專利名稱：：用二價(jià)鹽和磷酸鹽進(jìn)行絮凝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及簡單和非常有效的用于從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：當(dāng)需要具有非常高純度的蛋白時(shí)，例如當(dāng)?shù)鞍状糜谒幬镱I(lǐng)域時(shí)，需要非常有效的絮凝過程。許多已知的絮凝劑是無法使用的，因?yàn)樗鼈兛赡茉谧罱K醫(yī)藥產(chǎn)品中成為雜質(zhì)。因此，本發(fā)明的目的是對(duì)上述問題提供簡單而有效的解決方案。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以以非常有效的方式從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白，即，使用二價(jià)鹽和磷酸鹽的組合，因此我們要求保護(hù)一種從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000%(w/w)；b)添加二價(jià)鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調(diào)整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調(diào)整發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5的pH；和e)去除細(xì)菌細(xì)胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及簡單的和非常有效的從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的方法，包括添加二價(jià)鹽和磷酸鹽，在此之后去除細(xì)菌細(xì)胞并獲得具有非常低濁度的蛋白溶液。細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞可為芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)胞，例如，選自下組的芽孢桿菌屬細(xì)胞嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)>短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenuformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)禾口蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；優(yōu)選為遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞；特別是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞可為大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，或假單胞菌屬菌種O^seudomonassp.)細(xì)胞，或鏈霉菌屬菌種(Sti^ptomycessp.)細(xì)胞，特別是鼠灰鏈(Streptomycesmurinus)^[fMMM^^M^MUM(Streptomycesacidiscabies)M胞。目標(biāo)蛋白根據(jù)本發(fā)明，所述目標(biāo)蛋白可為肽或多肽。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的肽含有5至100個(gè)氨基酸；優(yōu)選10至80個(gè)氨基酸；更優(yōu)選15至60個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的待回收的肽為甜味蛋白(brazzein)。優(yōu)選的多肽可為任何可由細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白。所述蛋白可為胰島素、thaxomin、白蛋白或酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白是待用于藥物的酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述方法施用于水解酶(根據(jù)EnzymeNomenclature；RecommendaionsoftheNomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistry為類型EC3)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，選自下組的酶是優(yōu)選的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、和纖維素酶蛋白酶合適的蛋白酶包括那些動(dòng)物、植物(vegetable)或微生物起源。優(yōu)選微生物起源的。包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程的突變體。所述蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例為枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，特別是那些來源于芽孢桿菌屬的，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于TO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例為胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于W089/06270和WO94/25583的鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。其他合適的蛋白酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2005/11M55中的擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase,Primase,Duralase、Esperase禾口Kannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、ProperaseT\Purafect,Purafect0xP、FN2TM和FN3(GenencorInternationalInc.)MM:合適的脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和WO96/27002)、或威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶可為芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993)，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)的脂肪酶。其他合適的脂肪酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136159中的脂肪酶。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如獲得自地衣芽孢桿菌特殊菌株，其更加詳細(xì)地描述于GB1，296,839。其他合適的淀粉酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136161中的淀粉酶。商業(yè)上可獲得的淀粉酶為Duramyl、TermamylSC、TermamylUltra、Stainzyme,Natalase和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的和蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium)、梭孢殼屬(Thielavia)、或枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶。目標(biāo)蛋白亦可為葡萄糖異構(gòu)酶如Sweetzyme(NovozymesA/S)。發(fā)酵液本發(fā)明可用于任何工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，例如，用于任何具有至少50升，優(yōu)選至少500升，更優(yōu)選至少5000升，甚至更優(yōu)選至少50000升發(fā)酵介質(zhì)的發(fā)酵。產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的細(xì)菌細(xì)胞可通過本領(lǐng)域任何已知方法來發(fā)酵。所述發(fā)酵介質(zhì)可為如描述于例如WO98/37179的基本培養(yǎng)基，或所述發(fā)酵介質(zhì)可為包含復(fù)合氮源和碳源的復(fù)合培養(yǎng)基，其中所述復(fù)合氮源可如描述于W02004/003216為部分水解的。發(fā)酵可作為分批、重復(fù)分批、批次補(bǔ)料、重復(fù)批次補(bǔ)料或連續(xù)發(fā)酵過程進(jìn)行。在批次補(bǔ)料過程中，完全不將或僅部分將包含一種或多種結(jié)構(gòu)和/或催化元件的化合物在發(fā)酵起始前添加至介質(zhì)，并分別將全部或剩余部分的所述包含一種或多種結(jié)構(gòu)和/或催化元件的化合物在發(fā)酵過程中給料。選用于給料的化合物可一同或分別給料于發(fā)酵過程。在重復(fù)批次補(bǔ)料或連續(xù)發(fā)酵過程中，在發(fā)酵中加合地將完整的起始介質(zhì)給料。起始介質(zhì)可與結(jié)構(gòu)元件給料一同給料或分別給料。在重復(fù)批次補(bǔ)料過程中，以規(guī)則的時(shí)間間隔去除部分包含生物質(zhì)的發(fā)酵液，而在連續(xù)過程中，部分發(fā)酵液的去除連續(xù)進(jìn)行。由此用對(duì)應(yīng)于移除的發(fā)酵液的量的一部分新鮮介質(zhì)來補(bǔ)充至發(fā)酵過程。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選來自批次補(bǔ)料發(fā)酵過程的發(fā)酵液。MM本發(fā)明的方法可適用于未經(jīng)處理的發(fā)酵液或首先經(jīng)歷，但不限于例如pH調(diào)整和/或溫度調(diào)整的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵液可用水稀釋至1000%(w/w)；優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋10-1000%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋100-900%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋200-800%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋200-800%(w/w)；且特別是所述發(fā)酵液可用水稀釋300-700%(w/w)0根據(jù)本發(fā)明，用水稀釋意味著所述稀釋介質(zhì)可為水，或可為來自目標(biāo)蛋白生產(chǎn)的超濾滲透物，或可為來自目標(biāo)蛋白生產(chǎn)的再循環(huán)水，或可為來自加熱器的冷凝物，或可為任何上述提及的組合，例如，水和超濾滲透物的混合物。然后將二價(jià)鹽，特別是鈣鹽和/或鎂鹽，例如氯化鈣或氯化鎂，添加至發(fā)酵液。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是鈣鹽，特別是氯化鈣。所述二價(jià)鹽應(yīng)添加至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升；優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-100毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為20-90毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為30-80毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為40-70毫摩爾每升；特別是至其在發(fā)酵液中的濃度為50-70毫摩爾每升。二價(jià)鹽的給藥通常是連線(in-line)或在混合罐中，或通過本領(lǐng)域中任何其他已知方法進(jìn)行的。然后可將發(fā)酵液中的磷酸根濃度調(diào)整至其濃度為高于10毫摩爾每升；優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-50毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-40毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-30毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-20毫摩爾每升。磷酸根濃度通常是通過添加磷酸鹽如NaH2P04、Na2HP04或H3P04來調(diào)整的。磷酸鹽的給藥通常是連線或在混合罐中，或通過本領(lǐng)域中任何其他已知方法進(jìn)行的。鈣和磷酸根的添加導(dǎo)致pH減少，通常至低于pH6.0的pH。通過將pH移至高于PH6，磷酸根和鈣沉淀為具有低溶解度的固體形式。令人驚訝的是，該沉淀非常有效地挾帶(entrap)細(xì)菌細(xì)胞。因此，在添加了鈣和磷酸根之后，即將發(fā)酵液的PH調(diào)整至高于6.0的pH，特別是至6.1至10.5的pH；優(yōu)選至6.2至10.5的pH；更優(yōu)選至6.3至10.5的pH；更優(yōu)選至6.4至10.5的pH；更優(yōu)選至6.5至10.5的pH；特別是至7.0至10.0的pH，特別是至8.0至9.0的pH。pH調(diào)整可通常通過任何本領(lǐng)域已知的堿例如NaOH或KOH進(jìn)行。然后通過本領(lǐng)域已知方法如，但不限于過濾例如鼓式過濾(drumfiltration)、膜過濾、板框壓濾機(jī)終端過濾(flter-pressdeadendfiltration)、錯(cuò)流過濾或離心來去除絮凝的細(xì)菌細(xì)胞。在去除細(xì)菌細(xì)胞之后，獲得了具有低于100NTU(=比濁法濁度單位)的蛋白溶液；特別是具有低于90的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于80的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于70的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于60的濁度的蛋白溶液；特別是具有5-50范圍的濁度的蛋白溶液。濁度是如本領(lǐng)域中已知并根據(jù)專利US4，198，161測量的，例如，通過來自HachLange的Hach2100P便攜式濁度計(jì)。后續(xù)的下游操作然后可以通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)一步處理所得的蛋白溶液。例如，可通過常規(guī)方法，包括但不限于進(jìn)一步過濾如超濾和滲濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)，沉淀或結(jié)晶，來回收蛋白。然后可將分離的蛋白進(jìn)一步通過多種本領(lǐng)域已知方法包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排阻)，電泳方法(例如制備性等電聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取來進(jìn)行純化和/或修飾。本發(fā)明進(jìn)一步由下述實(shí)施例來說明，其不意欲以任何方式限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1僅用鈣絮凝(地衣芽孢桿菌/淀粉酶)該實(shí)驗(yàn)的目的是為了說明聚沉(coagulation)的全部作用無法通過僅添加鈣獲得(磷酸根是必需的)。來源芽孢桿菌細(xì)胞為含有嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢桿菌細(xì)胞。發(fā)酵我們使用1500升的規(guī)模；使用含有蛋白源的鹽培養(yǎng)基，采用無機(jī)氮作為主要氮源和葡萄糖給藥作為碳源。因?yàn)閬碜园l(fā)酵的剩余磷酸根濃度，磷酸根濃度并非零，而是為2.8mM(參見下表1)。鈣以CaC12(36%)添加。鈣濃度在0至69.5mM之間變化。發(fā)酵液的pH(在調(diào)整之前)為6.7。在添加了鈣和磷酸根之后，通過使用NaOH將pH調(diào)整至7.0。將絮凝溶液以3500rpm(=2493g)離心5分鐘。表1實(shí)驗(yàn)條件"#1Γ^Ι稀釋(自來水)600%添加的Ρ04濃度O^M總Ρ04濃度2.8mM添加的Ca濃度WWPH調(diào)整設(shè)定點(diǎn)pH7.0表2:結(jié)果添加的C(Ca)淤漁濁度mM%w/wNTU0.03.6%100023.25.8%100046.39.2%63169.59.5%360用于稀釋的自來水含有2_3mM數(shù)量級(jí)的Ca。這未反映在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中。濁度讀數(shù)的最大值是1000NTU。因此，當(dāng)列出濁度為1000NTU時(shí)，這實(shí)質(zhì)上意味著>1000NTU。實(shí)驗(yàn)1闡明了不添加磷酸根無法獲得低濁度(<100)的酶溶液。7實(shí)施例2■■舞酬隨疑(MHffi滅/浦IS)該實(shí)驗(yàn)的目的是為了衡量獲得合適聚沉作用所需的磷酸根添加水平。因?yàn)榱姿岣奶砑咏档蚉H，起始pH會(huì)取決于添加的磷酸根的量而變化。為了確證改善的聚沉并非僅為該差異的作用，準(zhǔn)備了兩個(gè)系列的樣品一個(gè)為“如原樣(as-is)”，而另一個(gè)中在添加鈣和磷酸根之后pH調(diào)整至5.0。然后將兩個(gè)系列均調(diào)整至本實(shí)驗(yàn)的PH設(shè)定點(diǎn)(10.0)。來源芽孢桿菌細(xì)胞為含有嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢桿菌細(xì)胞。發(fā)酵發(fā)酵和絮凝如實(shí)施例1中所述用下述特定條件來進(jìn)行表3:實(shí)驗(yàn)條件權(quán)利要求1.一種從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000%(w/w)；b)添加二價(jià)鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調(diào)整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調(diào)整稀釋的發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5內(nèi)的pH；并e)去除細(xì)菌細(xì)胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)胞。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述芽孢桿菌屬細(xì)胞是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)細(xì)胞。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是酶。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶選自下組蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)鹽是鈣鹽。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)鹽濃度在10-100毫摩爾每升的范圍。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述磷酸根從NaH2P04、Na2HP04或H3P04獲得。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述磷酸根濃度是10-50毫摩爾每升的范圍。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是通過過濾或離心去除的。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)蛋白為醫(yī)藥產(chǎn)品。13.權(quán)利要求1的方法，其中將pH調(diào)整至6.5-10.5范圍內(nèi)的pH。全文摘要一種從發(fā)酵液絮凝細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000％(w/w)；b)添加二價(jià)鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調(diào)整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調(diào)整稀釋的發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5內(nèi)的pH；和e)去除細(xì)菌細(xì)胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。文檔編號(hào)C12N1/02GK102471755SQ201080030690公開日2012年5月23日申請(qǐng)日期2010年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者J.R.佩德森,P.F.平德申請(qǐng)人:諾維信公司