因庫登錄號X60429. 1或U09458. 1組成。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該編碼耐草甘膦的EPSPS的DNA區(qū)的核苷酸序列適合于歐洲油菜的密碼子使用。在又另一個實施方案中，本發(fā)明的這些植物是蕓薹屬植物，更具體地是油菜，甚至更具體地是歐洲油菜、蕪菁、小白菜或芥菜。本發(fā)明還提供了包含這些嵌合基因的本發(fā)明的這些植物的種子和植物細胞、連同這些嵌合DNA分子它們本身以及包含這些基因的克隆和/或表達載體。本發(fā)明還涉及用抑制除草劑(更具體地是草甘膦)的EPSPS處理植物的方法，其中所述植物對于施用至少2. Okg活性成分/公頃的草甘膦是耐受的，盡管可以施用顯著更低濃度的有效成分。 附圖簡要說明

圖1 :A組不同草甘膦耐受嵌合基因以及它們的組合的示意圖。P35S-2 =CaMV 35S 啟動子；cab22L 來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列；TpotPc-lPc 優(yōu)化的轉運肽，含有玉米和向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，適合于歐洲油菜的密碼子使用；2mEPSPS-lI^a 玉米的雙突變5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因，適合于歐洲油菜的密碼子使用；3' nos 來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的 3，UTR ；Ph4a748-Narl 擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子的NarI片段；intronlh3 擬南芥屬的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子；3' his 擬南芥的組蛋白H4基因的 3' UTR ；Ph4a748 擬南芥的組蛋白H4基因的全長啟動子。
B組噴施2. Okg/公頃的活性成分草甘膦10天之后的含有在此所述的草甘膦耐受嵌合基因的轉基因歐洲油菜植物。 發(fā)明詳述本發(fā)明是基于這樣的觀察，即在包含組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)的嵌合基因中包括來自一種植物的置換型組蛋白基因的內含子1顯著改進了包含這樣的基因的轉基因植物的草甘膦耐受性(當與包含相應的缺乏這樣的內含子序列的嵌合基因的轉基因植物比較時)。而且，諸位發(fā)明人還觀察到，相比于在其中使用類似的源于單子葉植物的EPSPS編碼區(qū)的植物，在油菜植物中使用針對密碼子使用進行優(yōu)化的EPSPS編碼區(qū)提供了更好的草甘膦耐受性?？梢酝ㄟ^包括一種第二草甘膦耐受嵌合基因來進一步改進草甘膦耐受性，其中一個啟動子如組蛋白H4啟動子(H4A748)可操作地連接到置換型組蛋白基因的內含子1以及一個EPSPS編碼區(qū)上。與以前觀察的科學報告(Chaubet-Gigot等人， 2001Plant Mol Biol. 45(1) 17-30)相反，其中描述了 H4A748啟動子的截短NarI片段與置換型組蛋白內含子1的組合優(yōu)于全長H4A748啟動子與置換型組蛋白內含子1的組合(如描述于W01997/004114中)，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)相比于該截短型式，全長型式的啟動子與EPSPS 的組合對于含有這樣的嵌合分子的植物賦予了更好的草甘膦耐受性。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有嵌合DNA分子的耐草甘膦植物，其中該嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段
a)一種植物可表達的組成型啟動子；
b)一個編碼5，UTR的DNA區(qū)；
c)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區(qū)；
d)一個編碼轉運肽的DNA區(qū)；
e)一個編碼耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的DNA區(qū)；以及
f)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)。如在此使用的“嵌合DNA分子”旨在表示包括不同起源的多個連接的DNA片段的 DNA分子。作為舉例，一個嵌合DNA分子可以包括一個連接到植物編碼序列上的病毒啟動子。該術語嵌合基因或嵌合DNA分子還可以與術語轉基因或重組DNA分子互換地使用。如在此使用的，術語嵌合基因、分子是指其中在自然中在這種布置中本來沒有發(fā)現(xiàn)不同元件的并且是人造的或已經人造的DNA分子。如在此使用的“包含”將被解釋為規(guī)定如所提到的陳述的這些特征、整體、步驟或部件的存在，但是并不排除一個或多個特征、整體、步驟或部件、或它們的組的存在或加入。 因此，例如一個包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質可以包含除了實際引用的那一個之外的多個核苷酸或氨基酸，即，它們被包埋在較大的核酸或蛋白質中。一個包含功能上或結構上定義的DNA區(qū)的嵌合基因可以包含另外的DNA區(qū)等。用語“可操作地連接”表示所述嵌合基因的元件以這樣一種方式互相連接，即它們的功能被協(xié)調并且允許該編碼序列的表達。作為舉例，一個啟動子被功能地連接到一個編碼序列上(當它能夠確保所述編碼序列的轉錄以及最終表達時)。如在此使用的，一種“植物可表達的組成型啟動子”是一種能夠在植物細胞以及植物中起到指導在大多數(shù)細胞類型中的高水平表達(以不依賴時空的方式)作用的啟動子。實例包括細菌啟動子，如來自土壤桿菌屬的章魚堿合成酶(0CQ和胭脂堿合成酶 (NOS)啟動子，而且還有病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S或19S RNA基因的啟動子(Odell等人，1985，Nature. 6 ；313 (6005) :810-2)、木薯葉脈花葉病毒的啟動子(CsVMV ； W097/48819)、甘蔗桿狀DNA病毒(ScBV)啟動子(Samac 等人，2004，Transgenic Res. 13(4) 349-61)、玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Sanger 等人，1990，Plant Mol Biol. 14(3) :433-43) 以及地三葉斑點病毒啟動子4號或7號WO 96/06932)。在植物起源的啟動子中，提及的啟動子有核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基啟動子(US 4962028)；玉米、水稻以及甘蔗的泛素啟動子；水稻肌動蛋白1啟動子(Act-I)以及玉米醇脫氫酶1啟動子(Adh-I)(來自 http://www. patentlens. net/daisy/promoters/242.html)0根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該植物可表達的組成型啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，更具體地來自SEQ ID 2的從2352至2770位的核苷酸(nt)的核苷酸序列。內含子是在前體mRNA中存在但是在經過精確剪接機制切除之后的成熟RNA中缺乏的間插序列。天然內含子增強基因表達的能力，一個被稱為內含子介導的增強效應 (intron-mediated enhancement, IME)的過程，在不同的生物(包括哺乳動物、昆蟲、線蟲以及植物)中是已知的(W007/098042，pll_12)。IME通常被描述為通過穩(wěn)定轉錄物而導致基因表達增加的一種轉錄后機制。在正常方向上要求該內含子位于啟動子與編碼序列之間。然而，已經描述了一些內含子作為啟動子或作為位置和方向非依賴性轉錄增強子起作用來影響翻譯(Chaubet-Gigot 等人，2001，Plant Mol Biol. 45(1) 17-30，p27_28)。含有這樣的內含子的基因的實例包括玉米蔗糖合成酶基因(Clancy and Hannah, 2002,Plant Physiol. 130(2) :918-29)、玉米醇脫氫酶-1 (Adh-I)和Bronze-1 基因(Callis 等人 1987Genes Dev. 1 (10) :1183-200 ;Mascarenhas 等人 1990，Plant Mol Biol. 15(6) 913-20)、來自苜蓿的置換型組蛋白H3基因(Keleman等人2002Transgenic Res. 11(1) 69-72)亦或擬南芥的置換型組蛋白H3(組蛋白H3. 3樣)基因(Chaubet-Gigot等人，2001， Plant Mol Biol. 45(1) :17-30)。如在此使用的，一種“植物置換型組蛋白基因的內含子1”涉及在置換型組蛋白編碼基因的5’非翻譯區(qū)(UTR)中的內含子。置換型組蛋白的作用是修復跨轉錄基因的核小體染色質結構(Waterborg等人，1993，J Biol Chem. 5 ；268 (7) :4912-7)，與復制型組蛋白相反，復制型組蛋白介導在S-期的核小體的組裝并且將這樣的組蛋白基因的轉錄激活限制在該 S-期(Atanassova 等人，1992，Plant J. 19922(3) :291-300)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該編碼組蛋白置換基因的內含子1的核苷酸序列是源于擬南芥的組蛋白H3. III變體基因或源于紫花苜蓿的組蛋白H3. 2基因。更具體地，該內含子1編碼DNA區(qū)可以包含選自下組的一個核苷酸序列，該組由基因庫登錄號X60429. 1 或U09458.1組成(在此通過引用進行結合)。更具體地，該內含子1編碼DNA區(qū)包括SEQ ID no. 9的692至1100核苷酸或四84至3064核苷酸或SEQ ID no. 10的555至668核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，該術語“EPSPS”是旨在表示任何天然或突變的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，其酶活性在于從磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸合成 5-0-(1-羧基乙烯基)-3-磷酸莽草酸(EC 2. 5. 1. 19 ；Morell et al.，1967，J. Biol. Chem. M2 :82-90)。具體而言，所述EPSPS酶可以起源于任何類型的生物。適合于本發(fā)明的 EPSPS酶還具有對于膦酰基甲基甘氨酸家族除草劑尤其是對于草甘膦是耐受性的特性。對于膦?；谆拾彼峒易宄輨┯绕涫遣莞熟?，天然耐受的或像這樣使用的編碼EPSPS的序列是已知的。作為舉例，可以提及的是細菌鼠傷寒沙門氏菌的AroA基因的序列(Comai等人，1983，Science 221 :370-371)、細菌土壤桿菌屬的CP4基因的序列(W0 92/04449)、或編碼牽牛屬 EPSPS (Shah 等人，1986，Science 233 :478-481)、 番茄 EPSPS (Gasser 等人，1988，J. Biol. Chem. 263 :4280-4289)、或 g 蟀草屬 EPSPS(W) 01/66704)的基因的序列?？梢酝ㄟ^突變而使編碼EPSPS的序列對草甘膦耐受也是已知的。作為舉例，可以提及編碼突變的 AroA EPSPSGtalker 等人，1985，J. Biol. Chem. 260(8) :4724-47 )、或突變的大腸桿菌 EPSPS (Kahrizi 等人，2007，Plant Cell Rep. 26(1) :95-104)的基因的序列。植物起源的突變的EPSPS酶的實例包括具有在位置80與120之間的丙氨酸至甘氨酸的置換以及在位置170與210之間的蘇氨酸至丙氨酸的置換的雙重突變型Qm)EPSPS(例如EP0293358、WO 92/06201)以及具有在位置102和106處的氨基酸置換的不同的雙重突變型(例如，US6566587、W004/074443)。編碼對草甘膦耐受的EPSPS的序列進一步包括在W02008/100353、 W02008/002964、W02008/002962、W02007/146980、W02007/146765、W02007/082269、 102007/0648 或 W02006/110586 中描述的那些。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，編碼耐草甘膦的EPSPS的基因的序列可以是描述于專利申請EP 0837944中的編碼玉米EPSPS的序列，包含在102位氨基酸以異亮氨酸取代蘇氨酸的一個第一突變、以及在106位氨基酸以絲氨酸取代脯氨酸的一個第二突變。更具體地，所述編碼EPSPS的DNA區(qū)編碼SEQ ID no. 8的氨基酸序列。由于在這些EPSPS之間 (更具體地在植物EPSPS之間)的強的序列同源性，帶有同樣突變的水稻EPSPS也已經描述于專利申請WO 00/66746和WO 00/66747中。一般而言，帶有上述蘇氨酸/異亮氨酸和脯氨酸/絲氨酸突變的任何EPSPS、以及編碼它們的基因，無論這些氨基酸就玉米EPSPS的位置102和106而言的相對位置如何，都可以在本發(fā)明中使用。為了應用這個原理，本領域的技術人員將容易地能找到有待在任何EPSPS序列中通過使用序列比對標準技術進行突變的兩種氨基酸。熟知的是不同的生物經常顯示出針對若干編碼相同氨基酸的密碼子的特殊偏好性。人們認為優(yōu)選的密碼子的存在可能有助于實現(xiàn)更快的翻譯速率和高準確度。Lutz等人(2001, Plant Physiol. 125(4) :1585-90)報告了一種密碼子優(yōu)化的細菌bar基因在煙草中的增強表達。Peng等人(2006,Plant Cell Rep. 25(2) :124-32)證明了源于黑曲霉的轉基因在低芥酸菜籽中的表達可以通過根據(jù)蕓薹屬密碼子使用改變該序列而改進。然而，這樣的策略是否在一個特殊的情況下起作用仍然是不可預知的。例如，WO 08/024372報告了來自Bacillus deramificans的支鏈淀粉酶編碼區(qū)的密碼子優(yōu)化并不導致在地衣芽孢桿菌中支鏈淀粉酶產生的增加。此外，Gregersen 等人(2005, Transgenic Res. 14(6) :887-905) 描述了用于在小麥中表達的熏煙色曲菌植酸酶基因的密碼子優(yōu)化對總的基因表達沒有顯著作用。然而，如在此所述，在植物(如油菜植物)中的草甘膦耐受嵌合基因的表達的進一步改進可以過通過根據(jù)旨在過表達的植物的密碼子使用來優(yōu)化編碼將要表達的蛋白質的序列來實現(xiàn)。因此，在另一個實施方案中，已經針對歐洲油菜的密碼子使用優(yōu)化了該編碼耐草甘膦的EPSPS的核苷酸序列，從而實現(xiàn)以下標準
a)對于每個氨基酸的密碼子使用的總百分比相應于如同對于歐洲油菜所觀察的那
些；
b)該核苷酸序列具有大于的AT含量；
c)該核苷酸序列不包含5’或3’隱蔽剪接位點或選自下組的核苷酸序列，該組由以下各項組成AAGGTAAGT、AAGGTAA、AGGTAA 或 TGCAG ；并且
d)該核苷酸序列不包含多腺苷酸化信號或選自下組的核苷酸序列，該組由以下各項組成CATAAA、AACCAA、ATTAAT、AAAATA、AATTAA、AATACA。本領域的技術人員將清楚的是，為了克隆的目的，關于某些限制性內切酶的識別序列的存在或缺乏可以對該核苷酸序列進行修改，而仍然實現(xiàn)上述標準。根據(jù)一個具體的實施方案，該編碼耐草甘膦的EPSPS的核苷酸序列包含SEQ ID no. 1的第997至第2334位的核苷酸。本領域的技術人員還將清楚的是，可以進一步修改該示例性的核苷酸序列，而仍然以100個核苷酸、75個核苷酸、50個核苷酸、40個核苷酸、30個核苷酸、20個核苷酸、10 個核苷酸或5個核苷酸編碼耐草甘膦的EPSPS酶，而仍然實現(xiàn)上述標準。因此，在另一個實施方案中，已經針對歐洲油菜的密碼子使用優(yōu)化了該編碼耐草甘膦的EPSPS的核苷酸序列。更具體地，所述編碼EPSPS的DNA區(qū)包含SEQ ID no. 1的從997位至23；34位的核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的植物在它的嵌合DNA分子中進一步包含可操作地連接的編碼5，非翻譯區(qū)(UTR)的DNA區(qū)。如在此使用的，一個5’ UTR,也被稱為弓I導序列，是信使RNA (mRNA)的一個特殊區(qū)域，它位于該編碼區(qū)的轉錄起始位點與起始密碼子之間。它涉及mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的效率。例如，35S轉錄起始位點的牽牛葉綠素a/b結合蛋白基因下游的5'非翻譯前導序列可以用來增進報道基因表達的穩(wěn)態(tài)水平(Harpster等人，1988，Mol Gen Genet. 212(1) 182-90)。W095/006742描述了使用源于編碼熱休克蛋白的基因的5'非翻譯前導序列來增加轉基因表達。
在本發(fā)明的一個另外的實施方案中，該編碼5’ UTR的DNA區(qū)可以包含來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列，更具體地是SEQ ID no. 2的從2283位至2351位的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，該嵌合DNA分子還包含一個編碼轉運肽或信號肽的亞細胞尋址序列 (subcellular addressing sequence)。位于該編碼EPSPS的核酸序列的上游或下游的這樣一個序列，使得有可能指導所述EPSPS特異性地進入宿主生物的細胞區(qū)室中。根據(jù)一個具體的實施方案，在轉錄方向上該轉運肽包含至少一個植物基因的信號肽序列，它編碼指導將多肽轉運到質體中的信號肽，當?shù)谝恍盘栯谋坏鞍姿饷盖懈顣r產生了植物基因的成熟N末端部分的序列的一部分，以及編碼指導將多肽轉運到質體的亞區(qū)室中的信號肽的植物基因的第二信號肽。該信號肽序列優(yōu)選地源于根據(jù)EP0508909的針對核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亞基的基因。更具體地，編碼該轉運肽的DNA區(qū)編碼SEQ ID no. 7的氨基酸序列。根據(jù)又另一個實施方案，同樣已經針對歐洲油菜的密碼子使用將編碼該轉運肽的核苷酸序列進行了優(yōu)化，更具體地包含SEQ ID no. 1的從2335位至2706位的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明認為可以使用的特異性轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)是不重要的并且可以使用本領域已知的具有類似作用的任何這樣的序列。作為非限制性實例，可以提到編碼根癌農桿菌胭脂堿合成酶的基因的nos終止序列(Bevan et al.，1983，Nucleic Acids Res. 11(2) ；369-385)、或如申請EP 0 633 317中所描述的組蛋白基因的his終止序列。本發(fā)明還涉及另外含有一種第二嵌合DNA分子的植物，其中該第二嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段
a)擬南芥的組蛋白H4基因的一個啟動子序列；
b)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區(qū)；
c)一個編碼轉運肽的DNA區(qū)；
d)一個編碼耐草甘膦的EPSPS的DNA區(qū)；以及
e)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)。擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子(H4A748)驅動在S-期的強優(yōu)先表達以及分生組織特異性表達譜，而在非分裂細胞中保持基礎表達(Atanassova等人，1992，Plant J. 19922(3) :291-300)。然而，或者擬南芥的置換型組蛋白H3基因的5，UTR內含子添加到這種細胞周期依賴性啟動子導致高的分生組織非依賴性報告基因表達。特別地，相比于帶有該內含子的全長H4A748啟動子，這種啟動子的截短NarI片段與內含子1的結合引起了在芽和根中的甚至3-4倍的更高的報告基因表達水平(Chaubet-Gigot等人，2001 Plant Mol Biol. 45(1) :17_30，圖 4)。根據(jù)另一個實施方案，擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子序列包含全長H4A748序列，更具體地是SEQ ID no. 6的從6166位至7087位的核苷酸(nt)。在另一個實施方案中，該第二嵌合DNA分子還包含編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的一個DNA區(qū)、編碼轉運肽的一個DNA區(qū)、編碼耐草甘膦的EPSPS的一個DNA區(qū)以及一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)。這些DNA區(qū)如在本申請中的別處所描述是類似的。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的植物是一種蕓薹屬植物，更優(yōu)選一種油菜植物。如在此使用的“油菜”是指歐洲油菜、蕪菁、小白菜或芥菜中的任何一種。
然而，本領域的技術人員將會清楚的是，在此描述的這些方法和手段被認為適合于所有的植物細胞和植物，即雙子葉和單子葉植物細胞和植物兩者，包括但不局限于棉花、 蕓薹屬植物、油菜、小麥、玉米或玉蜀黍、大麥、苜猜、花生、向日葵、水稻、燕麥、甘蔗、大豆、 草坪草、大麥、黑麥、高粱、甘蔗、蔬菜(包括菊苣、萵苣、番茄、西葫蘆、甜椒、茄子、黃瓜、甜瓜、洋蔥、韭蔥)、煙草、馬鈴薯、甜菜、木瓜、菠蘿、芒果、擬南芥，而且還有用于園藝、花卉栽培或林業(yè)(白楊、冷杉、桉樹，等)的植物。提供含有根據(jù)本發(fā)明的嵌合DNA分子的植物細胞也是本發(fā)明的一個實施方案。通過傳統(tǒng)方法產生的包含本發(fā)明的嵌合DNA分子的植物的子代或雜種的配子、種子、胚芽(合子的或體細胞的)同樣包括在本發(fā)明的范圍之內。本發(fā)明的另一個目的是如在此描述的嵌合DNA分子或包含這樣的嵌合DNA分子的用于轉化植物的克隆和/或表達載體?？梢詫⒏鶕?jù)本發(fā)明的嵌合DNA分子以常規(guī)方式穩(wěn)定地插入到單個植物細胞的核基因組中，并且可以按常規(guī)方式來使用如此轉化的植物細胞以產生具有增強的草甘膦耐受性的轉化植物。在這點上，在根癌農桿菌中可以使用含有一個或多個嵌合DNA分子的T-DNA 載體來轉化植物細胞，并且此后使用例如在EP 0 116 718, EP 0 270 822, WO 84/(^913和公開的歐洲專利申請EP 0242 246中以及在Gould等人的(1991，Plant Physiol. 95 (2) 426-434)中所述的程序從該轉化的植物細胞再生一種轉化的植物。構建用于農桿菌介導的植物轉化的T-DNA載體是本領域是熟知的。T-DNA載體可以或者是一種如描述于EP 0 120 561和EP 0 120 515中的二元載體亦或是一種如描述于EP 0 116 718中的通過同源重組整合進入農桿菌Ti質粒的共整合載體。優(yōu)選的T-DNA載體各自含有一個可操作地連接到轉錄的DNA區(qū)的啟動子，該轉錄的DNA區(qū)位于T-DNA邊界序列之間、或至少位于該右邊界序列的左邊。邊界序列描述于Gielen等人的(1984，EMBO J. 3 (4) :835-46)中?？梢允褂靡阎姆椒?，如電穿孔或三親本交配，來進行將T-DNA載體導入農桿菌中。當然，可以使用其他類型的載體使用以下程序來轉化植物細胞，如直接基因轉移(如描述于，例如在 EP 0223247中)、花粉介導的轉化(如描述于，例如在EP 0270356和WO 85/01856中)、原生質體轉化(如描述于，例如在US 4684611中)、植物RNA病毒介導的轉化(如描述于，例如在EP 0067553和US 4407956中)、脂質體介導的轉化(如描述于，例如在US 4536475 中)、以及其他方法，如最近描述的用于轉化某些玉米(例如，US 6140553 ;Fromm等人， 1990, Biotechnology (N Y) · 8 (9) :833-9 ；Gordon-Kamm 等人，1990，Plant Cell. 19902(7) 603-618)和水稻(Shimamoto 等人，1989，Tanpakushitsu Kakusan Koso. 34(14) :1873-8) 系的方法以及通常用于轉化單子葉植物的方法(W092/09696)。對于棉花轉化，特別優(yōu)選的是描述于PCT專利公開WO 00/71733中的方法。對于水稻轉化，可以參考描述于WO 92/09696、WO 94/00977以及WO 95/06722中的這些方法。這些生成的轉化植物可以用于常規(guī)的植物育種方案中以產生更多的具有增加的草甘膦耐受性的轉化植物。在另一個實施方案中，提供了一種用抑制EPSPS的除草劑(更具體地是草甘膦) 處理本發(fā)明的這些植物的方法。甚至更具體地，這種方法的這些植物對于施用2. Okg/公頃的草甘膦是耐受的。在另一個實施方案中，提供了本發(fā)明的嵌合DNA分子用于獲得耐草甘膦的植物的用途。
可以用以下化合物的至少一種來處理根據(jù)本發(fā)明的植物。根據(jù)本發(fā)明的這些植物和種子可以用一種化合物，如選自以下清單的一種化合物進行進一步處理
a.水果/蔬菜除草劑類莠去津、除草定、敵草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西瑪津、氟樂靈、吡氟禾草靈、草丁膦、Gowan氯吡嘧磺隆、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺andaziflam)
b.水果/蔬菜殺蟲劑類涕滅威、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿巴美丁、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ -三氟氯氰菊酯、滅螨醌、聯(lián)苯胼酯、甲氧蟲酰胼、雙苯氟脲、環(huán)蟲酰胼、噻蟲啉、 呋蟲胺、嘧螨酯、季酮螨酯、Y-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多殺菌素、氯蟲酰胺、溴氰蟲酰胺、殺鈴脲、螺蟲乙酯、吡蟲啉、氟蟲酰胺、硫雙威、氰氟蟲腙、氟啶蟲胺腈、丁氟螨酯、殺螨劑 (Cyanopyrafen)、噻蟲胺、噻蟲嗪、乙基多殺菌素、硫雙威、氟啶蟲酰胺、滅蟲威、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽、茚蟲威、苯線磷、蚊蠅醚、苯丁錫
c.水果/蔬菜殺真菌劑類辛唑嘧菌胺、嘧菌酯、苯噻菌胺、啶酰菌胺、克菌丹、多菌靈、百菌清、銅、氰霜唑、環(huán)氟菌胺、霜脲氰、環(huán)唑醇、嘧菌環(huán)胺、苯醚甲環(huán)唑、達滅芬 (Dimetomorph)、二噻農、咪唑菌酮、環(huán)酰菌胺、氟啶胺、咯菌酯、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟苯吡菌胺(Fluxapyroxad)、滅菌丹、福賽得(Fosetyl)、異菌脲、丙森鋅、萘吡菌胺(Isopyrazam)、醚菌酯、代森錳鋅、雙炔酰菌胺、甲霜靈/精甲霜靈、代森聯(lián)、苯菌酮、滅克落、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威、丙環(huán)唑、甲代森鋅、丙氧喹啉、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、喹氧靈、葚孢菌素、硫磺、戊唑醇、甲基硫菌靈、肟菌酯
d.谷類除草劑2.4-二氯苯氧基乙酸、酰嘧磺隆、溴苯腈、唑酮草酯、綠麥隆、氯磺隆、 炔草酯、二氯吡啶酸、麥草畏、禾草靈、吡氟草胺、噁唑禾草靈、雙氟磺草胺、氟唑磺隆、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆、氟草煙、呋草酮、草甘膦、碘磺隆(iodosulfuron)、碘化腈、異丙隆、2-甲基-4-氯-苯氧基乙酸(mcpa)、甲磺胺磺隆、甲磺隆、二甲戊樂靈、唑啉草酯、丙苯磺隆、芐草丹、甲氧磺草胺、磺酰磺隆、噻吩磺隆、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟樂靈、三氟甲磺隆
e.谷類殺真菌劑嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、環(huán)氟菌胺、環(huán)唑醇、嘧菌環(huán)胺、二甲苯氧菌胺、氟環(huán)唑、苯銹啶、芬普福、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟苯吡菌胺(Fluxapyroxad)、萘吡菌胺(Isopyrazam)、醚菌酯、葉菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鮮胺、丙環(huán)唑、丙氧喹啉、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、苯氧喹啉、螺環(huán)菌胺、戊唑醇、甲基硫菌靈、肟菌酯
f.谷類殺蟲劑樂果、高效氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalthrin)、溴氰菊酯、順式氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)、β -氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、丁諾特呋喃(Dinetofuran)、Clorphyriphos、抗蚜威、甲硫威、氟啶蟲胺腈
g.玉蜀黍除草劑類莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麥草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草丁膦、草甘磷、異惡唑草酮、(S-)異丙甲草胺、硝草酮、煙嘧磺隆、氟嘧磺隆、玉嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、Tembo三酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、噻烯卡巴腙、氟噻草胺、派羅克殺草砜(Pyroxasulfon)
h.玉蜀黍殺蟲劑類克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯、氟蟲腈、吡蟲啉、λ-三氟氯氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻蟲嗪、噻蟲胺、螺甲螨酯、氟蟲酰胺、殺鈴脲、氯蟲酰胺、溴氰菊酯、硫雙威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、虱螨脲、丁基嘧啶磷(Tebupirimphos)、乙蟲腈、溴氰蟲酰胺、噻蟲啉、啶蟲脒、丁諾特呋喃、阿維菌素
i.玉蜀黍殺真菌劑類嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、環(huán)唑醇、二甲苯氧菌胺、氟環(huán)唑、種衣酯(Fenitropan)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟苯吡菌胺(Fluxapyroxad)、萘吡菌胺 (Isopyrazam)、葉菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯
j.水稻除草劑類丁基拉草、敵稗、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氰氟草酯、殺草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻酰草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、殺草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、噁嗪草酮、雙環(huán)磺草酮、環(huán)酯草醚、五氟磺草胺、雙草醚、 丙炔惡草酮、乙氧嘧磺隆、瑞飛特、硝草酮、莊無忌(Tefuryltrione)、噁草酮、噁唑禾草靈、 嘧磺草胺(Pyrimisulfan)
k.水稻殺蟲劑類二嗪磷、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、丁諾特呋喃、氟蟲腈、吡蟲啉、 異丙威、噻蟲啉、環(huán)蟲酰胼、噻蟲胺、乙蟲腈、氟蟲酰胺、溴氰菊酯、啶蟲脒、硫雙威、噻蟲嗪、 溴氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽、氯氰菊酯、毒死蜱、依芬普司、克百威、丙硫克百威、氟啶蟲胺腈
1.水稻殺真菌劑類嘧菌酯、多菌靈、環(huán)丙酰亞胺、雙氯氰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、敵瘟磷、 嘧菌腙、慶大霉素、己唑醇、惡霉靈、異稻瘟凈(IBP)、稻瘟靈、異噻菌胺、春雷霉素、代森錳鋅、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、烯丙苯噻唑、丙環(huán)唑、丙森鋅、咯喹酮、戊唑醇、甲基托布津、噻酰菌胺、三環(huán)唑、肟菌酯、有效霉素
m.棉花除草劑類敵草隆、伏草隆、甲基胂酸單鈉鹽(MSMA)、乙氧氟草醚、撲草凈、氟樂靈、氟唑草酮、烯草酮、穩(wěn)殺得、草甘膦、氟草敏、二甲戊樂靈、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草丁膦、丙炔氟草胺、賽苯隆
η.棉花殺蟲劑類乙酰甲胺磷、涕滅威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿巴美丁、啶蟲脒、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉、茚蟲威、λ-氯氟氰菊酯、多殺菌素、硫雙威、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶蟲丙醚、氟啶蟲酰胺、氟蟲雙酰胺、殺鈴脲、氟蟲酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺蟲乙酯
ο.噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、丁諾特呋喃、氟蟲雙酰胺、溴氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、Y-三氟氯氰菊酯、4-[[(6_氯吡啶-3-基)甲基](2，2_ 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5Η)-酮硫雙威、除蟲菌素、氟啶蟲酰胺、啶蟲丙醚、螺甲螨酯、氟啶蟲胺腈
P.棉花殺真菌劑類嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、銅、環(huán)唑醇、苯醚甲環(huán)唑、二甲苯氧菌胺、氟環(huán)唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、異菌脲、萘吡菌胺(Isopyrazam)、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙森鋅、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、五氯硝苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基托布津、肟菌酯
q.大豆除草劑類甲草胺、滅草松、氟樂靈、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、噁唑禾草靈、氟磺胺草醚、吡氟樂草靈、草甘膦、甲氧咪草煙、滅草喹、咪草煙、(S-)異丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊樂靈、醌肟草、草丁膦
r.大豆殺蟲劑類λ-三氟氯氰菊酯、硫雙威、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、丁諾特呋喃、氟蟲雙酰胺、氟蟲酰胺、溴氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽、氟蟲腈、乙蟲清、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、Y三氟氯氰菊和λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6_氯吡啶-3-基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5Η)-酮、螺蟲乙酯、螺螨酯(Spinodiclofen)、殺鈴脲、氟啶蟲酰胺、硫雙威、β -氟氯氰菊酯
s.大豆殺真菌劑類嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、銅、環(huán)唑醇、苯醚甲環(huán)唑、二甲苯氧菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟苯吡菌胺、萘吡菌胺(Isopyrazam)、異菌脲、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳、葉菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙環(huán)唑、丙森鋅、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、氟醚唑、甲基托布津、肟菌酯 t.甜菜除草劑類氯草敏、甜菜安、乙氧呋草黃、甜菜寧、野麥畏、克草立特、吡氟禾草靈、環(huán)草定、苯嗪草酮、氯甲喹啉酸、噻草酮、氟胺磺隆、醌肟草、喹禾靈(Quizalofop)
u.甜菜殺蟲劑類吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、丁諾特呋喃、溴氰菊酯、 β-氟氯氰菊酯、Υ/λ三氟氯氰菊酯、4-[[(6_氨基吡啶-3-基)甲基](2，2_ 二氟乙基) 氨基]呋喃-2 (5Η)-酮、七氟菊酯、氟蟲酰胺、溴氰蟲酰胺、氟蟲腈、克百威
v.低芥酸菜籽除草劑類滅草松、禾草靈、吡氟樂草靈、草丁膦、草甘膦、吡唑草胺、氟樂靈、胺苯磺隆、氯甲喹啉酸、喹禾靈(Quizalofop)、烯草酮、醌肟草
w.低芥酸菜籽殺真菌劑類嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、環(huán)唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟苯吡菌胺、異菌脲、萘吡菌胺 (Isopyrazam)、縮節(jié)胺、葉菌唑、苯氧菌胺、多效唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鮮胺、丙硫菌唑、 吡唑醚菌酯、戊唑醇、甲基托布津、肟菌酯、乙烯菌核利
χ.低芥酸菜籽殺蟲劑克百威、噻蟲啉、溴氰菊酯、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、啶蟲脒、丁諾特呋喃、β-氟氯氰菊酯、Y和λ三氟氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、乙蟲清、多殺菌素、乙基多殺菌素、氟蟲雙酰胺、氟蟲酰胺、溴氰蟲酰胺、4-[[(6_氨基吡啶-3-基)甲基](2，2_二氟乙基)氨基]呋喃-2(5Η)_酮具體而言，可以通過應用如以上清單中所指出的低芥酸菜籽除草劑類、低芥酸菜籽殺真菌劑類或低芥酸菜籽殺蟲劑類的化合物中的至少一種處理蕓薹屬植物。本發(fā)明另外提供了用于產生抗草甘膦蕓薹屬植物及其種子的方法，包括以下步驟使主要組成為包含如在此所述的一種或二種嵌合DNA分子的植物細胞的一種植物與另外一種植物或與它自身雜交，其中該方法可以進一步包括鑒定或選擇包含根據(jù)本發(fā)明的這些嵌合基因的子代植物或種子、和/或施用一個有效量的抑制EPSPS的化合物(如草甘膦) 并且采收種子。還提供的是一種用于從包含根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因或多種嵌合基因的蕓薹屬植物生產油或種子粉的方法，包括本領域已知的用于從油菜植物的種子提取和加工油的步
馬聚ο本發(fā)明還提供了一種用于增加植物尤其是蕓薹屬植物中的草甘膦耐受性的方法， 包括以下步驟獲得包含如在本申請中別處所述的一種嵌合基因或多種嵌合基因的蕓薹屬植物，并且在大田中種植所述蕓薹屬植物。以下非限制性實例描述了用于增加根據(jù)本發(fā)明的植物中的除草劑耐受性的方法和手段。除非在實例中另外說明，所有的重組DNA技術是根據(jù)如Sambrook等人在(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and in Volumes I and2 of Ausubel et al. (1994)Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ( ) 43^ + ' ^ 的。用于植物分子操作的標準材料和方法描述于由R. D. D. Croy著述的由BIOS ScientificPublications Ltd (英國)和 Blackwell Scientific Publications (英國)聯(lián)合出版的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中。其他的針對標準分子生物學技術的參考包括 Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press(英國)。針對聚合酶鏈式反應的標準材料和方法可以發(fā)現(xiàn)于 Dieffenbach 和 Dveksler 的(1995) PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in McPherson at al. (2000) PCR-Basics :From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany 中。貫穿本說明書和實例，可以參考以下序列
SEQ ID No. 1 載體pTJN47的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. 2 載體pTJN50的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. 3 載體pTJN51的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. 4 載體pTJN48的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. 5 載體pTJN49的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. 6 載體pTJN75的T-DNA的核苷酸序列 SEQ ID No. :7 優(yōu)化的轉運肽TPotp C-IPc的的氨基酸序列 SEQ ID No. 8 :2mEPSPS-lPa 的氨基酸序列
SEQ ID No. 9 針對H3. 3樣組蛋白變體的擬南芥H3基因1和H3基因2的核苷酸序列 (X60429. 1)。
SEQ ID No. 10 紫花苜蓿栽培品種主組蛋白H3. 2基因的核苷酸序列(U09458. 1) 實例
實例1 嵌合DNA分子的構建圖IA提供了根據(jù)本發(fā)明的嵌合DNA分子的實例。這些分子并不被解釋為可以組裝的最佳構建體，但是僅僅用作針對本領域的熟練技術人員的實例。使用常規(guī)的重組DNA技術構建了以下T-DNA表達載體(pTJN47、pTJN50、pTJN51、 PTJN48、pTJN49、pTJN75)，這些載體包含以下可操作地連接的DNA片段pTJN47
a)Ph4a748-NarI包括擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子區(qū)的序列(Chabout6等人， 1987，Plant Mol. Biol. 8，179-191)
b)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992, J Mol Biol 225 :569-574)
c)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus arrnuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人的 (1996, U. S. patent 5，510，471)所描述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
d)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrun等人，1997W09704103)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)3'his:包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列(Chabout6等人1987， 如上述)
載體pTJN47的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 1中。
pTJN50
a)P35S2:包括花椰菜花葉病毒35S轉錄本的啟動子區(qū)的序列(Odell等人，1985)
b)5'cab22L:包括來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列的序列 (Harpster 等人，1988)
c)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
d)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)3'nos:包括來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的序列 (Depicker 等人，1982)
載體pTJN50的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 2中。pTJN48
a)Ph4a748-NarI包括擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子區(qū)的序列(Chabout6等人， 1987)
b)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992)
c)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
d)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)3'his 包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列(Chabout6等人，1987)
f)P35S2包括花椰菜花葉病毒35S轉錄本的啟動子區(qū)的序列(Odell等人，1985)
g)5'cab22L:包括來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列的序列 (Harpster 等人，1988)
h)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
i)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
j)3' nos 包括來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的序列 (Depicker 等人，1982)
載體pTJN48的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 3中。pTJN51
a)P35S2包括花椰菜花葉病毒35S轉錄本的啟動子區(qū)的序列(Odell等人，1985)
b)5'cab22L:包括來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列的序列 (Harpster 等人，1988)
c)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列(Chaubet 等人，1992)
d)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
f)3'nos:包括來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的序列 (Depicker 等人，1982)
載體pTJN51的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 4中。pTJN49
a)Ph4a748-NarI包括擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子區(qū)的序列(Chabout6等人， 1987)
b)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992)
c)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
d)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)3'his 包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列(Chabout6等人，1987)
f)P35S2包括花椰菜花葉病毒35S轉錄本的啟動子區(qū)的序列(Odell等人，1985)
g)5'cab22L:包括來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列的序列 (Harpster 等人，1988,如上述)
h)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992)
i)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
j) 2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
k)3' nos 包括來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的序列 (Depicker 等人，1982)
載體pTJN49的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 5中。pTJN75
a)Ph4a748包括擬南芥的組蛋白H4基因的啟動子區(qū)的序列(Chabout6等人，1987)
b)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992)
c)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus annuus (向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人(1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
d)2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
e)3'his 包括擬南芥的組蛋白H4基因的3'非翻譯區(qū)的序列(Chabout6等人，1987)
f)P35S2包括花椰菜花葉病毒35S轉錄本的啟動子區(qū)的序列(Odell等人，1985)
g)5'cab22L:包括來自矮牽牛的葉綠素a/b結合蛋白基因的引導序列的序列 (Harpster 等人，1988)
h)內含子lh3At包括擬南芥的組蛋白H3. III變體的基因II的第一內含子的序列 (Chaubet 等人，1992)
i)TPotpC-IPc 優(yōu)化的轉運肽的編碼序列，含有ka mays (玉米)和Helianthus arrnuus(向日葵)的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因的序列，如由Lebrim等人 (1996)所述，適合于歐洲油菜的密碼子使用
j) 2mepsps-lPa =Zea mays (玉米)的雙突變5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的編碼序列(Lebrim等人，1997)，適合于歐洲油菜的密碼子使用
k)3' nos:包括來自pTiT37的T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的序列 (Depicker 等人，1982)
載體PTJN75的T-DNA的核苷酸序列表示于SEQ ID no. 6中。使用Leto 1. O基因優(yōu)化軟件(Entelechon GmbH,德國)對歐洲油菜進行密碼子優(yōu)化
實例2 帶有實例1的T-DNA載體的歐洲油菜的農桿菌介導的轉化將所生成的T-DNA載體導入根癌農桿菌C58ClRif (pGV4000)中，并且根據(jù)本領域已知的方法使用大觀霉素和鏈霉素選擇轉化體。根據(jù)本領域已知的方法使用農桿菌菌株來轉化歐洲油菜變種PPS02-144B并且針對草甘膦耐受性(0. 4kg活性成分/公頃)選擇轉基因植物，并且使用DNA印跡法和RT-PCR 對單拷貝數(shù)量進行核實。TO植物與野生型植物回交，并且將生成的Tl代用于在溫室中進行針對草甘膦耐受性的試驗。
實例3 草甘膦耐警件的測量為了分析草甘膦耐受性，對于每個轉化事件，將51個Tl種子播種在溫室中，并且在2-4葉期以2. Okg活性成分/公頃劑量(相當于5倍的用于溫室中的常規(guī)劑量)的草甘膦進行萌發(fā)后處理。在噴霧之后十天，對每種構建體的一個代表性事件的存活植物拍攝照片(圖1A)并且針對以下參數(shù)對這些存活的群體進行評分為了評定活力，在1至9的等級上進行了評估，其中1 =死亡，3 =活力弱的，6 = 略異常的表型并且9 =有活力的。每種構建體的5個代表性事件的平均值(Av)和標準差 (sd)表示在表1中。為了評定ΡΡΤ0Χ，在1至9的等級上對植物進行了評估，其中1 =完全發(fā)黃，5 = 50%的植物是發(fā)黃的，并且9 =沒有發(fā)黃。每種構建體的5個代表性事件的平均值(Av)和標準差(sd)表示在表1中。 表權利要求
1.一種包含一種嵌合DNA分子的植物細胞或植物，該嵌合DNA分子包含以下可操作連接的DNA片段a)一種植物可表達的組成型啟動子；b)一個編碼5，UTR的DNA區(qū)；c)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區(qū)；d)一個編碼轉運肽的DNA區(qū)；e)一個編碼耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的DNA區(qū)；以及f)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)，該區(qū)在植物細胞中有功能的。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物細胞或一種植物，其中所述組成型啟動子是CaMV35S啟動子。
3.根據(jù)權利要求1或2的任何一項所述的植物細胞或一種植物，其中所述內含子1包含SEQ ID no. 9的第692位至第1100位的核苷酸或第四84位至第3064位的核苷酸或SEQ ID no. 10的第555位至第668位的核苷酸。
4.根據(jù)權利要求1至3的任何一項所述的植物細胞或一種植物，其中所述編碼耐草甘膦的EPSPS的DNA區(qū)編碼SEQ ID no. 8的氨基酸序列。
5.根據(jù)權利要求4所述的植物細胞或一種植物，其中所述編碼耐草甘膦的EPSPS的 DNA區(qū)包含SEQ ID no. 1的第997位至第23；34位的核苷酸。
6.根據(jù)權利要求1至5的任何一項所述的植物細胞或一種植物，進一步包含一種第二嵌合DNA分子，所述第二嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段a)擬南芥的組蛋白H4基因的一個啟動子序列；b)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的第二 DNA區(qū)；c)一個編碼轉運肽的第二 DNA區(qū)；d)一個編碼耐草甘膦的EPSPS的第二 DNA區(qū)；以及e)一個第二 3’轉錄終止和多腺苷酸化區(qū)，該區(qū)在植物細胞中有功能的。
7.根據(jù)權利要求6所述的植物細胞或一種植物，其中所述組蛋白H4啟動子序列包含 SEQ ID no. 6的第6166位至第7087位的核苷酸。
8.根據(jù)權利要求6或7的任何一項所述的植物細胞或一種植物，其中所述內含子1包含SEQ ID no. 9的第692位至第1100位的核苷酸或第四84位至第3064位的核苷酸或SEQ ID no. 10的第555位至第668位的核苷酸。
9.根據(jù)權利要求6至8的任何一項所述的植物細胞或一種植物，其中所述編碼耐草甘膦的EPSPS的DNA區(qū)編碼SEQ ID no. 8的氨基酸序列。
10.根據(jù)權利要求9所述的植物細胞或一種植物，其中所述編碼耐草甘膦的EPSPS的 DNA區(qū)包含SEQ ID no. 1的第997位至第23；34位的核苷酸。
11.根據(jù)權利要求1至10的任何一項所述的植物細胞或一種植物，是一種蕓薹屬植物。
12.根據(jù)權利要求1至11的任何一項所述的植物，是一種油菜。
13.一種如權利要求1至12的任何一項所述的植物的種子，包括如在權利要求1至12 的任何一項中所述的嵌合基因。
14.一種如在權利要求1至四中的任何一項所述的嵌合DNA分子。
15.一種用于在大田中種植植物的方法，包括使如在權利要求1至12的任何一項中所述的植物生長并且用一種抑制EPSPS的除草劑處理所述植物。
16.根據(jù)權利要求14的一種嵌合DNA分子用來產生一種耐草甘膦植物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有一種嵌合DNA分子的植物，該嵌合DNA分子在一種植物組成型啟動子和一種置換型組蛋白內含子1的控制下編碼一種耐草甘膦的EPSPS酶，由此向所述植物賦予增強的草甘膦耐受性。
文檔編號C12N15/82GK102471776SQ201080029250
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權日2009年7月1日
發(fā)明者C·范德施特雷滕, F·莫伊勒韋特, R·魯伊特 申請人:拜爾生物科學公司